CN111218430B - 一种nadh类似物依赖型的细胞色素p450还原酶及其应用 - Google Patents

一种nadh类似物依赖型的细胞色素p450还原酶及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种NADH类似物依赖型的细胞色素P450还原酶及其应用。以NADH类似物为辅因子及还原力，催化电子传递，还原细胞色素P450完成催化循环。此酶与不同类型细胞色素P450酶融合表达，构建NADH类似物依赖的、杂合的、自给自足型细胞色素P450酶，获得的NADH类似物依赖细胞色素P450酶可与再生NADH类似物的氧化还原酶偶联，利用NAD类似物催化不同家族细胞色素P450的对应底物转化为产物。该NADH类似物依赖型细胞色素P450还原酶可用于构建生物正交的不依赖天然辅因子NAD(P)H的代谢途径，实现P450酶催化的能量消耗与内源能量代谢解偶联。

Description

一种NADH类似物依赖型的细胞色素P450还原酶及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)类似物依赖型细胞色素P450还原酶及其应用，具体地说，是经基因工程改造的BMR，以NAD(H)类似物为辅因子及还原力，催化还原细胞色素P450酶，使细胞色素P450酶催化底物转化。将NADH类似物依赖型细胞色素P450还原酶与细胞色素P450酶融合表达构建的NADH类似物依赖的杂合的自给自足型细胞色素P450酶可应用于生物正交代谢途径的构建，实现P450酶催化的能量消耗与内源能量代谢解偶联。
背景技术
细胞色素P450酶是一类功能多样的硫醇盐-亚铁血红素酶蛋白，可选择性活化C-H键、N-H键、S-H键等，从而催化20余种不同类型的反应，实现对大量不同结构底物的选择性羟化、环氧化、脱烷基等修饰性反应，被誉为自然界的“万能催化剂”。但其活性依赖于氧化还原伴侣蛋白将NAD(P)H的两个电子传递到其亚铁血红素辅基上，才能完成其催化循环，实现底物转化为产物。根据细胞色素P450酶电子传递体系，可将其分为五类：(1)Class I为三组分体系，存在于绝大部分细菌和许多真核生物线粒体中，包括含有FAD的铁氧还蛋白还原酶(FdR)、含有Fe-S簇的铁氧还蛋白(Fdx)和含有亚铁血红素的P450酶三个游离组分，细菌中Class I P450三个蛋白均可溶，真核生物线粒体中Class I P450仅Fdx可溶，FdR和P450锚定在膜上。在反应过程中，FdR将电子从NAD(P)H传递到Fdx，Fdx再将电子到P450酶。(2)Class II为双组分体系，存在于大部分真核微生物内质网膜上，包括含有辅因子FAD和FMN的NAD(P)H细胞色素P450还原酶(NAD(P)H cytochrome P450reductase,CPR)和P450酶，二者均锚定在膜上。在反应过程中，CPR将电子从NAD(P)H传递到P450酶。(3)Class III为单组分体系，存在于细菌中，是由含有血红素辅基的P450酶结构域和含有辅因子FAD和FMN的P450还原酶结构域融合而成的一条双功能肽链，在反应过程中，不需要外加辅助的电子传递蛋白，电子在分子内部传递，是一种电子自给自足型催化体系。(4)Class IV也为单组分体系，具有与Class I相同的三个组分在一条融合的多肽链上，N-末端的P450功能域与含辅因子FMN的FdR能域相连，在与C-末端含Fe-S簇的Fdx功能域相连，也是一种电子自给自足型催化体系。(5)Class V为不常见的不依赖于NAD(P)H的P450酶。(Bernhardt R.etal.Cytochromes P450as versatile biocatalysts.J.Biotechnol,2006,124,128-145)
P450BM3是来源于巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的脂肪酸羟化酶，属于Class III类自给自足型P450，是目前文献报道催化效率最高的P450酶，催化效率高达17000min-1，包括含有血红素的P450结构域(BMP)和P450还原酶结构域(BMR)，利用NADPH和O2催化脂肪酸次末端亚甲基羟基化生成羟基脂肪酸(Christopher J.C.Whitehouse,etal.P450BM3(CYP102A1):connecting the dots.Chem Soc Rev,2012,41,1218–1260)。但其他类P450酶生物转化体系仍存在整体效率偏低、依赖还原型辅酶和宿主底物供给能力弱等问题，严重制约其工业化应用。
烟酰胺类辅因子(NAD(P))及其还原态NAD(P)H是生命过程中的重要辅酶，参与生命体中的氧化还原代谢及其他一系列重要生物化学过程，任何改变NAD浓度及其氧化还原状态的操作都会对细胞产生全局性影响。而利用NAD类似物和只能识别其的突变型氧化还原酶，可实现在辅酶水平对目标氧化还原过程进行调控，对生物催化和合成生物学研究具有重要意义(Ji DB,et al.Creation of bioorthogonal redox systems depending onnicotinamide flucytosine dinucleotide.J Am Chem Soc,2011,133,20857-20862；WangL,et al.Synthetic cofactor-linked metabolic circuits for selective energytransfer.ACS Catal,2017,7,1977-1983)。本研究组报道了几种具有良好生物相容性的NAD类似物。如，烟酰胺胞嘧啶二核苷酸(NCD)、烟酰胺5-氟胞嘧啶二核苷酸(NFCD)、烟酰胺5-氯胞嘧啶二核苷酸(NClCD)、烟酰胺5-溴胞嘧啶二核苷酸(NBrCD)和烟酰胺5-甲基胞嘧啶二核苷酸(NMeCD)(Ji DB,et al.Creation of bioorthogonal redox systems dependingon nicotinamide flucytosine dinucleotide.J Am Chem Soc,2011,133,20857-20862；Ji DB,et al.Synthesis of NAD analogs to develop bioorthogonal redoxsystem.Sci China Chem,2013,56,296-300)。同时，也报道了一些可识别NAD类似物的酶，如来自粪肠球菌Enterococcus faecalis的NADH氧化酶(NOX，Genbank S45681)、D-乳酸脱氢酶(DLDH，Gnebank CAA47255)V152R突变体、苹果酸酶(ME，Genbank P26616)L310R/Q401C突变体、苹果酸脱氢酶(MDH，Genbank CAA68326)L6R突变体。目前，已经实现利用NAD类似物进行胞内代谢反应的调控，通过向胞内转运NCD，DLDH-V152R可利用NCD将丙酮酸还原为乳酸，实现了特异性的生物催化调控(Wang L,et al.Synthetic cofactor-linkedmetabolic circuits for selective energy transfer.ACS Catal,2017,7,1977-1983)。
因此构建NADH类似物依赖型的细胞色素P450还原酶，进而与P450酶融合构建NADH类似物依赖的自给自足型细胞色素P450酶，对实现P450脂肪酸脱羧酶/羟化酶的能量消耗与内源NADPH供给解耦联具有重要意义。
发明内容
本发明属于生物技术领域，涉及辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)类似物依赖型细胞色素P450还原酶及其应用，具体地说，是经基因工程改造的BMR，以NAD(H)类似物为辅因子及还原力，催化还原细胞色素P450酶，使细胞色素P450酶完成对底物的催化转化，将其与细胞色素P450酶融合表达构建的NADH类似物依赖的杂合的自给自足型细胞色素P450酶可应用于生物正交代谢途径的构建，实现P450酶催化的能量消耗与内源能量代谢解偶联。因此，本发明的方法可应用在生物催化和生物转化领域，具有重要价值。
一种NADH类似物依赖型的细胞色素P450还原酶，其特征在于：
细胞色素P450还原酶来源于巨大芽孢杆菌Bacillus megatherium的P450BM3的含黄素单核苷酸和黄素腺嘌呤二核苷酸的P450还原酶结构域BMR，即P450 BM3从第471位到第1048位氨基酸序列，编码基因具有SEQ ID NO：1的基因序列，具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列；
NADH类似物依赖型的细胞色素P450还原酶为在BMR基础上经基因工程改造获得的多位点突变体，突变位点包括但不限于BMR-R967D/K973S(氨基酸编号于P450BM3一致，第967位的赖氨酸R突变为天冬氨酸D，第973位的赖氨酸K突变为丝氨酸S)、BMR-R967D/K973S/Q977F(第967位的赖氨酸R突变为天冬氨酸D，第973位的赖氨酸K突变为丝氨酸S，第977位谷氨酰胺Q突变为苯丙氨酸F)、BMR-R967D/K973S/Q1005H(第967位的赖氨酸R突变为天冬氨酸D，第973位的赖氨酸K突变为丝氨酸S，第1005位谷氨酰胺Q突变为组氨酸H)、BMR-R967D/Q977F/W1047S(第967位的赖氨酸R突变为天冬氨酸D，第977位谷氨酰胺Q突变为苯丙氨酸F，第1047位的酪氨酸W突变为丝氨酸S)、BMR-R967D/Q1005H/W1047S(第967位的赖氨酸R突变为天冬氨酸D，第1005位谷氨酰胺Q突变为组氨酸H，第1047位的酪氨酸W突变为丝氨酸S)、BMR-R967D/K973S/W1047S(第967位的赖氨酸R突变为天冬氨酸D，第973位的赖氨酸K突变为丝氨酸S，第1047位的酪氨酸W突变为丝氨酸S)、BMR-R967D/K973S/Q977F/W1047S(第967位的赖氨酸R突变为天冬氨酸D，第973位的赖氨酸K突变为丝氨酸S，第977位谷氨酰胺Q突变为苯丙氨酸F，第1047位的酪氨酸W突变为丝氨酸S)中的一种或两种以上。
