CN114621935B - 一种甲醛脱氢酶突变体及其应用 - Google Patents
一种甲醛脱氢酶突变体及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本申请公开了一种甲醛脱氢酶突变体及其应用，所述甲醛脱氢酶突变体选自以SEQ ID NO.1所示的野生型甲醛脱氢酶为基础进行如下突变后的突变体中的任一种：第192位的A突变为R；第236位的L突变为V；第223位的L突变为V；第223位的L突变为T；第218位的L突变为V；第267位的R突变为V；第192位的A突变为R、第236位的L突变为V；第192位的A突变为R、第236位的L突变为V、第223位的L突变为V；第192位的A突变为R、第236位的L突变为V、第223位的L突变为T。所述甲醛脱氢酶突变体可以更好地利用甲醛类化合物还原NAD类似物得到还原态NAD类似物。
Description
技术领域
本申请涉及一种甲醛脱氢酶突变体及其应用，属于生物技术领域。
背景技术
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)及其还原态NADH是生命过程中的重要辅酶，辅酶是一类可以将化学基团从一个酶转移到另一个酶上的有机小分子，对于特定酶的活性发挥是必要的，大多数反应都需要辅因子与其他途径产生联系，辅因子几乎参与了维持生命活动的所有代谢。为调控其靶蛋白功能，又不对其他相关蛋白产生干扰，因此采用特异性识别NAD类似物的突变型酶，具有相应的催化功能从而在辅酶水平对目标氧化还原过程进行特异性调控，对生物催化和合成生物学研究具有重要意义(Ji DB,et al.J Am Chem S℃,2011,133,20857-20862；Wang L,et al.ACS Catal,2017,7,1977-1983)。
目前已经报道了几种具有良好生物相容性的NAD类似物。如，烟酰胺胞嘧啶二核苷酸(NCD)、烟酰胺胸腺嘧啶二核苷酸(NTD)、烟酰胺尿嘧啶二核苷酸(NUD)(Ji DB,et al.JAm Chem S℃,2011,133,20857-20862；Ji DB,et al.Sci China Chem,2013,56,296-300)。同时，也报道了一些可识别NAD类似物的酶，如来自粪肠球菌Enter℃℃cus faecalis的NADH氧化酶(NOX，Genbank S45681)、D-乳酸脱氢酶(DLDH，Gnebank CAA47255)V152R突变体、苹果酸酶(ME，Genbank P26616)L310R/Q401C突变体、苹果酸脱氢酶(MDH，GenbankCAA68326)L6R突变体。
利用NAD类似物及识别它们的酶，可以构建更经济有效的生物催化体系(纪德彬等.催化学报,2012,33,530-535)。目前，已经实现利用NAD类似物进行胞内代谢反应的调控，通过向胞内转运NCD，DLDH-V152R可利用NCD将丙酮酸还原为乳酸，实现了特异性的生物催化调控(Wang L,et al.ACS Catal,2017,7,1977-1983)。
和使用其他氧化还原辅酶一样，NAD类似物也必需再生循环。辅酶再生方式主要有酶法、电化学法、化学法和光化学法。其中酶法具有选择性高、可以与合成酶兼容及高转换数等优点。甲醛脱氢酶可以利用甲醛，将甲醛转化成甲酸，产生细胞生命活动必须的代谢物和还原力，从而实现一碳资源的有效利用(Müller JE,et al.Metab Eng,2015,28,190-201；Zhang W,et al.RSC Adv,2017,7,4083–4091)。
甲醛具有强还原性，能与DNA、RNA和蛋白质的亲核基团形成交联结构从而造成蛋白或核酸损伤(Woolston BM,et al.Biotechnol Bioeng,2018,115,206-215)。而甲醛的下游产物甲酸相对甲醛来说对细胞的毒性较小，利用甲醛脱氢酶对NAD类似物还原的同时能实现对甲醛的解毒作用。以NAD为辅酶将甲醛氧化为甲酸的酶分为两类，第一类甲醛脱氢酶(EC 1.2.1.1)依赖于谷胱甘肽，在甲醛和谷胱甘肽存在时，能自发生成甲醛脱氢酶的底物S-羟甲基谷胱甘肽，经甲醛脱氢酶催化生成的S-甲酰基谷胱甘肽被S-甲酰基谷胱甘肽水解酶(EC 3.1.2.12)不可逆地水解为谷胱甘肽和甲酸(BARBER RD,et al.J Bacteriol,1996,178,1386-1393)。第二类甲醛脱氢酶能直接利用甲醛和NAD+，生成甲酸和NADH。来源于恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的甲醛脱氢酶是已鉴定的仅有的不依赖于谷胱甘肽的甲醛脱氢酶，催化甲醛的不可逆氧化(Zhang W,et al.Protein Expres Purif,2013,92,208-213；ITO K,et al.J Bacteriol,1994,176,2483-2491)。采用不依赖于谷胱甘肽的甲醛脱氢酶可使反应简单化，使甲醛直接、不可逆地转化成甲酸，同时将还原力储存在NADH中，因此来源于恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)的甲醛脱氢酶PpFADH和来源于铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的甲醛脱氢酶aFADH在NAD类似物的还原和甲醛直接氧化的生物正交解毒体系中占有绝对优势。
虽然NAD类似物再生循环对生物催化和合成生物学等领域具有重要意义，但是目前通过改造酶的结构来高效还原NAD类似物的文献很少，尚没有文献报道如何改造甲醛脱氢酶来高效还原NAD类似物。因此，通过甲醛脱氢酶还原甲醛实现NAD类似物的再生是将一碳资源利用和NAD类似再生相结合的新的还原方法，在实现NAD类似物还原的同时，解除甲醛对细胞和蛋白的毒性。
基于以上背景和优势，在已有的利用甲醇及其衍生物还原NAD类似物的方法基础上，本申请利用的定向进化的方法，以获得对NAD类似物还原效率进一步提升的突变体。
发明内容
根据本申请的一个方面，提供一种甲醛脱氢酶突变体，所述甲醛脱氢酶突变体，通过在来源于Pseudomonas putida的甲醛脱氢酶PpFADH的基础上发生突变得到，可以更好地利用甲醛类化合物还原NAD类似物得到还原态NAD类似物。
一种甲醛脱氢酶突变体，所述甲醛脱氢酶突变体选自以SEQ ID NO.1所示的野生型甲醛脱氢酶为基础进行如下突变后的突变体中的任一种：
第192位的A突变为R；或
第236位的L突变为V；或
第223位的L突变为V；或
第223位的L突变为T；或
第218位的L突变为V；或
第267位的R突变为V；或
第192位的A突变为R、第236位的L突变为V；或
第192位的A突变为R、第236位的L突变为V、第223位的L突变为V；或
第192位的A突变为R、第236位的L突变为V、第223位的L突变为T；或
第192位的A突变为R、第236位的L突变为V、第218位的L突变为V、第267位的R突变为V；或
第236位的L突变为V、第223位的L突变为V；或
第218位的L突变为V、第223位的L突变为V。
根据本申请的一个方面，提供一种核酸，所述核酸编码上述任一项所述的甲醛脱氢酶突变体中的任一种。
可选地，所述核酸选自以SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列为基础进行如下突变后的突变体中的任一种：
可选地，所述核酸选自以SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列为基础进行如下突变后的突变体中的任一种：
第192个密码子GCC突变为AGA；或
第236个密码子CTG突变为GTG；或
第223个密码子CTG突变为GTT；或
第223个密码子CTG突变为ACG；或
第218个密码子CTC突变为GTT；或
第267个密码子CGC突变为GTT；或
第192个密码子GCC突变为AGA、第236个密码子CTG突变为GTG；或
第192个密码子GCC突变为AGA、第236个密码子CTG突变为GTG、第223个密码子CTG突变为GTT；或
第192个密码子GCC突变为AGA、第236个密码子CTG突变为GTG、第223个密码子CTG突变为ACG；或
