KR101694582B1 - 신규 포름알데하이드 탈수소효소 및 이를 이용한 포름알데하이드의 생산방법 - Google Patents

신규 포름알데하이드 탈수소효소 및 이를 이용한 포름알데하이드의 생산방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규 포름알데하이드 탈수소효소의 유전자로부터 발현되는 포름산에 대한 독립적 환원활성을 보유한 포름알데하이드 탈수소효소, 상기 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질 전환된 균주로부터 포름알데하이드 탈수소효소를 제조하는 방법 및 그 효소의 환원반응을 통하여 포름산으로부터 포름알데하이드를 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

신규 포름알데하이드 탈수소효소 및 이를 이용한 포름알데하이드의 생산방법 {A NOVEL FORMALDEHYDE DEHYDROGENASE AND A METHOD FOR FORMALDEHYDE PRODUCTION USING THE SAME}
본 발명은 신규 포름알데하이드 탈수소효소 및 이를 이용한 포름알데하이드의 생산방법에 관한 것으로 더욱 상세하게는 버크올데리아 멀티보란스 (KTCT 2970) 유래 신규 포름알데하이드 탈수소효소 및 상기 효소가 NADH 조효소를 이용하여 포름산에서 포름알데하이드를 제조하는 방법에 관한 것이다.
생체촉매 반응들은 기존 화학촉매들이 수행할 수 없었던 반응들을 포함한 다양한 촉매반응들을 생체친화적인 환경에서 수행함으로써 생명공학의 발전과 함께 산업적으로 빠르게 성장 중인 분야이다.
대표적으로 키랄성 화합물, 알코올, 알데하이드, 아미노산 및 의약물질 중간체의 합성, 생분해 또는 생체 응용에 적합한 고분자의 합성, 분석 및 진단용 바이오센서의 개발 등에 응용되고 있다. 또한 현재 이산화탄소 농도의 증가와 이에 따른 지구온난화로 인한 문제로 학계와 산업계에서 이산화탄소의 저감 연구와 더불어 이산화탄소의 환원반응에 의해 새로운 에너지를 생산하고자 하는 응용분야의 연구를 수행하고 있다. 즉 포름산 탈수소효소를 통해 이산화탄소가 포름산으로 변환되고, 생성된 포름산은 포름알데하이드 탈수소효소에 의해 포름알데하이드로 변환되며, 마지막으로 알코올 탈소수효소가 포름알데하이드를 메탄올로 전환시킨다. 이와같은 다중 효소시스템의 완성을 위해 포름알데하이드 탈수소효소가 반드시 필요하다. 이러한 중요성 및 유용성에도 불구하고 포름알데하이드 탈수소효소의 환원반응은 산화반응에 비해 거의 보고 된 바가 없다. 또한 일반적 탈수소효소의 특성상 산화반응이 환원반응에 비해 열역학적으로 월등히 유리하고 보다 잘 일어남에 따라 독립적인 환원활성을 나타내는 포름알데하이드 탈수소효소가 보고된 바 없다.
따라서 포름산을 포름알데하이드로 변환하는 독립적인 환원성을 갖는 신규 포름알데하이드 탈수소효소를 확보하는 것은 이를 다중효소 시스템에 적용시켜 이산화탄소를 이용 메탄올을 생산할 수 있는 것 뿐만 아니라, 산업적으로 중요한 다양한 케미칼의 생산에 막중한 역할을 할 것이다.
본 발명은 상기의 문제점을 해결하고, 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 첫 번째 목적은 포름산을 독립적으로 환원시키는 포름알데하이드 탈수소효소를 제공하는 것이다.
본 발명의 두 번째 목적은 상기 포름알데하이드 탈수소효소를 코딩하는 유전자를 제공하는 것이다.