NADH类似物依赖型细胞色素P450还原酶，其特征在于：
1)NADH类似物依赖型细胞色素P450还原酶以NADH类似物为辅因子；
2)NADH类似物依赖型细胞色素P450还原酶利用NADH类似物催化还原K3[Fe(CN)6]、细胞色素c；
3)NADH类似物依赖型细胞色素P450还原酶可与不同类型细胞色素P450酶融合构建NADH类似物依赖的自给自足的细胞色素P450酶；
4)NADH类似物依赖的自给自足的细胞色素P450酶的催化过程为：NADH类似物依赖型细胞色素P450还原酶将NADH类似物的两个电子，逐个传递到细胞色素P450酶的血红素催化活性中心，使细胞色素P450酶完成对底物的催化转化。
NADH类似物为NCDH、NTDH和NUDH中的一种或两种以上，其化学结构如下：
Figure BDA0001879572140000031
NADH类似物NCDH、NTDH或NUDH是由酶法或化学法还原NCD、NTD和NUD而得，NCD、NTD和NUD的化学结构如下：
Figure BDA0001879572140000041
酶法还原NCD、NTD和NUD的再生酶为包括但不限于苹果酸酶ME-L310R/Q401C、D-乳酸脱氢酶DLDH-V152R、亚磷酸脱氢酶PDH-I151R或甲酸脱氢酶FDH-G171Y中的一种或两种以上；所述再生NAD类似物的氧化还原酶对应再生底物包括但不限于苹果酸化合物，亚磷酸化合物，D-乳酸化合物，甲酸化合物中的一种或两种以上；其中，苹果酸化合物为苹果酸、苹果酸盐中的一种或两种以上；D-乳酸化合物为D-乳酸、D-乳酸盐中的一种或两种以上；亚磷酸化合物为亚磷酸、亚磷酸盐中的一种或两种以上；甲酸化合物为甲酸、甲酸盐中的一种或两种以上；所述酶法再生NADH类似物的反应体系为pH 7.5的缓冲液中，NAD类似物1mM-20mM，再生酶10U-500U，再生底物4mM-25mM，20℃-40℃下反应20min-2h，其中缓冲体系包括但不限于磷酸盐、Tris-HCl、MES或HEPES缓冲液中的一种或两种以上。化学法还原NCD，NTD和NUD的反应体系为在水溶液中，以Na2S2O4、NaBH4、NaBH(Et)3、NaBH3CN中的一种或两种中以上的任意组合为还原剂，其中NAD类似物与还原剂的比例为1：2-4，20℃-40℃下反应20min-2h。
一种NADH类似物依赖型的细胞色素P450还原酶的应用，其特征在于：所述的NADH类似物依赖型细胞色素P450还原酶与细胞色素P450酶通过连接肽融合表达的构建NADH类似物依赖的、杂合的、自给自足型细胞色素P450酶，其中连接肽包括但不限于P450BM3的451-470的氨基酸序列(BM3res.451-470：KKIPLGGIPSPSTEQSAKKV)或(G4S)n，其中n为2-6的整数。
所述的与NADH类似物依赖型的细胞色素P450还原酶融合的细胞色素P450酶为Class I细胞色素P450酶、Class II类的细胞色素P450酶、Class IIIP450结构域、或ClassIV类的P450结构域中的一种或两种以上，其中Class I类P450酶包括但不限于CYP101A1、CYP105A3、CYP152A1、CYP152B1、CYP152L1中的一种或两种以上；Class II类P450酶包括但不限于CYP3A4、CYP2C19、CYP2C9中的一种或两种以上；Class III类P450酶结构域包括但不限于CYP102A1的第1位到第450位氨基酸序列；Class IV类P450酶结构域包括但不限于P450RhF的第1位到第444位氨基酸序列，其中Class I类P450酶对应底物包括但不限于D-莰酮、美伐他汀、C12-C20饱和脂肪酸；Class II类P450酶对应底物包括但不限于红霉素、奥美拉唑、双氯酚酸中的一种或两种以上，Class III类P450酶对应底物包括但不限于C12-C20饱和脂肪酸；Class IV类P450酶对应底物包括但不限于7-乙氧基香豆素。
NADH类似物依赖的杂合的自给自足型细胞色素P450酶，在pH 5-9缓冲体系中，与再生NADH类似物的苹果酸酶ME-L310R/Q401C、D-乳酸脱氢酶DLDH-V152R、亚磷酸脱氢酶PDH-I151R或甲酸脱氢酶FDH-G171Y及对应再生底物偶联，利用NAD类似物完成底物的催化转化。其中，缓冲体系包括但不限于磷酸盐、Tris-HCl、MES或HEPES缓冲液中的一种或两种以上。
所述NADH类似物依赖的杂合的自给自足型细胞色素P450酶、与来源于衣原体的NTT4或来源于拟南芥的AtNDT2蛋白以及再生NADH类似物的苹果酸酶ME-L310R/Q401C、D-乳酸脱氢酶DLDH-V152R、亚磷酸脱氢酶PDH-I151R或甲酸脱氢酶FDH-G171Y的一种或两种以上在微生物细胞内共表达，通过微生物细胞催化脂肪酸生产ω-羟基脂肪酸；其中NAD类似物通过来源于衣原体的NTT4或来源于拟南芥的AtNDT2蛋白转运至胞内。
所述表达NADH类似物依赖型的细胞色素P450酶并用于胞内催化脂肪酸羟基化的微生物细胞包括但不局限于原核微生物中的大肠杆菌，乳酸乳球菌；真核微生物中的酿酒酵母，里氏木霉中的一种或两种以上。
本发明所使用的苹果酸酶来自大肠杆菌K12(UniProt code P26616)，D-乳酸脱氢酶来自Lactobacillus helveticus(Uniprot code P30901)，亚磷酸脱氢酶来自Ralstoniasp.strain 4506(Uniprot code G4XDR8)，甲酸脱氢酶来自Pseudomonas sp.101(Uniprotcode P33160)。本发明所用到的突变型脱氢酶是利用
Figure BDA0001879572140000051
单位点突变试剂盒引入氨基酸突变得到突变型苹果酸酶(L310R/Q401C)、突变型乳酸脱氢酶(V152R)、突变型亚磷酸脱氢酶(I151R)和突变型甲酸脱氢酶(L287R)。本发明所用的以上氧化还原酶都是按文献(Protein Expression and Purification,2007,53,97-103)方法表达纯化。
本发明所使用的CYP101A1来源于Pseudomonas putida(UniProt code P00183)，所使用的CYP105A3来源于Streptomyces carbophilus(UniProt code Q59831)，所使用的CYP152A1来源于Bacillus subtilis(strain 168)(UniProt code O31440)，所使用的CYP152B1来源于Sphingomonas paucimobilis(UniProt code O24782)，所使用的CYP152L1来源于Jeotgalicoccus sp.ATCC 8456(UniProt code E9NSU2)，所使用的CYP3A4来源于Homo sapiens(Human)(UniProt code P08684)，所使用的CYP2C19来源于Homo sapiens(Human)(UniProt code P33261)，所使用的CYP2C9来源于Homo sapiens(Human)(UniProtcode P11712)，所使用的CYP102A1来源于Bacillus megaterium(UniProt code P14779)，所使用的P450RhF来源于Rhodococcus sp.NCIMB 9784(UniProt code Q8KU27)。
NADH类似物依赖型细胞色素P450还原酶以NADH类似物为辅因子及还原力，催化电子传递，还原细胞色素P450完成催化循环。此酶可与不同类型细胞色素P450酶融合表达，构建NADH类似物依赖的、杂合的、自给自足型细胞色素P450酶，获得的NADH类似物依赖细胞色素P450酶可与再生NADH类似物的氧化还原酶偶联，利用NAD类似物催化不同家族细胞色素P450的对应底物转化为产物。该NADH类似物依赖型细胞色素P450还原酶可用于构建生物正交的不依赖天然辅因子NAD(P)H的代谢途径，实现P450酶催化的能量消耗与内源能量代谢解偶联。
本发明的优点和有益效果：酶催化条件温和，反应效率高；产物选择性高，应用于胞内体系时可将小分子的化学能还原力选择性传递到底物氧化的目标代谢物。此外，将NADH类似物依赖型细胞色素P450还原酶与细胞色素P450酶融合表达构建的NADH类似物依赖的杂合的自给自足型细胞色素P450酶可应用于生物正交代谢途径的构建，实现P450酶催化的能量消耗与内源能量代谢解偶联。
具体实施方式
以下实施例将有助于本领域普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。
NAD类似物(NCD、NTD和NUD)参照文献方法(Ji DB,et al.Synthesis of NADanalogs to develop bioorthogonal redox system.Sci China Chem,2013,56,296-300)制备。NAD类似物用水制成浓度为20mM的溶液，备用。
大肠杆菌等原核生物转化的电转化方法参照《分子克隆指南》第三版，酿酒酵母等真核生物转化的方法参照文献(Gietz,R.D.,et al.Nature Protocols 2007,2,31)中醋酸锂转化方法。
酶的突变与筛选：在晶体结构分析软件Pymol中，选取来源于来源于巨大芽孢杆菌(Bacillus megatherium)P450BM3晶体结构(PDB ID:4DQL)做为模板，选取氨基酸序列SEQID NO：2中与NAD辅酶AMP部分相结合的氨基酸残基，将其对应的DNA序列SEQ ID NO：1中相应的碱基用RF克隆(Wang JX,et al.J.Microbiol.Meth.2007,71,225)的方法进行迭代饱和突变，并通过RF克隆的方法，整合到pUC18载体上，将获得质粒DAN转化至宿主E.coliBL21(DE3)中，挑取单克隆接至LB培养基，加入IPTG至终浓度0.5mM，25℃下200rpm培养48h，4000rpm离心，去上清，菌体用溶菌酶裂解，细胞裂解液上清，通过与偶联再生NADH类似物的再生酶的显色反应液，进行显色并筛选。筛选方法如下，在90μ显色反应液(50mM pH7.5HEPES缓冲液中，噻唑蓝(MTT)0.4mM，NAD类似物20μM，NADH类似物再生酶10U，再生底物1mM)中加入10μL突变文库转化子裂解液上清，利用Beckman高通量筛选液体工作测定粗酶活，获得具有识别NADH类似物的突变型。
