KR20190088648A - 에탄올에서 부탄디올의 생산방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 에탄올에서 부탄디올의 생산방법 및 이의 다양한 적용에 관한 것이다. 본 발명의 에탄올에서 부탄디올 생산 방법은, 효소로서 NOX, EtDH, FLS, BDH의 단백질과 이의 변이체 단백질을 다단계 촉매활성이 나타나도록 인공 합성 경로를 디자인하여 무-세포(cell-free) 촉매 방법을 이용하였다. 본 발명의 부탄디올 생산 방법은 종래 미생물 이용 발효법과 비교하여 세포 생장이 필요하지 않고, 짧은 합성 경로, 빠른 반응 속도, 높은 수율 및 생산성, 목적으로 하는 반응 조건의 조절이 용이하여, 효과적으로 부탄디올을 생산할 수 있다. 또한, 상기 단백질을 나노입자에 고정하여 다 수의 재사용이 가능하고 부탄디올 생성에도 효과적이므로 경제적이다. 따라서, 유효 성분으로서 부탄디올이 요구되는 관련 산업에 유용하게 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 에탄올에서 부탄디올의 생산방법 및 이의 다양한 적용에 관한 것이다.
화석연료들의 사용은 지구온난화 가스 및 폐기물을 대량생산하여 인류에게 심각한 환경적인 위기를 초래하고 있다. 화석연료로부터 생산되어지는 화학공업을 대체할 수 있는, 즉 인류에게 유해한 폐기물의 생산 및 에너지 소비를 최소화할 수 있는 바이오매스를 원료로 사용하는 환경 친화적인 새로운 생물 공정의 개발이 필요하다. 바이오에너지로 대표되는 바이오에탄올, 바이오디젤, 바이오가스, 부탄디올에 대한 관심이 증가하고 있지만, 언급된 종류의 바이오에너지 모두 전력생산이나 수송용 연료로 사용될 수 있으나, 실적용 및 생산 방법의 몇몇 단점으로 인해 새로운 신재생에너지 자원인 탄화수소(hydrocarbon) 형태의 화합물에 대한 관심이 증가되고 있다.
2,3-부탄다이올의 3 가지 이성질체들의 혼합물을 생합성한다. meso-2,3-부탄다이올의 이성질체로는 (R,R)-, meso- 및 (S,S)- 형태의 이성질체가 존재한다. 이러한 이성질체의 생합성 비율은 유전자 및 배양 환경 등에 의해서 매우 급격하게 변화되는 것을 볼 수 있다.
meso-2,3-부탄다이올은 용매, 부동액(anti-freeze solution) 및 가소제(plasticizer)의 합성에 이용되는 화학물질이다. 화학적 전환을 통해 합성고무 제조에 사용되는 부타디엔(1,3-butadiene), 액체연료 첨가제(liquid fuel additive)인 MEK(methyl ethyl ketone) 및 식품 첨가제 향료로써 사용되는 아세토인(acetoin), 디아세틸(diacetyl) 및 폴리우레탄의 전구체 등의 생산이 가능하다.
meso-2,3-부탄다이올은 생물학적 방법으로 생산이 가능하며, 2차 세계대전 당시 상업적 규모로 개발되었다가, 최근 산업바이오 기술 개발과 함께 다시 관심을 받고 있다. meso-2,3-부탄다이올은 혼합산 발효(mixed acid fermentation) 대사경로를 통해 생산되며 균주와 탄소원에 따라서 다양한 생산 양산을 보여준다. 글루코오즈를 탄소원으로 이용하는 경우, 피부르산염(pyruvate) 및 아세토인(acetoin)을 거쳐 meso-2,3-부탄다이올이 생산되거나 다이아세틸(diacetyl)을 거치는 부탄다이오 순환을 통해 meso-2,3-부탄다이올이 생산되는 선택적 경로를 갖고 있다.
미생물을 이용하여 산업적으로 유용한 수준으로 부탄디올을 생산하기 위하여는 발효 과정을 수행하여야 하며, 부탄디올의 선택성, 수율 및 생산성, 즉 단위시간 당 부탄디올의 생산량 모두가 우수하여야 하고, 이와 같은 조건을 만족하는 미생물을 발굴하기 위해서는 과도한 반복 실험이 요구되어 왔다.
본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 에탄올에서 부탄디올로의 효과적인 생산 방법에 대해 연구하던 중, 종래 미생물 발효법을 이용하지 않고 무-세포(Cell-free) 상에서 NOX, EtDH, FLS, BDH의 단백질 및 이의 변이체 단백질을 발굴하여 이를 효소로서 다단계 반응에 적용한 결과, 에탄올을 기질로 하는 부탄디올을 효과적으로 생산할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 FLS 변이 아미노산을 제공할 수 있다.
또한 본 발명의 목적은 상기 FLS 변이 아미노산을 코딩하는 유전자를 제공할 수 있다.
또한 본 발명의 목적은 재조합 벡터를 제공할 수 있다.
또한 본 발명의 목적은 상기 재조합 벡터가 도입된 형질전환 미생물을 제공할 수 있다.
또한 본 발명의 목적은 상기 형질전환 미생물에서 생산된 단백질을 정제하고 반응시키는 단계;를 포함하는 부탄디올 생산 방법을 제공할 수 있다.
또한 본 발명의 목적은 상기 형질전환 미생물에서 생산된 단백질을 나노입자에 고정하고 반응시키는 단계;를 포함하는 부탄디올 생산 방법을 제공할 수 있다.
상기 목적의 달성을 위해, 본 발명은 서열번호 8로 표시되는 FLS(formolase) 아미노산에서 482번째 루신이 세린, 아르기닌 및 글루탐산으로 치환된 변이로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 변이를 포함하는 FLS 변이 아미노산을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 FLS 변이 아미노산을 코딩하는 유전자를 제공한다.
또한 본 발명은 NOX(NADH oxidase) 유전자, EtDH(ethanol dehydrogenase) 유전자, EtDH의 변이체 유전자, FLS(formolase) 유전자, 상기 FLS 변이 아미노산을 코딩하는 유전자, BDH(2,3-butanediol dehydrogenase) 유전자 및 BDH의 변이체 유전자로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 재조합 벡터가 도입된 형질전환 미생물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 형질전환 미생물에서 생산된 단백질을 정제하고 반응시키는 단계;를 포함하는 부탄디올 생산 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 형질전환 미생물에서 생산된 단백질을 나노입자에 고정하고 반응시키는 단계;를 포함하는 부탄디올 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 에탄올에서 부탄디올 생산 방법은, 효소로서 NOX, EtDH, FLS, BDH의 단백질과 이의 변이체 단백질을 다단계 촉매활성이 나타나도록 인공 합성 경로를 디자인하여 무-세포(cell-free) 촉매 방법을 이용하였다. 본 발명의 부탄디올 생산 방법은 종래 미생물 이용 발효법과 비교하여 세포 생장이 필요하지 않고, 짧은 합성 경로, 빠른 반응 속도, 높은 수율 및 생산성, 목적으로 하는 반응 조건의 조절이 용이하여, 효과적으로 부탄디올을 생산할 수 있다. 또한, 상기 단백질을 나노입자에 고정하여 다 수의 재사용이 가능하고 부탄디올 생성에도 효과적이므로 경제적이다. 따라서, 유효 성분으로서 부탄디올이 요구되는 관련 산업에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1a는 본 발명의 최적 효소를 포함하는 무-세포 다중 촉매 시스템을 이용한 에탄올에서 아세토인의 생성 방법을 모식화한 도이다.
도 1b는 본 발명의 최적 효소를 포함하는 무-세포 다중 촉매 시스템을 이용한 에탄올에서 2,3-부탄디올의 생성 방법을 모식화한 도이다.
도 2a는 NOX 효소 단백질을 발현하는 벡터맵을 나타낸 도이다.
도 2b는 EtDH 효소 단백질을 발현하는 벡터맵을 나타낸 도이다.
도 2c는 EtDH:D46G 효소 단백질을 발현하는 벡터맵을 나타낸 도이다.
도 2d는 FLS:L482S 효소 단백질을 발현하는 벡터맵을 나타낸 도이다.
도 2e는 BDH:S119A 효소 단백질을 발현하는 벡터맵을 나타낸 도이다.
도 3은 EtDH, EtDH:D46G, BDH, BDH: S199A, NOX, FLS 단백질 발현을 확인한 도이다.
도 4는 FLS 효소에 따른 아세토인 생성을 VP 반응으로 확인한 도이다(A는 50 mM 아세트 알데히드, 0 시간; B는 100 mM 아세트알데히드, 0시간; C는 50 mM 아세트알데히드, 6 시간; D는 100 mM 아세트알데히드, 6시간).
도 5는 본 발명의 다단계 효소 및 이의 변이체를 이용한 아세토인, 2,3-부탄디올 생성을 키랄-칼럼 GC(Chiral-column GC) 분석한 결과이다(A는 표준 물질의 혼합물; B는 중간 생성물 아세트알데히드를 통한 에탄올에서 아세토인의 반응; C는 중간 생성물 아세트알데히드 및 아세토인을 통한 에탄올에서 2,3-부탄디올의 반응).
도 6은 본 발명의 각 효소의 열안정성(Thermostability)을 30, 37, 45도에서 확인한 도이다(1은 EtDH:D46G(에탄올, NAD+ 포함); 2는 EtDH:D46G (ethanol, NAD+ 포함); 3은 EtDH:D46G(에탄올, NADP+); 4는 FLS(아세트알데히드, TPP 포함); 5는 FLS:L482S(아세트알데히드, TPP); 6은 BDH:S199A(아세토인, NADPH 포함); 7은 BDH:S199A(부탄온, NADPH 포함); 8은 NOX (O2, NADH 포함)).
도 7a는 pH 조건(6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5 및 8.5)에 따른 에탄올에서 아세토인 생성 농도를 확인한 도이다.
도 7b는 온도(20, 25, 30, 37 및 42도)에 따른 에탄올에서 아세토인 생성 농도를 확인한 도이다.
도 7c는 NAD+(1, 2, 4, 6, 8 mM)에 따른 에탄올에서 아세토인 생성 농도를 확인한 도이다.
도 7d는 TPP(1, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 및 0.5 mM)에 따른 에탄올에서 아세토인 생성 농도를 확인한 도이다.
도 7e는 금속 이온(Mg2+, Mn2+, Ca2+, Fe2+, Ni2+, Cu2+ 및 Zn2+)에 따른 에탄올에서 아세토인 생성 농도를 확인한 도이다.
도 8은 최적 반응 조건하에 시간 조건에 따른 에탄올에서 아세토인의 생성을 확인한 도이다.
도 9는 에탄올에서 아세토인으로의 속도 조절 단계(Rate limiting step)를 확인한 도이다.
도 10은 FLS 아미노산 서열의 돌연변이 핫스팟을 분석한 도이다(A는 핫 스폿 예측의 결과; B는 FLS 효소의 구조 모델(파란색 : 기질 터널 포켓, 골든 활성 사이트 포켓, 적색 : FLS 효소의 높은 변이 가능한 잔기, 황색 : FLS 효소의 중간 변이 가능한 잔기).
도 11a는 FLS 및 이의 변이체의 아세토인 생성을 확인한 도이다.
도 11b는 FLS의 고유 활성(specific activity)과 비교하여 FLS 및 이의 변이체의 활성을 확인한 도이다.
도 12a는 기질인 아세트알데히드와 FLS의 활성 부위 잔기 W480간의 분자 상관관계를 확인한 도이다.
도 12b는 기질인 아세트알데히드와 FLS:L482S의 활성 부위 잔기 W480간의 분자 상관관계를 확인한 도이다.
도 12c는 기질인 아세트알데히드와 FLS의 100-ns 분자 역동 시뮬레이션을 확인한 도이다.
도 12d는 기질인 아세트알데히드와 FLS:L482S의 100-ns 분자 역동 시뮬레이션을 확인한 도이다.
도 13a는 시간 조건에 따른 기질인 에탄올에서 아세트알데히드 및 아세토인의 생성을 확인한 도이다.
도 13b는 기질인 에탄올의 농도에 따른 에탄올에서 아세트알데히드 및 아세토인의 생성을 확인한 도이다.
도 14은 PDB 데이터베이스를 이용하여 EtDH (CnMDH) 아미노산 서열을 정렬하여, NAD+ 및/또는 NADP+ 부위를 확인한 도이다.
도 15은 에탄올에서 2,3-부탄디올 생산을 위하여 NAD+ 및/또는 NADP+의 영향을 확인한 도이다.
도 16a는 시간 조건에 따른 기질인 에탄올에서 아세트알데히드, 아세토인 및 2,3-부탄디올의 생성을 확인한 도이다.
도 16b는 기질인 에탄올의 농도에 따른 아세트알데히드, 아세토인 및 2,3-부탄디올의 생성을 확인한 도이다.
도 17a는 에탄올에서 아세토인 생산을 위한 효소의 재순환성(Recyclability)을 확인한 도이다(에탄올(■), 아세트알데히드(▲), 아세토인(●)).
도 17b는 에탄올에서 아세토인 생산을 위하여 고정된 효소의 재사용성(Reusability)을 확인한 도이다.
도 17c는 에탄올에서 2,3-부탄디올 생산을 위한 효소의 재순환성(Recyclability)을 확인한 도이다(에탄올(■), 아세트알데히드(▲), 아세토인(●), 2,3-부탄디올 (▼)).
도 17d는 에탄올에서 2,3-부탄디올 생산을 위하여 고정된 효소의 재사용성(Reusability)을 확인한 도이다.
도 1b는 본 발명의 최적 효소를 포함하는 무-세포 다중 촉매 시스템을 이용한 에탄올에서 2,3-부탄디올의 생성 방법을 모식화한 도이다.
도 2a는 NOX 효소 단백질을 발현하는 벡터맵을 나타낸 도이다.
도 2b는 EtDH 효소 단백질을 발현하는 벡터맵을 나타낸 도이다.
도 2c는 EtDH:D46G 효소 단백질을 발현하는 벡터맵을 나타낸 도이다.
도 2d는 FLS:L482S 효소 단백질을 발현하는 벡터맵을 나타낸 도이다.
도 2e는 BDH:S119A 효소 단백질을 발현하는 벡터맵을 나타낸 도이다.
도 3은 EtDH, EtDH:D46G, BDH, BDH: S199A, NOX, FLS 단백질 발현을 확인한 도이다.
도 4는 FLS 효소에 따른 아세토인 생성을 VP 반응으로 확인한 도이다(A는 50 mM 아세트 알데히드, 0 시간; B는 100 mM 아세트알데히드, 0시간; C는 50 mM 아세트알데히드, 6 시간; D는 100 mM 아세트알데히드, 6시간).
도 5는 본 발명의 다단계 효소 및 이의 변이체를 이용한 아세토인, 2,3-부탄디올 생성을 키랄-칼럼 GC(Chiral-column GC) 분석한 결과이다(A는 표준 물질의 혼합물; B는 중간 생성물 아세트알데히드를 통한 에탄올에서 아세토인의 반응; C는 중간 생성물 아세트알데히드 및 아세토인을 통한 에탄올에서 2,3-부탄디올의 반응).
도 6은 본 발명의 각 효소의 열안정성(Thermostability)을 30, 37, 45도에서 확인한 도이다(1은 EtDH:D46G(에탄올, NAD+ 포함); 2는 EtDH:D46G (ethanol, NAD+ 포함); 3은 EtDH:D46G(에탄올, NADP+); 4는 FLS(아세트알데히드, TPP 포함); 5는 FLS:L482S(아세트알데히드, TPP); 6은 BDH:S199A(아세토인, NADPH 포함); 7은 BDH:S199A(부탄온, NADPH 포함); 8은 NOX (O2, NADH 포함)).
도 7a는 pH 조건(6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5 및 8.5)에 따른 에탄올에서 아세토인 생성 농도를 확인한 도이다.
도 7b는 온도(20, 25, 30, 37 및 42도)에 따른 에탄올에서 아세토인 생성 농도를 확인한 도이다.
도 7c는 NAD+(1, 2, 4, 6, 8 mM)에 따른 에탄올에서 아세토인 생성 농도를 확인한 도이다.