본 발명의 세 번째 목적은 상기 포름알데하이드 탈수소효소의 유전자를 포함한 재조합 발현벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 네 번째 목적은 형질전환된 재조합 대장균을 포함하는 모든 형질전환 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다섯 번째 목적은 형질전환된 균주를 이용한 재조합 포름알데하이드 탈수소효소 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 환원활성 보유 포름알데하이드 탈수소효소를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 효소는 버크올데리아 멀티보란스 유래인 것이 바람직하나, 유전공학적인 방법이나 화학적인 합성방법을 통하여 제조될 수 있다.
본 발명의 일 구체 예에 있어서, 본 발명의 상기 효소의 분자량은 46.5 kDa인 것을 특징으로 한다.
또 본 발명은 상기 본 발명의 효소를 코딩하는 포름알데하이드 탈수소효소 유전자를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것이 바람직하나, 유전자 코드의 디제너러시 등을 고려하여 서열번호 2에 기재된 서열과 적어도 85% 이상, 바람직하게는 적어도 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상 상동성을 가지는 서열이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또한 본 발명은 상기 본 발명의 포름알데하이드 탈수소효소 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.
또 본 발명은 상기 본 발명의 재조합 발현벡터로 형질전환된 균주를 배양하여 포름알데하이드 탈수소효소를 생산하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 본 발명의 포름알데하이드 탈수소효소를 기질에 처리하여 상기 효소의 환원 반응을 통해 기질로부터 포름알데하이드를 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 기질은 포름산인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또한 본 발명은 상기 본 발명의 포름알데하이드 탈수소효소를 유효성분으로 포함하는 포름알데하이드 생산용 조성물을 제공한다.
이하 본 발명을 설명한다.
본 발명에서는 포름산으부터 포름알데하이드를 생산할 수 있는 버크올데리아 멀티보란스 (KTCT 2970) 유래 신규 포름알데하이드 탈수소효소를 소개하고, 상기 시스템을 이용하여 포름산으로부터 효율적으로 포름알데하이드를 생산할 수 있는 반응 조건을 제시하고자 한다.
본 발명은 서어던 하이브리다이제이션과 콜로니 혼성화를 통하여 버크올데리아 멀티보란스로부터 포름알데하이드 탈수소효소 유전자를 클로닝하는 것을 특징으로 한다. 또한 본 발명은 포름알데하이드의 생산방법에 있어서, 버크올데리아 멀티보란스(KTCT 2970, Burkholderia multivorans) 유래 포름산 탈수소효소를 생성하는 것을 특징으로 한다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 포름알데하이드 탈수소효소는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 가진 것을 특징으로 한다. 또, 서열번호 2의 아미노산 서열에 대해서, 이들 아미노산 서열을 가진 단백질이 표시하는 포름알데하이드 탈수소효소 활성이 손상되지 않는 범위 내에서, 1 이상의 아미노산의 결실, 치환 및 부가의 적어도 1 종의 변이가 도입된 변이 포름알데하이드 탈수소효소도 본 발명에 관한 포름알데하이드 탈수소효소에 포함된다.
또, 본 발명에는 서열번호 2의 아미노산서열을 가진 포름알데하이드 탈수소효소를 코딩하는 포름알데하이드 탈수소효소 유전자가 포함되고, 그 유전자 서열로서는 서열번호 1로 표시되는 것을 들 수 있다. 또, 이들 서열번호 1의 염기서열을 변이시켜서 얻게 되는 상기한 변이 포름알데하이드 탈수소효소를 코딩하는 변이 포름알데하이드 탈수소효소 유전자도 본 발명에 관한 포름알데하이드 탈수소효소 유전자에 포함된다.
또, 본 발명에는, 상기 포름알데하이드 탈수소효소 유전자를 함유하는 재조합벡터, 상기 재조합벡터에 의해서 형질전환된 형질전환체가 포함된다. 또한, 본 발명에는 이 형질전환체를 배양하여 얻게 되는 배양물로부터 포름알데하이드 탈수소효소를 분리하는 것을 특징으로 하는 포름알데하이드 탈수소효소의 제조방법이 포함된다.