酶的表达纯化：挑取突变型工程菌，用Ni亲和层析柱按文献方法(Wang JX,etal.Protein Express.Purif.2007,53,97)进行蛋白质的过表达纯化，备用。蛋白含量测定：以牛血清白蛋白ABS为标准蛋白，采用Bradford法测定。
融合型自给自足的NADH类似物依赖的P450酶的构建是将不同来源P450酶基因(N-端)和NADH类似物依赖的P450还原酶基因(C-端)利用连接肽通过融合PCR连接而成，融合时在整个融合蛋白的N-端加His-tag，并将NADH类似物依赖的P450还原酶基因BMR原有的N端His-tag去掉，融合所得的基因片段经RF克隆到pUC18载体上，重组载体电击转化到E.coliBL(DE3)中，并按文献(Protein Expression and Purification,2007,53,97-103)方法表达纯化。其中与Class II类P450融合时将P450的N端21个氨基酸替换为P450BM3的前50个氨基酸序列：MTIKEMPQPKTFGELKNLPLLNTDK PVQALMKIADELGEIFKFEAPGRVT。
再生底物以及相应产物的检测：利用美国戴安公司ICS-2500离子色谱系统在ED50脉冲电化学检测模式下分析测定反应溶液中苹果酸，乳酸，甲酸或亚磷酸等再生底物和对应产物的含量。使用IonPac AS11-HC阴离子交换分析柱(200mm×4mm)，IonPac AG11-HC阴离子交换保护柱(50mm×4mm)。分析条件：流动相为24mM NaOH，流速1mL/min，柱温：30℃，进样量25μL。NAD及NADH类似物采用液相色谱仪Agilent 1100分析，分析柱为Zorbax 150mm×3.0mm C18(3.5μm)，流动相为5mM硫酸四丁铵，流速为0.5mL/min。每个样品检测20min。紫外检测器波长为264nm(类似物及其还原态在260nm有较强吸收)和340nm(类似物还原态在340nm有较强吸收)。不同P450酶底物美伐他汀、黄酮、红霉素、双氯芬酸、奥美拉唑及对应产物采用液相色谱仪Agilent 1100分析，分析柱为Zorbax 150mm×3.0mm C18(3.5μm)，流动相为乙腈和乙酸铵水溶液梯度浓度洗脱，流速为0.5mL/min。二极管阵列DAD检测器波长为254nm和220nm。C12-C18脂肪酸及衍生物经硅烷化产物、D-莰酮及羟基化产物采用天美GC-7890F气相色谱分析，分析柱为极性柱FFAP石英毛细管柱(30m×0.32mm×0.4μm)；柱温100℃，进样器温度250℃，检测器(FID)温度280℃；进样量0.2μL；载气N2 40mL/min，H2 40.6mL/min，空气130mL/min；分流进样，柱前压0.22Mpa。通过标准品，对照标准样品进行定性，采用面积归一法确定相对含量。
实施例1：酶法还原NAD类似物NCD、NTD和NUD为还原型NADH类似物NCDH、NTDH和NUDH。
将NAD类似物NCD、NTD和NUD，分别用苹果酸酶ME-L310R/Q401C、D-乳酸脱氢酶DLDH-V152R、亚磷酸脱氢酶PDH-I151R或甲酸脱氢酶FDH-G171Y还原，按下述方法进行反应：将1mM的NAD类似物、4mM的底物(苹果酸、D-乳酸、亚磷酸或甲酸中的一种)和10U的酶(苹果酸酶ME-L310R/Q401C、D-乳酸脱氢酶DLDH-V152R、亚磷酸脱氢酶PDH-I151R或甲酸脱氢酶FDH-G171Y中的一种)溶解在1mL浓度50mM，pH 7.5的HEPES缓冲液中混匀，30℃反应20min，取20μL分析。
分析发现，所有样品在340nm均出现了特征吸收峰，说明苹果酸酶ME-L310R/Q401C、D-乳酸脱氢酶DLDH-V152R、亚磷酸脱氢酶PDH-I151R和甲酸脱氢酶FDH-G171Y可以利用底物催化还原NAD类似物。由于NAD类似物还原态产物的摩尔消光系数ε340约为6220M-1·cm-1，与NADH相同，用NADH标准品绘制曲线，得到定量结果(表1)。可见，不同的酶催化不同的类似物活性不同。可依据不同的NAD类似物，选择合适的再生酶。
表1酶法还原NADH类似物的实验结果
Figure BDA0001879572140000091
实施例2：还原态NAD类似物的酶法制备
将实施例1的反应体系放大，可用于制备还原态NAD类似物。以甲酸脱氢酶FDH-G171Y利用甲酸钠制备NUDH为例，说明制备过程。将20mM的NUD、25mM的甲酸钠和5mg的甲酸脱氢酶FDH-G171Y溶解在10mL浓度为50mM，pH为7.5的磷酸钠缓冲液中混匀，30℃反应2h。反应结束后直接冷冻干燥，浓缩至总体积约为4mL，用甲酸型阴离子交换树脂柱(201×4)分离，在紫外波长340nm跟踪收集产物，冷冻干燥，得白色粉末11.6mg，产率约90％。将上述白色粉末样品进行高分辨质谱分析，测得精确分子量(M+H)+为643.1026，与NUDH的理论分子量(C20H29N4O16P2 +，643.1054)一致，表明得到了还原态产物NUDH。
按照实施例2的方法制备得NCDH、NTDH和NUDH。
实施例3：化学法还原NAD类似物NCD、NTD和NUD为还原型NADH类似物NCDH、NTDH和NUDH。
将NAD类似物NCD、NTD和NUD，分别用Na2S2O4、NaBH4、NaBH(Et)3、NaBH3CN还原，按下述方法进行反应：将1mM的NAD类似物、4mM的还原剂(Na2S2O4、NaBH4、NaBH(Et)3、NaBH3CN)溶解在1mL的H2O中混匀，30℃反应20min，取20μL分析。
分析发现，所有样品在340nm均出现了特征吸收峰，说明Na2S2O4、NaBH4、NaBH(Et)3、NaBH3CN可以还原NAD类似物。定量方法同实施例1，结果如表2。可见化学还原剂Na2S2O4、NaBH4、NaBH(Et)3、NaBH3CN均可用于还原NAD类似物制备NADH类似物，没有底物选择性。
表2化学法还原NAD类似物的实验结果
Figure BDA0001879572140000101
实施例4：还原态NAD类似物的化学法制备
将实施例3的反应体系放大，可用于制备还原态NAD类似物。以Na2S2O4还原制备NCDH为例，说明制备过程。将20mM的NCD、80mM的Na2S2O4和80mM的碳酸钠溶解在10mL水中混匀，30℃反应2h。反应结束后直接冷冻干燥，浓缩至总体积约为4mL，用甲酸型阴离子交换树脂柱(201×4)分离，在紫外波长340nm跟踪收集产物，冷冻干燥，得白色粉末11.6mg，产率约90％。将上述白色粉末样品进行高分辨质谱分析，测得精确分子量(M+H)+为642.1210，与NCDH的理论分子量(C20H20N5O15P2 +，642.1208)一致，表明得到了还原态产物NCDH。
按照实施例4的方法制备得NCDH、NTDH和NUDH。
实施例5：NADH类似物依赖型细胞色素P450还原酶利用NADH类似物催化还原K3[Fe(CN)6]和细胞色素c。
采用50mM，pH 7.5的Tris-HCl缓冲体系，100μL的反应体系组成为：0.5mM K3[Fe(CN)6]、0.3mM NADH类似物、10nM NADH类似物依赖型细胞色素P450还原酶(BMR-R967D/K973S、BMR-R967D/K973S/Q977F、BMR-R967D/K973S/Q977F/W1047S)，30℃反应，测定420nm吸光值的降低，确定K3[Fe(CN)6]的还原，K3[Fe(CN)6]在420nm的摩尔吸光系数为1020M-1cm-1。测定340nm吸光值的降低，确定NADH类似物的消耗，结果如表3所示，酶活以每分钟每摩尔酶催化产物生成或底物消耗的摩尔数，单位mol(mol enzyme)-1min-1。
采用50mM，pH 7.0的磷酸钾缓冲体系，100μL的反应体系组成为：10μM细胞色素c、10μM NADH类似物、10nM NADH类似物依赖型细胞色素P450还原酶(BMR-R967D/K973S、BMR-R967D/K973S/Q977F、BMR-R967D/K973S/Q977F/W1047S)，30℃反应，测定550nm吸光值确定还原型细胞色素c的生成，还原型细胞色素c的摩尔吸光系数为21.1mM-1cm-1。测定340nm吸光值的降低，确定NADH类似物的消耗，结果如表3所示，酶活以每分钟每摩尔酶催化产物生成或底物消耗的摩尔数，单位mol(mol enzyme)-1min-1。
以野生型BMR以及不加酶或不加NADH类似物为对照，发现不加酶或不加NADH类似物时均没有K3[Fe(CN)6]和细胞色素c的还原。野生型BMR为催化剂时只有微量K3[Fe(CN)6]和细胞色素c的还原活性。而NADH类似物依赖型细胞色素P450还原酶BMR-R967D/K973S、BMR-R967D/K973S/Q977F、BMR-R967D/K973S/Q977F/W1047S，利用不同的NADH类似物时，对K3[Fe(CN)6]和细胞色素c的还原活性均较高，但不同NADH类似物依赖型细胞色素P450还原酶对不同NADH类似物的催化活性不同。
表3 NADH类似物依赖型细胞色素P450还原酶对NADH类似物的酶活
Figure BDA0001879572140000121
Figure BDA0001879572140000131
实施例6：融合的NADH类似物依赖型细胞色素P450酶与再生酶偶联的催化体系。