第192个密码子GCC突变为AGA、第236个密码子CTG突变为GTG、第218个密码子CTC突变为GTT、第267个密码子CGC突变为GTT；或
第236个密码子CTG突变为GTG、第223个密码子CTG突变为GTT；或
第218个密码子CTC突变为GTT、第223个密码子CTG突变为GTT。
根据本申请的一个方面，提供一种载体，所述载体包含含有上述任一项所述的核酸的表达盒。
根据本申请的一个方面，提供一种宿主，所述宿主的细胞内包含上述任一项所述的载体。
可选地，所述宿主包括原核微生生物和/或真核微生生物。
可选地，所述原核微生物包括大肠杆菌和/或乳酸乳球菌；
所述真核微生物包括酿酒酵母、里氏木霉或圆红冬胞酵母中至少一种。
可选地，所述宿主的细胞内表达有NTT4核苷酸转运蛋白和/或AtNDT2核苷酸转运蛋白。
可选地，所述宿主的细胞内表达有苹果酸酶突变体ME-L310R/Q401C。
可选地，所述宿主的细胞内表达有乳酸脱氢酶突变体DLDH-V152R、乳酸脱氢酶突变体V152R/I177R/A212G、乳酸脱氢酶突变体V152R/I177S/A212D、乳酸脱氢酶突变体V152R/N213E或乳酸脱氢酶突变体V152R/I77K/N213I中至少一种。
可选地，所述宿主的细胞内表达有酿酒酵母醇脱氢酶、羟基丁酮脱氢酶、苹果酸脱氢酶突变体MDH-L6R中至少一种。
根据本申请的一个方面，提供一种上述任一项所述的甲醛脱氢酶突变体、上述任一项所述的核酸、上述任一项所述的载体、上述任一项所述的宿主在利用甲醛类化合物还原NAD类似物反应中的应用。
可选地，所述NAD类似物选自具有式I～III任一所示的结构式的物质中的任一种；
可选地，所述甲醛类化合物包括甲醛和/或氘代甲醛。
根据本申请的一个方面，提供一种上述任一项所述的甲醛脱氢酶突变体、上述任一项所述的核酸、上述任一项所述的载体、上述任一项所的宿主在酶I催化底物还原中的应用；
所述酶I选自苹果酸酶突变体ME-L310R/Q401C；乳酸脱氢酶突变体DLDH-V152R、乳酸脱氢酶突变体V152R/I177R/A212G、乳酸脱氢酶突变体V152R/I177S/A212D、乳酸脱氢酶突变体V152R/N213E、乳酸脱氢酶突变体V152R/I77K/N213I、酿酒酵母醇脱氢酶、羟基丁酮脱氢酶、苹果酸脱氢酶突变体MDH-L6R中的任一种。
根据本申请的一个方面，提供一种还原型NAD类似物的制备方法I，所述制备方法I包括：在甲醛脱氢酶突变体I存在下，利用甲醛类化合物I将NAD类似物I还原I，获得所述还原型NAD类似物；
所述甲醛脱氢酶突变体I选自上述任一项所述的甲醛脱氢酶突变体中的至少一种；
所述NAD类似物I选自式I～III所示的物质中的至少一种。
可选地，所述还原I的条件包括：在pH 4～9的缓冲体系I中，甲醛脱氢酶突变体I为1μg/mL～6000μg/mL，NAD类似物I为0.001mM～30mM、甲醛类化合物I为1mM～1000mM。
可选地，所述还原I的条件包括：反应温度I为10～40℃，反应时间I为2～120min。
根据本申请的一个方面，提供一种还原型NAD类似物的制备方法II，所述制备方法II包括：在宿主II存在下，利用甲醛类化合物II将NAD类似物II还原II，获得所述还原型NAD类似物，
所述宿主II选自上述任一项所述的宿主中的任一种；
所述NAD类似物II选自式I～III所示的物质中的至少一种。
根据本申请的一个方面，提供一种苹果酸的制备方法III，所述制备方法III包括：在甲醛脱氢酶突变体III、甲醛类化合物III、NAD类似物III存在下，利用苹果酸酶ME-L310R/Q401C将丙酮酸III还原III，得到所述苹果酸；
所述甲醛脱氢酶突变体III选自上述任一项所述的甲醛脱氢酶突变体中的至少一种；
所述NAD类似物III选自式I～III所示的物质中的至少一种。
可选地，所述还原III的条件包括：在pH 4～9的缓冲体系III中，甲醛类化合物III为1～10mM、丙酮酸III为1～100mM、NAD类似物III为0.001～1mM、甲醛脱氢酶突变体III为0.01～0.5mg/mL和ME-L310R/Q401C为0.01～1mg/mL。
可选地，所述缓冲体系III中还包括：MnCl2为0.01～2mM、碳酸氢钠III为1～100mM、
可选地，所述还原III的条件包括：反应温度III为5～40℃，反应时间III为2～240min。
根据本申请的一个方面，提供一种苹果酸的制备方法IV，所述制备方法IV包括：将含有甲醛类化合物IV、NAD类似物IV、宿主IV的培养液IV反应IV，得到所述苹果酸；
所述宿主IV选自上述任一项所述的宿主中的任一种；
所述NAD类似物IV选自式I～III所示的物质中的至少一种。
可选地，所述培养液IV中，pH值为6～8，宿主IV的菌体密度OD600nm为7～12，碳酸氢钠IV为1～15mM、丙酮酸IV为5～15mM、甲醛类化合物IV为1～10mM、NAD类似物IV为0.01～10mM。
可选地，所述反应IV的条件包括：厌氧条件下，温度IV为10～42℃，转速IV为100～300rpm，时间IV为1～10h。
可选地，所述温度IV的上限选自16、20、25、30、35、42℃；下限选自10、16、20、25、30、35℃。
根据本申请的一个方面，提供一种D-乳酸的制备方法V，所述制备方法V包括：在甲醛脱氢酶突变体V、甲醛类化合物V、NAD类似物V存在下，利用乳酸脱氢酶突变体将丙酮酸还原V，获得所述D-乳酸；
所述甲醛脱氢酶突变体V选自上述任一项所述的甲醛脱氢酶突变体中的至少一种；
所述乳酸脱氢酶突变体选自DLDH-V152R、V152R/I177R/A212G、V152R/I177S/A212D、V152R/N213E或V152R/I77K/N213I中的至少一种；
所述NAD类似物V选自式I～III所示的物质中的至少一种。
可选地，所述还原V的条件包括：在pH 4～9的缓冲体系V中，甲醛类化合物V为1～10mM、丙酮酸V为1～100mM、NAD类似物V为0.001～0.5mM、甲醛脱氢酶突变体V为0.01～0.5mg/mL和乳酸脱氢酶突变体为0.01～1mg/mL。
可选地，所述缓冲体系V的pH上限选自5、6、7、8、9；下限选自4、5、6、7、8。
可选地，还原V的条件包括：反应温度V为5～40℃，反应时间V为2～120min
根据本申请的一个方面，提供一种D-乳酸的制备方法VI，所述制备方法VI包括：将含有甲醛类化合物VI、NAD类似物VI、宿主VI的培养液VI反应VI，得到所述D-乳酸；
所述宿主VI选自上述任一项所述的宿主中的任一种；
所述NAD类似物VI选自式I～III所示的物质中的至少一种。
可选地，所述培养液VI中，pH值VI为6～9，宿主VI的菌体密度OD600nm为7～9，丙酮酸VI为5～15mM、甲醛类化合物VI为1～20mM、NAD类似物VI为0.01～10mM。
可选地，所述反应VI的条件为：厌氧条件下，转速VI为100～300rpm，温度VI为10～42℃，时间VI为1～10h。
本申请涉及一种利用甲醛还原NAD类似物的方法，具体来说，是以甲醛为还原剂，以可利用甲醛的酶为催化剂，以NAD类似物为电子受体，生成的还原态的NAD类似物可作为其他氧化还原酶的辅酶，用于还原反应。同时将甲醛特异性氧化成毒性较低的甲酸，实现解毒作用。因此，本申请的方法可应用在生物催化和生物转化领域，具有重要价值。
本申请涉及一种利用甲醛还原NAD类似物的方法，其特征在于：以甲醛为还原剂，以可利用甲醛的酶为催化剂，在pH 4～9的缓冲体系中，反应温度15～40℃，酶的终浓度为1μg/mL～6000μg/mL，NAD类似物的终浓度为0.001mM～30mM、甲醇化合物的终浓度为1mM～1000mM下，反应2～120min，获得还原型NAD类似物，同时生成毒性较低的甲酸。所述的缓冲体系包括但不限于磷酸缓冲液，Tris-HCl缓冲液，HEPES缓冲液，MES缓冲液，PIPES缓冲液，乙酸-乙酸钠缓冲体系中的一种或两种以上。
NAD类似物包括NCD、烟酰胺胸腺嘧啶二核苷酸(NTD)和烟酰胺尿嘧啶二核苷酸(NUD)，他们具有如下的化学结构：
本申请涉及的NAD类似物参照文献方法(Ji DB,et al.Sci China Chem,2013,56,296-300)制备。