도 7d는 TPP(1, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 및 0.5 mM)에 따른 에탄올에서 아세토인 생성 농도를 확인한 도이다.
도 7e는 금속 이온(Mg2+, Mn2+, Ca2+, Fe2+, Ni2+, Cu2+ 및 Zn2+)에 따른 에탄올에서 아세토인 생성 농도를 확인한 도이다.
도 8은 최적 반응 조건하에 시간 조건에 따른 에탄올에서 아세토인의 생성을 확인한 도이다.
도 9는 에탄올에서 아세토인으로의 속도 조절 단계(Rate limiting step)를 확인한 도이다.
도 10은 FLS 아미노산 서열의 돌연변이 핫스팟을 분석한 도이다(A는 핫 스폿 예측의 결과; B는 FLS 효소의 구조 모델(파란색 : 기질 터널 포켓, 골든 활성 사이트 포켓, 적색 : FLS 효소의 높은 변이 가능한 잔기, 황색 : FLS 효소의 중간 변이 가능한 잔기).
도 11a는 FLS 및 이의 변이체의 아세토인 생성을 확인한 도이다.
도 11b는 FLS의 고유 활성(specific activity)과 비교하여 FLS 및 이의 변이체의 활성을 확인한 도이다.
도 12a는 기질인 아세트알데히드와 FLS의 활성 부위 잔기 W480간의 분자 상관관계를 확인한 도이다.
도 12b는 기질인 아세트알데히드와 FLS:L482S의 활성 부위 잔기 W480간의 분자 상관관계를 확인한 도이다.
도 12c는 기질인 아세트알데히드와 FLS의 100-ns 분자 역동 시뮬레이션을 확인한 도이다.
도 12d는 기질인 아세트알데히드와 FLS:L482S의 100-ns 분자 역동 시뮬레이션을 확인한 도이다.
도 13a는 시간 조건에 따른 기질인 에탄올에서 아세트알데히드 및 아세토인의 생성을 확인한 도이다.
도 13b는 기질인 에탄올의 농도에 따른 에탄올에서 아세트알데히드 및 아세토인의 생성을 확인한 도이다.
도 14은 PDB 데이터베이스를 이용하여 EtDH (CnMDH) 아미노산 서열을 정렬하여, NAD+ 및/또는 NADP+ 부위를 확인한 도이다.
도 15은 에탄올에서 2,3-부탄디올 생산을 위하여 NAD+ 및/또는 NADP+의 영향을 확인한 도이다.
도 16a는 시간 조건에 따른 기질인 에탄올에서 아세트알데히드, 아세토인 및 2,3-부탄디올의 생성을 확인한 도이다.
도 16b는 기질인 에탄올의 농도에 따른 아세트알데히드, 아세토인 및 2,3-부탄디올의 생성을 확인한 도이다.
도 17a는 에탄올에서 아세토인 생산을 위한 효소의 재순환성(Recyclability)을 확인한 도이다(에탄올(■), 아세트알데히드(▲), 아세토인(●)).
도 17b는 에탄올에서 아세토인 생산을 위하여 고정된 효소의 재사용성(Reusability)을 확인한 도이다.
도 17c는 에탄올에서 2,3-부탄디올 생산을 위한 효소의 재순환성(Recyclability)을 확인한 도이다(에탄올(■), 아세트알데히드(▲), 아세토인(●), 2,3-부탄디올 (▼)).
도 17d는 에탄올에서 2,3-부탄디올 생산을 위하여 고정된 효소의 재사용성(Reusability)을 확인한 도이다.
본 발명은 서열번호 8로 표시되는 FLS(formolase) 아미노산에서 482번째 루신이 세린, 아르기닌 및 글루탐산으로 치환된 변이로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 변이를 포함하는 FLS 변이 아미노산을 제공한다.
본 발명에서 용어, "FLS(formolase)"는 3개의 1-카본 포름알데히드(carbon formaldehyde) 분자를 하나의 3-카본 디하이드록시아세톤(dihydroxyacetone) 분자로 carboligation을 촉매한다. 본 발명의 목적 상, FLS 및 이의 변이체는 알코올 대사 과정에서 생성된 아세트알데히드를 기질로 하여 아세토인을 생성하고, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "FLS 변이 아미노산"은 야생형 FLS 아미노산 중 하나 이상의 아미노산을 치환, 삽입, 제거 또는 변형한 것을 의미한다.
상기 FLS는 서열번호 7로 표시되는 염기서열로 코딩될 수 있고, 상기 FLS에서 482번째 루신이 세린으로 치환된 변이는 서열번호 10의 아미노산 서열로 표시되고, 482번째 루신이 아르기닌으로 치환된 변이는 서열번호 11의 아미노산 서열로 표시되고, 482번째 루신이 글루탐산으로 치환된 변이는 서열번호 12의 아미노산 서열로 표시될 수 있다.
상기 FLS 변이 아미노산은 396번째 트레오닌의 변이, 446번째 트레오닌의 변이, 473번째 메티오닌의 변이, 477번째 세린의 변이 및 499번째 루신의 변이로 구성된 군에서 선택된 1종 이상을 더 포함할 수 있으나, 에탄올 대사 과정에서 생산된 아세트알데히드를 아세토인으로 전환시키기 위한 목적을 달성하기 위해서라면, 이에 제한되지 않는다.
상기 FLS는 슈도모나스 플루오레스센스(Pseudomonas fluorescens)로부터 유래되나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 FLS 변이는 FLS의 구조를 분석한 결과, 6개의 잔여(Six residuals) 핫스팟(T396, T446, M473, S477, L482 및 L499)를 발굴하였다. 그 중, 기질인 아세트알데히드와 분자 상호 작용은 활성 부위 잔기는 W480임을 확인하고, FLS 보다 변이체 FLS:L482S가 더 강하게 기질과 결합하고, 수소 결합함을 확인하였다(도 12a 내지 12d).
본 발명에 따른 FLS 및 이의 변이 아미노산의 범위는 본 발명의 아미노산으로 합성된 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 아미노산과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 본 발명의 FLS 및 이의 변이 아미노산과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질 또는 아미노산을 말한다.
본 발명의 FLS 및 이의 변이 아미노산은 이의 천연형 아미노산 서열을 갖는 단백질뿐만 아니라 이의 아미노산 서열 변이체가 또한 본 발명의 범위에 포함된다.
상기 FLS 및 이의 변이 아미노산은 천연에서 추출하거나 합성 (Merrifleld, J. Amer. chem. Soc. 85:2149-2156, 1963) 또는 DNA 서열을 기본으로 하는 유전자 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다 (Sambrook et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA, 2판, 1989).
또한 본 발명은 상기 FLS 변이 아미노산을 코딩하는 유전자를 제공한다.
상기 유전자의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 본 발명의 FLS 변이 아미노산을 코딩하는 유전자로서 사용될 수 있는 FLS 변이 핵산분자는 이를 구성하는 핵산 분자의 작용성 등가물, 예를 들어, FLS 변이 핵산 분자의 일부 염기서열이 결실(deletion), 치환(substitution) 또는 삽입(insertion)에 의해 변형되었지만, FLS 변이 핵산 분자와 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체(variants)를 포함하는 개념이다. 구체적으로, 상기 유전자는 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 이에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다
또한 본 발명은 NOX(NADH oxidase) 유전자, EtDH(ethanol dehydrogenase) 유전자, EtDH의 변이체 유전자, FLS(formolase) 유전자, 상기 FLS 변이 아미노산을 코딩하는 유전자, BDH(2,3-butanediol dehydrogenase) 유전자 및 BDH의 변이체 유전자로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명에서 용어, "NOX(NADH oxidase)"는 본 발명의 목적 상, 기질로서 산소를 이용하며, NADH를 산화시켜 NAD+를 재생산한다. 상기 재생산된 NAD+는 EtDH가 조효소로 이용할 수 있다.
본 발명에서 용어, "EtDH(ethanol dehydrogenase)"는 본 발명의 목적 상, 에탄올을 기질로 이용하고, 조효소로서 NAD+ 및/또는 NADP+를 이용하여 에탄올을 탈수소시킬 수 있다. 이 후, 아세트알데히드 생산을 유도하여, 이를 기질로 이용하는 FLS가 아세토인을 생성하도록 할 수 있다.
본 발명에서 용어, "BDH(2,3-butanediol dehydrogenase)"는 본 발명의 목적 상, 아세토인을 기질로 하여 NADPH를 조효소로 이용하여 2,3-부탄디올의 생성을 촉매시킨다.
상기 NOX 유전자는 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus)로부터 유래되고, 상기 EtDH 유전자 또는 EtDH 변이체 유전자는 쿠프리아비두스 네카터(Cupriavidus necator)로부터 유래될 수 있다. 또한, 상기 BDH 유전자 또는 BDH 변이체 유전자는 클로스트리디움 오토에타노지넘(Clostridium autoethanogenum)으로부터, 상기 DDH(diol dehydratase) 유전자 및 DDH의 변이체 유전자는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)로부터 유래될 수 있으나, 본 발명의 부탄디올 생성을 위한 효소 생산을 위해서라면, 이에 제한되지 않는다.
상기 NOX 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로, EtDH 유전자는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열로, EtDH의 변이체는 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 EtDH의 46번째 아스파르트산이 글리신으로 치환되고, 서열번호 5의 염기서열로 표시로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 BDH 유전자는 서열번호 13으로 표시되는 염기서열이고, BDH의 변이체는 서열번호 13의 아미노산 서열로 표시되는 BDH의 199번째 세린이 알라닌으로 치환되고, 서열번호 15의 염기서열로 표시되나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 실시예 1-2의 방법을 이용하여, 각 단백질 및 이의 변이체를 발현하도록 플라미스미드를 제작하였고, NOX 단백질 발현 플라스미드 및 벡터맵은 도 2a에 나타내었다. 또한, EtDH 또는 EtDH:D46G 변이체 발현 플라스미드 및 벡터맵은 도 2b 및 도 2c에 나타내었다. 또한, FLS:L482S, BDH:S199A 변이체 발현 플라스미드 및 벡터맵은 도 2d, 도 2e에 나타내었다(표 1).
본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 단백질을 효소로 이용 시, 열 안정성(Thermostability)을 확인한 결과, EtDH, EtDH:D46G, EtDH:D46G, EtDH:D46G, FLS, FLS:L482S, BDH:S199A, BDH:S199A 및 NOX 단백질은 높은 30 내지 45도에서도 열 안정성이 나타나며, 특히 30도에서 반응 활성이 우수함을 확인하였다(도 6).
본 발명에서 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 유전자를 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 유전자의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 DNA 제조물을 의미하는 것으로, 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다.
본 발명에서 "작동가능하게 연결된 (operably linked)"는 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 말한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.
본 발명의 벡터는 프로모터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트, 분비시그널 등을 포함할 수 있으며, 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 개시 코돈 및 종결 코돈은 유전자 작제물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다.
본 발명에서 사용되는 벡터는 숙주 중에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며 당 업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 예컨대 비바이러스성 벡터 또는 바이러스성벡터를 사용할 수 있다.
상기 비바이러스성 벡터로는 플라스미드가 대표적이다. 플라스미드 발현 벡터는 사람에게 사용할 수 있는 FDA의 승인된 유전자 전달방법으로 사람 세포에 직접적으로 플라스미드 DNA를 전달하는 방법으로, 플라스미드 DNA는 바이러스 벡터와는 달리 균질하게 정제될 수 있는 장점이 있다. 본 발명에서 사용할 수 있는 플라스미드 발현 벡터로는 당업계에 공지된 포유동물 발현 플라스미드를 사용할 수 있다. 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 pRK5(유럽특허 제307,247호), pSV16B(국제특허공개 제91/08291호) 및 pVL1392(PharMingen) 등이 대표적이다.
또한 본 발명의 발현 벡터로 바이러스 벡터를 사용할 수 있다. 바이러스 벡터는 예를 들어, 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 아데노바이러스-연관 바이러스, 허피스바이러스(herpes virus) 및 아비폭스바이러스(avipoxvirus) 등이 포함된다. 바이러스 벡터는 다음의 기준을 충족해야 한다: (1) 목적하는 세포에 감염할 수 있어야 하며 이에 따라 적합한 숙주 범위를 갖는 바이러스 벡터가 선택되어야 하고, (2) 전달된 유전자가 적절한 기간 동안 세포에서 보존되고 발현될 수 있어야 하며, (3) 벡터가 숙주에 안전해야 한다.
상기 레트로바이러스 벡터는 바이러스 유전자가 모두 제거되었거나 또는 변경되어 비-바이러스 단백질이 바이러스 벡터에 의해 감염된 세포 내에서 만들어지도록 제작된 것이다. 유전자 요법을 위한 레트로바이러스 벡터의 주요 장점은 다량의 유전자를 복제세포 내에 전달하고, 세포 DNA 내로 전달된 유전자를 정확하게 통합하며, 유전자 형질 감염 후 연속적인 감염이 유발되지 않는 것이다. FDA에서 인증 받은 레트로바이러스 벡터는 PA317 암포트로픽 레트로바이러스 패키지 세포를 이용하여 제조한 것이다(Miller, A.D. and Buttimore, C., Molec.Cell Biol., 6:2895-2902, 1986).
비-레트로바이러스 벡터로는 상기에서 언급한 바와 같은 아데노바이러스가 있다. 아데노바이러스의 주요 장점은 다량의 DNA 단편(36kb 게놈)을 운반하고, 매우 높은 역가로 비-복제세포를 감염시킬 수 있는 능력이 있다는 것이다. 또한, 허피스 바이러스도 사람 유전자 요법을 위해 유용하게 사용될 수 있다(Wolfe, J.H., et al.,Nature Genetics,1:379-384, 1992). 이외에도, 공지된 적절한 바이러스 벡터를 사용할 수 있다.
세포 내로 유전자 전달을 위해 사용할 수 있는 다른 바이러스 벡터로는 뮤린 백혈병 바이러스(MLV), JC, SV40, 폴리오마, 엡스타인-바르 바이러스 파필로마 바이러스, 백시니아, 폴리오바이러스, 헤르페스 바이러스, 신드비스 바이러스, 렌티 바이러스, 기타 사람 및 동물 바이러스가 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 상기 발현 벡터는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 세포에 도입할 수 있다. 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAE Dextran- mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감염(polybrene-mediated transfection), 전기침공법(electropora tion), 유전자 총(gene gun) 및 세포 내로 핵산을 유입시키기 위한 다른 공지의 방법에 의해 세포 내로 도입할 수 있다(Wu et al., J. Bio. Chem., 267:963-967, 1992; Wu and Wu, J. Bio. Chem.,263:14621-14624, 1988).
또한, 본 발명의 벡터는 선별 마커(selection market)를 추가로 포함할 수 있다. 선별 마커는 벡터로 형질전환 된 세포를 선별, 즉, 목적 유전자의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나, 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 재조합 벡터가 도입된 형질전환 미생물을 제공한다.
본 발명의 형질전환체는 벡터를 프로모터가 작용할 수 있는 양태로 숙주세포 내에 도입시키는 것에 의해 구축될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제 가능하게 되는 것을 의미한다. 형질전환은 핵산 분자를 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기천공법(electroporation), 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, 미세주입법(microinjection), 폴리에틸렌글리콜(PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 포함될 수 있으나 이들로 제한되는 것은 아니다.
발현벡터로 형질전환되는 숙주세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용하면 된다. 본 발명에서 이용될 수 있는 숙주세포로는 곤충세포주, 효모, 진균, 세균 또는 조류가 가능하다.
본 발명에서 상기 형질전환 미생물은 배양할 수 있으며, "배양"은 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 것을 의미한다.
상기 형질전환 미생물은 통상의 배지에서 생육 가능하며, 상기 배지는 특정 미생물을 배양하기 위하여 배양대상 즉 배양체가 되는 미생물이 필요로 하는 영양물질을 포함하는 것으로 특수한 목적을 위한 물질이 추가로 첨가되어 혼합된 것일 수 있다. 상기 배지는 배양기 또는 배양액이라고도 하며, 천연배지, 합성배지 또는 선택배지를 모두 포함하는 개념이다.