采用50mM，pH 8.0的MES缓冲液体系，500μL的反应体系组成为：1mM美伐他汀、0.1mM NAD类似物(NCD、NUD或NTD)、4mM的再生底物亚磷酸和10U的再生酶(亚磷酸脱氢酶PDH-I151R)，0.1mg/mL NADH类似物依赖型细胞色素P450酶(CYP105A3-(GGGGS)2-BMR-R967D/Q977F/W1047S、CYP105A3-(GGGGS)4-BMR-R967D/Q1005H/W1047S、CYP105A3-(GGGGS)6-BMR-R967D/K973S/Q977F/W1047S)，美伐他汀用DMSO助溶，DMSO体积分数不超过5％，37℃反应24h，500μL反应液中加入100μL的1M HCl和1mL的甲基叔丁基醚(MTBE)，200rpm震荡1h后，有机相用0.22μm有机滤膜过滤，经HPLC分析，结果如表4所示。以游离存在的CYP105A3和野生型BMR以及不加再生酶或再生底物为对照，发现不加再生酶或不加再生底物时均没有产物普伐他汀的生成。游离存在的CYP105A3和野生型BMR配对体系中只有微量产物普伐他汀的生成。而融合的CYP105A3-(GGGGS)2-BMR-R967D/Q977F/W1047S、CYP105A3-(GGGGS)4-BMR-R967D/Q1005H/W1047S、CYP105A3-(GGGGS)6-BMR-R967D/K973S/Q977F/W1047S利用不同的NADH类似物时，美伐他汀的转化率均较高。
表4 NADH类似物依赖型细胞色素P450酶与再生酶的偶联催化结果
Figure BDA0001879572140000132
Figure BDA0001879572140000141
实施例7：融合的NADH类似物依赖型细胞色素P450酶与再生酶偶联的催化体系。
采用50mM，pH 8.0的MES缓冲液体系，500μL的反应体系组成为：1mM肉豆蔻酸、0.1mM NAD类似物(NCD、NUD或NTD)、4mM的再生底物亚磷酸和10U的再生酶(亚磷酸脱氢酶PDH-I151R)，0.1mg/mL NADH类似物依赖型细胞色素P450酶[(CYP102A1res.1-450)-(BM3res.451-470)-BMR-R967D/Q977F/W1047S、(CYP102A1res.1-450)-(BM3res.451-470)-BMR-R967D/Q1005H/W1047S、(CYP102A1res.1-450)-(BM3res.451-470)-BMR-R967D/K973S/Q977F/W1047S]，肉豆蔻酸用DMSO助溶，DMSO体积分数不超过5％，37℃反应24h，500μL反应液中加入100μL的1M HCl和1mL的甲基叔丁基醚(MTBE)，200rpm震荡1h后，有机相用0.22μm有机滤膜过滤，经HPLC分析，结果如表5所示。以野生型CYP102A1及不加再生酶或再生底物为对照，发现不加再生酶或不加再生底物时均没有ω-羟基肉豆蔻酸的生成。而(CYP102A1res.1-450)-(BM3res.451-470)-BMR-R967D/Q977F/W1047S、(CYP102A1res.1-450)-(BM3res.451-470)-BMR-R967D/Q1005H/W1047S、(CYP102A1res.1-450)-(BM3res.451-470)-BMR-R967D/K973S/Q977F/W1047S利用不同的NADH类似物时，肉豆蔻酸羟基化的转化率均较高。
表5 NADH类似物依赖型细胞色素P450酶与再生酶的偶联催化结果
Figure BDA0001879572140000142
Figure BDA0001879572140000151
实施例8：融合的NADH类似物依赖型细胞色素P450酶与再生酶偶联的催化体系。
采用50mM，pH 8.0的MES缓冲液体系，500μL的反应体系组成为：1mM7-乙氧基香豆素、0.1mM NAD类似物(NCD、NUD或NTD)、4mM的再生底物亚磷酸和10U的再生酶(亚磷酸脱氢酶PDH-I151R)，0.1mg/mL NADH类似物依赖型细胞色素P450酶[(P450RhF res.1-444)-(GGGGS)2-BMR-R967D/Q977F/W1047S、(P450RhF res.1-444)-(GGGGS)4-BMR-R967D/Q1005H/W1047S、(P450RhF res.1-444)-(GGGGS)6-BMR-R967D/K973S/Q977F/W1047S]，7-乙氧基香豆素用DMSO助溶，DMSO体积分数不超过5％，37℃反应24h，500μL反应液中加入100μL的1MHCl和1mL的甲基叔丁基醚(MTBE)，200rpm震荡1h后，有机相用0.22μm有机滤膜过滤，经HPLC分析，结果如表6所示。以游离存在的CYP105A3和野生型BMR以及不加再生酶或再生底物为对照，发现不加再生酶或不加再生底物时均没有产物7-羟基香豆素的生成。游离存在的(P450RhF res.1-444)和野生型BMR配对体系中只有微量产物7-羟基香豆素的生成。而融合的(P450RhF res.1-444)-(GGGGS)2-BMR-R967D/Q977F/W1047S、(P450RhF res.1-444)-(GGGGS)4-BMR-R967D/Q1005H/W1047S、(P450RhF res.1-444)-(GGGGS)6-BMR-R967D/K973S/Q977F/W1047S利用不同的NADH类似物时，美伐他汀的转化率均较高。
表6 NADH类似物依赖型细胞色素P450酶与再生酶的偶联催化结果
Figure BDA0001879572140000161
实施例9：NADH类似物依赖型细胞色素P450酶介导的微生物细胞催化C12-C18脂肪酸β-羟基化。
将NADH类似物依赖型细胞色素P450酶、再生NADH类似物的再生酶和NAD类似物转运蛋白同时在宿主中表达，形成一种依赖NADH类似物的生物催化体系。当培养基中的再生底物和NAD类似物进入宿主细胞后，启动该生物催化体系。因此，应用NADH类似物依赖型细胞色素P450酶将不依赖胞内NADPH水平，可利用胞外再生底物还原力选择性传递到脂肪酸羟基化反应中去，实现P450酶的能量消耗与内源NADPH供给解耦联。
下面以大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)为宿主菌，构建催化脂肪酸羟基化的工程菌株为例予以说明。
NAD转运蛋白AtNDT2(Accession NO.NC_003070)具有较宽泛的底物谱(PalmieriF,et al.Molecular identification and functional characterization ofarabidopsis thaliana mitochondrial and chloroplastic NAD carrier proteins.JBiol Chem,2009,284,31249-31259)，可以转运NCD。将表达转运蛋白的AtNDT2的基因由gapAP1启动子(Charpentier B,et al.The Escherichia coli gapA gene istranscribed by polymerase holoenzyme Eσ70and by the RNA polymerase Eσ32.JBacteriol,1994,176,830-839)控制表达。将编码CYP152A1-(BM3res.451-470)-BMR-R967D/Q977F/W1047S的基因和编码D-乳酸脱氢酶DLDH-V152R的基因，由异丙基硫代半乳糖(IPTG)诱导的lac启动子控制，将上述三种表达盒通过替换pUC18的LacZ基因克隆到同一质粒获得工程质粒。
将上述工程质粒导入E.coli BL21(DE3)获得工程菌株E.coli LQ 001。在LB培养基中诱导工程菌株E.coli LQ 001表达上述三种功能蛋白，培养基中添加100μg/mL氨苄青霉素、1mM的IPTG，在25℃、200rpm的摇床中培养48h至菌体密度OD600nm为4.5，2000×g离心6min收集菌体。
用pH 7.5的MOPS培养基洗涤重悬菌体，将菌体密度OD600nm调整到9。上述工程菌悬液中加入5mM脂肪酸(C12-C18)、5％DMSO助溶、10mM D-乳酸钠、0.1mM的NCD，总体积1mL，在30℃，200rpm摇床中反应4h，取500μL加入100μL的1M HCl和1mL的甲基叔丁基醚(MTBE)，200rpm震荡1h后，有机相用0.22μm有机滤膜过滤，取150μL加入50μL硅烷化试剂N-甲基-N-三甲基硅烷基三氟乙酰胺(MSTFA)衍生化后经GC分析，各种脂肪酸羟基化的转化率分别为：51.2％(C12:0)；43.5％(C14:0)；48.5％(C16:0)；56.7％(C18:0)。
在不添加NCD的对照实验中，脂肪酸转化率分别为：4.2％(C12:0)；3.8％(C14:0)；2.8％(C16:0)；3.2％(C18:0)。
实验结果表明在全细胞催化过程中，NADH类似物依赖型细胞色素P450酶CYP152A1-(BM3res.451-470)-BMR-R967D/Q977F/W1047S利用乳酸脱氢酶DLDH-V152R氧化D-乳酸钠生成的NCDH，催化脂肪酸β-羟基化。
实施例10：NADH类似物依赖型细胞色素P450酶介导的微生物细胞催化C12-C18脂肪酸α-羟基化。
将NADH类似物依赖型细胞色素P450酶、再生NADH类似物的再生酶和NAD类似物转运蛋白同时在宿主中表达，形成一种依赖NADH类似物的生物催化体系。当培养基中的再生底物和NAD类似物进入宿主细胞后，启动该生物催化体系。因此，应用NADH类似物依赖型细胞色素P450酶将不依赖胞内NADPH水平，可利用胞外再生底物还原力选择性传递到脂肪酸羟基化反应中去，实现P450酶的能量消耗与内源NADPH供给解耦联。
下面以大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)为宿主菌，构建催化脂肪酸羟基化的工程菌株为例予以说明。