本申请使用的甲醛脱氢酶为具有以甲醛为还原剂，催化还原NAD类似物为相应还原态的活性蛋白质。这些酶为来源于Pseudomonas putida的甲醛脱氢酶PpFADH(PDB ID1KOL，https://www.rcsb.org/structure/1KOL)的突变体(突变位点用氨基酸序号和突变前后的氨基酸名称表示，如A192R表示第192位氨基酸由A突变成R，其余位点类似)、PpFADH-A192R，PpFADH-L236V，PpFADH-L223V，PpFADH-L223T，PpFADH-L218V，PpFADH-R267V，PpFADH-A192R/L236V，PpFADH-A192R/L236V/L223V，PpFADH-A192R/L236V/L223T，PpFADH-A192R/L236V/L218V/R267V，PpFADH-L236V/L223V，PpFADH-L218V/L223V中的一种或两种以上。这些酶的表达和纯化参照在大肠杆菌中表达其他氧化还原酶的文献方法进行(Ji DB,et al.J Am Chem S℃,2011,133,20857-20862)。
本申请涉及的NAD类似物和NAD一样含有烟酰胺单核苷酸单元，该单元的还原态为1,4-二氢烟酰胺单核苷酸。因此，NAD类似物还原态产物在340nm附近的紫外光谱区有较强吸收，摩尔消光系数ε340约为6220M-1·cm-1(Ji DB,et al.Creation of bioorthogonalredox systems depending on nicotinamide flucytosine dinucleotide.J Am Chem S℃.2011,133,20857-20862)。本申请利用该性质分析NAD类似物还原过程。利用液相色谱定量NAD类似物及其还原态产物的条件为：液相色谱仪为Agilent 1100，分析柱为Zorbax150mm×3.0mm(3.5μm)，流动相为5mM硫酸四丁胺，流速为0.5mL/min。每个样品检测20min。检测波长为260nm(辅因子及其还原态在260nm有较强的光吸收)和340nm(还原态辅酶在340nm有较强的光吸收)。
制备的NAD类似物还原态产物，可被其他酶用作辅酶，应用于还原反应，同时，该反应生成毒性较低的甲酸，起到解毒作用。因此，本申请可视为一种再生循环NAD类似物还原态的技术。通过本申请的技术，将甲醛的还原力转移并贮存在NAD类似物还原态中，以便于对其他底物进行选择性还原，同时解除甲醛对细胞的毒性，使细胞的生理生化条件受到最小程度的干扰。
所用缓冲体系中甲醛脱氢酶的终浓度为1μg/mL～6000μg/mL(优选50μg/mL～500μg/mL，再优选100μg/mL～300μg/mL)、NAD类似物的终浓度为0.001mM～20mM(优选0.01mM～20mM，再优选0.1mM～10mM)、甲醛的终浓度为1mM-1000mM(优选5mM～500mM，再优选10mM～50mM)，所述的缓冲体系包括但不限于磷酸缓冲液，Tris-HCl缓冲液，HEPES缓冲液，MES缓冲液，PIPES缓冲液中的一种或两种以上。
利用所述甲醛脱氢酶还原NAD类似物，为包括但不局限于ME-L310R/Q401C，DLDH-V152R或酿酒酵母醇脱氢酶提供还原型辅酶时，采用pH 5～8的缓冲体系，反应温度10～40℃。利用所述甲醛脱氢酶还原NAD类似物，为包括但不局限于催化丙酮酸还原的苹果酸酶ME(NCBI no.NP_415996.1)突变体ME-L310R/Q401C；催化丙酮酸还原的乳酸脱氢酶DLDH(GeneBank No.CAA47255.1，PDB ID:2DLD)突变体DLDH-V152R、V152R/I177R/A212G、V152R/I177S/A212D、V152R/N213E或V152R/I77K/N213I或酿酒酵母醇脱氢酶提供还原型辅酶时，采用pH 4～9的缓冲体系，反应温度15～40℃。
所述可利用甲醛化合物的酶表达在微生物的细胞内，NAD类似物可通过NAD转运蛋白AtNDT2(Accession NO.NC_003070)或NTT4(Haferkamp I,et al.Nature,2004,432,622-625.)转入胞内；甲醛渗透进入细胞，NAD类似物还原反应在细胞内进行。
所述表达甲醛脱氢酶并用于胞内还原NAD类似物的微生物细胞包括但不局限于原核微生物，如大肠杆菌，乳酸乳球菌等或真核微生物，如酿酒酵母等。
利用本申请的方法，一方面甲醛氧化生成还原态NAD类似物，可以与其他酶如催化丙酮酸还原为苹果酸的苹果酸酶ME-L310R/Q401C、催化丙酮酸还原为乳酸的乳酸脱氢酶DLDH-V152R等偶联，在胞内或胞外实现还原力的循环利用。另一方面，可以构建甲醛解毒的生物正交反应，有利于实现微生物吸收降解甲醛从而起到防止甲醛对细胞的损伤作用。
本申请中，Tris-HCl缓冲液为三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液；
HEPES缓冲液为4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液；
PIPES缓冲液为哌嗪-1,4-二乙磺酸缓冲液
MES缓冲液为
Hampton Research and Wizard为
本申请中，突变体蛋白的命名为：
野生型蛋白名称-突变位点，突变位点用氨基酸序号和突变前后的氨基酸名称表示，如PpFADH-A192R表示野生型PpFADH蛋白的第192位氨基酸由A突变成R。
本申请能产生的有益效果包括：
1)本申请所提供的甲醛脱氢酶突变体，通过在来源于Pseudomonas putida的甲醛脱氢酶PpFADH的基础上发生突变，可以更好地利用甲醛类化合物还原NAD类似物得到还原态NAD类似物。
2)本申请所提供的甲醛脱氢酶突变体，可以通过促进甲醛类化合物还原NAD类似物生成还原态NAD类似物，所述还原态NAD类似物可以与其他酶如催化丙酮酸还原为苹果酸的苹果酸酶ME-L310R/Q401C、催化丙酮酸还原为乳酸的乳酸脱氢酶突变体DLDH-V152R、乳酸脱氢酶突变体V152R/I177R/A212G、乳酸脱氢酶突变体V152R/I177S/A212D、乳酸脱氢酶突变体V152R/N213E、乳酸脱氢酶突变体V152R/I77K/N213I等偶联，在胞内或胞外实现还原力的循环利用。
附图说明
图1为将甲醛脱氢酶突变体PpFADH-A192R/L236V/L223V与NCD进行晶体解析，获得的含有配体NCD的晶体结构。
图2为将甲醛脱氢酶突变体A192R/L236V/L223T与NCD进行晶体解析，获得的含有配体NCD的晶体结构。
具体实施方式
下面结合实施例详述本申请，但本申请并不局限于这些实施例。
如无特别说明，本申请的实施例中的原料均通过商业途径购买。其中NBT(硝基四氮唑兰)、PMS(酚嗪硫酸甲酯)、溶菌酶、MTT(噻唑蓝)、PES(酚嗪硫酸乙酯)、DNase I、卡那霉素(Kan)、NAD、Tris、HEPES、琼脂糖等购自北京鼎国昌盛生物技术公司。酵母提取物、胰蛋白胨购自Oxoid公司；蛋白浓度标准BSA、质粒快速提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒等购自生工生物工程股份有限公司；PrimeSTAR HS DNA聚合酶、Dpn I、primerSTAR Max Premix等购自宝生物工程(大连)有限公司；Trans 2K plusⅡDNA Marker购自全式金生物技术有限公司；琼脂粉、Goldview核酸染料等购自北京鼎国昌盛生物技术公司；引物及测序分别在生工生物工程股份有限公司和苏州泓迅生物科技股份有限公司进行。
本申请具体实施例中，所提供的甲醛脱氢酶突变体如下：
PpFADH-A192R：甲醛脱氢酶PpFADH的第192位的A突变为R；相应的基因序列为在SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列为基础进行如下突变：第192个密码子GCC突变为AGA；