배양에 사용되는 배지는 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 온도, pH 등을 조절하면서 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 사용될 수 있는 탄소원으로는 글루코즈 및 자일로즈의 혼합당을 주 탄소원으로 사용하며 이외에 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 및 질산암모늄과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민과 같은 아미노산 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해생성물 등 유기질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간 및 탄산칼슘 등이 사용될 수 있다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다.
또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식, 유가식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 형질전환 미생물에서 생산된 단백질을 정제하고 반응시키는 단계;를 포함하는 부탄디올 생산 방법을 제공한다.
상기 생산 방법은 무-세포(cell-free) 상태에서 상기 형질전환 미생물에서 생산된 단백질을 다단계 촉매 작용을 수행하여 부탄디올을 생산하고, 에탄올을 기질로 이용하나, 이에 제한되지 않는다.
상기 생산 방법은 조효소인 NAD+, NADP+, 비타민 B12 및 TPP(thiamine pyrophosphate)로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 조효소를 더 포함하나, 이의 처리 농도 또는 처리량 또한 제한되지 않는다.
상기 생산 방법은 금속 이온 Mg2+, Mn2+, Ca2+, Fe2+, Ni2+, Cu2+ 및 Zn2+으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 금속 이온을 더 포함하며, 바람직하게는 Mg2+, Mn2+, Ca2+, Fe2+ 및 Ni2+이 더 효율적으로 촉매 반응을 유도할 수 있으나, 부탄디올을 생산하기 위해서라면 이에 제한되지 않는다.
상기 생산 방법은 pH 5.0 내지 9.0의 조건으로 부탄디올을 생산하고, 바람직하게는 6.5 내지 8.5의 조건이나, 부탄디올 생성 목적 달성을 위해서라면 이에 제한되지 않는다.
상기 생산 방법은 16 내지 45도에서 부탄디올을 생산하나, 바람직하게는 25 내지 42도의 조건이나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 에탄올에서 C4 화합물인 부탄디올을 생성하기 위하여, 다단계 효소(cascade enzymes)를 이용한 인공 합성 경로를 디자인하였으며, 상기 다단계 효소로서, NOX, EtDH, FLS 및 BDH와 이의 각 변이체를 선발하였다. 구체적으로, NOX는 기질로서 산소를 이용하며, NADH를 산화시켜 NAD+를 재생산한다. 상기 재생산된 NAD+는 EtDH가 조효소로 이용한다. EtDH 및 이의 변이체는 에탄올을 기질로 이용하고, 조효소로서 NAD+ 및/또는 NADP+를 이용하여 에탄올을 탈수소화하여, 아세트알데히드 생산을 유도한다. 이 후, FLS 및 이의 변이체는 아세트알데히드를 기질로 하여 아세토인의 생성을 유도한다. BDH는 아세토인을 기질로 하여 NADPH를 조효소로 이용하여 2,3-부탄디올의 생성을 촉매시킨다.
본 발명은 무세포 다중 효소 촉매(Cell-free multi-enzyme catalysis, CFME) 방법을 이용한 in vitro 상에서 간소화된 경로를 이용하여 에탄올에서 부탄디올의 인공 합성 목적을 달성하였다. 상기 무-세포 다중 효소 촉매 방법을 이용 시, 종래의 세포를 이용한 대사 공학, 예컨대 박테리아, 재조합 미생물 등을 배양한 발효법의 낮은 목표 생성물 수율, 원치 않는 부산물 생성, 세포내 수송 제약 등의 문제점을 해결하여, 세포 생장이 필요하지 않고, 짧은 합성 경로, 빠른 반응 속도, 높은 수율 및 생산성, 목적으로 하는 반응 조건의 조절 등과 같은 장점이 존재한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 최적의 부탄디올 생산 방법은, 본 발명에서 디자인한 인공 합성 경로에 따라 무세포 다중 효소 촉매를 이용하고, 기질로서 에탄올을 이용한다. 효소로서 NOX, EtDH:D46G, FLS:L482S, BDH:S199A를 이용하고, 조효소로서, NAD+, NADP+, TPP, 비타민 B12, Mg2+을 첨가한 반응 혼합물로 부탄디올 생성을 효과적으로 유도할 수 있다(도 1a 및 도1b).
또한 본 발명은 상기 형질전환 미생물에서 생산된 단백질을 나노입자에 고정하고 반응시키는 단계;를 포함하는 부탄디올 생산 방법을 제공한다.
상기 나노입자는 산화 규소(silicon oxide)를 부착하고 글루타알데히드(glutaraldehyde)와 반응시키나, 본 발명의 단백질을 나노입자에 부착하여 부탄디올을 생산하기 위한 목적을 달성하기 위해서라면, 이에 제한되지 않는다.
상기 고정된 단백질 나노입자는 재사용이 가능하고, 바람직하게는 1 내지 30회 재사용이 가능하며, 더욱 바람직하게는 1 내지 20회이나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 최적의 부탄디올 생산 방법은, 본 발명에서 디자인한 인공 합성 경로에 따라 무세포 다중 효소 촉매를 이용하고, 기질로서 에탄올을 이용한다. 효소로서 NOX, EtDH:D46G, FLS:L482S, BDH:S199A를 이용하고, 조효소로서, NAD+, NADP+, TPP, 비타민 B12, Mg2+을 첨가한 반응 혼합물로 부탄디올 생성을 효과적으로 유도할 수 있다(도 1a 및 도1b). 상기 효소를 나노입자에 부착시켜 고정시키고 부탄디올 생성을 유도한 결과, 재사용 후에도 효과적으로 부탄디올이 생성됨을 확인하였다(도 17a 내지 도 17d).
하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 실험 준비 및 실험 방법
<1-1> 효소 및 시약 구입
제한 효소인 DNA Polymerase High Fidelity and T4 DNA ligase는 TaKaRa Biotech(Shiga, Japan) 및 New England Biolabs(Ipswich, MA, USA)에서 각각 구입하였다. DNA 및 단백질 마커는 Tiangen Biotech(Shanghai, China)에서 구입하였다. IPTG(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside), DTT(dithiothreitol) 및 DMSO(dimethyl sulfoxide)는 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA) 및 Sinopharm(Shanghai, China)에서 각각 구입하였다. 대조군으로서, (3S/3R)-아세토인(acetoin)은 (2S, 3S)-2,3-부탄디올(butanediol), (2R, 3R)-2,3-부탄디올(butanediol), meso-2,3-부탄디올(butanediol)은 Sigma-Aldrich에서 구입하였다. 모든 다른 시약은 달리 명시되지 않는 한, 분석 등급이었으며 상업적으로 이용 가능한 것을 이용하였다.
<1-2> 박테리아 균주, 플라스미드 및 박테리아 성장 조건
본 발명에 이용된 균주 및 플라스미드는 하기 표 1에 나타내었으며, 클로닝 및 발현 발현 숙주로서 Escherichia coli DH5α 및 BL21(DE3)을 이용하였으며 37도에서 배양하였다. 플라스미드 pET28a를 이용하여 발현 벡터를 제작하였다. Luria-Bertani(LB) 배지는 균주 배양 및 재조합 단백질 발현에 사용되었으며, 최종 농도 50 μg mL-1의 재조합 균주를 배양하기 위해 카나마이신을 상기 배지에 추가하였다.
| Strain or plasmid | Relevant genotype and description | Vector Map |
| Strains | ||
| E. coli DH5α | Host of plasmid for cloning | |
| E. coli BL21(DE3) | Host of plasmid for expression, F-, ompT, hsdSB(rB-mB-), gal(λ c I 857, ind1, Sam7, nin5, lacUV-T7 gene1), dcm(DE3) | |
| Plasmids | ||
| pET28a | Expression vector, KmR | |
| pET-EtDH | pET28a carries EtDH gene | fig. 2b |
| pET-EtDH:D46G | pET28a carries EtDH mutant gene | fig. 2c |
| pET-FLS | pET28a carries FLS gene | |
| pET-FLS:L482S | pET28a carries FLS mutant gene | fig. 2d |
| pET-FLS:L482R | pET28a carries FLS mutant gene | |
| pET-FLS:L482E | pET28a carries FLS mutant gene | |
| pET-BDH | pET28a carries BDH gene | |
| pET-BDH:S199A | pET28a carries BDH mutant gene | fig. 2e |
| pET-NOX | pET28a carries NOX gene | fig. 2a |
<1-3> 다단계 효소(cascade enzymes)의 재조합 단백질 발현 및 정제
에탄올에서 C4 화합물인 아세토인 및 2,3-부탄디올을 생성하기 위하여, 다단계 효소(cascade enzymes)를 이용하였으며, EtDH(ethanol dehydrogenase), FLS(formolase), BDH(2,3-butanediol dehydrogenase) 및 NOX(NADH oxidase)의 유전자는 각 쿠프리아비두스 네카터(Cupriavidus necator)[T. Y. Wu, et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 2016, 100, 1], 슈도모나스 플루오레스센스(Pseudomonas fluorescens)[ J. Siegel, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2015, 112, 3704], 클로스트리디움 오토에타노지넘(Clostridium autoethanogenum)[M. Kopke, et al., Appl. Environ. Microbiol., 2014, 80, 3394] 및 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus)[ Y. W. Zhang, et al., Enzyme Microb. Tech., 2012, 50, 255]에서 유래한 유전자를 이용하였으며, General Biosystems, Inc. (Anhui, China)에서 합성하였다. 또한, 상기 각 유전자를 발현 플라스미드 pET28a에 클로닝하였다. 단백질 발현 플라스미드를 E. coli BL21(DE3)에 도입하였으며, 각 pET-EtDH, pET-FLS, pET-BDH 및 pET-NOX가 포함된 각 재조합 E. coli BL21(DE3)를 600 nm 에서 광학 밀도가 0.6 일 때, 0.5 mM IPTG가 포함된 LB 배지에 37도로 배양하였다.
18도에서 24시간 유도한 후, 세포를 원심분리하여 수득하고 ice bath에서 초음파 처리하여 파쇄하였다. 세포 파편을 제거하기 위하여 세포 용해물을 8000×g, 10분간 원심 분리하였다. EtDH, FLS, BDH 및 NOX 효소를 수득하기 위하여, 용해성 분획을 정제 프로토콜(GE Healthcare, Little Chalfont, UK)에 따라 HisTrap HP 칼럼을 이용하여 정제하였다.
<1-4> 효소 변이체(enzyme variants)의 제작
상기 각 EtDH, FLS, BDH 효소에 대한 변이체를 제작하고 이를 발현 및 정제하였다.
또한, EtDH 또는 BDH 변이체를 제작하기 위하여, EtDH:D46G 및 BDH:S199A 변이체는 하기 표 2에 나타낸 EtDH1/EtDH2 및 BDH1/BDH2 프라이머를 이용하여 부위 특이적 돌연변이 유도(site-directed mutagenesis)를 수행하여 제작하였다. 야생형 EtDH 및 BDH 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드 pET-EtDH 및 pET-BDH는 PCR 증폭을 위한 DNA 주형으로서 각각 사용되었다. 정정된(correct) 돌연변이 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드를 E. coli BL21(DE3)에 형질전환 시킨 후, 콜로니는 카나마이신 저항성인 것으로 선택하여 단백질 발현에 이용하였다. 각 단백질의 정제 후, EtDH 및 BDH 변이체의 활성 및 운동 파라미터(kinetic parameter)를 측정하였다.
또한, FLS 효소의 촉매 효율을 높이기 위하여, 신규한 돌연변이 영역을 찾아내고자, HotSpot Wizard 2.0 server를 이용하여 FLS 구조(PDB No.: 4QPZ)를 입력하여 핫 스팟을 분석하였다[(J. Siegel, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2015, 112, 3704), (J. Bendl, et al., Acids Res., 2016, 44, 479)]. 6개의 잔여(Six residuals) 핫스팟(T396, T446, M473, S477, L482 및 L499)를 하기 표 2의 FLS1-FLS12 프라이머를 이용하여 부위 특이적 돌연변이를 유도하였다. 야생형 FLS를 포함하는 재조합 플라스미드 pET-FLS를 DNA 주형으로 이용하였으며, 돌연변이 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드를 E. coli BL21(DE3)로 형질전환하였다. FLS 변이체를 아세트알데이히드(acetaldehyde)를 기질로 하는 전체-세포 생촉매법(whole-cell biocatalytic method)을 이용하여 스크리닝 하였다. 구체적으로, 콜로니를 LB 배지에 접종한 후 600 nm에서 광학 밀도가 0.6에 도달하였을 때, 18도로 24시간 동안 0.5 mM IPTG를 추가하여 단백질 발현을 유도하였다. 상기 세포는 원심 분리하여 수득하고, 50 mM 인산 완충액(pH 8.0), 100 mM 아세트알데히드 및 40 gL-1 wet cell weight(WCW)를 포함하는 반응 혼합물로 6시간, 30도 조건으로 전체-세포 생촉매 작용을 수행하였다.
| Primers | Sequence (5'-3′') | Mutation site | seq No. |
| EtDH1 | GATTGTTACCGGTGCTGGCCTGCATAAAATG | D46G | 17 |
| EtDH2 | CATTTTATGCAGGCCAGCACCGGTAACAATC | D46G | 18 |
| FLS1 | GGTAGCGGATGGTGGCCTGNNNTATCTCTGGCTGTCC | T396 | 19 |
| FLS2 | GGACAGCCAGAGATANNNCAGGCCACCATCCGCTACC | T396 | 20 |
| FLS3 | CCGCCGCACGATCCTTGTGNNNGGCGATGGCTCGGTG | T446 | 21 |
| FLS4 | CACCGAGCCATCGCCNNNCACAAGGATCGTGCGGCGG | T446 | 22 |
| FLS5 | GCCGCTGATCGTCATCATCNNNAACAACCAAAGCTGG | M473 | 23 |
| FLS6 | CCAGCTTTGGTTGTTNNNGATGATGACGATCAGCGGC | M473 | 24 |
| FLS7 | CATCATCATGAACAACCAANNNTGGGGGTGGACATTG | S477 | 25 |
| FLS8 | CAATGTCCACCCCCANNNTTGGTTGTTCATGATGATG | S477 | 26 |
| FLS9 | CCAAAGCTGGGGGTGGACANNNCATTTCCAGCAATTG | L482 | 27 |
| FLS10 | CAATTGCTGGAAATGNNNTGTCCACCCCCAGCTTTGG | L482 | 28 |
| FLS11 | TCGCGTGACGGGCACCCGTNNNGAAAATGGCTCCTAT | L499 | 29 |
| FLS12 | ATAGGAGCCATTTTCNNNACGGGTGCCCGTCACGCGA | L499 | 30 |
| BDH1 | GAATTATCGGTGTTGGAGCCAGACCTGTTTGTGTTG | S199A | 31 |
| BDH2 | CAACACAAACAGGTCTGGCTCCAACACCGATAATTC | S199A | 32 |
| 유전자의 염기서열 또는 이의 변이체 | 유래 | 염기서열 번호 | 아미노산 서열번호 |
| NOX(NADH oxidase) | 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) | 1 | 2 |
| EtDH(ethanol dehydrogenase) | 쿠프리아비두스 네카터(Cupriavidus necator) | 3 | 4 |
| EtDH:D46G | 5 | 6 | |
| FLS(formolase) | 슈도모나스 플루오레스센스(Pseudomonas fluorescens) | 7 | 8 |
| FLS:L482S | 9 | 10 | |
| FLS:L482R | 11 | ||
| FLS:L482E | 12 | ||
| BDH(2,3-butanediol dehydrogenase) | 클로스트리디움 오토에타노지넘(Clostridium autoethanogenum) | 13 | 14 |
| BDH: S199A | 15 | 16 |
<1-5> 효소 활성 분석
1-5-1. EtDH 효소 활성 분석
EtDH 효소 활성 및 이의 변이체는 100 mM glycine-NaOH 완충액(pH 9.5), 5 mM Mg2+, 3 mM NAD+/NADP+ 및 10 mM 에탄올을 포함하는 반응 혼합물로 25도에서 측정하였다. 활성은 분광광도계(UV-1800, MAPADA, Shanghai, China)를 이용하여 340 nm에서 NAD+/NADP+ 감소율로 확인하였다. 1 단위의 EtDH 활성은 분 당 1 μmol의 NAD+/NADP+ 를 감소시키는데 필요한 효소의 양으로 확인하였다.