NAD转运蛋白AtNDT2(Accession NO.NC_003070)具有较宽泛的底物谱(PalmieriF,et al.Molecular identification and functional characterization ofarabidopsis thaliana mitochondrial and chloroplastic NAD carrier proteins.JBiol Chem,2009,284,31249-31259)，可以转运NUD。将表达转运蛋白的AtNDT2的基因由gapAP1启动子(Charpentier B,et al.The Escherichia coli gapA gene istranscribed by polymerase holoenzyme Eσ70and by the RNA polymerase Eσ32.JBacteriol,1994,176,830-839)控制表达。将编码CYP152B1-(GGGGS)3-BMR-R967D/Q1005H/W1047S的基因和编码苹果酸酶ME-L310R/Q401C的基因，由异丙基硫代半乳糖(IPTG)诱导的lac启动子控制，将上述三种表达盒通过替换pUC18的LacZ基因克隆到同一质粒获得工程质粒。
将上述工程质粒导入E.coli BL21(DE3)获得工程菌株E.coli LQ 002。在LB培养基中诱导工程菌株E.coli LQ 002表达上述三种功能蛋白，培养基中添加100μg/mL氨苄青霉素、1mM的IPTG，在25℃、200rpm的摇床中培养48h至菌体密度OD600nm为4.5，2000×g离心6min收集菌体。
用pH 7.5的MOPS培养基洗涤重悬菌体，将菌体密度OD600nm调整到9。上述工程菌悬液中加入5mM脂肪酸(C12-C18)、5％DMSO助溶、10mM L-苹果酸、0.1mM的NUD，总体积1mL，在30℃，200rpm摇床中反应4h，取500μL加入100μL的1M HCl和1mL的甲基叔丁基醚(MTBE)，200rpm震荡1h后，有机相用0.22μm有机滤膜过滤，取150μL加入50μL硅烷化试剂N-甲基-N-三甲基硅烷基三氟乙酰胺(MSTFA)衍生化后经GC分析，各种脂肪酸羟基化的转化率分别为：63.4％(C12:0)；54.7％(C14:0)；49.4％(C16:0)；50.5％(C18:0)。
在不添加NUD的对照实验中，脂肪酸转化率分别为：4.8％(C12:0)；5.4％(C14:0)；4.3％(C16:0)；5.1％(C18:0)。
实验结果表明在全细胞催化过程中，NADH类似物依赖型细胞色素P450酶CYP152B1-(GGGGS)3-BMR-R967D/Q1005H/W1047S利用苹果酸酶ME-L310R/Q401C再生的NUDH，催化脂肪酸α-羟基化。
实施例11：NADH类似物依赖型细胞色素P450酶介导的微生物细胞催化C12-C18脂肪酸脱羧。
将NADH类似物依赖型细胞色素P450酶、再生NADH类似物的再生酶和NAD类似物转运蛋白同时在宿主中表达，形成一种依赖NADH类似物的生物催化体系。当培养基中的再生底物和NAD类似物进入宿主细胞后，启动该生物催化体系。因此，应用NADH类似物依赖型细胞色素P450酶将不依赖胞内NADPH水平，可利用胞外再生底物还原力选择性传递到脂肪酸羟基化反应中去，实现P450酶的能量消耗与内源NADPH供给解耦联。
下面以改造大肠杆菌Escherichia coli XZ654(Zhang X,et al.L-malateproduction by metabolically engineered Escherichia coli.Appl EnvironMicrobiol,2011,77,427-434)，构建生产催化脂肪酸羟基化的工程菌株为例予以说明。
NAD转运蛋白NTT4(Haferkamp I，et al.A candidate NAD+transporter in anintracellular bacterial symbiont related to Chlamydiae.Nature,2004,432,622-625.),可以转运NTD。将表达转运蛋白的NTT4的基因由gapAP1启动子(Charpentier B,etal.The Escherichia coli gapA gene is transcribed by polymerase holoenzyme Eσ70and by the RNA polymerase Eσ32.J Bacteriol,1994,176,830-839)控制表达。将编码CYP105A3-(GGGGS)5-BMR-R967D/K973S/Q977F/W1047S的基因和编码苹果酸酶ME-L310R/Q401C的基因，由异丙基硫代半乳糖(IPTG)诱导的lac启动子控制，将上述三种表达盒通过替换pUC18的LacZ基因克隆到同一质粒获得工程质粒。
将上述工程质粒导入E.coli XZ654获得工程菌株E.coli LQ 003。在LB培养基中诱导工程菌株E.coli LQ 003表达上述三种功能蛋白，培养基中添加100μg/mL氨苄青霉素、1mM的IPTG，在25℃、200rpm的摇床中培养48h至菌体密度OD600nm为4.5，2000×g离心6min收集菌体。
用pH 7.5的MOPS培养基洗涤重悬菌体，将菌体密度OD600nm调整到9。上述工程菌悬液中加入5mM脂肪酸(C12-C18)、5％DMSO助溶、10mM L-苹果酸、0.1mM的NTD，总体积1mL，在30℃，200rpm摇床中反应4h，取500μL加入100μL的1M HCl和1mL的甲基叔丁基醚(MTBE)，200rpm震荡1h后，有机相用0.22μm有机滤膜过滤，取150μL加入50μL硅烷化试剂N-甲基-N-三甲基硅烷基三氟乙酰胺(MSTFA)衍生化后经GC分析，各种脂肪酸羟基化的转化率分别为：65.3％(C12:0)；68.8％(C14:0)；63.4％(C16:0)；56.9％(C18:0)。
在不添加NTD的对照实验中，脂肪酸转化率分别为：4.2％(C12:0)；5.4％(C14:0)；4.6％(C16:0)；5.1％(C18:0)。
实验结果表明在全细胞催化过程中，NADH类似物依赖型细胞色素P450酶CYP105A3-(GGGGS)5-BMR-R967D/K973S/Q977F/W1047S利用苹果酸酶ME-L310R/Q401C再生的NTDH，催化脂肪酸羟基化。
实施例12：NADH类似物依赖型细胞色素P450酶介导的透性化乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)AS1.2829细胞催化2-金刚烷酮羟基化。
将NADH类似物依赖型细胞色素P450酶、再生NADH类似物的再生酶和NAD类似物转运蛋白同时在宿主中表达，形成一种依赖NADH类似物的生物催化体系。当培养基中的再生底物和NAD类似物进入宿主细胞后，启动该生物催化体系。
将编码CYP101A1-(GGGGS)5-BMR-R967D/Q977F/W1047S的基因和编码甲酸脱氢酶FDH-G171Y的基因，由组成型启动子P32控制，将上述两种表达盒通过替换pMG36e的P32表达盒(GUCHTE MV,et al.Construction of a lactococcal expression vector:expressionof hen egg white lysozyme in Lactococcus lactis subsp.Lactis.Appl EnvironMicrobiol,1989,55,224-228.)获得工程质粒。
将上述工程质粒导入乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)AS1.2829获得工程菌株L.lactis LQ 004。在LB培养基中诱导工程菌株L.lactis LQ 004表达上述两种功能蛋白，培养基中添加100μg/mL氨苄青霉素、1mM的IPTG，在25℃、200rpm的摇床中培养48h至菌体密度OD600nm为4.5，2000×g离心6min收集菌体。按文献方法使细胞透性化(Zhang W,etal.Bioreduction with efficient recycling of NADPH by coupled permeabilizedmicroorganisms.Appl Environ Microbiol,2009,75,687-694)，制备方式为：取5mL的冻存细胞在室温下水浴解冻，加入5mM的EDTA和体积比1％的甲苯，30℃、200rpm摇床中温浴30min，然后再在4℃放置1h。2000×g离心6min去除含有EDTA和甲苯的上清，用浓度50mM、pH7.5的Tris-Cl洗两遍后重悬于5mL的浓度为50mM、pH 7.5的Tris-Cl中，获得透性化细胞。
上述用50mM、pH 7.5的Tris-Cl重悬的透性化工程菌悬液中加入2mM 2-金刚烷酮、5％DMSO助溶、10mM甲酸钠、0.1mM的NCD，总体积1mL，在30℃，200rpm摇床中反应4h，取500μL加入1mL的甲基叔丁基醚(MTBE)，200rpm震荡1h后，有机相用0.22μm有机滤膜过滤，经HPLC分析，2-金刚烷酮羟基化的转化率为67.9％。在不添加NCD的对照实验中，2-金刚烷酮转化率4.1％。
实验结果表明在乳酸乳球菌全细胞催化过程中，NADH类似物依赖型细胞色素P450酶CYP101A1-(GGGGS)5-BMR-R967D/Q977F/W1047S利用甲酸脱氢酶FDH-G171Y再生的NCDH，催化2-金刚烷酮羟基化。
实施例13：NADH类似物依赖型细胞色素P450酶介导的透性化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY4741催化红霉素脱甲基化。
将NADH类似物依赖型细胞色素P450酶、再生NADH类似物的再生酶和NAD类似物转运蛋白同时在酿酒酵母细胞中表达，形成一种依赖NADH类似物的生物催化体系。当培养基中的再生底物和NAD类似物进入宿主细胞后，启动该生物催化体系。
将编码CYP3A4-(GGGGS)6-BMR-R967D/Q1005H/W1047S的基因和编码甲酸脱氢酶FDH-G171Y的基因，由TEF组成型启动子、CYC1终止子控制，将上述两种表达盒整合到p416酵母游离型穿梭表达载体获得工程质粒。