PpFADH-L236V：甲醛脱氢酶PpFADH的第236位的L突变为V；相应的基因序列为在SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列为基础进行如下突变：第236个密码子CTG突变为GTG；
PpFADH-L223V：甲醛脱氢酶PpFADH的第223位的L突变为V；相应的基因序列为在SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列为基础进行如下突变：第223个密码子CTG突变为GTT；
PpFADH-L223T：甲醛脱氢酶PpFADH的第223位的L突变为T；相应的基因序列为在SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列为基础进行如下突变：第223个密码子CTG突变为ACG；
PpFADH-L218V：甲醛脱氢酶PpFADH的第218位的L突变为V；相应的基因序列为在SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列为基础进行如下突变：第218个密码子CTC突变为GTT；
PpFADH-R267V：甲醛脱氢酶PpFADH的第267位的R突变为V；相应的基因序列为在SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列为基础进行如下突变：第267个密码子CGC突变为GTT；
PpFADH-A192R/L236V：甲醛脱氢酶PpFADH的第192位的A突变为R、第236位的L突变为V；相应的基因序列为在SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列为基础进行如下突变：第192个密码子GCC突变为AGA、第236个密码子CTG突变为GTG；
PpFADH-A192R/L236V/L223V：甲醛脱氢酶PpFADH的第192位的A突变为R、第236位的L突变为V、第223位的L突变为V；相应的基因序列为在SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列为基础进行如下突变：第192个密码子GCC突变为AGA、第236个密码子CTG突变为GTG、第223个密码子CTG突变为GTT；PpFADH-A192R/L236V/L223T：甲醛脱氢酶PpFADH的第192位的A突变为R、第236位的L突变为V、第223位的L突变为T；相应的基因序列为在SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列为基础进行如下突变：
第192个密码子GCC突变为AGA、第236个密码子CTG突变为GTG、第223个密码子CTG突变为ACG；或
PpFADH-A192R/L236V/L218V/R267V：甲醛脱氢酶PpFADH的第192位的A突变为R、第236位的L突变为V、第218位的L突变为V、第267位的R突变为V；相应的基因序列为在SEQ IDNO：2所示的核苷酸序列为基础进行如下突变：第192个密码子GCC突变为AGA、第236个密码子CTG突变为GTG、第218个密码子CTC突变为GTT、第267个密码子CGC突变为GTT；
PpFADH-L236V/L223V：甲醛脱氢酶PpFADH的第236位的L突变为V、第223位的L突变为V；相应的基因序列为在SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列为基础进行如下突变：第236个密码子CTG突变为GTG、第223个密码子CTG突变为GTT；
PpFADH-L218V/L223V：甲醛脱氢酶PpFADH的第218位的L突变为V、第223位的L突变为V；相应的基因序列为在SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列为基础进行如下突变：第218个密码子CTC突变为GTT、第223个密码子CTG突变为GTT。
对比例1：无酶条件下甲醛与NAD类似物的反应
NAD类似物(NCD、NTD和NUD)参照文献方法(Ji DB,et al.Sci China Chem,2013,56,296-300)制备。NAD类似物用水制成浓度为20mM的溶液，备用。
1mL反应体系中：1mM的NAD类似物底物；5mM的甲醛；50mM，pH 7.5的Tris-HCl缓冲液，30℃反应2h，取20μL分析。
用HPLC检测NAD类似物底物及其还原态产物。液相色谱仪为Agilent 1100，分析柱为Zorbax150mm×3.0mm(3.5μm)，流动相为5mM硫酸四丁胺，流速为0.5mL/min。每个样品检测20min。检测波长为260nm(NAD类似物及其还原态在260nm有较强吸收)和340nm(NAD类似物底物还原态在340nm有较强的光吸收)。
分析发现，所有反应的样品在340nm没有特征峰，在260nm仅检测到与NAD类似物保留时间相同的特征峰。说明在无酶条件下甲醛不能直接还原NAD类似物。
对比例2：酶失活条件下甲醛与NAD类似物的反应
将来源于Pseudomonas putida的甲醛脱氢酶PpFADH(PDB 1KOL)在98℃水浴加热60min，备用。参考文献测定NADH的方法(Guo Q,et al.Bi℃hemistry,2016,55,2760-2771)，以NAD为底物，检测结果表明甲醛脱氢酶PpFADH样品失去了催化还原NAD为NADH的活性。
将NAD类似物NCD、NTD和NUD，逐一按照下述方法进行反应：1mL的反应体系中：1mM的NAD类似物；10mM甲醛；100μg/ml灭活的甲醛脱氢酶PpFADH；浓度50mM，pH 7.5的Tris-HCl缓冲液，30℃反应2h，取20μL分析。
按对比例1的方法分析发现，所有反应的样品在340nm没有特征峰，在260nm仅检测到与NAD类似物保留时间相同的特征峰。说明加热灭活的酶不能催化甲醛还原NAD类似物。
实施例1：以甲醛为还原剂，甲醛脱氢酶催化还原NAD类似物
将NAD及其类似物NCD、NTD和NUD，与甲醛脱氢酶PpFADH、PpFADH-A192R，PpFADH-L236V，PpFADH-L223V，PpFADH-L223T，PpFADH-L218V，PpFADH-R267V，PpFADH-A192R/L236V，PpFADH-A192R/L236V/L223V，PpFADH-A192R/L236V/L223T，PpFADH-A192R/L236V/L218V/R267V，PpFADH-L236V/L223V，PpFADH-L218V/L223V逐一进行NAD类似物-甲醛脱氢酶组合，按下述方法进行反应：1mL反应体系中：1mM的NAD或类似物；10mM的甲醛和100μg/ml的甲醛脱氢酶；浓度50mM，pH 7.5的HEPES缓冲液，30℃反应30min，取20μL分析。
按对比例1的分析方法分析发现，所用样品在340nm均出现了特征吸收峰，但不同组合得到的吸收峰强度有明显差别，说明甲醛脱氢酶可以催化甲醛还原NAD类似物。由于NAD类似物还原态产物的摩尔消光系数ε340约为6220M-1cm-1，与NADH相同，用NADH标准品绘制曲线，得到定量结果(表1)。可见，PpFADH的催化活性整体较低。
实施例1的结果表明，甲醛脱氢酶可以有效催化甲醛还原本申请涉及的NAD类似物，制备相应的还原态产物。综合实施例1、对比例1和对比例2的结果说明，以甲醛为还原剂，还原NAD类似物，活性甲醛脱氢酶起到了不可替代的作用。
表1甲醛脱氢酶催化甲醛还原NAD及其类似物的实验结果
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实施例2：还原态NAD类似物的制备
将实施例1的反应体系放大，可用于制备还原态NAD类似物。以NUDH为例，说明制备过程。10ml的反应体系：20mM的NUD；20mM的甲醛；0.8mg/ml的甲醛脱氢酶PpFADH-A192R；浓度为50mM，pH为7.5的磷酸钠缓冲液；30℃反应80min。反应结束后直接冷冻干燥，浓缩至总体积约为4mL，用甲酸型阴离子交换树脂柱分离，在紫外波长340nm跟踪收集产物，冷冻干燥，得白色粉末6.6mg，产率约52％。