1-5-2. FLS 효소 활성 분석
FLS 효소 활성 및 이의 변이체는 100 mM 인산 완충액(pH 8.0), 1 mM Mg+, 0.1 mM TPP 및 20 mM 아세트알데히드를 포함하는 반응 혼합물로 검정하였으며, 반응 후 실온에서 1시간 두었으며, 아세트알데히드에서 아세토인의 농도는 VP 반응으로 측정하였으며, 표준 아세토인 검정곡선으로 계산하였다.
1-5-3. BDH 효소 활성 분석
FLS 효소 활성 및 이의 변이체는 50 mM Tris-HCl 완충액(pH 7.5), 0.2 mM NADPH, 1 mM DTT; 및 20 mM 아세토인 또는 5 mM 부탄온을 포함하는 반응 혼합물로 실온에 두어 측정하였다. 활성은 분광광도계(UV-1800, MAPADA)를 사용하여 340 nm에서 NADPH의 산화율로 확인하였다. 1 단위의 BDH 활성은 분 당 1 μmol NADPH를 산화시키는데 필요한 효소의 양으로 정의되었다.
1-5-4. NOX 효소 활성 분석
NOX 효소 활성은 50 mM HEPES-NaOH buffer (pH 8.0) 및 0.2 mM NADH를 포함하는 반응 혼합물로 실온에서 측정하였다. 활성은 분광광도계(UV-1800, MAPADA)를 이용하여 340 nm에서 NADH의 산화율로 확인하였다. 1단위의 NOX 활성은 분 당 1 μmol NADH를 산화시키는데 필요한 효소의 양으로 측정하였다.
<1-6> VP(Voges-proskauer) 반응
각 조건의 처리군을 10,000×g에서 5분 간 4도에서 원심분리 하였다. 각 처리군의 아세토인 농도를 분석하고 VP 반응에서 정량화하기 위하여, 10mL 튜브에 희석된 시료 0.3 mL, 0.5 % 크레아틴 0.3 mL, 5 % 알파 나프톨 0.3 mL 및 5 % NaOH 0.3 mL를 넣고 30 에서 30 분간 부드럽게 진탕시켰다. 분광 광도계 (UV-1800, MAPADA)를 사용하여 520 nm에서 반응 용액의 광학 밀도를 측정하고 검량선으로부터 아세토인 농도를 계산하였다. 보정 그래프는 표준 아세토인 농도와 0.04-0.4 mM 범위의 VP 반응 후 520 nm에서 해당 광학 밀도 사이에 측정하였다.
<1-7> 운동 파라미터(kinetic parameters)의 측정
EtDH 및 EtDH:D46G의 운동 파라미터는 100 mM glycine-NaOH 완충액(pH 9.5), 5 mM Mg2+, 3 mM NAD+/NADP+ 및 0.5-100 mM 에탄올을 포함하는 반응 혼합물로 실온에 두어 확인하였다. FLS 및 이의 변이체의 운동 파라미터는 100 mM 인산 완충액(pH 8.0), 1 mM Mg+, 0.1 mM TPP 및 0.5-20 mM 아세트알데히드를 포함하는 반응 혼합물로 실온에 두어 확인하였다. BDH 및 BDH:S199A의 운동 파라미터는 50 mM Tris-HCl 완충액(pH 7.5), 0.2 mM NADPH, 1 mM DTT; 및 0.5-100 mM 아세토인 또는 0.5-10 mM 부탄온을 포함하는 반응 혼합물로 실온에 두어 평가하였다.
상기 K m 및 k cat 값은 미카엘리스-멘텐 방정식(Michaelis-Menten equation)의 비선형 회귀 피팅으로 확인하였으며 3회 반복하였다.
<1-8> 무-세포 다중 효소 촉매 시스템(Cell-free multi-enzyme catalysis system)
도 1a 및 도 1b에 나타낸 바와 같이, 무-세포 다중 효소 촉매를 이용하여 에탄올로부터 아세토인, 2,3-부탄디올의 합성은 기질, 조효소, 금속 이온 및 해당되는 효소를 포함하는 0.5-mL 반응 혼합물로 수행하였다. 온도, pH, 조효소 및 메탈 이온을 포함하는 반응 조건은 인공적인 반응 경로의 플럭스(flux)를 증대시키기 위한 최적 조건으로 수행하였다. 아세토인, 2,3-부탄디올 최적 반응 조건은 하기와 같다.
아세토인 생성은 50 mM HEPES buffer (pH 8.0), 1 mM NAD+, 0.1 mg mL-1 EtDH, 0.2 mg mL-1 FLS:L482S, 0.1 mg mL-1 NOX, 0.1 mM TPP, 1 mM Mg2+, 1 mM DTT, 20 % DMSO 및 100 mM 에탄올을 포함하는 0.5-mL 반응 혼합물을 30도 두어 수행하였다.
2,3-부탄디올은 50 mM HEPES 완충액(pH 8.0), 1 mM NAD+, 1 mM NADP+, 0.1 mg mL-1 EtDH:D46G, 0.2 mg mL-1 FLS:L482S, 0.1 mg mL-1 NOX, 0.1 mg mL-1 BDH:S199A, 0.1 mM TPP, 1 mM Mg2+, 1 mM DTT, 20 % DMSO 및 100 mM 에탄올을 포함하는 0.5-mL 반응 혼합물을 30도 두어 수행하였다.
모든 반응은 6시간 동안 수행하였으며, 각 생성물은 가스 크로마토그래피로 확인하였다. 또한, 생성물에 대한 백분율 수율은 하기와 같은 수식으로 계산하였다: 백분율 수율(%) = 생성물 수율(mM)/이론 수율(theoretical yield)(mM). 이론적으로, 2몰의 에탄올은 1몰의 아세토인, 2,3- 부탄디올 생성할 수 있다.
<1-9> 단계적 연쇄 반응의 재순환성 확인(Recyclability of cascade reactions)
정제된 효소를 활성 규소 산화물 입자와 혼합하고 이를 12시간, 4도 조건으로 배양하였다. 고정화하기 전에, 규소 산화물 입자(4830HT; Nanostructured & Amorphous Materials, Houston, TX, USA)를 글루타르알데히드(glutaraldehyde) (Sigma)를 포함하는 나노입자를 처리하여 활성화시켰다. 고정화 수율(%) 및 고정화 효율(%)은 다음과 같은 고정화된 효소로 다음과 같은 수학식으로 계산하였다 : 고정화 효율 = (αi/αf)×100, 고정화 수율 = [{Pi-(Pw + Ps)}/Pi] × 100. αi는 고정화된 효소의 총 활성도이고, αf는 자유 효소의 총 활성도이며, Pi는 조효소 제제의 총 단백질 함량이고, Pw 및 Ps는 고정 후 세척용액 또는 상등액의 단백질 농도를 의미한다.
아세토인 생산을 위하여, 50 mM HEPES 완충액(pH 8.0), 1 mM NAD+, 1.06 U mL-1 EtDH, 0.05 U mL-1 FLS:L482S, 0.98 U mL-1 NOX, 0.1 mM TPP, 1 mM Mg2+, 1 mM DTT, 20% DMSO 및 100 mM 에탄올을 포함하는 0.5mL 반응 혼합물로 반응을 수행하였다.
2,3-부탄디올 생성을 위하여, 50 mM HEPES 완충액(pH 8.0), 1 mM NAD+, 1 mM NADP+, 0.1 mg mL-1 EtDH:D46G, 0.2 mg mL-1 FLS:L482S, 0.1 mg mL-1 NOX, 0.1 mg mL-1 BDH:S199A, 0.1 mM TPP, 1 mM Mg2+, 1 mM DTT, 20% DMSO 및 100 mM 에탄올을 포함하는 0.5mL 반응 혼합물로 30도, 6시간 동안 반응을 수행하였다.
또한, 고정화된 효소의 재사용성을 확인하기 위하여, 상기와 같은 동일한 반응 조건하에 수행하였다. 각 1차 반응 순환 후, 고정화된 효소는 4000×g로 30분 동안 원심분리하여 제거하였다. 고정화된 효소를 수집하고 탈이온수 및 완충액으로 세척하였다. 2차 반응 순환을 위하여, 상기 고정화된 효소를 새로운 완충액에 용해시키고, 기질을 첨가한 후, 상기 1차 반응 순환과 동일하게 처리하였다.
<1-10> 분석 방법
세포 성장 분석
세포 성장은 분광 광도계(UV-1800, MAPADA)를 사용하여 600 nm에서 광학 밀도를 측정하여 확인하였다. 단백질 농도는 브레트포드 법(Bradford method)을 이용하여 측정하였고, 소 혈청 알부민(bovine serum albumin)을 표준 단백질로 사용하였다.
GC-MS 분석
키랄 칼럼(chiral column)(Supelco β-DEX™ 120, 30-m 길이, 0.25-mm 내경)이 장착된 가스 크로마토그래프 시스템(Agilent GC9860, Santa Clara, CA, USA)을 사용하여 정량하였다. 수행 조건은 다음과 같다: N2를 1.2 mL min-1의 유속으로 캐리어 카스로서 이용하였다; 인젝터 온도 및 검출기 온도는 각각 215 및 245도로 설정하였다; 칼럼 온도는 50도에서 1.5분간 유지시킨 후, 15°C min-1의 속도로 180도까지 증가시켰다.
<실시예 2> 본 발명의 다단계 효소 및 이의 변이체의 단백질 발현 확인
본 발명의 다단계 효소 및 이의 변이체 단백질 발현을 확인하기 위하여, 18도에서 24시간 유도한 후, 세포를 원심 분리하여 수득하고 ice bath에서 초음파 처리하여 파쇄하였다. 세포 파편을 제거하기 위하여 세포 용해물을 8000×g, 10분간 원심 분리하였다. NOX, EtDH, FLS, BDH 효소를 수득하기 위하여, 용해성 분획을 정제 프로토콜(GE Healthcare, Little Chalfont, UK)에 따라 HisTrap HP 칼럼을 이용하여 정제하였다. DDH 정제는 종래의 방법으로 수행하였다[M. Seyfried, et al., J. Bacteriol., 1996, 178, 5793]. 상기 각 정제된 효소는 초미세여과(ultrafiltration)하여 농축 및 탈염화시킨 후, SDS-PAGE로 검출하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, EtDH 및 EtDH:D46G 단백질과 BDH 및 BDH: S199A 단백질은 동일한 분자량으로 발현됨을 확인하여, 야생형과 변이형간의 발현되는 분자량은 차이가 없음을 확인하였다. 또한, 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) 유래 또는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 유래된 NOX 단백질은 각각 분자량이 상이하여, 동일한 유전자라 할지라도 유래에 따라 발현되는 단백질이 상이함을 확인하였다. 또한, FLS 유전자가 제대로 발현됨을 확인하였다.
<실시예 3> 본 발명의 다단계 효소 및 이의 변이체를 이용한 에탄올에서 C
4
화합물 생성 확인
본 발명의 다단계 효소 및 이의 변이체를 이용하여, 에탄올에서 C4 화합물인 아세토인(acetoin), 2,3-부탄디올(2,3-butanediol) 생성을 유도하기 위하여, 상기 무-세포 다중 효소 촉매 시스템을 이용한 인공 합성 경로를 도 1a 및 도 1b와 같이 설계하였다. 에탄올은 먼저 NAD(P)H-의존성 EtDH에 의해 탈수소되어 아세트알데히드를 생성하며, 응축 반응을 거쳐 본 발명의 FLS 및 이의 변이체에 의하여 아세토인을 생성한다. NOX는 NAD+를 재생하는 데 사용한다. 이어서, NADPH-의존성 BDH에 의해 아세토인이 환원되어 2,3-부탄디올이 생성된다.
<3-1> 본 발명의 FLS 효소에 따른 아세토인 생성 확인
본 발명의 FLS 효소에 의한 아세트알데히드에서 아세토인으로의 전환능을 확인하기 위하여, VP 반응을 수행하였으며, 기질인 아세트알데히드를 50 또는 100nM 처리하거나, 처리시간을 0 또는 6시간 두고 FLS 효소를 처리하여 각 조건을 설정하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 아세토인이 생성됨을 확인하여, FLS 효소를 처리하고, 기질인 아세트알데히드를 농도로 달리할 경우 얻어지는 아세토인 농도도 다르다는 것을 색의 변화가 짙음을 통해 효과적으로 확인하였다.
<3-2> 본 발명의 다단계 효소 및 이의 변이체를 이용한 아세토인, 2,3-부탄디올 생성 분석
본 발명의 다단계 효소 및 이의 변이체를 이용하여, 이를 무-세포 다중 효소 촉매 시스템을 이용한 인공 합성 경로로 아세토인, 2,3-부탄디올을 생성하였다. 그 후, 시판되는 표준 물질인 에탄올, 아세트알데히드, 3S/3R)-아세토인(acetoin)은 (2S, 3S)-2,3-부탄디올(butanediol), (2R, 3R)-2,3-부탄디올(butanediol), meso-2,3-부탄디올(butanediol)을 혼합하여 이를 대조군으로서 이용하였다. 또한, 본 발명의 무-세포 다중 효소 촉매에 따른 각 다단계 효소를 이용한 분석 결과를 GC/GC-MS 분석을 이용하여 수행하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 각 다단계 효소를 이용한 무-세포 다중 효소 촉매 시스템을 이용 시, 시판되는 표준 물질과 비교하여 동일한 피크의 아세토인, 2,3-부탄디올을 생성함을 확인하였다.
<실시예 4> 본 발명의 인공 합성 경로에서 다단계 효소 및 이의 변이체의 촉매 효과 확인
<4-1> 본 발명의 다단계 효소 및 이의 변이체의 운동 파라미터(kinetic parameter) 측정을 통한 촉매 효율 비교
본 발명의 다단계 효소 및 이의 변이체의 운동 파라미터(kinetic parameter) 측정을 통한 촉매 효율을 비교하기 위하여, 다음과 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, EtDH 및 EtDH:D46G의 운동 파라미터는 100 mM glycine-NaOH 완충액(pH 9.5), 5 mM Mg2+, 3 mM NAD+/NADP+ 및 0.5-100 mM 에탄올을 포함하는 반응 혼합물로 실온에 두어 확인하였다. FLS 및 이의 변이체의 운동 파라미터는 100 mM 인산 완충액(pH 8.0), 1 mM Mg+, 0.1 mM TPP 및 0.5-20 mM 아세트알데히드를 포함하는 반응 혼합물로 실온에 두어 확인하였다. BDH 및 BDH:S199A의 운동 파라미터는 50 mM Tris-HCl 완충액(pH 7.5), 0.2 mM NADPH, 1 mM DTT; 및 0.5-100 mM 아세토인 또는 0.5-10 mM 부탄온을 포함하는 반응 혼합물로 실온에 두어 평가하였다. 기질 친화도인 Km 및 kcat 값은 미카엘리스-멘텐 방정식(Michaelis-Menten equation)의 비선형 회귀 피팅으로 확인하였으며 3회 반복하였다. DDH 및 NOX는 종래 결과[(S. Kwak, et al., Bioresource Technol., 2013, 135, 432), (M. Kopke, et al., Appl. Environ. Microbiol., 2014, 80, 3394)]를 참고하여 비교하였다. 그 결과를 표 4에 나타내었다.
표 4에 나타낸 바와 같이, EtDH 및 EtDH:D46G 효소는 기질로서 에탄올, 조효소로서 NAD+를 이용 시, 각 kcat/Km 값이 17.09, 9.97s-1mM-1임을 확인하여, 조효소로서 NADP+를 이용하는 것 보다 NAD+를 이용하는 것이 촉매 효율을 높일 수 있음을 확인하였다.
또한, FLS 효소는 기질로서 아세트알데히드를, 조효소로서 TPP(thiamine pyrophosphate)를 이용 시, kcat/Km 값이 7.69×10-3 s-1mM-1임을 확인하였다. 또한, 이의 변이체인 FLS:L482S, FLS:L482R 및 FLS:L482E는 각 kcat/Km 값이 1.33×10-2, 1.06×10-2 및 9.66×10-3s-1mM-1임을 확인하여, 상기 야생형 FLS 효소 보다 각 72.95%, 37.84% 및 25.62%으로 촉매 효율이 증가됨을 확인하였다.