본 발명의 포름알데하이드 탈수소효소 유전자는 버크올데리아 멀티보란스 (KTCT 2970)의 균체로부터 분리된 것이다. 포름알데하이드 탈수소효소 유전자를 가진 균주로부터 염색체 DNA를 취득한 후, 설계한 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 하고, 버크올데리아 멀티보란스 (KTCT 2970) 균주의 염색체 DNA를 주형으로 해서 폴리머라제 연쇄반응(PCR)을 행하여, 포름알데하이드 탈수소효소 유전자를 부분적으로 증폭한다. 이와 같이 해서 얻게 된 PCR 증폭 단편은 버크올데리아 멀티보란스 (KTCT 2970) 균주의 포름알데하이드 탈수소효소 유전자에 100% 가까운 상동성을 가진 단편으로서, 콜로니하이브리디제이션을 행할 때의 프로브로서 높은 S/N비를 기대할 수 있는 동시에, 하이브리디제이션의 스트린전시(stringency)제어를 용이하게 한다. 상기의 PCR 증폭 단편을 적당한 시약을 사용해서 표지하고, 상기 염색체 DNA 라이브러리에 대해서 콜로니 하이브리디제이션을 행하여, 포름알데하이드 탈수소효소 유전자를 선발한다 (Current Protocols in Molecular Biology, 1권, 603페이지, 1994년).
상기의 방법에 의해 선발된 대장균으로부터 알칼리법(Current Protocols in Molecular Biology, 1권, 161페이지, 1994년)을 사용하여 플라스미드를 회수함으로써, 포름알데하이드 탈수소효소 유전자를 함유하는 DNA단편을 얻을 수 있다. 또한, 상기 방법에 의해 염기서열을 결정한 후에는, 상기 염기서열을 가진 DNA단편의 제한효소에 의한 분해에 의해 조제한 DNA 단편을 프로브로 사용하여 하이브리다이즈함으로써 본 발명의 전체 유전자를 얻는 것이 가능하다. 서열번호 1에는 본 발명의 포름알데하이드 탈수소효소 유전자의 염기서열을 서열번호 2에는 상기 유전자가 코딩하는 아미노산서열을 표시한다.
본 발명의 형질전환된 미생물은 본 발명의 재조합벡터를 상기 재조합벡터를 제작할 때 사용한 발현벡터에 적합한 숙주 속에 도입함으로써 얻게 된다. 본 발명에 사용된 발현벡터로서는 pET28a을 사용하였으나 상기의 요건을 만족하는 발현벡터이면 어느 것이나 사용 가능하다.
본 발명에 관한 포름알데하이드 탈수소효소의 제조는, 이것을 코딩하는 유전자를 가진 재조합벡터에 의해 숙주를 형질전환해서 얻은 형질전환체를 배양하고, 배양물(배양균체 또는 배양상청액) 속에 유전자 산물인 포름알데하이드 탈수소효소를 생성 축적시켜, 배양물로부터 효소를 취득함으로써 행하여진다.
포름알데하이드 탈수소효소의 취득 및 정제는, 얻게 되는 배양물로부터 균체 또는 상청액을 원심 회수하여, 균체파쇄, 친화성 크로마토그래피, 양이온 또는 음이온교환 크로마토그래피 등을 단독으로 또는 조합함으로써 행할 수 있다.
본 발명에서 환원성을 보이는 포름알데하이드 탈수소효소를 개발하고자 버크올데리아 멀티보란스 (KTCT 2970)로부터 포름알데하이드 탈수소효소 유전자를 클로닝하였다. 발현된 재조합 버크올데리아 멀티보란스 (KTCT 2970 Burkholderia multivorans) 유래의 포름알데하이드 탈수소효소가 NADH를 조효소로 사용한 환원반응을 통해 포름산으로부터 포름알데하이드를 제조할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 산업적으로 유용한 포름알데하이드 탈수소효소를 제조하기 위하여 버크올데리아 멀티보란스 (KTCT 2970)의 유전자로부터 포름알데하이드 탈수소효소를 암호화하는 유전자를 클로닝하고, 전기 유전자의 염기서열 및 그로부터 유추되는 아미노산 서열을 분석한다. 본 발명의 포름알데하이드 탈수소효소는 포름산을 기질로 하여 환원반응을 촉매하여 포름알데하이드를 형성하는 효소로서, 보다 바람직하게는 환원반응에 대한 특이성을 갖고 포름산을 포름알데하이드로 전환시킬 수 있는 능력을 갖는 포름알데하이드 탈수소효소를 의미한다.