将上述工程质粒导入酿酒酵母获得工程菌株S.cerevisiae LQ 005。用pH 6.0的含有20g/L葡萄糖、10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨的YEPD培养基诱导工程菌S.cerevisiaeLQ 005表达上述两种功能蛋白，在25℃、200rpm的摇床中培养48h至菌体密度OD600nm为4.5，2000×g离心6min收集菌体，用浓度50mM、pH 7.5的Tris-Cl洗涤重悬菌体，将菌体密度OD600nm调整到9。参照实施例9方法使细胞透性化，获得透性化细胞，制备方式为：取5mL的冻存细胞在室温下水浴解冻，加入5mM的EDTA和体积比1％的甲苯，30℃、200rpm摇床中温浴30min，然后再在4℃放置1h。2000g离心6min去除含有EDTA和甲苯的上清，用浓度50mM、pH7.5的Tris-Cl洗两遍后重悬于5mL的浓度为50mM、pH 7.5的Tris-Cl中，获得透性化细胞。
上述用50mM、pH 7.5的Tris-Cl重悬的透性化工程菌悬液中加入5mM红霉素、5％DMSO助溶、10mM甲酸钠、0.1mM的NUD，总体积1mL，在30℃，200rpm摇床中反应4h，取500μL加入1mL的甲基叔丁基醚(MTBE)，200rpm震荡1h后，有机相用0.22μm有机滤膜过滤，经HPLC分析，红霉素脱甲基化的转化率为52.5％。在不添加NUD的对照实验中，红霉素转化率为3.4％。
实验结果表明在酿酒酵母全细胞催化过程中，NADH类似物依赖型细胞色素P450酶CYP3A4-(GGGGS)6-BMR-R967D/Q1005H/W1047S利用甲酸脱氢酶FDH-G171Y再生的NUDH，催化红霉素脱甲基化。
实施例14：NADH类似物依赖型细胞色素P450酶介导的透性化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY4741催化双氯酚酸4-羟基化。
将NADH类似物依赖型细胞色素P450酶、再生NADH类似物的再生酶和NAD类似物转运蛋白同时在酿酒酵母细胞中表达，形成一种依赖NADH类似物的生物催化体系。当培养基中的再生底物和NAD类似物进入宿主细胞后，启动该生物催化体系。
将编码CYP2C9-(GGGGS)6-BMR-R967D/Q1005H/W1047S的基因和编码苹果酸酶ME-L310R/Q401C的基因，由TEF组成型启动子、CYC1终止子控制，将上述两种表达盒整合到p416酵母游离型穿梭表达载体获得工程质粒。
将上述工程质粒导入酿酒酵母获得工程菌株S.cerevisiae LQ 006。用pH 6.0的含有20g/L葡萄糖、10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨的YEPD培养基诱导工程菌S.cerevisiaeLQ 006表达上述两种功能蛋白，在25℃、200rpm的摇床中培养48h至菌体密度OD600nm为4.5，2000×g离心6min收集菌体，用浓度50mM、pH 7.5的Tris-Cl洗涤重悬菌体，将菌体密度OD600nm调整到9。参照实施例9方法使细胞透性化，获得透性化细胞，制备方式为：取5mL的冻存细胞在室温下水浴解冻，加入5mM的EDTA和体积比1％的甲苯，30℃、200rpm摇床中温浴30min，然后再在4℃放置1h。2000g离心6min去除含有EDTA和甲苯的上清，用浓度50mM、pH7.5的Tris-Cl洗两遍后重悬于5mL的浓度为50mM、pH 7.5的Tris-Cl中，获得透性化细胞。
上述用50mM、pH 7.5的Tris-Cl重悬的透性化工程菌悬液中加入1mM双氯酚酸、5mML-苹果酸、0.1mM的NCD，总体积1mL，在30℃，200rpm摇床中反应4h，加入0.2mL冰浴冷甲醇，13000g离心5min，取500μL有机相用0.22μm有机滤膜过滤，经HPLC分析，双氯酚酸羟基化的转化率为63.8％。在不添加NCD的对照实验中，双氯酚酸转化率为2.8％。
实验结果表明在酿酒酵母全细胞催化过程中，NADH类似物依赖型细胞色素P450酶CYP2C9-(GGGGS)6-BMR-R967D/Q1005H/W1047S利用苹果酸酶ME-L310R/Q401C再生的NCDH，催化双氯酚酸羟基化。
实施例15：NADH类似物依赖型细胞色素P450酶介导的透性化里氏木霉(Trichoderma reesei)细胞催化奥美拉唑羟基化。
将NADH类似物依赖型细胞色素P450酶、再生NADH类似物的再生酶和NAD类似物转运蛋白同时在里氏木霉细胞中表达，形成一种依赖NADH类似物的生物催化体系。当培养基中的再生底物和NAD类似物进入宿主细胞后，启动该生物催化体系。
将编码CYP2C19-(BM3res.451-470)-BMR-R967D/K973S/Q977F/W1047S的基因和编码甲酸脱氢酶FDH-G171Y的基因，由启动子Pcbh1和终止子Tcbh1控制，将上述两种表达盒整合到pCAMBIA1300载体上获得工程质粒。
将上述工程质粒导入里氏木霉获得工程菌株T.reesei LQ 007。用pH 4.8的含有15g/L乳糖、10g/L酵母提取物、1g/L(NH4)2SO4、3g/L的KH2PO4、0.5g/L的MgSO4、0.6g/L的CaCl2、0.05g/L的FeSO4·7H2O、0.0016g/L的MnSO4·H2O、0.0014g/L的ZnSO4·7H2O、0.0037g/L的C℃l2·6H2O的培养基诱导工程菌T.reesei LQ 007表达上述两种功能蛋白，在25℃、200rpm的摇床中培养48h，2000×g离心6min收集菌体，用浓度50mM、pH 7.5的Tris-Cl洗涤重悬菌体，将菌体密度调整到3g菌体干重/L。参照实施例9方法使细胞透性化，获得透性化细胞。
上述用50mM、pH 8.0的Tris-Cl重悬的透性化工程菌悬液中加入5mM奥美拉唑、5％DMSO助溶、10mM甲酸钠、0.1mM的NTD，总体积1mL，在30℃，200rpm摇床中反应4h，取500μL加入100μL的1M NaOH，用0.22μm滤膜过滤，经HPLC分析，奥美拉唑羟基化的转化率为60.2％。在不添加NTD的对照实验中，奥美拉唑转化率为3.6％
实验结果表明在里氏木霉全细胞催化过程中，NADH类似物依赖型细胞色素P450酶CYP2C19-(BM3res.451-470)-BMR-R967D/K973S/Q977F/W1047S利用甲酸脱氢酶FDH-G171Y再生的NTDH，催化奥美拉唑羟基化。
SEQ ID NO：1
CGCAAAAAGGCAGAAAACGCTCATAATACGCCGCTGCTTGTGCTATACGGTTCAAATATGGGAACAGCTGAAGGAACGGCGCGTGATTTAGCAGATATTGCAATGAGCAAAGGATTTGCACCGCAGGTCGCAACGCTTGATTCACACGCCGGAAATCTTCCGCGCGAAGGAGCTGTATTAATTGTAACGGCGTCTTATAACGGTCATCCGCCTGATAACGCAAAGCAATTTGTCGACTGGTTAGACCAAGCGTCTGCTGATGAAGTAAAAGGCGTTCGCTACTCCGTATTTGGATGCGGCGATAAAAACTGGGCTACTACGTATCAAAAAGTGCCTGCTTTTATCGATGAAACGCTTGCCGCTAAAGGGGCAGAAAACATCGCTGACCGCGGTGAAGCAGATGCAAGCGACGACTTTGAAGGCACATATGAAGAATGGCGTGAACATATGTGGAGTGACGTAGCAGCCTACTTTAACCTCGACATTGAAAACAGTGAAGATAATAAATCTACTCTTTCACTTCAATTTGTCGACAGCGCCGCGGATATGCCGCTTGCGAAAATGCACGGTGCGTTTTCAACGAACGTCGTAGCAAGCAAAGAACTTCAACAGCCAGGCAGTGCACGAAGCACGCGACATCTTGAAATTGAACTTCCAAAAGAAGCTTCTTATCAAGAAGGAGATCATTTAGGTGTTATTCCTCGCAACTATGAAGGAATAGTAAACCGTGTAACAGCAAGGTTCGGCCTAGATGCATCACAGCAAATCCGTCTGGAAGCAGAAGAAGAAAAATTAGCTCATTTGCCACTCGCTAAAACAGTATCCGTAGAAGAGCTTCTGCAATACGTGGAGCTTCAAGATCCTGTTACGCGCACGCAGCTTCGCGCAATGGCTGCTAAAACGGTCTGCCCGCCGCATAAAGTAGAGCTTGAAGCCTTGCTTGAAAAGCAAGCCTACAAAGAACAAGTGCTGGCAAAACGTTTAACAATGCTTGAACTGCTTGAAAAATACCCGGCGTGTGAAATGAAATTCAGCGAATTTATCGCCCTTCTGCCAAGCATACGCCCGCGCTATTACTCGATTTCTTCATCACCTCGTGTCGATGAAAAACAAGCAAGCATCACGGTCAGCGTTGTCTCAGGAGAAGCGTGGAGCGGATATGGAGAATATAAAGGAATTGCGTCGAACTATCTTGCCGAGCTGCAAGAAGGAGATACGATTACGTGCTTTATTTCCACACCGCAGTCAGAATTTACGCTGCCAAAAGACCCTGAAACGCCGCTTATCATGGTCGGACCGGGAACAGGCGTCGCGCCGTTTAGAGGCTTTGTGCAGGCGCGCAAACAGCTAAAAGAACAAGGACAGTCACTTGGAGAAGCACATTTATACTTCGGCTGCCGTTCACCTCATGAAGACTATCTGTATCAAGAAGAGCTTGAAAACGCCCAAAGCGAAGGCATCATTACGCTTCATACCGCTTTTTCTCGCATGCCAAATCAGCCGAAAACATACGTTCAGCACGTAATGGAACAAGACGGCAAGAAATTGATTGAACTTCTTGATCAAGGAGCGCACTTCTATATTTGCGGAGACGGAAGCCAAATGGCACCTGCCGTTGAAGCAACGCTTATGAAAAGCTATGCTGACGTTCACCAAGTGAGTGAAGCAGACGCTCGCTTATGGCTGCAGCAGCTAGAAGAAAAAGGCCGATACGCAAAAGACGTGTGGGCTGGGTAA