또한, BDH:S199A 효소는 야생형 BDH와 비교하였을 때, 기질로서 부탄온을, 조효소로서 NADPH를 이용 시 촉매효율이 증가됨을 확인하였다.
| Enzyme | Substrate/coenzyme | K m | k cat | k cat/K m |
| (mM) | (s-1) | (s-1 mM-1) | ||
| EtDH | Ethanol/NAD+ | 0.37 ± 0.05 | 6.28 ± 0.11 | 17.09 |
| Ethanol/NADP+ | 0 | 0 | 0 | |
| EtDH:D46G | Ethanol/NAD+ | 0.57 ± 0.03 | 5.65 ± 0.09 | 9.97 |
| Ethanol/NADP+ | 0.60 ± 0.02 | 0.99 ± 0.03 | 1.65 | |
| FLS | Acetaldehyde/TPP | 58.46 ± 2.32 | 0.45 ± 0.03 | 7.69 × 10-3 |
| FLS:L482S | Acetaldehyde/TPP | 47.45 ± 1.20 | 0.63 ± 0.01 | 1.33 × 10-2 |
| FLS:L482R | Acetaldehyde/TPP | 50.27 ± 1.44 | 0.53 ± 0.02 | 1.06 × 10-2 |
| FLS:L482E | Acetaldehyde/TPP | 50.95 ± 1.51 | 0.49 ± 0.03 | 9.66 × 10-3 |
| BDH | Acetoin/NADPH | 84.86 ± 7.98 | 157.0 ± 9.0 | 18.5 |
| Acetoin/NADH | 0 | 0 | 0 | |
| Butanone/NADPH | 1.94 ± 0.05 | 29.90 ± 1.02 | 15.41 | |
| Butanone/NADH | 0 | 0 | 0 | |
| BDH:S199A | Acetoin/NADPH | 116.1 ± 8.7 | 224.3 ± 9.72 | 19.31 |
| Acetoin/NADH | 0 | 0 | 0 | |
| Butanone/NADPH | 1.08 ± 0.03 | 40.78 ± 1.42 | 37.76 | |
| Butanone/NADH | 0 | 0 | 0 | |
| NOX | O2/NADH | 5.8 ×10-3 | 218.7 | 3.77 ×104 |
<4-3> 본 발명의 다단계 효소 및 이의 변이체의 열 안정성(Thermostability) 확인
본 발명의 다단계 효소 및 이의 변이체의 열 안정성을 확인하기 위하여, EtDH(에탄올, NAD+ 포함), EtDH:D46G(에탄올, NAD+ 포함), EtDH:D46G(에탄올, NADP+), EtDH:D46G (ethanol, NAD+ 포함), FLS(아세트알데히드, TPP 포함), FLS:L482S(아세트알데히드, TPP), BDH:S199A(아세토인, NADPH 포함), BDH:S199A(부탄온, NADPH 포함), NOX (O2, NADH 포함) 세포를 30, 37, 45 에서 6시간 동안 배양한 후 활성을 측정하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 열 안정성을 확인한 결과, 30도 조건에서 EtDH, FLS 및 NOX 효소는 각 87.91%, 70.43%, 및 91.30%의 열 안정성이 나타남을 확인하였다. 또한, 37도 및 45도에서 NOX 효소는 지속적인 열 안정성이 나타남을 확인하였다.
<실시예 5> 본 발명의 인공 합성 경로를 통한 아세토인 생성
<5-1> 에탄올에서 아세토인으로의 최적 반응 조건 확인
에탄올에서 아세토인의 생성을 위하여, EtDH, FLS 및 NOX 효소를 사용하였다. 구체적으로, 초기 반응은 50 mM HEPES 버퍼(pH 7.0), 0.1 mg mL-1 EtDH, 0.2 mg mL-1 FLS, 0.1 mg mL-1 NOX, 4 mM NAD+, 0.1 mM TPP, 1 mM Mg2+, 1 mM DTT, 20% DMSO, 초기 기질로서 100 mM 에탄올을 포함하는 0.5-mL 반응 혼합액을 이용하였다. 반응은 30도 조건에서 6시간 동안 진행하였고, 반응 용액에서 이론적 수득율(theoretical yield)의 35.96%인 17.98 mM의 아세토인이 생성됨을 확인하여, 본 발명의 인공 합성 경로를 이용시, 에탄올에서 아세토인으로 반응 유도가 가능함을 확인하였다.
또한, 온도, pH, 조효소(NAD+ 및 TPP) 및 금속 이온의 조건에 따라, 반응 최적 조건을 찾기 위하여, 온도는 20, 25, 30, 37 및 42도의 조건을 두었다. 또한, pH는 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5 및 8.5의 조건에서, NAD+ 는 1, 2, 4, 6, 8 mM 농도 조건에서, TPP는 1, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 및 0.5 mM 농도 조건에서, 금속 이온은 Mg2+, Mn2+, Ca2+, Fe2+, Ni2+, Cu2+ 및 Zn2+을 처리하여 최적 반응 조건을 확인하였다. 그 결과를 도 7a 내지 도 7e에 나타내었다.
도 7a의 결과 pH 조건은 8.0이, 도 7b의 결과 온도는 30도에서, 도 7c의 결과 NAD+의 농도는 1mM에서, 도 7d의 결과 TPP는 0.1mM 농도에서, 도 7e의 결과 금속 이온 Mg2+에서 가장 최적 반응 조건임을 확인하였으며, 에탄올에서 아세토인으로의 반응 플럭스를 향상시킴을 확인하였다.
또한, 상기 최적 반응 조건에 시간에 따른 아세토인의 생성을 확인하기 위하여, EtDH, FLS 및 NOX 효소를 이용하고 100 mM 에탄올을 기질로 하여 0, 2, 4, 6, 및 8 시간을 처리하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 6시간 처리 시, 이론적 수득율(theoretical yield)의 45.50%인 22.75 mM의 아세토인이 생성됨을 확인하였다.
<5-2> 에탄올에서 아세토인으로의 속도 조절 단계(Rate limiting step) 확인
에탄올에서 아세토인으로의 속도 조절 단계를 확인하기 위하여, 각 EtDH, FLS 또는 NOX 효소를 1/10의 농도로 줄이고 이를 제외한 나머지 효소는 일정한 농도를 유지하여 3회 반복하여 아세토인 양을 확인하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타낸 바와 같이, EtDH 또는 NOX 효소보다 FLS 효소의 농도가 줄어들었을 때, 아세토인의 생성에 영향을 끼침을 확인하였다. 따라서, 상기 FLS 효소는 아세토인 생성에 중요한 효소임을 확인하였다.
<5-3> FLS 효소 변이체의 촉매 효율 확인 및 선발
FLS 효소의 촉매 효율을 향상시키기 위해, HotSpot Wizard 2.0 서버를 사용하여 FLS 아미노산 서열의 돌연변이 핫스팟을 분석 하였다. 핫 스팟 마법사 2.0 서버를 사용하여 핫 스팟 잔기(T396, T446, M473, S477, L482 및 L499) 6개 부위 포화 돌연변이 유발을 확인하고, 이의 각 구조 모델을 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타낸 바와 같이, FLS에서 L482 부위가 효소 활성에 중요한 역할을 함을 확인하였다.
또한, 상기 FLS 변이체를 선발하기 위하여, FLS 및 이의 변이체인 L482S, L482R 및 L482E를 전체-세포 생촉매법을 이용하여 기질로서 아세트알데히드(100 mM)를 이용하여 아세토인을 생성 농도를 VP 법을 이용하여 확인하였다. 또한, 정제 후 FLS의 고유 활성(specific activity)인 0.16 U/mg과 비교하여, 각 변이체의 활성(%)을 비교하였으며 3회 반복하여 평균 ± 표준 편차값을 구하였다. 그 결과를 도 11a 및 11b에 나타내었다.
도 11a에 나타낸 바와 같이, 야생 FLS보다 FLS 변이체가 아세토인을 더 생성함을 확인하였다. 또한, 도 11b에 나타낸 바와 같이, FLS 변이체 L482S, L482R 및 L482E은 FLS 고유 활성보다 각 59.03%, 36.89% 및 34.12%로 증가됨을 확인하였다. 따라서, FLS 변이체 중L482S가 가장 아세토인 생성에 효과적임을 확인하였다.
<5-4> 야생형 FLS와 이의 변이체 FLS:L482S의 구조 및 활성 비교
야생형 FLS와 이의 변이체 FLS:L482S의 구조 및 활성을 비교하기 위하여, 100 ns에 대한 분자 역학 시뮬레이션 분석을 사용하여 야생형 FLS와 이의 변이체 FLS:L482S의 구조적 변화와 효소 활성간의 상관 관계를 확인하였다. 그 결과를 도 12a 내지 도 12d에 나타내었다.
도 12a 및 도 12b에 나타낸 바와 같이, 야생형 FLS와 이의 변이체 FLS:L482S는 기질인 아세트알데히드와 분자 상호 작용은 활성 부위 잔기 W480이며, 야생형 FLS보다(2.1Å) 변이체 FLS:L482S가 기질인 아세트알데히드에 더 강하게 결합(2.8Å)함을 확인하였다. 또한, 도 12c 및 도 12d에 나타낸 바와 같이, 변이체 FLS:L482S는 야생형 FLS보다 더 수소 결합함을 확인하였다.
<5-5> 기질 및 농도에 따른 FLS:L482S의 활성 비교
기질로서 에탄올을 이용하고 이의 농도에 따른 FLS:L482S의 활성을 비교하기 위하여, 50 mM HEPES 버퍼(pH 8.0), 1 mM NAD+, 1.06 Uml-1 EtDH, 0.05 U mL-1 FLS:L482S, 0.98 U mL-1 NOX, 0.1 mM TPP, 1 mM Mg2+, 1 mM DTT, 20% DMSO, 및 100-500 mM 에탄올을 포함하는 0.5-mL 반응 혼합액으로 반응을 수행하였다. 그 후, 0-6시간, 30도의 조건을 두어 아세토인 생성을 확인하였다. 그 결과를 도 13a 및 도 13b에 나타내었다.
도 13a에 나타낸 바와 같이, 반응 4시간째에 100 mM 에탄올을 기질로 이용 시, 이론적 수율의 88.78%에 해당하는 44.39 mM의 아세토인을 수득하였다. 아세토인 이외에, 에탄올의 대사 작용에 생성되는 아세트알데히드가 측정되었고, 이는 반응 2시간 동안 9.58 mM까지 축적된 다음 6 시간에 5.65 mM로 감소함을 확인하였다. 또한, 다른 부산물은 축적되지 않아, FLS:L482S를 이용한 아세토인의 생산을 위한 본 발명의 인공 합성 경로는 기질에 특이적임을 확인하였다.
도 13b에 나타낸 바와 같이, 아세토인 생산에 대한 기질 농도(200, 300, 400 및 500 mM)의 영향을 확인한 결과, 농도 의존적으로 아세토인 및 아세트알데히드의 생성이 증가됨을 확인하였다.
<실시예 6> 본 발명의 인공 합성 경로를 통한 2,3-부탄디올 생성
<6-1> EtDH:D46G 변이체 및 BDH:S199A 제작
에탄올에서 2,3-부탄디올 생성하는 본 발명의 인공 합성 경로를 설계 시, 에탄올을 아세트알데히드로 전환시키고, 조효소로서 NAD+ 및 NADP+를 동시에 이용하면서, NADH 축적을 방지하기 위한 NAD(P)H 퍼지 벨브 조절 노드(purge valve regulatory node)를 디자인하기 위해, EtDH의 변이체를 제작하였다. 구체적으로 PDB 데이터베이스에서 다른 탈수소효소(dehydrogenase)를 포함하는 EtDH(cnMDH)의 아미노산 서열을 정렬하였다. 도 14에 나타낸 바와 같이, 조효소로서 NAD+만을 이용하는 부위와, NAD+/NADP+ 동시 이용 부위를 확인하였고, 상기 동시 이용 부위를 포함하는 EtDH:D46G을 선발하였다. 또한, BDH:S199A는 종래 방법[D. J. Maddock, et al., Protein Eng. Des. Sel., 2015, 28, 251]을 이용하여 부위 특이적 돌연변이 유도(site-specific mutagenesis)하여 제작하였다.
또한, 상술한 도 6에 나타낸 바와 같이, 상기 변이체의 열안정성을 30, 37 및 45도에서 분석 확인한 결과, EtDH:D46G 변이체는 아세트알데히드를 조효소 NAD+ 및 NADP+가 있는 기질로 사용했을 때, 30 도에서 6 시간 동안 배양 한 후 활성 수준이 86.53% 및 86.67 %로 유지됨을 확인하였다. 또한, BDH:S199A 변이체는 조효소인 NADPH와 기질로서 아세토인을 사용 시, 30 도에서 6 시간 동안 활성 수준이80.81%로 유지됨을 확인하였다.
<6-2> 조효소에 따른 에탄올에서 2,3-부탄디올 생성 확인
조효소에 따른 에탄올에서 2,3-부탄디올 생성을 확인하기 위하여, EtDH: D46G, FLS:L482S, BDH:S199A 및 NOX 효소를 1 mM NAD+ 및/또는 1 mM NADP+ 존재 하에 100 mM 에탄올과 반응시킨 후, 2,3-부탄디올 생성 농도(mM)를 확인하였다. 그 결과를 도 15에 나타내었다.
도 15에 나타낸 바와 같이, NAD+를 조효소로 사용될 때 2,3-부탄디올은 검출되지 않음을 확인하였다. 반면, NADP+ 존재 시 에탄올로부터 18.20 mM의 2,3-부탄디올이 생성됨을 확인하였다. 따라서, BDH가 아세토인을 2,3-부탄디올로 전환시키는 NADPH 의존 효소인 바, 2,3-부탄디올 생성에는 NADP+ 조효소가 필요함을 확인하였다.
<6-3> 기질 및 농도에 따른 2,3-부탄디올 생성 확인
기질로서 에탄올을 이용하고 이의 농도에 따른 2,3-부탄디올 생성을 비교하기 위하여, 50 mM HEPES 버퍼(pH 8.0), 1 mM NAD+, 1 mM NADP+, 0.88 UmL-1 EtDH:D46G, 0.05 UmL-1 FLS:L482S, 0.98 UmL-1 NOX, 5.11 UmL-1 BDH:S199A, 0.1 mM TPP, 1 mM Mg2+, 1 mM DTT, 20% DMSO 및 100-500 mM 에탄올을 포함하는 0.5-mL 반응 혼합액으로 무-세포 다중 효소 촉매 반응을 수행하였다. 그 후, 0-6시간, 30도의 조건을 두어 2,3-부탄디올 생성을 확인하였다. 그 결과를 도 16a 및 도 16b에 나타내었다.
도 16a에 나타낸 바와 같이, 조효소인 NAD+ 및 1 mM NADP+를 동시에 사용 시, 반응 5 시간에서 이론적 수율의 88.28 %의 2,3-부탄디올이 생성됨을 확인하였다. 따라서, NADH 축적을 저해하고, 반응 과정 전반에 걸쳐 저농도의 아세토 인이 반응액에 축적되어 BDH:S199A에 의하여 아세토인에서 2,3- 부탄디올로의 높은 촉매 효율이 나타남을 확인하였다.
또한, 도 16b에 나타낸 바와 같이, 상이한 기질 농도를 사용 시, 농도 의존적으로 2,3-부탄디올이 생성되며, 에탄올 농도가 500 mM 일 때 최대 2,3-부탄디올 농도가 127.3 mM임을 확인하였다.
<실시예 7> 본 발명의 인공 합성 경로에서의 최적 효소 및 이의 고유 활성도
본 발명의 인공 합성 경로에서의 최적 효소와 이의 활성에 영향을 미치는 각 기질 및 조효소를 확인하였다. 또한, 각 효소의 고유 활성도(Specific activity)를 확인하였다. 그 결과를 표 5에 나타내었다.