본 발명의 포름알데하이드 탈수소효소는 다음의 특징을 갖는다: (ⅰ) 분자량이 약 46.5 kDa; (ⅱ) 기존에 알려진 포름알데하이드 탈수소효소는 단독으로 포름산을 포름알데하이드로 환원시키는 활성을 거의 보이지 않고 있다. 그러나 본 발명의 포름알데하이드 탈수소효소는 다중효소 시스템인 아닌 단독으로 NADH 조효소를 사용하여 포름산을 환원시켜 포름알데하이드를 생산한다. 따라서 포름산에서 포름알데하이드를 생산하는 본 발명의 효소는 매우 특이하다 할 것이며, 경제적인 포름알데하이드의 생물촉매 생산에 유용하게 적용될 것이다.
본 발명에서 규명한 버크올데리아 멀티보란스 (Burkholderia multivorans) 유래의 포름알데하이드 탈수소효소는 NADH 조효소를 이용하고 포름산을 환원시켜 포름알데하이드를 효율적으로 생산할 수 있다.
도 1은 벡터 pET28a의 벡터맵으로 버크올데리아 멀티보란스 (KTCT 2970, Burkholderia multivorans)의 염색체에서 포름알데하이드 탈수소효소 유전자를 지니고 있는 단편을 찾아 대장균에서 이용되는 벡터에 클로닝한 것이다.
도 2는 버크올데리아 멀티보란스 (Burkholderia multivorans) 로부터 유래된 포름알데하이드 탈수소효소 유전자를 포함하는 발현벡터의 제조방법을 나타내는 도면이다.
도 3은 버크올데리아 멀티보란스 (Burkholderia multivorans) 로부터 유래된 포름알데하이드 탈수소효소의 SDS-PAGE 젤 사진이다. 1; 사이즈 마커, 2; 발현벡터를 형질전환된 균주를 이용하여 발현된 수용성 단백질, 3; 포름알데하이드 탈수소효소의 불용성 단백질, 4; 포름알데하이드 탈수소효소의 수용성 단백질.
도 4는 환원반응을 통해 포름알데하이드의 생산을 위한 최적 pH를 나타낸 도이다.
도 5는 포름알데하이드 탈수소효소의 동역학적 매개변수 그래프이다.
이하, 본 발명을 다음의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명하나, 본 발명이 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 버크올데리아 멀티보란스 (Burkholderia multivorans) 로부터 신규 포름알데하이드 탈수소효소 유전자의 클로닝
일반적으로 유사한 기능을 지니는 유전자의 경우에는 각 염기서열과 크기가 어느 정도 유사하다고 알려져 있다. 따라서 버크올데리아 멀티보란스의 포름알데하이드 탈수소효소의 유전자도 약 1.2 kb 정도의 크기를 지녔을 것으로 추정하고 다른 균의 이미 알려진 포름알데하이드 탈수소효소 염기서열을 바탕으로 버크올데리아 멀티보란스의 포름알데하이드 탈수소효소 전체 유전자를 클로닝하였다.