将上述白色粉末样品进行高分辨质谱分析，测得精确分子量(M+H)+为643.1026，与NUDH的理论分子量(C20H29N4O16P2 +，643.1054)一致，表明得到了还原态产物NUDH。按照实施例2的方法用相同用量的NUD、亚磷酸钠和亚磷酸脱氢酶rsPDH-I151R生产NAD类似物，得到了还原态的NUDH，产率约35％。说明甲醛脱氢酶PpFADH-A192R与亚磷酸脱氢酶rsPDH-I151R均能催化相应的底物生产NAD类似物，且产率接近。
按照实施例2的方法，用甲醛脱氢酶突变体PpFADH-A192S(见之前专利，申请号201811154805.6)制备还原态NAD类似物。用相同的反应体系和分析方法，检测结果表明，在紫外波长340nm跟踪收集产物，冷冻干燥，得白色粉末5.6mg，产率约44％。说明甲醛脱氢酶突变体PpFADH-A192R制备还原态NAD类似物要高于甲醛脱氢酶突变体PpFADH-A192S的催化活性。
实施例3：以甲醛为还原剂，甲醛脱氢酶催化还原NAD类似物
1ml的反应体系：0.1mM的NUD；1mM的甲醛；80μg/ml甲醛脱氢酶PpFADH-L236V；浓度为50mM，pH 8.0的PIPES缓冲液；40℃反应4min，取20μL分析。
按对比例1的方法分析发现，样品在340nm出现了特征吸收峰。生成的NUDH浓度达到69μM，即产率达到69％。
综合实施例1和实施例3的结果表明，甲醛脱氢酶催化还原NAD类似物的反应中，采用甲醛为还原剂，可使NAD类似物还原。
按照实施例3的方法用相同用量的NUD、亚磷酸钠和亚磷酸脱氢酶rsPDH-I151R生产NAD类似物，生成的NUDH浓度达到43μM，即产率达到40％。说明甲醛脱氢酶PpFADH-L236V与亚磷酸脱氢酶rsPDH-I151R均能催化相应的底物生产NAD类似物，甲醛脱氢酶PpFADH-L236V催化的反应产率高于亚磷酸脱氢酶rsPDH-I151R。
按照实施例3的方法，用甲醛脱氢酶突变体PpFADH-A192S/A261N(见之前专利，申请号201811154805.6)以甲醛为还原剂催化还原NAD类似物。用相同的反应体系和分析方法，检测结果表明，生成的类似物浓度达到60μM，即产率达到60％。说明甲醛脱氢酶突变体PpFADH-L236V以甲醛为还原剂催化还原NAD类似物高于甲醛脱氢酶突变体PpFADH-A192S/A261N的催化活性。
实施例4：以氘代甲醛为还原剂，甲醛脱氢酶催化还原NAD类似物
5mL反应体系中：2mM的NCD；8mM氘代甲醛；16μg/ml
甲醛脱氢酶PpFADH-L223V；浓度50mM，pH 5.0的MES缓冲液；10℃反应120min，取20μL分析。
按对比例1的分析方法分析发现，样品在340nm出现了特征吸收峰。产物NCDH浓度达到0.71mM，即产率为71％。
将样品进行高分辨质谱分析，测得精确分子量(M-H)-为641.1118，与NCD2H的理论分子量(C20H27 2HN5O15P2 -，641.1125)一致，表明得到了氘代NCD还原态产物。
实施例4的结果表明，甲醛脱氢酶可用氘代甲醛为还原剂，催化还原NAD类似物生成相应的氘代还原态产物。
按照实施例4的方法用相同用量的NCD、亚磷酸钠和亚磷酸脱氢酶rsPDH-I151R/E213C生产氘代NAD类似物，产物NCDH浓度达到0.38mM，即产率为38％。说明甲醛脱氢酶PpFADH-L223V与rsPDH-I151R/E213C均能催化相应的底物生产NAD类似物，甲醛脱氢酶PpFADH-L223V催化的反应产率高于亚磷酸脱氢酶rsPDH-I151R/E213C。
按照实施例4的方法，用甲醛脱氢酶突变体PpFADH-A192T/R267N(见之前专利，申请号201811154805.6)以氘代甲醛为还原剂催化还原NAD类似物。用相同的反应体系和分析方法，检测结果表明，产物浓度达到0.61mM，即产率为61％。说明甲醛脱氢酶突变体PpFADH-L236V以氘代甲醛为还原剂催化还原NAD类似物高于甲醛脱氢酶突变体PpFADH-A192T/R267N的催化活性。
实施例5：甲醛脱氢酶、苹果酸酶ME-L310R/Q401C和NAD类似物体系催化丙酮酸还原羧化制备苹果酸
参照文献(Ji DB,et al.J Am Chem S℃,2011,133,20857-20862)方法纯化苹果酸酶ME-L310R/Q401C，备用。ME-L310R/Q401C偏好类似物NCDH而对NADH活性低，需要以NCDH为辅因子。
苹果酸酶ME-L310R/Q401C可催化的反应为：丙酮酸+CO2+NCDH→苹果酸+NCD。甲醛脱氢酶催化的反应为：甲醛+NCD→甲酸+NCDH。将两反应合并，净反应为：甲醛+丙酮酸+CO2→苹果酸+甲酸。因此甲醛脱氢酶和苹果酸酶构成的体系可以实现以甲醛为还原剂，还原羧化丙酮酸生成苹果酸。该体系中，NAD类似物被再生循环，而且达到了固定CO2的效果，具有一定的潜力。以甲醛为底物的反应体系，在再生还原型NAD类似物的同时，将来自甲醛的碳引入到细胞代谢体系中，将甲醛转化成毒性较低的甲酸，同时实现底物的物质、能量代谢和解毒功效。其中具有代表性的实验过程如下：
采用50mM，pH 5.0的Tris-HCl缓冲体系，100μL的反应体系组成为：8.0mM甲醛、50mM丙酮酸、0.1mM NCD、1.0mM MnCl2、10mM碳酸氢钠、0.1mg/mL PpFADH-A192R/L236V/L223V和0.08mg/mL ME-L310R/Q401C。37℃反应120min，加900μL乙腈水混合液(乙腈：水＝4:1)终止反应。
利用美国戴安公司ICS-2500离子色谱系统在ED50脉冲电化学检测模式下分析测定反应溶液中苹果酸，丙酮酸和甲醛的含量。使用IonPac AS11-HC阴离子交换分析柱(200mm×4mm)，IonPac AG11-HC阴离子交换保护住(50mm×4mm)。分析条件：流动相为24mMNaOH，流速1mL/min，柱温：30℃，进样量25μL。检测结果表明，反应液含1mM甲醛、42mM丙酮酸和6.4mM苹果酸。
在进行上述反应时，设置了另外4组对照实验体系，分别缺少甲醛、NCD、PpFADH-A192R/L236V/L223V或ME-L310R/Q401C中的一种，分析发现这些反应没有产生苹果酸。根据反应的化学计量关系可知，NCD再生循环利用360次。
在进行上述反应时，还设置了1组实验，用氘代甲醛代替甲醛，其他成分和条件相同，分析发现反应液丙酮酸浓度降低至46.3mM同时产生3.5mM苹果酸，说明该体系可用氘代甲醛为还原剂。
按照实施例5的方法，用亚磷酸脱氢酶rsPDH-I151R/E213C、苹果酸酶ME-L310R/Q401C和NAD类似物体系催化丙酮酸还原羧化制备苹果酸。用相同的反应体系和分析方法，检测结果表明，反应液含有1.2mM亚磷酸、46.5mM丙酮酸和3.5mM苹果酸。说明甲醛脱氢酶、苹果酸酶ME-L310R/Q401C和NAD类似物体系催化丙酮酸还原羧化制备苹果酸要高于亚磷酸脱氢酶rsPDH-I151R/E213C、苹果酸酶ME-L310R/Q401C和NAD类似物体系的催化活性。
按照实施例5的方法，用甲醛脱氢酶突变体PpFADH-P220C(见之前专利，申请号201811154805.6)、苹果酸酶ME-L310R/Q401C和NAD类似物体系催化丙酮酸还原制备苹果酸。用相同的反应体系和分析方法，检测结果表明，检测结果表明，反应液含0.1mM甲醛、46.1mM丙酮酸和3.6mM苹果酸。说明甲醛脱氢酶突变体PpFADH-A192R/L236V/L223V、苹果酸酶ME-L310R/Q401C和NAD类似物体系催化丙酮酸还原制备苹果酸高于甲醛脱氢酶突变体PpFADH-P220C的催化活性。
实施例6：甲醛脱氢酶、D-乳酸脱氢酶DLDH-V152R和NAD类似物体系催化丙酮酸还原制备乳酸
参照文献(Ji DB,et al.J Am Chem S℃,2011,133,20857-20862)方法纯化D-乳酸脱氢酶DLDH-V152R/N213E，备用。D-乳酸脱氢酶DLDH-V152R/N213E偏好NAD类似物，需要以还原型类似物为辅因子。
乳酸脱氢酶催化的反应为：丙酮酸+NTDH→D-乳酸+NTD。甲醛脱氢酶催化的反应为：甲醛+NTD→甲酸+NTDH。将两反应合并，总反应为：甲醛+丙酮酸→D-乳酸+甲酸。因此，甲醛脱氢酶和D-乳酸脱氢酶构成的体系可实现以甲醛为还原剂，还原丙酮酸生成D-乳酸。该体系中，NAD类似物被循环再生，具有一定的应用潜力。其中具有代表性的实验过程如下：