표 5에 나타낸 바와 같이, EtDH 또는 EtDH:D46G 변이체 효소는 기질로서 에탄올, 조효소로서 NAD+을 이용 시, 고유 활성도가 각 10.64±0.15, 8.81±0.13 U mg-1임을 확인하였다. 또한, FLS:L482S 변이체 효소는 기질로 아세트알데히드, 조효소로 TPP를 이용 시, 0.26±0.01 U mg-1임을 관찰하였다. 또한, BDH:S199A 변이체 효소는 기질로 아세토인 또는 부탄온을 이용하고 조효소로 NADPH 이용 시 각 51.13 ± 3.74, 57.55 ± 2.65 U mg-1임을 관찰하였다. NOX 조효소는 O2 기질, NADH 조효소일 때 9.83 ± 0.48 mg-1의 고유 활성도가 나타남을 확인하였다.
| Enzyme | Substrate/coenzyme | Specific activity (U mg-1) |
| EtDH | Ethanol/NAD+ | 10.64 ± 0.15 |
| EtDH:D46G | Ethanol/NAD+ | 8.81 ± 0.13 |
| Ethanol/NADP+ | 1.35 ± 0.01 | |
| FLS:L482S | Acetaldehyde/TPP | 0.26 ± 0.01 |
| BDH:S199A | Acetoin/NADPH | 51.13 ± 3.74 |
| Butanone/NADPH | 57.55 ± 2.65 | |
| NOX | O2/NADH | 9.83 ± 0.48 |
<실시예 8> 아세토인 또는 2,3-부탄디올 생산을 위한 효소의 재순환성 확인(Recyclability of cascade reactions)
아세토인 또는 2,3-부탄디올 생산을 위한 효소의 재순환성을 확인하기 위하여, 상기 실시예 1-8의 방법에 따라, 아세토인 생산을 위한 각 효소 또는 2,3-부탄디올 생산을 위한 각 효소를 활성 규소 산화물 입자와 혼합하고 이를 12시간, 4도 조건으로 배양하였다. 고정화하기 전에, 규소 산화물 입자(4830HT; Nanostructured & Amorphous Materials, Houston, TX, USA)를 글루타르알데히드(glutaraldehyde) (Sigma)를 포함하는 나노입자를 처리하여 활성화 시키고, 1차-10차 반응 순환하여 고정화 수율(%) 및 고정화 효율(%)을 확인하였다. 그 결과를 도 17a 내지 17d에 나타내었다.
도 17a에 나타낸 바와 같이, 고정화된 효소를 이용 시, 효과적으로 에탄올에서 아세토인을 생성함을 확인하였다.
또한, 17b에 나타낸 바와 같이, 아세토인 생성을 위한 고정화된 효소를 1차 내지 10차 반응 순환한 결과, 10차 재사용 후에도 초기 1차 아세토인 생성 농도와 비교하여 94 %의 효율이 나타남을 확인하였다.
도 17c에 나타낸 바와 같이, 고정화된 효소를 이용 시 에탄올에서 2,3-부탄디올을 효과적으로 생성함을 확인하였다.
또한, 17d에 나타낸 바와 같이, 2,3-부탄디올 생성을 위한 고정화된 효소를 1차 내지 10차 반응 순환한 결과, 10차 재사용 후에도 초기 1차 2,3-부탄디올 생성 농도와 비교하여 73%의 효율이 나타남을 확인하였다.
<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp
<120> A method for producing butandiol from ethanol
<130> PN1710-396
<160> 32
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 1362
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Full-length NOX
<400> 1
atgaagattc ttgtcattgg tgctacccat gccggtacat ttgcaaccca gcagatccta 60
accgaccatc cagatgcaga ggttactgtc tacgaacgca ataacaacct gtccttcctc 120
tcgtgcggca ttgccttgtg ggttggtgat catgtcagtg acccggataa aatgttctat 180
tccagtcccg aagcactcgc taaactcggt gctaatatgc aaatggaaca tgatgtgctc 240
aatattgatc cagcaactaa aacagttgaa gtcaaggatc taaaaaccgg aaccgttact 300
accgatactt atgacaaatt agtctacaca accggatcga cgccaatcat tccaaatatt 360
cccggtatcc acgattcaaa cgtctactta tgcaaaaatt ggtccgacgc caagacgcta 420
aaagatctgg ccccgtccat taaaagcgcc attgtcatcg gtgcaggcta catcggtgca 480
gaattagccg aacaatttgc gttaaccgac aaagaagtca cgttaatcga tggacttcca 540
cgggttttgg cgaaaaactt tgacgccact atcacggatc gcgttgaaaa gctttacacc 600
gatcacgggg ttcacttggc actcaatgag atggttaccg agttcgcaca agctgatcag 660
ggtatcaagg ttacaaccaa taaaggcgac tataccgcgg atattgcaat tttatgtacc 720
ggcttccgtc cgaacacgga tctgctaaag gaccatctgg acaccctgcc taatggcgct 780
gtcataacaa atgcatatat gcagaccagt gaccccgaca ttttcgctgc tggtgatacc 840
gctaccgtcc actataatcc gactggcaaa aatgactaca tcccgcttgc gaccaacgca 900
gtccgtcaag gcattcttgt tggtaaaaat atcatgaccc ccacggaaaa atacctggga 960
acacaatcta gctcggccgt tgaacttttt gatcacgcca ttgcggcaag cggcctaacg 1020
gtggaaggcg ctcacacacg tggacttgag cttgatagtg tcacgatcga acaggattat 1080
cgccccgatt tcatgttaac cacaacgccg gtgctctgca gcctgacatg ggatcccaag 1140
acgcatgaag ttaaaggagg tgcctttttc tccaagcacg atatcagcca aagcgctaat 1200
gtcatttcgc ttgcgatcca gacccacatg acgatcgaaa cacttgcgat ggttgacatg 1260
ctcttccaac ctaacttcga tcagccgatt aactgggtaa atgccgtggc tatggcggca 1320
gttgacaagg ctaaaaagaa gccgacaaca ccggtagcct aa 1362
<210> 2
<211> 453
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AMINO ACID OF NOX
<400> 2
Met Lys Ile Leu Val Ile Gly Ala Thr His Ala Gly Thr Phe Ala Thr
1 5 10 15
Gln Gln Ile Leu Thr Asp His Pro Asp Ala Glu Val Thr Val Tyr Glu
20 25 30
Arg Asn Asn Asn Leu Ser Phe Leu Ser Cys Gly Ile Ala Leu Trp Val
35 40 45
Gly Asp His Val Ser Asp Pro Asp Lys Met Phe Tyr Ser Ser Pro Glu
50 55 60
Ala Leu Ala Lys Leu Gly Ala Asn Met Gln Met Glu His Asp Val Leu
65 70 75 80
Asn Ile Asp Pro Ala Thr Lys Thr Val Glu Val Lys Asp Leu Lys Thr
85 90 95
Gly Thr Val Thr Thr Asp Thr Tyr Asp Lys Leu Val Tyr Thr Thr Gly
100 105 110
Ser Thr Pro Ile Ile Pro Asn Ile Pro Gly Ile His Asp Ser Asn Val
115 120 125
Tyr Leu Cys Lys Asn Trp Ser Asp Ala Lys Thr Leu Lys Asp Leu Ala
130 135 140
Pro Ser Ile Lys Ser Ala Ile Val Ile Gly Ala Gly Tyr Ile Gly Ala
145 150 155 160
Glu Leu Ala Glu Gln Phe Ala Leu Thr Asp Lys Glu Val Thr Leu Ile
165 170 175
Asp Gly Leu Pro Arg Val Leu Ala Lys Asn Phe Asp Ala Thr Ile Thr
180 185 190
Asp Arg Val Glu Lys Leu Tyr Thr Asp His Gly Val His Leu Ala Leu
195 200 205
Asn Glu Met Val Thr Glu Phe Ala Gln Ala Asp Gln Gly Ile Lys Val
210 215 220
Thr Thr Asn Lys Gly Asp Tyr Thr Ala Asp Ile Ala Ile Leu Cys Thr
225 230 235 240
Gly Phe Arg Pro Asn Thr Asp Leu Leu Lys Asp His Leu Asp Thr Leu
245 250 255
Pro Asn Gly Ala Val Ile Thr Asn Ala Tyr Met Gln Thr Ser Asp Pro
260 265 270
Asp Ile Phe Ala Ala Gly Asp Thr Ala Thr Val His Tyr Asn Pro Thr
275 280 285
Gly Lys Asn Asp Tyr Ile Pro Leu Ala Thr Asn Ala Val Arg Gln Gly
290 295 300
Ile Leu Val Gly Lys Asn Ile Met Thr Pro Thr Glu Lys Tyr Leu Gly
305 310 315 320
Thr Gln Ser Ser Ser Ala Val Glu Leu Phe Asp His Ala Ile Ala Ala
325 330 335
Ser Gly Leu Thr Val Glu Gly Ala His Thr Arg Gly Leu Glu Leu Asp
340 345 350
Ser Val Thr Ile Glu Gln Asp Tyr Arg Pro Asp Phe Met Leu Thr Thr
355 360 365
Thr Pro Val Leu Cys Ser Leu Thr Trp Asp Pro Lys Thr His Glu Val
370 375 380
Lys Gly Gly Ala Phe Phe Ser Lys His Asp Ile Ser Gln Ser Ala Asn
385 390 395 400
Val Ile Ser Leu Ala Ile Gln Thr His Met Thr Ile Glu Thr Leu Ala
405 410 415
Met Val Asp Met Leu Phe Gln Pro Asn Phe Asp Gln Pro Ile Asn Trp
420 425 430
Val Asn Ala Val Ala Met Ala Ala Val Asp Lys Ala Lys Lys Lys Pro
435 440 445
Thr Thr Pro Val Ala
450
<210> 3
<211> 1173
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Full-length EtDH
<400> 3
atgacccatc tgaatattgc taatcgcgtg gatagttttt ttattccgtg tgttaccctg 60
tttggcccgg gttgcgcacg tgaaaccggc gcccgtgcac gtagtctggg cgcacgtaaa 120
gccctgattg ttaccgatgc tggcctgcat aaaatgggcc tgtcagaagt tgttgcaggt 180
catattcgtg aagctggtct gcaagcagtg atttttccgg gcgctgaacc gaatccgacc 240
gatgttaatg tgcatgatgg tgtgaaactg tttgaacgtg aagaatgtga ttttattgtg 300
tctctgggtg gcggtagcag ccatgattgc gctaaaggca ttggcctggt taccgcgggt 360
ggcggccata ttcgcgatta tgaaggtatt gataaaagta ccgtgccgat gaccccgctg 420
atttcaatta ataccaccgc tggtacagcc gccgaaatga cccgcttttg tattattacc 480
aattctagta atcatgttaa aatggcaatt gttgattggc gttgcacccc gctgattgcg 540
attgatgacc ctagtctgat ggtggcaatg ccgccggcgc tgaccgcggc aaccggcatg 600
gatgctctga cccatgcaat tgaagcgtat gtgtcaaccg cagccacccc gattaccgat 660
gcgtgtgcag aaaaagcgat tgtgctgatt gcggaatggc tgccgaaagc ggttgcgaat 720
ggcgatagca tggaagcccg tgcggctatg tgctatgcac agtatctggc aggcatggcg 780
tttaataatg catcactggg ttatgtgcac gctatggcac atcagctggg cggcttttat 840
aatctgccgc atggtgtgtg caatgcaatt ctgctgccgc atgtgtcaga atttaatctg 900
attgccgcac cggaacgcta tgcacgcatt gccgaactgc tgggtgaaaa tattggtggt 960
ctgtctgctc atgatgcggc gaaagctgct gttagcgcga ttcgcaccct gtctacctct 1020
attggtattc cggctggtct ggcgggtctg ggtgttaaag ccgatgacca tgaagttatg 1080
gccagcaatg ctcagaaaga tgcttgtatg ctgaccaatc cgcgcaaagc caccctggcc 1140
caggttatgg cgatttttgc tgccgccatg taa 1173
<210> 4
<211> 390
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AMINO ACID OF EtDH
<400> 4
Met Thr His Leu Asn Ile Ala Asn Arg Val Asp Ser Phe Phe Ile Pro
1 5 10 15
Cys Val Thr Leu Phe Gly Pro Gly Cys Ala Arg Glu Thr Gly Ala Arg
20 25 30
Ala Arg Ser Leu Gly Ala Arg Lys Ala Leu Ile Val Thr Asp Ala Gly
35 40 45
Leu His Lys Met Gly Leu Ser Glu Val Val Ala Gly His Ile Arg Glu
50 55 60
Ala Gly Leu Gln Ala Val Ile Phe Pro Gly Ala Glu Pro Asn Pro Thr
65 70 75 80
Asp Val Asn Val His Asp Gly Val Lys Leu Phe Glu Arg Glu Glu Cys
85 90 95
Asp Phe Ile Val Ser Leu Gly Gly Gly Ser Ser His Asp Cys Ala Lys
100 105 110
Gly Ile Gly Leu Val Thr Ala Gly Gly Gly His Ile Arg Asp Tyr Glu
115 120 125
Gly Ile Asp Lys Ser Thr Val Pro Met Thr Pro Leu Ile Ser Ile Asn
130 135 140
Thr Thr Ala Gly Thr Ala Ala Glu Met Thr Arg Phe Cys Ile Ile Thr
145 150 155 160
Asn Ser Ser Asn His Val Lys Met Ala Ile Val Asp Trp Arg Cys Thr
165 170 175
Pro Leu Ile Ala Ile Asp Asp Pro Ser Leu Met Val Ala Met Pro Pro
180 185 190
Ala Leu Thr Ala Ala Thr Gly Met Asp Ala Leu Thr His Ala Ile Glu
195 200 205
Ala Tyr Val Ser Thr Ala Ala Thr Pro Ile Thr Asp Ala Cys Ala Glu
210 215 220
Lys Ala Ile Val Leu Ile Ala Glu Trp Leu Pro Lys Ala Val Ala Asn
225 230 235 240
Gly Asp Ser Met Glu Ala Arg Ala Ala Met Cys Tyr Ala Gln Tyr Leu
245 250 255
Ala Gly Met Ala Phe Asn Asn Ala Ser Leu Gly Tyr Val His Ala Met
260 265 270
Ala His Gln Leu Gly Gly Phe Tyr Asn Leu Pro His Gly Val Cys Asn
275 280 285
Ala Ile Leu Leu Pro His Val Ser Glu Phe Asn Leu Ile Ala Ala Pro
290 295 300
Glu Arg Tyr Ala Arg Ile Ala Glu Leu Leu Gly Glu Asn Ile Gly Gly
305 310 315 320
Leu Ser Ala His Asp Ala Ala Lys Ala Ala Val Ser Ala Ile Arg Thr
325 330 335
Leu Ser Thr Ser Ile Gly Ile Pro Ala Gly Leu Ala Gly Leu Gly Val
340 345 350
Lys Ala Asp Asp His Glu Val Met Ala Ser Asn Ala Gln Lys Asp Ala
355 360 365
Cys Met Leu Thr Asn Pro Arg Lys Ala Thr Leu Ala Gln Val Met Ala
370 375 380
Ile Phe Ala Ala Ala Met
385 390
<210> 5
<211> 1173
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EtDH:D46G
<400> 5
atgacccatc tgaatattgc taatcgcgtg gatagttttt ttattccgtg tgttaccctg 60
tttggcccgg gttgcgcacg tgaaaccggc gcccgtgcac gtagtctggg cgcacgtaaa 120
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catattcgtg aagctggtct gcaagcagtg atttttccgg gcgctgaacc gaatccgacc 240
gatgttaatg tgcatgatgg tgtgaaactg tttgaacgtg aagaatgtga ttttattgtg 300
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ggcggccata ttcgcgatta tgaaggtatt gataaaagta ccgtgccgat gaccccgctg 420
atttcaatta ataccaccgc tggtacagcc gccgaaatga cccgcttttg tattattacc 480
aattctagta atcatgttaa aatggcaatt gttgattggc gttgcacccc gctgattgcg 540
attgatgacc ctagtctgat ggtggcaatg ccgccggcgc tgaccgcggc aaccggcatg 600
gatgctctga cccatgcaat tgaagcgtat gtgtcaaccg cagccacccc gattaccgat 660
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caggttatgg cgatttttgc tgccgccatg taa 1173
<210> 6
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AMINO ACID OF EtDH:D46G
<400> 6
Met Thr His Leu Asn Ile Ala Asn Arg Val Asp Ser Phe Phe Ile Pro
1 5 10 15
Cys Val Thr Leu Phe Gly Pro Gly Cys Ala Arg Glu Thr Gly Ala Arg
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Ala Arg Ser Leu Gly Ala Arg Lys Ala Leu Ile Val Thr Gly Ala Gly
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Leu His Lys Met Gly Leu Ser Glu Val Val Ala Gly His Ile Arg Glu
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65 70 75 80
Asp Val Asn Val His Asp Gly Val Lys Leu Phe Glu Arg Glu Glu Cys
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Asp Phe Ile Val Ser Leu Gly Gly Gly Ser Ser His Asp Cys Ala Lys
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Gly Ile Gly Leu Val Thr Ala Gly Gly Gly His Ile Arg Asp Tyr Glu
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Gly Ile Asp Lys Ser Thr Val Pro Met Thr Pro Leu Ile Ser Ile Asn
130 135 140
Thr Thr Ala Gly Thr Ala Ala Glu Met Thr Arg Phe Cys Ile Ile Thr
145 150 155 160