클로닝에는 대장균 pET28a 벡터를 사용하였다. 대장균의 배양 배지로는 일반적 조성의 LB 배지를 사용하였고, 버크올데리아 멀티보란스의 배양에는 상기 펩톤한천배지 (Malt extract peptone agar)를 사용하였다. 대장균의 평판(plate) 배지로는 각각 LB 아가(agar)와 3～5% 설탕, 0.3～0.5% 쇠고기 추출물, 0.9～1.1% 박토 펩톤, 1.3～1.7% 아가 조성의 아가 플레이트를 사용하였다. 필요에 따라 50 ㎍/ml 엠피실린(amipicillin)을 첨가하였다. 배양 방법은 버크올데리아 멀티보란스의 경우, 배지 50 ml이 들어 있는 250 ml의 삼각 플라스크에 접종하여 37℃, 200 rpm 조건에서 5일간 배양하였고, 대장균의 경우에는 37℃, 200 rpm 조건에서 16 시간 배양하였다.
대부분의 DNA는 아가로스겔(TAE buffer, 0.5%) 전기영동법으로 확인하였고, 겔 상에서 DNA 밴드의 정제는 QiaXII 겔 추출장치(QIAGEN, USA)를 이용하였으며, DNA간의 연결(ligation) 반응은 T4 DNA 연결효소(NEB)를 이용하였다. 또한 버크올데리아 멀티보란스 (Burkholderia multivorans)의 RNA 추출은 Qiagen plant total RNA kit(QIAGEN)을 이용하였으며, cDNA 합성을 위한 역전사 효소는 Oligo-dT RT-mix(intron)를 이용하였다.
포름알데하이드 탈수소효소 유전자를 클로닝하기 위하여 버크올데리아 멀티보란스 (Burkholderia multivorans)염색체를 분리하였다. 버크올데리아 멀티보란스 포름알데하이드 탈수소효소 유전자의 일부분을 증폭하기 위해 다른 균에서 이미 알려진 포름알데하이드 탈수소효소 염기서열을 바탕으로 비특이적 프라이머(degenerated primer), BmFalDH_ 5'- SP1 atttgyggcagcgatcwrcatatgkwysrc (서열번호 3)와 BmFalDH_ SP1-Attggcrthccgggnytgtaygtgmcc (서열번호 4)를 제작하였다. 이를 이용하여 연쇄중합반응에 의해 780 bp 크기에 해당하는 포름알데하이드 탈수소효소 유전자 일부를 버크올데리아 멀티보란스 염색체에서 증폭하였다.
그리고 증폭된 상기의 부분 염기서열 중 그 절단 부위가 존재하지 않는 제한 효소인 Sac1, Not1, Xho1, Sal1을 이용하여 버크올데리아 멀티보란스의 genomic DNA를 완전히 절단하였다. 그리고 앞서 중합효소 연쇄반응을 통하여 얻은 DNA 단편을 이용하여 방사능 표지된 탐침자(probe)를 제작하였다. 이를 이용하여 서어던 하이브리다이제이션으로 찾고자 하는 유전자를 지닌 DNA 단편을 탐색하였다. 2.7 kb 정도의 Sac1으로 잘린 조각과 약 5.3 kb 정도의 Sal 1으로 잘린 조각을 이용하여 원하는 유전자를 탐색하였다. 버크올데리아 멀티보란스 염색체를 Sac1으로 절단한 후 분리한 2.7 kb 정도 크기의 DNA 조각과 Sal 1으로 절단한 5.3 kb 정도의 DNA 단편들을 pUC에 클로닝하고 이를 pUC- faldh 라고 명명하였다(도 1).
pUC- faldh 라이브러리에서 앞서 만든 780 bp 크기의 탐침자를 이용하여 콜로니 혼성화를 수행하여 원하는 포름알데하이드 탈수소효소의 유전자를 지닌 클론을 결정하였다. 그리고 결정한 클론을 이용하여 염기서열을 분석함으로써 포름알데하이드 탈수소효소의 전체 유전자 염기서열 1,197 bp를 밝혔으며 (서열번호 1), 이는 예상한 바와 같이 다른 여러 균에서 밝혀진 포름알데하이드 탈수소효소 유전자와 크기가 비슷하였다.