采用50mM，pH 9.0的MES缓冲液体系，100μL的反应体系组成为：5.0mM甲醛、6.0mM丙酮酸、0.1mM NTD、0.05mg/mL PpFADH-A192R/L236V/L223V和0.06mg/mL DLDH-V152R/N213E。40℃反应10min，加900μL乙腈水混合液(乙腈：水＝4:1)终止反应。
参照实施例5的方法利用离子色谱系统分析，结果表明反应液含有1.2mM甲醛、5.2mM D-乳酸、0.8mM丙酮酸。
实验结果表明，该体系利用甲醛为还原剂，近定量地将丙酮酸还原为乳酸，取得了很高的原料利用效率。根据反应的化学计量关系可知，NTD再生循环利用33次。
按照实施例6的方法，用亚磷酸脱氢酶rsPDH-I151R、D-乳酸脱氢酶DLDH-V152R/N213E和NAD类似物体系催化丙酮酸还原制备乳酸。用相同的反应体系和分析方法，检测结果表明，反应液含有2.0mM亚磷酸、3.0mM D-乳酸、2.0mM丙酮酸。说明甲醛脱氢酶、D-乳酸脱氢酶DLDH-V152R/N213E和NAD类似物体系催化丙酮酸还原制备乳酸要高于亚磷酸脱氢酶rsPDH-I151R、D-乳酸脱氢酶DLDH-V152R/N213E和NAD类似物类似物体系的催化活性。
按照实施例6的方法，用甲醛脱氢酶突变体PpFADH-A192S/R267Q/V282K(见之前专利，申请号201811154805.6)、D-乳酸脱氢酶DLDH-V152R和NAD类似物体系催化丙酮酸还原制备乳酸。用相同的反应体系和分析方法，检测结果表明，反应液含有0.5mM甲醛、3.3mM D-乳酸、0.6mM丙酮酸。说明甲醛脱氢酶突变体PpFADH-A192R/L236V/L223V、D-乳酸脱氢酶DLDH-V152R/N213E和NAD类似物体系催化丙酮酸还原制备乳酸要高于甲醛脱氢酶突变体PpFADH-A192S/R267Q/V282K、D-乳酸脱氢酶DLDH-V152R和NAD类似物类似物体系的催化活性。
实施例7：甲醛脱氢酶、D-乳酸脱氢酶DLDH-V152R/N213E和NAD类似物体系催化丙酮酸还原制备乳酸
按照实施例6的方法，将反应的缓冲体系改为pH 8.0的Tris-HCl缓冲液，按照相同的反应条件和分析方法，结果表明反应终止后的反应液含有1.0mM甲醛、4.8mM D-乳酸、1.2mM丙酮酸。说明在pH 8.0的条件下，含有突变体PpFADH-A192R/L236V/L223V的体系，可以以甲醛为还原剂，近定量地将丙酮酸还原为乳酸，取得了很高的原料利用效率。但转化效率低于pH 9.0的反应体系。
实施例8：甲醛脱氢酶、D-乳酸脱氢酶DLDH-V152R/N213E和NAD类似物体系催化丙酮酸还原制备乳酸
按照实施例6的方法，将反应的缓冲体系改为pH 4.0的乙酸-乙酸钠缓冲液，按照相同的反应条件和分析方法，结果表明反应终止后的反应液含有1.4mM甲醇、4.3mM D-乳酸、1.7mM丙酮酸。说明在pH 4.0的条件下，含有PpFADH-L218V的体系，可以以甲醛为还原剂，近定量地将丙酮酸还原为乳酸，取得了相应的原料利用效率。但转化效率低于pH 8.0和pH 9.0的反应体系。
实施例9：醇脱氢酶利用还原态NAD类似物催化醛还原反应
参照实施例2的方法制备还原态类似物NTDH，备用。
采用20mM、pH 7.5的磷酸钠缓冲液体系，500μL反应体系组成为：4.0mM乙醛、2.0mMNTDH、0.1mg/mL来源于酿酒酵母的醇脱氢酶(购自Sigma公司，货号：A3263)。在20℃下反应，用分光光度计在紫外波长340nm处跟踪反应。反应30min后，体系中NTDH降低为0.4mM。同时，体系中产生了1.5mM乙醇。
在没有添加酿酒酵母醇脱氢酶的对照实验体系中，反应30min后NTDH浓度未见明显变化。
实施例9的结果说明还原态NAD类似物可被氧化还原酶用作辅酶，催化还原反应。
实施例10：甲醛脱氢酶介导的胞内还原NAD类似物及其应用
可以将所识别NAD类似物的甲醛脱氢酶、偏好NAD类似物的氧化还原酶和NAD类似物转运蛋白同时在宿主中表达，形成一种依赖NAD类似物的生物催化体系。当培养基中的甲醛和NAD类似物进入宿主细胞后，对细胞造成生存压力，启动该生物催化体系迅速高效氧化甲醛。因此，应用甲醛脱氢酶介导的胞内还原NAD类似物的技术，可将胞外还原力选择性、高效地传递到胞内目标氧化还原反应。下面以改造的大肠杆菌Escherichia coli XZ654(Zhang X,et al.Appl Environ Microbiol,2011,77,427-434)，构建生产苹果酸的工程菌株为例予以说明。
NAD转运蛋白AtNDT2(Accession NO.NC_003070)具有较宽泛的底物谱(PalmieriF,et al.J Biol Chem,2009,284,31249-31259)，可以转运NCD。将表达转运蛋白的AtNDT2的基因由gapAP1启动子(Charpentier B,et al.J Bacteriol,1994,176,830-839)控制表达。将编码aFADH-H270S的基因和编码ME-L310R/Q401C的基因，由异丙基硫代半乳糖(IPTG)诱导的lac启动子控制，将上述三种表达盒通过替换pUC18的LacZ基因克隆到同一质粒获得工程质粒。
将上述工程质粒导入敲除内源甲醛脱氢酶基因frmA的E.coli XZ654获得工程菌株E.coli WJT001。在LB培养基中诱导工程菌株E.coli WJT 001表达上述三种功能蛋白，培养基中添加100μg/mL氨苄青霉素、1mM的IPTG，在25℃、200rpm的摇床中培养48h至菌体密度OD600nm为4.5，2000×g离心6min收集菌体。
用pH 7.5的MOPS培养基洗涤重悬菌体，将菌体密度OD600nm调整到9。上述工程菌悬液中加入10mM碳酸氢钠、10mM丙酮酸、6mM甲醛、0.1mM的NCD，分别在16℃、30℃、42℃的200rpm摇床中厌氧反应4h，取100μL加900μL乙腈水混合液(乙腈：水＝4:1)终止反应。
参照实施例5的方法利用离子色谱系统分析，结果表明16℃反应液含2.9mM甲醛、4.5mM苹果酸、7mM丙酮酸。30℃反应液含1.2mM甲醛、6.2mM苹果酸、5.2mM丙酮酸。42℃反应液含0.6mM甲醛、5.0mM苹果酸、5mM丙酮酸。
在只添加甲醛和NCD中的一种及不添加甲醛和NCD的对照实验中，苹果酸浓度分别为2.2mM、1.9mM和1.9mM。
实验结果表明在全细胞催化过程中，甲醛脱氢酶PpFADH-R267V通过氧化甲醛为ME-L310R/Q401C提供NCDH，催化丙酮酸还原羧化成苹果酸，使苹果酸产量由1.9mM提高到6.2mM。只添加甲醛时苹果酸产量没有明显增加，只添加NCD时苹果酸不增加。
实施例10说明，在全细胞催化过程中胞内甲醛脱氢酶可以通过氧化甲醛提供还原态NAD类似物，被ME-L310R/Q401C用作辅酶应用于还原反应，可作为一种通过提供氧化还原力调控微生物体内苹果酸的代谢强度的方式。
按照实施例10的方法，将表达rsPDH-I151R/E213C的基因和ME-L310R/Q410C的基因由异丙基硫代半乳糖(IPTG)诱导的lac启动子控制，构建相应的工程菌株，用同样的实验和分析方法检测各成分的含量。结果表明16℃反应液含1.8mM亚磷酸、2.8mM苹果酸、7.1mM丙酮酸。30℃反应液含0.1mM亚磷酸、4.2mM苹果酸、5.6mM丙酮酸。42℃反应液含0.5mM亚磷酸、3.8mM苹果酸、5.6mM丙酮酸。说明甲醛脱氢酶PpFADH-R267V参与的上述催化体系与亚磷酸脱氢酶rsPDH-I151R/E213C参与的类似的催化体系比稍高。
按照实施例10的方法，用甲醛脱氢酶突变体PpFADH-H270S(见之前专利，申请号201811154805.6)通过氧化甲醛为ME-L310R/Q401C提供NCDH，催化丙酮酸还原羧化成苹果酸，苹果酸产量最高为4.3mM。说明甲醛脱氢酶突变体PpFADH-R267V通过氧化甲醛为ME-L310R/Q401C提供NCDH，催化丙酮酸还原羧化成苹果酸，产量要高于甲醛脱氢酶突变体PpFADH-H270S。