Asn Ser Ser Asn His Val Lys Met Ala Ile Val Asp Trp Arg Cys Thr
165 170 175
Pro Leu Ile Ala Ile Asp Asp Pro Ser Leu Met Val Ala Met Pro Pro
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Ala Leu Thr Ala Ala Thr Gly Met Asp Ala Leu Thr His Ala Ile Glu
195 200 205
Ala Tyr Val Ser Thr Ala Ala Thr Pro Ile Thr Asp Ala Cys Ala Glu
210 215 220
Lys Ala Ile Val Leu Ile Ala Glu Trp Leu Pro Lys Ala Val Ala Asn
225 230 235 240
Gly Asp Ser Met Glu Ala Arg Ala Ala Met Cys Tyr Ala Gln Tyr Leu
245 250 255
Ala Gly Met Ala Phe Asn Asn Ala Ser Leu Gly Tyr Val His Ala Met
260 265 270
Ala His Gln Leu Gly Gly Phe Tyr Asn Leu Pro His Gly Val Cys Asn
275 280 285
Ala Ile Leu Leu Pro His Val Ser Glu Phe Asn Leu Ile Ala Ala Pro
290 295 300
Glu Arg Tyr Ala Arg Ile Ala Glu Leu Leu Gly Glu Asn Ile Gly Gly
305 310 315 320
Leu Ser Ala His Asp Ala Ala Lys Ala Ala Val Ser Ala Ile Arg Thr
325 330 335
Leu Ser Thr Ser Ile Gly Ile Pro Ala Gly Leu Ala Gly Leu Gly Val
340 345 350
Lys Ala Asp Asp His Glu Val Met Ala Ser Asn Ala Gln Lys Asp Ala
355 360 365
Cys Met Leu Thr Asn Pro Arg Lys Ala Thr Leu Ala Gln Val Met Ala
370 375 380
Ile Phe Ala Ala Ala Met
385 390
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<211> 1692
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Full-length FLS
<400> 7
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gatgtgggtg ggaccatcga ggctttggcg caggccaccg cgcaagatgc ggcttggccg 1020
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cccttcgcat ga 1692
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<211> 563
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid of Full-length FLS
<400> 8
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His Glu Ala Ala Ala Gly His Ala Ala Glu Gly Tyr Ala Arg Ala Gly
50 55 60
Ala Lys Leu Gly Val Ala Leu Val Thr Ala Gly Gly Gly Phe Thr Asn
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Ala Val Thr Pro Ile Ala Asn Ala Arg Thr Asp Arg Thr Pro Val Leu
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Ala His Arg Val Met Ala Thr Glu His Ile Pro Arg Leu Val Met Gln
130 135 140
Ala Ile Arg Ala Ala Leu Ser Ala Pro Arg Gly Pro Val Leu Leu Asp
145 150 155 160
Leu Pro Trp Asp Ile Leu Met Asn Gln Ile Asp Glu Asp Ser Val Ile
165 170 175
Ile Pro Asp Leu Val Leu Ser Ala His Gly Ala His Pro Asp Pro Ala
180 185 190
Asp Leu Asp Gln Ala Leu Ala Leu Leu Arg Lys Ala Glu Arg Pro Val
195 200 205
Ile Val Leu Gly Ser Glu Ala Ser Arg Thr Ala Arg Lys Thr Ala Leu
210 215 220
Ser Ala Phe Val Ala Ala Thr Gly Val Pro Val Phe Ala Asp Tyr Glu
225 230 235 240
Gly Leu Ser Met Leu Ser Gly Leu Pro Asp Ala Met Arg Gly Gly Leu
245 250 255
Val Gln Asn Leu Tyr Ser Phe Ala Lys Ala Asp Ala Ala Pro Asp Leu
260 265 270
Val Leu Met Leu Gly Ala Arg Phe Gly Leu Asn Thr Gly His Gly Ser
275 280 285
Gly Gln Leu Ile Pro His Ser Ala Gln Val Ile Gln Val Asp Pro Asp
290 295 300
Ala Cys Glu Leu Gly Arg Leu Gln Gly Ile Ala Leu Gly Ile Val Ala
305 310 315 320
Asp Val Gly Gly Thr Ile Glu Ala Leu Ala Gln Ala Thr Ala Gln Asp
325 330 335
Ala Ala Trp Pro Asp Arg Gly Asp Trp Cys Ala Lys Val Thr Asp Leu
340 345 350
Ala Gln Glu Arg Tyr Ala Ser Ile Ala Ala Lys Ser Ser Ser Glu His
355 360 365
Ala Leu His Pro Phe His Ala Ser Gln Val Ile Ala Lys His Val Asp
370 375 380
Ala Gly Val Thr Val Val Ala Asp Gly Gly Leu Thr Tyr Leu Trp Leu
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405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
Gly Ser Val Gly Tyr Ser Ile Gly Glu Phe Asp Thr Leu Val Arg Lys
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Gln Leu Pro Leu Ile Val Ile Ile Met Asn Asn Gln Ser Trp Gly Trp
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530 535 540
Ala Leu Asp Pro Ile Pro Pro Glu Glu Leu Ile Leu Ile Gly Met Asp
545 550 555 560
Pro Phe Ala
<210> 9
<211> 1692
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FLS:L482S
<400> 9
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catctgttcg gcctgcacgg cattcatatc gatacgattt ttcaagcctg tctcgatcat 120
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tcgggcgcgc tgcgtgatga tgaaaccaac acgttgcagg cggggattga tcaggtcgcc 360
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gatgtgggtg ggaccatcga ggctttggcg caggccaccg cgcaagatgc ggcttggccg 1020
gatcgcggcg actggtgcgc caaagtgacg gatctggcgc aagagcgcta tgccagcatc 1080
gctgcgaaat cgagcagcga gcatgcgctc cacccctttc acgcctcgca ggtcattgcc 1140
aaacacgtcg atgcaggggt gacggtggta gcggatggtg gcctgaccta tctctggctg 1200
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aatgtcgcgg tcgcgctcga tccgatcccg cccgaagaac tcattctgat cggcatggac 1680
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AMINO ACID OF FLS:L482S
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Ile Phe Gln Ala Cys Leu Asp His Asp Val Pro Ile Ile Asp Thr Arg
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130 135 140
Ala Ile Arg Ala Ala Leu Ser Ala Pro Arg Gly Pro Val Leu Leu Asp
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Leu Pro Trp Asp Ile Leu Met Asn Gln Ile Asp Glu Asp Ser Val Ile
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Ile Pro Asp Leu Val Leu Ser Ala His Gly Ala His Pro Asp Pro Ala
180 185 190
Asp Leu Asp Gln Ala Leu Ala Leu Leu Arg Lys Ala Glu Arg Pro Val
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Ile Val Leu Gly Ser Glu Ala Ser Arg Thr Ala Arg Lys Thr Ala Leu
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Ser Ala Phe Val Ala Ala Thr Gly Val Pro Val Phe Ala Asp Tyr Glu
225 230 235 240
Gly Leu Ser Met Leu Ser Gly Leu Pro Asp Ala Met Arg Gly Gly Leu
245 250 255
Val Gln Asn Leu Tyr Ser Phe Ala Lys Ala Asp Ala Ala Pro Asp Leu
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Val Leu Met Leu Gly Ala Arg Phe Gly Leu Asn Thr Gly His Gly Ser
275 280 285
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<211> 563
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AMINO ACID OF FLS:L482R
<400> 11
Met Ala Met Ile Thr Gly Gly Glu Leu Val Val Arg Thr Leu Ile Lys
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Ala Gly Val Glu His Leu Phe Gly Leu His Gly Ile His Ile Asp Thr
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Asp Leu Asp Gln Ala Leu Ala Leu Leu Arg Lys Ala Glu Arg Pro Val
195 200 205
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Ser Ala Phe Val Ala Ala Thr Gly Val Pro Val Phe Ala Asp Tyr Glu
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Gly Leu Ser Met Leu Ser Gly Leu Pro Asp Ala Met Arg Gly Gly Leu
245 250 255
Val Gln Asn Leu Tyr Ser Phe Ala Lys Ala Asp Ala Ala Pro Asp Leu
260 265 270
Val Leu Met Leu Gly Ala Arg Phe Gly Leu Asn Thr Gly His Gly Ser
275 280 285
Gly Gln Leu Ile Pro His Ser Ala Gln Val Ile Gln Val Asp Pro Asp
290 295 300
Ala Cys Glu Leu Gly Arg Leu Gln Gly Ile Ala Leu Gly Ile Val Ala
305 310 315 320
Asp Val Gly Gly Thr Ile Glu Ala Leu Ala Gln Ala Thr Ala Gln Asp
325 330 335
Ala Ala Trp Pro Asp Arg Gly Asp Trp Cys Ala Lys Val Thr Asp Leu
340 345 350
Ala Gln Glu Arg Tyr Ala Ser Ile Ala Ala Lys Ser Ser Ser Glu His
355 360 365
Ala Leu His Pro Phe His Ala Ser Gln Val Ile Ala Lys His Val Asp
370 375 380
Ala Gly Val Thr Val Val Ala Asp Gly Gly Leu Thr Tyr Leu Trp Leu
385 390 395 400
Ser Glu Val Met Ser Arg Val Lys Pro Gly Gly Phe Leu Cys His Gly
405 410 415
Tyr Leu Asn Ser Met Gly Val Gly Phe Gly Thr Ala Leu Gly Ala Gln
420 425 430
Val Ala Asp Leu Glu Ala Gly Arg Arg Thr Ile Leu Val Thr Gly Asp
435 440 445
Gly Ser Val Gly Tyr Ser Ile Gly Glu Phe Asp Thr Leu Val Arg Lys
450 455 460
Gln Leu Pro Leu Ile Val Ile Ile Met Asn Asn Gln Ser Trp Gly Trp
465 470 475 480
Thr Arg His Phe Gln Gln Leu Ala Val Gly Pro Asn Arg Val Thr Gly
485 490 495
Thr Arg Leu Glu Asn Gly Ser Tyr His Gly Val Ala Ala Ala Phe Gly
500 505 510
Ala Asp Gly Tyr His Val Asp Ser Val Glu Ser Phe Ser Ala Ala Leu
515 520 525
Ala Gln Ala Leu Ala His Asn Arg Pro Ala Cys Ile Asn Val Ala Val
530 535 540
Ala Leu Asp Pro Ile Pro Pro Glu Glu Leu Ile Leu Ile Gly Met Asp
545 550 555 560
Pro Phe Ala
<210> 12
<211> 563
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AMINO ACID OF FLS:L482E
<400> 12
Met Ala Met Ile Thr Gly Gly Glu Leu Val Val Arg Thr Leu Ile Lys
1 5 10 15
Ala Gly Val Glu His Leu Phe Gly Leu His Gly Ile His Ile Asp Thr
20 25 30
Ile Phe Gln Ala Cys Leu Asp His Asp Val Pro Ile Ile Asp Thr Arg
35 40 45
His Glu Ala Ala Ala Gly His Ala Ala Glu Gly Tyr Ala Arg Ala Gly
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Ala Lys Leu Gly Val Ala Leu Val Thr Ala Gly Gly Gly Phe Thr Asn
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Gln Ala Gly Ile Asp Gln Val Ala Met Ala Ala Pro Ile Thr Lys Trp
115 120 125
Ala His Arg Val Met Ala Thr Glu His Ile Pro Arg Leu Val Met Gln
130 135 140
Ala Ile Arg Ala Ala Leu Ser Ala Pro Arg Gly Pro Val Leu Leu Asp
145 150 155 160
Leu Pro Trp Asp Ile Leu Met Asn Gln Ile Asp Glu Asp Ser Val Ile
165 170 175
Ile Pro Asp Leu Val Leu Ser Ala His Gly Ala His Pro Asp Pro Ala
180 185 190
Asp Leu Asp Gln Ala Leu Ala Leu Leu Arg Lys Ala Glu Arg Pro Val
195 200 205
Ile Val Leu Gly Ser Glu Ala Ser Arg Thr Ala Arg Lys Thr Ala Leu
210 215 220
Ser Ala Phe Val Ala Ala Thr Gly Val Pro Val Phe Ala Asp Tyr Glu
225 230 235 240
Gly Leu Ser Met Leu Ser Gly Leu Pro Asp Ala Met Arg Gly Gly Leu
245 250 255
Val Gln Asn Leu Tyr Ser Phe Ala Lys Ala Asp Ala Ala Pro Asp Leu
260 265 270
Val Leu Met Leu Gly Ala Arg Phe Gly Leu Asn Thr Gly His Gly Ser
275 280 285
Gly Gln Leu Ile Pro His Ser Ala Gln Val Ile Gln Val Asp Pro Asp
290 295 300
Ala Cys Glu Leu Gly Arg Leu Gln Gly Ile Ala Leu Gly Ile Val Ala
305 310 315 320
Asp Val Gly Gly Thr Ile Glu Ala Leu Ala Gln Ala Thr Ala Gln Asp
325 330 335
Ala Ala Trp Pro Asp Arg Gly Asp Trp Cys Ala Lys Val Thr Asp Leu
340 345 350
Ala Gln Glu Arg Tyr Ala Ser Ile Ala Ala Lys Ser Ser Ser Glu His
355 360 365
Ala Leu His Pro Phe His Ala Ser Gln Val Ile Ala Lys His Val Asp
370 375 380
Ala Gly Val Thr Val Val Ala Asp Gly Gly Leu Thr Tyr Leu Trp Leu
385 390 395 400
Ser Glu Val Met Ser Arg Val Lys Pro Gly Gly Phe Leu Cys His Gly
405 410 415
Tyr Leu Asn Ser Met Gly Val Gly Phe Gly Thr Ala Leu Gly Ala Gln
420 425 430
Val Ala Asp Leu Glu Ala Gly Arg Arg Thr Ile Leu Val Thr Gly Asp
435 440 445
Gly Ser Val Gly Tyr Ser Ile Gly Glu Phe Asp Thr Leu Val Arg Lys
450 455 460
Gln Leu Pro Leu Ile Val Ile Ile Met Asn Asn Gln Ser Trp Gly Trp
465 470 475 480
Thr Glu His Phe Gln Gln Leu Ala Val Gly Pro Asn Arg Val Thr Gly
485 490 495
Thr Arg Leu Glu Asn Gly Ser Tyr His Gly Val Ala Ala Ala Phe Gly
500 505 510
Ala Asp Gly Tyr His Val Asp Ser Val Glu Ser Phe Ser Ala Ala Leu
515 520 525
Ala Gln Ala Leu Ala His Asn Arg Pro Ala Cys Ile Asn Val Ala Val
530 535 540
Ala Leu Asp Pro Ile Pro Pro Glu Glu Leu Ile Leu Ile Gly Met Asp
545 550 555 560
Pro Phe Ala
<210> 13
<211> 1056
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Full-length BDH
<400> 13
atgaaaggtt ttgcaatgtt aggtattaac aaattaggat ggattgaaaa gaaaaaccca 60
gtgccaggtc cttatgatgc gattgtacat cctctagctg tatccccatg tacatcagat 120
atacatacgg tttttgaagg agcacttggt aatagggaaa atatgatttt aggccatgaa 180
gctgtaggtg aaatagccga agttggcagc gaagttaaag attttaaagt tggcgataga 240
gttatcgtac catgcacaac acctgactgg agatctttag aagtccaagc tggttttcag 300