실시예 2: 재조합 발현 벡터 및 재조합 균주 제조
상기 실시예 1에 따른 포름알데하이드 탈수소효소를 암호화하는 유전자를 이용하여, 전기 포름알데하이드 탈수소효소를 대장균에서 대량으로 발현시키기 위하여, 발현 벡터 pET28a(Novagen, 미국)의 BamHⅠ과 Xho1 부위에 상기 효소 유전자를 삽입한 후 대장균 BL21(DE3)(NEB, 영국)에 형질 전환시켰다 (도 2).
실시예 3: 재조합 포름알데하이드 탈수소효소의 발현 및 순수 분리
상기 실시예 2에서 제조된 재조합 균주를 LB 배지에 접종하고 37℃에서 24시간 동안 배양한 후 SDS-PAGE 젤에서 발현된 단백질을 확인하였다 (도 3).
상기 실시예 2의 방법으로 발현시킨 재조합 포름알데하이드 탈수소효소를 정제하기 위하여, 재조합 균주 배양액을 원심분리 (8000×g, 10분)하여 균체만을 모은 후, 초음파 처리하여 대장균의 세포벽을 파쇄하고, 20,000×g에서 20분간 원심분리하여 침전물(균체)을 제거하고 상등액을 수득하였다. 수득한 후, 최종적으로 Ni-NTA His-tag 결합 크로마토그래피(Qiagen, 독일)를 수행하여, 재조합 포름알데하이드 탈수소효소를 순수 분리하였다.
실시예 4: 환원 반응을 통한 포름알데하이드 생산을 위한 최적 pH
상기 실시예 3에서 제조한 포름알데하이드 탈수소효소를 이용하여 포름알데하이드의 생산실험을 다음과 같은 조건에서 수행하였다. 포름알데하이드 탈수소효소를 이용하는 본 발명의 포름알데하이드 생산방법에서, 반응 시 pH를 변화시키면서 포름알데하이드의 생산량을 확인하였다.
효소 정제 방법은 실시예 3과 같이 수행하였으며, 100 mM의 기질 용액, 25℃에서, pH 4.0-10.0까지 변화시키면서 포름알데하이드의 생산량을 확인하였다. 도 4에 나타난 바와 같이, pH를 7.0에서 포름알데하이드의 생산량이 가장 높았다. 따라서, 본 발명의 포름알데하이드 생산 방법에서 최적 pH는 7.0임을 알 수 있었다.
실시예 5: 금속이온의 효과
순수 정제된 포름알데하이드 탈수소효소의 금속 이온이 효소 활성에 미치는 효과를 알아보기 위하여 본 실험을 수행하였다. 최종농도 1 mM 과 5mM의 MgCl2, MnCl2, CoCl2, ZnCl2, FeCl2, CuSO4, CoCl2, HgCl2, BaCl 또는 KCl를 효소 반응액에 첨가한 후 효소의 잔존 활성을 측정하였다. 1 mM, 5mM 농도에서 다양한 금속의 포름알데하이드 탈수소효소효소 활성에 대한 영향은 표 1에 나타내었다. 본 발명의 포름알데하이드 탈수소효소는 5 mM Mg2 + 존재 시 효소 활성이 2.7배 증가하는 것을 확인 하였다 (표 1).
상대적 활성(%) 상대적 활성(%)
금속 이온 1 mM 5 mM
MnCl2 62.32 111.6
MgCl2 147.8 269.6
CaCl2 50.67 75.96
ZnCl2 63.99 192.2
CuSO4 124.3 91.30
CoCl2 58.39 72.60
BaCl2 98.55 115.1
KCl 104.0 94.49
FeCl2 ND ND
HgCl2 ND ND
None 15.00 13.00
표 1은 포름알데하이드 탈수소효소의 금속이온 효과를 나타낸 표이다.