实施例11：甲醛脱氢酶介导的胞内还原NAD类似物及其应用
可以将所识别NAD类似物的甲醛脱氢酶、偏好NAD类似物的氧化还原酶和NAD类似物转运蛋白同时在宿主中表达，形成一种依赖NAD类似物的生物催化体系。下面以改造大肠杆菌Escherichia coli XZ654(Zhang X,et al.Appl Environ Microbiol,2011,77,427-434)，构建生产乳酸的工程菌株为例予以说明。
NAD转运蛋白NTT4(Haferkamp I,et al.Nature,2004,432,622-625)可以转运NGD。将上述三种表达转运蛋白NTT4的基因由gapAP 1启动子控制表达。将编码PpFADH-A192R/L236V的基因和编码DLDH-V152R的基因，由异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导的lac启动子控制，将上述三种表达盒通过替换pUC18的LacZ基因克隆到同一质粒上获得工程质粒。
将上述工程质粒导入敲除内源甲醛脱氢酶基因frmA的E.coli XZ654获得工程菌株E.coli WJT002。在LB培养基中诱导工程菌E.coli WJT 002表达上述三种功能蛋白，培养基中添加100μg/mL氨苄青霉素、1mM的IPTG，在25℃的200rpm摇床中培养48h至菌体密度OD600nm为4.5，2000×g离心6min收集菌体。
用pH 8.0的M9培养基洗涤重悬菌体，将密度OD600nm调整到9。上述工程菌悬液中加入10mM丙酮酸、10mM甲醛、0.1mM NUD，分别在30℃的200rpm摇床中厌氧反应3h，取100μL加900μL乙腈水混合液(乙腈：水＝4:1)终止反应。
参照实施例5的方法利用离子色谱系统进行分析，结果表明30℃反应液含0.9mM甲醛、5.7mM乳酸、4.3mM丙酮酸。
在只添加甲醛和NUD中的一种及不添加甲醛和NUD的对照实验中，乳酸浓度分别为0.9mM、0.9mM和0.6mM。
实验结果表明在全细胞催化过程中甲醛脱氢酶PpFADH-A192R/L236V通过氧化甲醛为DLDH-V152R/N213E提供NUDH，催化丙酮酸还原成乳酸，使乳酸产量由0.6mM提高到5.7mM。只添加甲醛或NUD时乳酸产量没有明显增加。
实施例11说明，在全细胞催化过程中胞内甲醛脱氢酶可以通过氧化甲醛提供还原态的NAD类似物，被DLDH-V152R/N213E用作辅酶应用于还原反应，可作为一种通过提供氧化还原力调控微生物体内乳酸的代谢强度的方式。
按照实施例11的方法，将表达rsPDH-I151R/I218F的基因和DLDH-V152R/N213E的基因由异丙基硫代半乳糖(IPTG)诱导的lac启动子控制，构建相应的工程菌株，用同样的实验和分析方法检测各成分的含量。结果表明30℃反应液含0.1mM亚磷酸、4.8mM乳酸、5.7mM丙酮酸。说明甲醛脱氢酶PpFADH-A192R/L236V参与的上述催化体系与亚磷酸脱氢酶rsPDH-I151R/I218F参与的类似的催化体系效率稍高。
按照实施例11的方法，用甲醛脱氢酶突变体PpFADH-G264S/A267L(见之前专利，申请号201811154805.6)通过氧化甲醛为DLDH-V152R提供NUDH，催化丙酮酸还原成乳酸，乳酸产量最高为4.9mM。说明甲醛脱氢酶突变体PpFADH-A192R/L236V通过氧化甲醛为DLDH-V152R/N213E提供NUDH，催化丙酮酸还原成乳酸，产量要高于甲醛脱氢酶突变体PpFADH-G264S/A267L。
实施例12：甲醛脱氢酶介导的透性化细胞内还原NAD类似物及其应用
可以将所识别NAD类似物的甲醛脱氢酶、偏好NAD类似物的氧化还原酶同时在宿主细胞中表达，形成一种依赖NAD类似物的生物催化体系。当培养基中的甲醛和NAD类似物进入宿主细胞后，对细胞造成生存压力，促使细胞迅速启动该生物催化体系。
将编码PpFADH-L223T的基因和编码DLDH-V152R/N213E的基因，由异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导的lac启动子控制，将上述两种表达盒通过替换pUC18的lacZ基因克隆到同一质粒上获得工程质粒。
将上述工程质粒导入敲除内源甲醛脱氢酶基因frmA的E.coli XZ654获得工程菌株E.coli WJT003。在LB培养基中诱导工程菌E.coli WJT 003表达上述两种功能蛋白，培养基中添加100μg/mL氨苄青霉素、1mM的IPTG，在25℃、200rpm的摇床中培养48h至菌体密度OD600nm为4.5，2000×g离心6min收集菌体，用浓度50mM，pH 7.5的Tris-Cl洗涤重悬菌体，将菌体密度OD600nm调整到9，按文献方法使细胞透性化(Zhang W,et al.Appl EnvironMicrobiol,2009,75,687-694)，制备方式为，取5mL的冻存细胞室温下水浴解冻，加入5mM的EDTA和体积比1％的甲苯，30℃、200rpm摇床温浴30min，然后再在4℃放置1h。2000g离心6min去除含有EDTA和甲苯的上清，用浓度50mM、pH 7.5的Tris-Cl洗两遍后重悬于5mL的浓度50mM、pH 5.0的Tris-Cl，获得透性化细胞。
上述用浓度50mM、pH 5.0的Tris-Cl重悬的透性化工程菌悬液中加入10mM丙酮酸、10mM甲醛、0.1mM的NCD，在30℃、200rpm的摇床中厌氧反应0.5h。取100μL样品，加入900μL乙腈水混合液(乙腈：水＝4:1)终止反应。
参照实施例5的方法用离子色谱系统分析，结果表明反应液含1.6mM甲醛、3.5mM乳酸和6.4mM丙酮酸。
在只添加甲醛和NCD的一种及不添加甲醛和NCD的对照实验中，乳酸浓度分别为0.6mM、0.4mM和0.3mM。
实验结果表明在全细胞催化过程中甲醛脱氢酶PpFADH-L223T通过氧化甲醛为DLDH-V152R/N213E提供NCDH，催化丙酮酸还原生成乳酸，使乳酸产量由0.3mM提高到3.5mM。只添加甲醛或NCD时苹果酸产量没有明显增加。
实施例12说明，在全细胞催化过程中胞内甲醛脱氢酶可以通过氧化甲醛提供还原态的NAD类似物，被DLDH-V152R/N213E用作辅酶应用于还原反应，可作为一种通过提供氧化还原力调控微生物体内乳酸的代谢强度的方式。
按照实施例12的方法，将表达rsPDH-I151R的基因和ME-L310R/Q401C的基因由异丙基硫代半乳糖(IPTG)诱导的lac启动子控制，构建相应的工程菌株，用同样的实验和分析方法检测各成分的含量。结果表明30℃反应液含2.4mM亚磷酸、2.5mM乳酸和7.8mM丙酮酸。说明甲醛脱氢酶PpFADH-L223T参与的上述催化体系效率高于亚磷酸脱氢酶rsPDH-I151R参与的类似的催化体系。
按照实施例12的方法，用甲醛脱氢酶突变体PpFADH-V219K/G264S(见之前专利，申请号201811154805.6)通过氧化甲醛为DLDH-V152R提供NCDH，催化丙酮酸还原生成乳酸，乳酸产量最高为2.6mM。说明甲醛脱氢酶突变体PpFADH-L223T通过氧化甲醛为DLDH-V152R/N213E提供NCDH，催化丙酮酸还原成乳酸，产量要高于甲醛脱氢酶突变体PpFADH-V219K/G264S。
实施例13：甲醛脱氢酶介导的透性化乳酸乳球菌(Lact℃℃cus lactis)AS1.2829细胞内还原NAD类似物及其应用
可以将所识别NAD类似物的甲醛脱氢酶、偏好NAD类似物的氧化还原酶同时在乳酸乳球菌中表达，形成一种依赖于NAD类似物的生物催化体系。当培养基中的甲醛和NAD类似物进入宿主细胞后，启动该生物催化体系。
将编码PpFADH-L218V的基因和编码DLDH-V152R的基因，由组成型表达启动子P32控制，将上述两种表达盒通过替换pMG36e的P32表达盒(GUCHTE MV,et al.Appl EnvironMicrobiol,1989,55,224-228.)获得工程质粒。