cagcattcaa acggtatgct tgcaggatgg aagttttcca attttaaaga tggtgtattt 360
gcagattact ttcatgtaaa cgatgcagat atgaatcttg ccatactccc agatgaaata 420
cctttagaaa gtgcagttat gatgacagac atgatgacta ctggttttca tggagcagaa 480
cttgcagaca taaaaatggg ctccagcgtt gtagtaattg gtataggagc tgttggatta 540
atgggaatag ccggttccaa acttcgagga gcaggcagaa ttatcggtgt tggaagcaga 600
cctgtttgtg ttgaaacagc taaattttat ggagcaactg atattgtaaa ttataaaaat 660
ggtgatatag ttgaacaaat catggactta actcatggta aaggtgtaga ccgtgtaatc 720
atggcaggcg gtggtgctga aacactagca caagcagtaa ctatggttaa acctggcggc 780
gtaatttcta acatcaacta ccatggaagc ggtgatactt taccaatacc tcgtgttcaa 840
tggggctgcg gcatggctca caaaactata agaggaggat tatgccccgg cggacgtctt 900
agaatggaaa tgctaagaga tcttgttcta tataaacgtg ttgatttgag taaacttgtt 960
actcatgtat ttgatggtgc agaaaatatt gaaaaggccc ttttgcttat gaaaaataag 1020
ccaaaagatt taattaaatc agtagttaca ttctaa 1056
<210> 14
<211> 351
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AMINO ACID OF BDH
<400> 14
Met Lys Gly Phe Ala Met Leu Gly Ile Asn Lys Leu Gly Trp Ile Glu
1 5 10 15
Lys Lys Asn Pro Val Pro Gly Pro Tyr Asp Ala Ile Val His Pro Leu
20 25 30
Ala Val Ser Pro Cys Thr Ser Asp Ile His Thr Val Phe Glu Gly Ala
35 40 45
Leu Gly Asn Arg Glu Asn Met Ile Leu Gly His Glu Ala Val Gly Glu
50 55 60
Ile Ala Glu Val Gly Ser Glu Val Lys Asp Phe Lys Val Gly Asp Arg
65 70 75 80
Val Ile Val Pro Cys Thr Thr Pro Asp Trp Arg Ser Leu Glu Val Gln
85 90 95
Ala Gly Phe Gln Gln His Ser Asn Gly Met Leu Ala Gly Trp Lys Phe
100 105 110
Ser Asn Phe Lys Asp Gly Val Phe Ala Asp Tyr Phe His Val Asn Asp
115 120 125
Ala Asp Met Asn Leu Ala Ile Leu Pro Asp Glu Ile Pro Leu Glu Ser
130 135 140
Ala Val Met Met Thr Asp Met Met Thr Thr Gly Phe His Gly Ala Glu
145 150 155 160
Leu Ala Asp Ile Lys Met Gly Ser Ser Val Val Val Ile Gly Ile Gly
165 170 175
Ala Val Gly Leu Met Gly Ile Ala Gly Ser Lys Leu Arg Gly Ala Gly
180 185 190
Arg Ile Ile Gly Val Gly Ser Arg Pro Val Cys Val Glu Thr Ala Lys
195 200 205
Phe Tyr Gly Ala Thr Asp Ile Val Asn Tyr Lys Asn Gly Asp Ile Val
210 215 220
Glu Gln Ile Met Asp Leu Thr His Gly Lys Gly Val Asp Arg Val Ile
225 230 235 240
Met Ala Gly Gly Gly Ala Glu Thr Leu Ala Gln Ala Val Thr Met Val
245 250 255
Lys Pro Gly Gly Val Ile Ser Asn Ile Asn Tyr His Gly Ser Gly Asp
260 265 270
Thr Leu Pro Ile Pro Arg Val Gln Trp Gly Cys Gly Met Ala His Lys
275 280 285
Thr Ile Arg Gly Gly Leu Cys Pro Gly Gly Arg Leu Arg Met Glu Met
290 295 300
Leu Arg Asp Leu Val Leu Tyr Lys Arg Val Asp Leu Ser Lys Leu Val
305 310 315 320
Thr His Val Phe Asp Gly Ala Glu Asn Ile Glu Lys Ala Leu Leu Leu
325 330 335
Met Lys Asn Lys Pro Lys Asp Leu Ile Lys Ser Val Val Thr Phe
340 345 350
<210> 15
<211> 1056
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BDH:S199A
<400> 15
atgaaaggtt ttgcaatgtt aggtattaac aaattaggat ggattgaaaa gaaaaaccca 60
gtgccaggtc cttatgatgc gattgtacat cctctagctg tatccccatg tacatcagat 120
atacatacgg tttttgaagg agcacttggt aatagggaaa atatgatttt aggccatgaa 180
gctgtaggtg aaatagccga agttggcagc gaagttaaag attttaaagt tggcgataga 240
gttatcgtac catgcacaac acctgactgg agatctttag aagtccaagc tggttttcag 300
cagcattcaa acggtatgct tgcaggatgg aagttttcca attttaaaga tggtgtattt 360
gcagattact ttcatgtaaa cgatgcagat atgaatcttg ccatactccc agatgaaata 420
cctttagaaa gtgcagttat gatgacagac atgatgacta ctggttttca tggagcagaa 480
cttgcagaca taaaaatggg ctccagcgtt gtagtaattg gtataggagc tgttggatta 540
atgggaatag ccggttccaa acttcgagga gcaggcagaa ttatcggtgt tggagccaga 600
cctgtttgtg ttgaaacagc taaattttat ggagcaactg atattgtaaa ttataaaaat 660
ggtgatatag ttgaacaaat catggactta actcatggta aaggtgtaga ccgtgtaatc 720
atggcaggcg gtggtgctga aacactagca caagcagtaa ctatggttaa acctggcggc 780
gtaatttcta acatcaacta ccatggaagc ggtgatactt taccaatacc tcgtgttcaa 840
tggggctgcg gcatggctca caaaactata agaggaggat tatgccccgg cggacgtctt 900
agaatggaaa tgctaagaga tcttgttcta tataaacgtg ttgatttgag taaacttgtt 960
actcatgtat ttgatggtgc agaaaatatt gaaaaggccc ttttgcttat gaaaaataag 1020
ccaaaagatt taattaaatc agtagttaca ttctaa 1056
<210> 16
<211> 351
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AMINO ACID OF BDH:S199A
<400> 16
Met Lys Gly Phe Ala Met Leu Gly Ile Asn Lys Leu Gly Trp Ile Glu
1 5 10 15
Lys Lys Asn Pro Val Pro Gly Pro Tyr Asp Ala Ile Val His Pro Leu
20 25 30
Ala Val Ser Pro Cys Thr Ser Asp Ile His Thr Val Phe Glu Gly Ala
35 40 45
Leu Gly Asn Arg Glu Asn Met Ile Leu Gly His Glu Ala Val Gly Glu
50 55 60
Ile Ala Glu Val Gly Ser Glu Val Lys Asp Phe Lys Val Gly Asp Arg
65 70 75 80
Val Ile Val Pro Cys Thr Thr Pro Asp Trp Arg Ser Leu Glu Val Gln
85 90 95
Ala Gly Phe Gln Gln His Ser Asn Gly Met Leu Ala Gly Trp Lys Phe
100 105 110
Ser Asn Phe Lys Asp Gly Val Phe Ala Asp Tyr Phe His Val Asn Asp
115 120 125
Ala Asp Met Asn Leu Ala Ile Leu Pro Asp Glu Ile Pro Leu Glu Ser
130 135 140
Ala Val Met Met Thr Asp Met Met Thr Thr Gly Phe His Gly Ala Glu
145 150 155 160
Leu Ala Asp Ile Lys Met Gly Ser Ser Val Val Val Ile Gly Ile Gly
165 170 175
Ala Val Gly Leu Met Gly Ile Ala Gly Ser Lys Leu Arg Gly Ala Gly
180 185 190
Arg Ile Ile Gly Val Gly Ala Arg Pro Val Cys Val Glu Thr Ala Lys
195 200 205
Phe Tyr Gly Ala Thr Asp Ile Val Asn Tyr Lys Asn Gly Asp Ile Val
210 215 220
Glu Gln Ile Met Asp Leu Thr His Gly Lys Gly Val Asp Arg Val Ile
225 230 235 240
Met Ala Gly Gly Gly Ala Glu Thr Leu Ala Gln Ala Val Thr Met Val
245 250 255
Lys Pro Gly Gly Val Ile Ser Asn Ile Asn Tyr His Gly Ser Gly Asp
260 265 270
Thr Leu Pro Ile Pro Arg Val Gln Trp Gly Cys Gly Met Ala His Lys
275 280 285
Thr Ile Arg Gly Gly Leu Cys Pro Gly Gly Arg Leu Arg Met Glu Met
290 295 300
Leu Arg Asp Leu Val Leu Tyr Lys Arg Val Asp Leu Ser Lys Leu Val
305 310 315 320
Thr His Val Phe Asp Gly Ala Glu Asn Ile Glu Lys Ala Leu Leu Leu
325 330 335
Met Lys Asn Lys Pro Lys Asp Leu Ile Lys Ser Val Val Thr Phe
340 345 350
<210> 17
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EtDH1 Primer
<400> 17
gattgttacc ggtgctggcc tgcataaaat g 31
<210> 18
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EtDH2 Primer
<400> 18
cattttatgc aggccagcac cggtaacaat c 31
<210> 19
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FLS1 Primer
<400> 19
ggtagcggat ggtggcctgn nntatctctg gctgtcc 37
<210> 20
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FLS2 Primer
<400> 20
ggacagccag agatannnca ggccaccatc cgctacc 37
<210> 21
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FLS3 Primer
<400> 21
ccgccgcacg atccttgtgn nnggcgatgg ctcggtg 37
<210> 22
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FLS4 Primer
<400> 22
caccgagcca tcgccnnnca caaggatcgt gcggcgg 37
<210> 23
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FLS5 Primer
<400> 23
gccgctgatc gtcatcatcn nnaacaacca aagctgg 37
<210> 24
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FLS6 Primer
<400> 24
ccagctttgg ttgttnnnga tgatgacgat cagcggc 37
<210> 25
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FLS7 Primer
<400> 25
catcatcatg aacaaccaan nntgggggtg gacattg 37
<210> 26
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FLS8 Primer
<400> 26
caatgtccac ccccannntt ggttgttcat gatgatg 37
<210> 27
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FLS9 Primer
<400> 27
ccaaagctgg gggtggacan nncatttcca gcaattg 37
<210> 28
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FLS10 Primer
<400> 28
caattgctgg aaatgnnntg tccaccccca gctttgg 37
<210> 29
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FLS11 Primer
<400> 29
tcgcgtgacg ggcacccgtn nngaaaatgg ctcctat 37
<210> 30
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FLS12 Primer
<400> 30
ataggagcca ttttcnnnac gggtgcccgt cacgcga 37
<210> 31
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BDH1 primer
<400> 31
gaattatcgg tgttggagcc agacctgttt gtgttg 36
<210> 32
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BDH2 primer
<400> 32
caacacaaac aggtctggct ccaacaccga taattc 36
Claims (27)
- 서열번호 8로 표시되는 FLS(formolase) 아미노산에서 482번째 루신이 세린, 아르기닌 및 글루탐산으로 치환된 변이로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 변이를 포함하는 FLS 변이 아미노산.
- 제1항에 있어서, 상기 FLS는 서열번호 7으로 표시되는 염기서열로 코딩되는 것을 특징으로 하는, FLS 변이 아미노산.
- 제1항에 있어서, 상기 FLS에서 482번째 루신이 세린으로 치환된 변이는(FLS:L482S) 서열번호 10의 아미노산으로 표시되고, 482번째 루신이 아르기닌으로 치환된 변이는(FLS:L482R) 서열번호 11의 아미노산으로 표시되며, 482번째 루신이 글루탐산으로 치환된 변이는(FLS:L482E) 서열번호 12의 아미노산으로 표시되는 것을 특징으로 하는, FLS 변이 아미노산.
- 제1항에 있어서, 상기 FLS 변이 아미노산은 396번째 트레오닌의 변이, 446번째 트레오닌의 변이, 473번째 메티오닌의 변이, 477번째 세린의 변이 및 499번째 루신의 변이로 구성된 군에서 선택된 1종 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, FLS 변이 아미노산.
- 제1항에 있어서, 상기 FLS는 슈도모나스 플루오레스센스(Pseudomonas fluorescens)로부터 유래된 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
- 제1항의 FLS 변이 아미노산을 코딩하는 유전자.
- NOX(NADH oxidase) 유전자, EtDH(ethanol dehydrogenase) 유전자, EtDH의 변이체 유전자, FLS(formolase) 유전자, 제2항의 FLS 변이 아미노산을 코딩하는 유전자, BDH(2,3-butanediol dehydrogenase) 유전자 및 BDH의 변이체 유전자로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
- 제7항에 있어서, 상기 NOX 유전자는 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus)로부터 유래된 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
- 제7항에 있어서, 상기 EtDH 유전자 또는 EtDH 변이체 유전자는 쿠프리아비두스 네카터(Cupriavidus necator)로부터 유래된 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
- 제7항에 있어서, 상기 BDH 유전자 또는 BDH 변이체 유전자는 클로스트리디움 오토에타노지넘(Clostridium autoethanogenum)로부터 유래된 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
- 제7항에 있어서, 상기 NOX 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
- 제7항에 있어서, 상기 EtDH 유전자는 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
- 제7항에 있어서, 상기 EtDH의 변이체는 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 EtDH의 46번째 아스파르트산이 글리신으로 치환되고(EtDH:D46G), 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
- 제7항에 있어서, 상기 BDH 유전자는 서열번호 13의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
- 제7항에 있어서, 상기 BDH의 변이체는 서열번호 14의 아미노산 서열로 표시되는 BDH의 199번째 세린이 알라닌으로 치환되고(BDH:S199A), 서열번호 15의 염기서열 및 서열번호 16의 아미노산으로 표시되는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
- 제7항의 재조합 벡터가 도입된 형질전환 미생물.
- 제16항의 형질전환 미생물에서 생산된 단백질을 정제하고 반응시키는 단계;를 포함하는 부탄디올 생산 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 부탄디올은 meso-2,3-부탄디올, (2R,3R)-2,3-부탄디올, (2S,3S)-2,3-부탄디올 및 rac-2,3-부탄디올로 구성된 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 생산 방법은 무-세포(cell-free) 상태에서 제16항의 형질전환 미생물에서 생산된 단백질을 다단계 촉매 작용을 수행하여 부탄디올을 생산하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 생산 방법은 에탄올을 기질로 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 생산 방법은 조효소인 NAD+, NADP+, 비타민 B12 및 TPP(thiamine pyrophosphate)로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 조효소를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 생산 방법은 금속 이온 Mg2+, Mn2+, Ca2+, Fe2+, Ni2+, Cu2+ 및 Zn2+으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 금속 이온을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 생산 방법은 pH 5.0 내지 8.5의 조건으로 부탄디올을 생산하는 것을 특징으로 하는
- 제17항에 있어서, 상기 생산 방법은 16 내지 45도에서 부탄디올을 생산하는 것을 특징으로 하는
- 제16항의 형질전환 미생물에서 생산된 단백질을 나노입자에 고정하고 반응시키는 단계;를 포함하는 부탄디올 생산 방법.
- 제25항에 있어서, 상기 나노입자는 산화 규소(silicon oxide)를 부착하고 글루타알데히드(glutaraldehyde)와 반응시키는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제25항에 있어서, 상기 고정된 단백질 나노입자는 재사용이 가능한 것을 특징으로 하는 방법.
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