실시예 6: 포름알데하이드 탈수소효소의 동역학변수
다양한 농도의 기질의 포름산 (0.125-5 mM)을 이용하여 효소 반응을 시킨 후, 비선형 회귀분석을 통하여 동역학적 매개변수를 측정하였다 (도 5). 포름알데하이드 탈수소효소의 NADH에 대한 Km 값은 약 0.19 mM, 포름알데하이드에 대한 Km 값은 약 1.7 mM, Vmax 값은 약 4.7 U mg-protein-1로 결정되었다.
실시예 7: 포름산으로부터 포름알데하이드의 생산실험
최적화 한 조건에서 버크올데리아 멀티보란스 유래 포름알데하이드 탈수소효소를 이용한 포름알데하이드 생산실험을 수행하였다. 반응액 내의 포름알데하이드 탈수소효소 20 μg, 10 mM 기질 농도, pH 7.0 및 반응온도 30℃로 조절한 후 실험한 결과 3시간 반응시켰을 때 약 27%의 전환율을 나타내었다. 이는 포름산으로부터 포름알데하이드의 직접적인 생물전환 생산에 관한 최초의 보고이다.
<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp <120> A NOVEL FORMALDEHYDE DEHYDROGENASE AND A METHOD FOR FORMALDEHYDE PRODUCTION USING THE SAME <130> HY140273 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1197 <212> DNA <213> Burkholderia multivorans <400> 1 atgagcagca atcgtggcgt tgtttacctg ggtccgggca aagtggaagt tcagaaaatc 60 gactatccga aaatggttga tccgagcggt cgtgcaattg gccacggtgt tatcctgaaa 120 gtggttagca ccaacatttg tggttctgat cagcatatgg tccgtggtcg taccacggca 180 ccggtcggtc tggtgctggg ccacgaaatt accggtgaag tcgtggaagt cggccgcgat 240 gtggaaacgc tgaaaatcgg tgacctggtt tcagtcccgt ttaatgttgc ctgcggtcgt 300 tgtgcaatgt gcaaagaaac ccatacgggc gtttgtctga acgtcaatcc gtcgcgcgcc 360 ggcggtgcat atggttacgt ggatatgggc ggttggatcg gcggtcaggc cgaatatgtg 420 ctggttccgt acgcagactt taacctgctg aaattcccgg atcgtgacca agcaatggct 480 aaaattcgcg atctgacctg cctgagcgac atcctgccga cgggctatca tggtgctgtg 540 agtgcgggtg ttaaaccggg ctccaccgtc tacattgcag gtgcaggtcc ggtgggtatg 600 gcagcagcag ctagcgcacg tctgctgggt gcagcagtta cgatcgtcgg cgatatgaac 660 gcagaacgcc tggcacacgc taaagcgatg ggctttgaaa ccgtggatct gtctaaagac 720 gctacgctgg gtgaacagat tgcgcaaatc ctgggcaaac cggaaattga ttgtgctgtg 780 gactgcgttg gtttcgaagc gcatggccac ggtagctctg gccatgccga agaagccccg 840 gcaaccgttc tgaattcact gatggaaatt acgcgtccgg ctggtgcaat tggtatcccg 900 ggtctgtatg tgaccgatga cccgggtgcg caggataaag cagctcaaca tggcagtctg 960 tccatccgct tcggcctggg ttgggccaaa tcacactcgt ttttcaccgg ccagacgccg 1020 gttctgaaat ataaccgtaa tctgatgcaa gccattctgt acgatcgcct gccgattgca 1080 aaaatcgtca atgtgaccgt tatctccctg gatgacgctc cggaaggtta caaaaaattt 1140 gatggcggtg cgccgcgtaa attcgtgatt gacccgcacg gcctgctggc agcctaa 1197 <210> 2 <211> 398 <212> PRT <213> Burkholderia multivorans <400> 2 Met Ser Ser Asn Arg Gly Val Val Tyr Leu Gly Pro Gly Lys Val Glu 1 5 10 15 Val Gln Lys Ile Asp Tyr Pro Lys Met Val Asp Pro Ser Gly Arg Ala 20 25 30 Ile Gly His Gly Val Ile Leu Lys Val Val Ser Thr Asn Ile Cys Gly 35 40 