SEQ ID NO：2
RKKAENAHNTPLLVLYGSNMGTAEGTARDLADIAMSKGFAPQVATLDSHAGNLPREGAVLIVTASYNGHPPDNAKQFVDWLDQASADEVKGVRYSVFGCGDKNWATTYQKVPAFIDETLAAKGAENIADRGEADASDDFEGTYEEWREHMWSDVAAYFNLDIENSEDNKSTLSLQFVDSAADMPLAKMHGAFSTNVVASKELQQPGSARSTRHLEIELPKEASYQEGDHLGVIPRNYEGIVNRVTARFGLDASQQIRLEAEEEKLAHLPLAKTVSVEELLQYVELQDPVTRTQLRAMAAKTVCPPHKVELEALLEKQAYKEQVLAKRLTMLELLEKYPACEMKFSEFIALLPSIRPRYYSISSSPRVDEKQASITVSVVSGEAWSGYGEYKGIASNYLAELQEGDTITCFISTPQSEFTLPKDPETPLIMVGPGTGVAPFRGFVQARKQLKEQGQSLGEAHLYFGCRSPHEDYLYQEELENAQSEGIITLHTAFSRMPNQPKTYVQHVMEQDGKKLIELLDQGAHFYICGDGSQMAPAVEATLMKSYADVHQVSEADARLWLQQLEEKGRYAKDVW
序列表
<110> 中国科学院大连化学物理研究所
<120> 一种NADH类似物依赖型的细胞色素P450还原酶及其应用
<140> 2018114163731
<141> 2018-11-26
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1737
<212> DNA
<213> 巨大芽孢杆菌(Bacillus megatherium)
<400> 1
cgcaaaaagg cagaaaacgc tcataatacg ccgctgcttg tgctatacgg ttcaaatatg 60
ggaacagctg aaggaacggc gcgtgattta gcagatattg caatgagcaa aggatttgca 120
ccgcaggtcg caacgcttga ttcacacgcc ggaaatcttc cgcgcgaagg agctgtatta 180
attgtaacgg cgtcttataa cggtcatccg cctgataacg caaagcaatt tgtcgactgg 240
ttagaccaag cgtctgctga tgaagtaaaa ggcgttcgct actccgtatt tggatgcggc 300
gataaaaact gggctactac gtatcaaaaa gtgcctgctt ttatcgatga aacgcttgcc 360
gctaaagggg cagaaaacat cgctgaccgc ggtgaagcag atgcaagcga cgactttgaa 420
ggcacatatg aagaatggcg tgaacatatg tggagtgacg tagcagccta ctttaacctc 480
gacattgaaa acagtgaaga taataaatct actctttcac ttcaatttgt cgacagcgcc 540
gcggatatgc cgcttgcgaa aatgcacggt gcgttttcaa cgaacgtcgt agcaagcaaa 600
gaacttcaac agccaggcag tgcacgaagc acgcgacatc ttgaaattga acttccaaaa 660
gaagcttctt atcaagaagg agatcattta ggtgttattc ctcgcaacta tgaaggaata 720
gtaaaccgtg taacagcaag gttcggccta gatgcatcac agcaaatccg tctggaagca 780
gaagaagaaa aattagctca tttgccactc gctaaaacag tatccgtaga agagcttctg 840
caatacgtgg agcttcaaga tcctgttacg cgcacgcagc ttcgcgcaat ggctgctaaa 900
acggtctgcc cgccgcataa agtagagctt gaagccttgc ttgaaaagca agcctacaaa 960
gaacaagtgc tggcaaaacg tttaacaatg cttgaactgc ttgaaaaata cccggcgtgt 1020
gaaatgaaat tcagcgaatt tatcgccctt ctgccaagca tacgcccgcg ctattactcg 1080
atttcttcat cacctcgtgt cgatgaaaaa caagcaagca tcacggtcag cgttgtctca 1140
ggagaagcgt ggagcggata tggagaatat aaaggaattg cgtcgaacta tcttgccgag 1200
ctgcaagaag gagatacgat tacgtgcttt atttccacac cgcagtcaga atttacgctg 1260
ccaaaagacc ctgaaacgcc gcttatcatg gtcggaccgg gaacaggcgt cgcgccgttt 1320
agaggctttg tgcaggcgcg caaacagcta aaagaacaag gacagtcact tggagaagca 1380
catttatact tcggctgccg ttcacctcat gaagactatc tgtatcaaga agagcttgaa 1440
aacgcccaaa gcgaaggcat cattacgctt cataccgctt tttctcgcat gccaaatcag 1500
ccgaaaacat acgttcagca cgtaatggaa caagacggca agaaattgat tgaacttctt 1560
gatcaaggag cgcacttcta tatttgcgga gacggaagcc aaatggcacc tgccgttgaa 1620
gcaacgctta tgaaaagcta tgctgacgtt caccaagtga gtgaagcaga cgctcgctta 1680
tggctgcagc agctagaaga aaaaggccga tacgcaaaag acgtgtgggc tgggtaa 1737
<210> 2
<211> 578
<212> PRT
<213> 巨大芽孢杆菌(Bacillus megatherium)
<400> 2
Arg Lys Lys Ala Glu Asn Ala His Asn Thr Pro Leu Leu Val Leu Tyr
1 5 10 15
Gly Ser Asn Met Gly Thr Ala Glu Gly Thr Ala Arg Asp Leu Ala Asp
20 25 30
Ile Ala Met Ser Lys Gly Phe Ala Pro Gln Val Ala Thr Leu Asp Ser
35 40 45
His Ala Gly Asn Leu Pro Arg Glu Gly Ala Val Leu Ile Val Thr Ala
50 55 60
Ser Tyr Asn Gly His Pro Pro Asp Asn Ala Lys Gln Phe Val Asp Trp
65 70 75 80
Leu Asp Gln Ala Ser Ala Asp Glu Val Lys Gly Val Arg Tyr Ser Val
85 90 95
Phe Gly Cys Gly Asp Lys Asn Trp Ala Thr Thr Tyr Gln Lys Val Pro
100 105 110
Ala Phe Ile Asp Glu Thr Leu Ala Ala Lys Gly Ala Glu Asn Ile Ala
115 120 125
Asp Arg Gly Glu Ala Asp Ala Ser Asp Asp Phe Glu Gly Thr Tyr Glu
130 135 140
Glu Trp Arg Glu His Met Trp Ser Asp Val Ala Ala Tyr Phe Asn Leu
145 150 155 160
Asp Ile Glu Asn Ser Glu Asp Asn Lys Ser Thr Leu Ser Leu Gln Phe
165 170 175
Val Asp Ser Ala Ala Asp Met Pro Leu Ala Lys Met His Gly Ala Phe
180 185 190
Ser Thr Asn Val Val Ala Ser Lys Glu Leu Gln Gln Pro Gly Ser Ala
195 200 205
Arg Ser Thr Arg His Leu Glu Ile Glu Leu Pro Lys Glu Ala Ser Tyr
210 215 220
Gln Glu Gly Asp His Leu Gly Val Ile Pro Arg Asn Tyr Glu Gly Ile
225 230 235 240
Val Asn Arg Val Thr Ala Arg Phe Gly Leu Asp Ala Ser Gln Gln Ile
245 250 255
Arg Leu Glu Ala Glu Glu Glu Lys Leu Ala His Leu Pro Leu Ala Lys
260 265 270
Thr Val Ser Val Glu Glu Leu Leu Gln Tyr Val Glu Leu Gln Asp Pro
275 280 285