45 Ser Asp Gln His Met Val Arg Gly Arg Thr Thr Ala Pro Val Gly Leu 50 55 60 Val Leu Gly His Glu Ile Thr Gly Glu Val Val Glu Val Gly Arg Asp 65 70 75 80 Val Glu Thr Leu Lys Ile Gly Asp Leu Val Ser Val Pro Phe Asn Val 85 90 95 Ala Cys Gly Arg Cys Ala Met Cys Lys Glu Thr His Thr Gly Val Cys 100 105 110 Leu Asn Val Asn Pro Ser Arg Ala Gly Gly Ala Tyr Gly Tyr Val Asp 115 120 125 Met Gly Gly Trp Ile Gly Gly Gln Ala Glu Tyr Val Leu Val Pro Tyr 130 135 140 Ala Asp Phe Asn Leu Leu Lys Phe Pro Asp Arg Asp Gln Ala Met Ala 145 150 155 160 Lys Ile Arg Asp Leu Thr Cys Leu Ser Asp Ile Leu Pro Thr Gly Tyr 165 170 175 His Gly Ala Val Ser Ala Gly Val Lys Pro Gly Ser Thr Val Tyr Ile 180 185 190 Ala Gly Ala Gly Pro Val Gly Met Ala Ala Ala Ala Ser Ala Arg Leu 195 200 205 Leu Gly Ala Ala Val Thr Ile Val Gly Asp Met Asn Ala Glu Arg Leu 210 215 220 Ala His Ala Lys Ala Met Gly Phe Glu Thr Val Asp Leu Ser Lys Asp 225 230 235 240 Ala Thr Leu Gly Glu Gln Ile Ala Gln Ile Leu Gly Lys Pro Glu Ile 245 250 255 Asp Cys Ala Val Asp Cys Val Gly Phe Glu Ala His Gly His Gly Ser 260 265 270 Ser Gly His Ala Glu Glu Ala Pro Ala Thr Val Leu Asn Ser Leu Met 275 280 285 Glu Ile Thr Arg Pro Ala Gly Ala Ile Gly Ile Pro Gly Leu Tyr Val 290 295 300 Thr Asp Asp Pro Gly Ala Gln Asp Lys Ala Ala Gln His Gly Ser Leu 305 310 315 320 Ser Ile Arg Phe Gly Leu Gly Trp Ala Lys Ser His Ser Phe Phe Thr 325 330 335 Gly Gln Thr Pro Val Leu Lys Tyr Asn Arg Asn Leu Met Gln Ala Ile 340 345 350 Leu Tyr Asp Arg Leu Pro Ile Ala Lys Ile Val Asn Val Thr Val Ile 355 360 365 Ser Leu Asp Asp Ala Pro Glu Gly Tyr Lys Lys Phe Asp Gly Gly Ala 370 375 380 Pro Arg Lys Phe Val Ile Asp Pro His Gly Leu Leu Ala Ala 385 390 395 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 atttgyggca gcgatcwrca tatgkwysrc 30 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 attggcrthc cgggnytgta ygtgmcc 27

Claims (9)

  1. 삭제
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  6. NADH를 조효소로 사용하고 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 포름알데하이드 탈수소효소를 포름산과 반응시켜, 상기 효소의 환원 반응을 통해 포름산으로부터 포름알데하이드를 생산하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 반응은 pH 6.5 내지 7.5에서 수행하는 것을 특징으로 하는 포름산으로부터 포름알데하이드를 생산하는 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 반응은 pH 7에서 수행하는 것을 특징으로 하는 포름산으로부터 포름알데하이드를 생산하는 방법.
  9. 제6항에 있어서, 상기 반응은 1 mM 내지 5 mM 마그네슘 이온 존재 하에서 수행하는 것을 특징으로 하는 포름산으로부터 포름알데하이드를 생산하는 방법.

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