Val Thr Arg Thr Gln Leu Arg Ala Met Ala Ala Lys Thr Val Cys Pro
290 295 300
Pro His Lys Val Glu Leu Glu Ala Leu Leu Glu Lys Gln Ala Tyr Lys
305 310 315 320
Glu Gln Val Leu Ala Lys Arg Leu Thr Met Leu Glu Leu Leu Glu Lys
325 330 335
Tyr Pro Ala Cys Glu Met Lys Phe Ser Glu Phe Ile Ala Leu Leu Pro
340 345 350
Ser Ile Arg Pro Arg Tyr Tyr Ser Ile Ser Ser Ser Pro Arg Val Asp
355 360 365
Glu Lys Gln Ala Ser Ile Thr Val Ser Val Val Ser Gly Glu Ala Trp
370 375 380
Ser Gly Tyr Gly Glu Tyr Lys Gly Ile Ala Ser Asn Tyr Leu Ala Glu
385 390 395 400
Leu Gln Glu Gly Asp Thr Ile Thr Cys Phe Ile Ser Thr Pro Gln Ser
405 410 415
Glu Phe Thr Leu Pro Lys Asp Pro Glu Thr Pro Leu Ile Met Val Gly
420 425 430
Pro Gly Thr Gly Val Ala Pro Phe Arg Gly Phe Val Gln Ala Arg Lys
435 440 445
Gln Leu Lys Glu Gln Gly Gln Ser Leu Gly Glu Ala His Leu Tyr Phe
450 455 460
Gly Cys Arg Ser Pro His Glu Asp Tyr Leu Tyr Gln Glu Glu Leu Glu
465 470 475 480
Asn Ala Gln Ser Glu Gly Ile Ile Thr Leu His Thr Ala Phe Ser Arg
485 490 495
Met Pro Asn Gln Pro Lys Thr Tyr Val Gln His Val Met Glu Gln Asp
500 505 510
Gly Lys Lys Leu Ile Glu Leu Leu Asp Gln Gly Ala His Phe Tyr Ile
515 520 525
Cys Gly Asp Gly Ser Gln Met Ala Pro Ala Val Glu Ala Thr Leu Met
530 535 540
Lys Ser Tyr Ala Asp Val His Gln Val Ser Glu Ala Asp Ala Arg Leu
545 550 555 560
Trp Leu Gln Gln Leu Glu Glu Lys Gly Arg Tyr Ala Lys Asp Val Trp
565 570 575
Ala Gly

Claims (10)

1.一种NADH类似物依赖型的细胞色素P450还原酶，其特征在于：
细胞色素P450还原酶来源于巨大芽孢杆菌Bacillus megatherium的P450 BM3的含黄素单核苷酸和黄素腺嘌呤二核苷酸的P450还原酶结构域BMR， 即P450 BM3从第471位到第1048位氨基酸序列，编码基因为SEQ ID NO：1所示的基因序列，为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；
NADH类似物依赖型的细胞色素P450还原酶为在BMR基础上经基因工程改造获得的多位点突变体，突变位点选自BMR-R967D/K973S、BMR-R967D/K973S/Q977F、BMR-R967D/K973S/Q1005H、BMR-R967D/Q977F/W1047S、BMR-R967D/Q1005H/W1047S、BMR-R967D/K973S/W1047S或BMR-R967D/K973S/Q977F/W1047S。
2.根据权利要求1所述的NADH类似物依赖型细胞色素P450还原酶，其特征在于：
1）NADH类似物依赖型细胞色素P450还原酶以NADH类似物为辅因子；
2）NADH类似物依赖型细胞色素P450还原酶利用NADH类似物催化还原K3[Fe(CN)6]或细胞色素c；
3）NADH类似物依赖型细胞色素P450还原酶可与不同类型细胞色素P450酶融合构建NADH类似物依赖的自给自足的细胞色素P450酶；
NADH类似物依赖的自给自足的细胞色素P450酶的催化过程为：NADH类似物依赖型细胞色素P450还原酶将NADH类似物的两个电子，逐个传递到细胞色素P450酶的血红素催化活性中心，使细胞色素P450酶完成对底物的催化转化。
3.根据权利要求1或2所述NADH类似物依赖型的细胞色素P450还原酶，其特征在于：NADH类似物为NCDH、NTDH或NUDH中的一种或两种以上，其化学结构如下：
Figure 10704DEST_PATH_IMAGE001
4.根据权利要求3所述的还原酶，其特征在于：NADH类似物NCDH、NTDH或NUDH是由酶法或化学法还原NCD、NTD或NUD而得，NCD、NTD或NUD的化学结构如下：
Figure 364324DEST_PATH_IMAGE002
或
Figure 772303DEST_PATH_IMAGE003
。
5.按照权利要求4所述的还原酶，其特征还在于：酶法还原NCD、NTD和NUD的再生酶为苹果酸酶ME-L310R/Q401C、D-乳酸脱氢酶DLDH-V152R、亚磷酸脱氢酶PDH-I151R或甲酸脱氢酶FDH-G171Y中的一种或两种以上；所述酶法还原NCD、NTD和NUD的再生酶对应再生底物为苹果酸化合物，亚磷酸化合物，D-乳酸化合物，甲酸化合物中的一种或两种以上；其中，苹果酸化合物为苹果酸、苹果酸盐中的一种或两种以上； D-乳酸化合物为D-乳酸、D-乳酸盐中的一种或两种以上；亚磷酸化合物为亚磷酸、亚磷酸盐中的一种或两种以上；甲酸化合物为甲酸、甲酸盐中的一种或两种以上；所述酶法再生NADH类似物的反应体系为pH 7.5的缓冲液中，NAD类似物1 mM-20 mM，再生酶10 U-500 U，再生底物4 mM-25 mM，20℃-40℃下反应20min-2 h，其中缓冲体系为磷酸盐、Tris-HCl、MES或HEPES缓冲液中的一种或两种以上；化学法还原NCD，NTD或NUD的反应体系为在水溶液中，以Na2S2O4、NaBH4、NaBH(Et)3、NaBH3CN中的一种或两种以上的任意组合为还原剂，其中NAD类似物与还原剂的比例为1：2-4，
20℃-40℃下反应20 min - 2 h。
6.如权利要求1-5任一所述的NADH类似物依赖型的细胞色素P450还原酶的应用，其特征在于：所述的NADH类似物依赖型细胞色素P450还原酶与细胞色素P450酶通过连接肽融合表达的构建NADH类似物依赖的、杂合的、自给自足型细胞色素P450酶，其中连接肽为P450BM3的第451-470位的氨基酸序列或(G4S)n，其中n为2-6的整数。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：与NADH类似物依赖型的细胞色素P450还原酶融合的细胞色素P450酶为Class I细胞色素P450酶、Class II类的细胞色素P450酶、Class IIIP450结构域、或Class IV类的P450结构域中的一种或两种以上，其中Class I类P450酶为CYP101A1、CYP105A3、CYP152A1、CYP152B1、CYP152L1中的一种或两种以上；ClassII类P450酶为CYP3A4、CYP2C19、CYP2C9中的一种或两种以上；Class III类P450酶结构域为CYP102A1的第1位到第450位氨基酸序列；Class IV类P450酶结构域包括但不限于P450RhF的第1位到第444位氨基酸序列，其中Class I类P450酶对应底物为D-莰酮、美伐他汀、C12-C20饱和脂肪酸；Class II类P450酶对应底物为红霉素、奥美拉唑、双氯酚酸中的一种或两种以上，Class III类P450酶对应底物为C12-C20饱和脂肪酸；Class IV类P450酶对应底物为7-乙氧基香豆素。
8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于：NADH类似物依赖的杂合的自给自足型细胞色素P450酶，在pH 5-9缓冲体系中，与再生NADH类似物的苹果酸酶ME-L310R/Q401C、D-乳酸脱氢酶DLDH-V152R、亚磷酸脱氢酶PDH-I151R或甲酸脱氢酶FDH-G171Y及对应再生底物偶联，利用NAD类似物完成底物的催化转化，其中，缓冲体系包括但不限于磷酸盐、Tris-HCl、MES或HEPES缓冲液中的一种或两种以上；
NADH类似物为NCDH、NTDH或NUDH中的一种或两种以上，其化学结构如下：
Figure 767941DEST_PATH_IMAGE001
9.按照权利要求8所述的应用，其特征在于：所述NADH类似物依赖的杂合的自给自足型细胞色素P450酶、与来源于衣原体的NTT4或来源于拟南芥的AtNDT2蛋白以及再生NADH类似物的苹果酸酶ME-L310R/Q401C、D-乳酸脱氢酶DLDH-V152R、亚磷酸脱氢酶PDH-I151R或甲酸脱氢酶FDH-G171Y的一种或两种以上在微生物细胞内共表达，通过微生物细胞催化脂肪酸生产ω-羟基脂肪酸；其中NAD类似物通过来源于衣原体的NTT4或来源于拟南芥的AtNDT2蛋白转运至胞内。
10.按照权利要求9所述的应用，其特征还在于：所述表达NADH类似物依赖型的细胞色素P450酶并用于胞内催化脂肪酸羟基化的微生物细胞为原核微生物中的大肠杆菌，乳酸乳球菌；真核微生物中的酿酒酵母，里氏木霉中的一种或两种以上。
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