将上述工程质粒导入乳酸乳球菌获得工程菌株L.lactis WJT 004。用pH 6.8的含有10g/L蔗糖、10g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨、10g/L的KH2PO4、2g/L的MgSO4和5mg/L红霉素的培养基诱导工程菌L.lactis WJT 004表达上述两种功能蛋白，在25℃、200rpm的摇床中培养48h至菌体密度为4.5，2000×g离心6min收集菌体，用浓度50mM、pH 7.5的Tris-Cl洗涤重悬菌体，将菌体密度OD600nm调整至9。参照实施例10的方法使细胞透性化，制备方式为：取5mL的冻存细胞在室温下水浴解冻，加入5mM的EDTA和体积比1％的甲苯，30℃、200rpm摇床中温浴30min，然后再在4℃放置1h。2000g离心6min去除含有EDTA和甲苯的上清，用浓度50mM、pH 7.5的Tris-Cl洗两遍后重悬于5mL的浓度为50mM、pH 7.5的Tris-Cl中，获得透性化细胞。
上述用50mM、pH 7.5的Tris-Cl重悬的透性化工程菌悬液中加入10mM丙酮酸、10mM甲醛。0.1mM的NUD，在30℃、200rpm的摇床中厌氧反应1h。取100μL反应液，加入900μL乙腈水混合液(乙腈：水＝4:1)终止反应。
参照实施例5的方法利用离子色谱系统分析，结果表明反应液中含有2.2mM甲醛、3.7mM乳酸和6.3mM丙酮酸。
在只添加甲醛和NUD的一种及不添加甲醛和NUD的对照实验中，乳酸浓度分别为0.4mM、0.4mM和0.2mM。
实施例13说明，在乳酸乳球菌全细胞催化过程中胞内甲醛脱氢酶可以通过氧化甲醛提供还原态的NAD类似物，被DLDH-V152R用作辅酶应用于还原反应，乳酸的积累量与不添加甲醛和NUD的对照实验相比有所提高，因此可作为一种通过提供氧化还原力调控微生物体内乳酸代谢强度的方式。
按照实施例13的方法，用甲醛脱氢酶突变体PpFADH-V219K/G264S(见之前专利，申请号201811154805.6)通过氧化甲醛为DLDH-V152R提供NCDH，催化丙酮酸还原生成乳酸，乳酸产量最高为2.6mM。说明甲醛脱氢酶突变体PpFADH-L223T通过氧化甲醛为DLDH-V152R/N213E提供NCDH，催化丙酮酸还原成乳酸，产量要高于甲醛脱氢酶突变体PpFADH-V219K/G264S。
实施例14：甲醛脱氢酶介导的透性化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY4741细胞内还原NAD类似物及其应用
可以将所识别NAD类似物的甲醛脱氢酶、偏好NAD类似物的氧化还原酶同时在酿酒酵母细胞中表达，形成一种依赖于NAD类似物的生物催化体系。当培养基中的甲醛和NAD类似物进入宿主细胞后，启动该生物催化体系。
将编码PpFADH-A192R/L236V/L218V/R267V的基因和编码DLDH-V152R/N213E的基因，由TEF组成型启动子、CYC1终止子控制，将上述两种表达盒整合到p416酵母游离型穿梭表达载体获得工程质粒。
将上述工程质粒导入酿酒酵母获得工程菌株S.cerevisiae WJT 005。用pH 6.0的含有20g/L葡萄糖、10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨的YEPD培养基培养工程菌S.cerevisiaeWJT 005表达上述两种功能蛋白，在25℃、200rpm的摇床中培养48h至菌体密度OD600nm为4.5，2000×g离心6min收集菌体，用浓度50mM、pH 7.5的Tris-Cl洗涤重悬菌体，将菌体密度OD600nm调整到9。参照实施例11的方法使细胞透性化，获得透性化细胞。
上述用50mM、pH 7.5的Tris-Cl重悬的透性化工程菌悬液中加入10mM丙酮酸、10mM甲醛、0.1mM NTD，在30℃、200rpm的摇床中厌氧反应1h。取100μL加入900μL乙腈水混合液(乙腈：水＝4:1)终止反应。
参照实施例5的方法利用离子色谱系统分析，结果表明反应液含有0.9mM甲醛、4.8mM乳酸和5.2mM丙酮酸。
在只添加甲醛和NTD中的一种及不添加甲醛和NTD的对照实验中，乳酸的浓度分别为0.4mM、0.6mM和0.4mM。
实施例14说明，在酿酒酵母全细胞催化过程中胞内甲醛脱氢酶可以通过氧化甲醛提供还原态的NAD类似物，被DLDH-V152R/N213E用做辅酶应用于还原反应，乳酸的积累量与不添加甲醛和NTD的对照实验相比有所提高，因此可作为一种通过提供氧化还原力调控微生物体内乳酸的代谢强度的方式。
按照实施例14的方法，用甲醛脱氢酶突变体PpFADH-G298V(见之前专利，申请号201811154805.6)在酿酒酵母全细胞催化过程中胞内甲醛脱氢酶通过氧化甲醛提供还原态的NAD类似物，被DLDH-V152R用做辅酶应用于还原反应，乳酸的积累量为3.7mM。说明甲醛脱氢酶突变体PpFADH-A192R/L236V/L218V/R267V在酿酒酵母全细胞催化过程中胞内甲醛脱氢酶通过氧化甲醛提供还原态的NAD类似物，被DLDH-V152R/N213E用做辅酶应用于还原反应，乳酸的积累量要高于甲醛脱氢酶突变体PpFADH-G298V。
实施例15：甲醛脱氢酶介导的里氏木霉(Trichoderma reesei)胞内还原NAD类似物及其应用
可以将所识别NAD类似物的甲醛脱氢酶、偏好NAD类似物的氧化还原酶同时在里氏木霉细胞中表达，形成一种依赖NAD类似物的生物催化体系。当培养基中的甲醛和NAD类似物进入宿主细胞后，启动该生物催化体系。
将编码PpFADH-L236V/L223V的基因和编码DLDH-V152R的基因，由启动子Pcbh1和终止子Tcbh1控制，将上述两种表达盒整合到pCAMBIA1300载体上获得工程质粒。
将上述工程质粒导入里氏木霉获得工程菌株T.reesei WJT 006，用pH 4.8的含有15g/L乳糖、10g/L酵母提取物、1g/L(NH4)2SO4、3g/L的KH2PO4、0.5g/L的MgSO4、0.6g/L的CaCl2、0.05g/L的FeSO4·7H2O、0.0016g/L的MnSO4·H2O、0.0014g/L的ZnSO4·7H2O、0.0037g/L的C℃l2·6H2O的培养基诱导工程菌T.reesei WJT 006表达上述两种功能蛋白，在25℃、200rpm的摇床中培养48h，2000×g离心6min收集菌体，用浓度50mM、pH 7.5的Tris-Cl洗涤重悬菌体，将菌体密度调整到3g菌体干重/L。参照实施例11方法使细胞透性化，获得透性化细胞。
上述浓度50mM、pH 7.5的Tris-Cl重悬的透性化工程菌悬液中加入10mM丙酮酸、10mM甲醛、0.1mM的NCD，在30℃、200rpm的摇床中厌氧反应2h。取100μL样品，加入900μL乙腈水混合液(乙腈：水＝4:1)终止反应。
参照实施例5的方法利用离子色谱系统分析，结果表明反应液含1.6mM甲醛、5.1mM乳酸、4.9mM丙酮酸。
在只添加甲醛和NCD中的一种及不添加甲醛和NCD的对照实验中，乳酸浓度分别为1.2mM、0.9mM和0.6mM。
实施例15说明，在里氏木霉全细胞催化过程中胞内甲醛脱氢酶可以通过氧化甲醛提供还原态的NAD类似物，被DLDH-V152R用作辅酶应用于还原反应，乳酸的积累量与不添加甲醛和NCD的对照实验相比有所提高，因此可作为一种通过提供氧化还原力调控微生物体内乳酸代谢强度的方式。
按照实施例15的方法，用甲醛脱氢酶突变体PpFADH-A192S(见之前专利，申请号201811154805.6)在里氏木霉全细胞催化过程中胞内甲醛脱氢酶通过氧化甲醛提供还原态的NAD类似物，被DLDH-V152R用作辅酶应用于还原反应，乳酸的积累量为3.3mM。说明甲醛脱氢酶突变体PpFADH-L236V/L223V在里氏木霉全细胞催化过程中胞内甲醛脱氢酶通过氧化甲醛提供还原态的NAD类似物，被DLDH-V152R/N213E用做辅酶应用于还原反应，乳酸的积累量要高于甲醛脱氢酶突变体PpFADH-A192S。
实施例16：甲醛脱氢酶介导的圆红冬胞酵母(Rhodosporidium toruloides)胞内还原NAD类似物及其应用
可以将所识别NAD类似物的甲醛脱氢酶、偏好NAD类似物的氧化还原酶同时在圆红冬胞酵母中表达，形成一种依赖NAD类似物的生物催化体系。当培养基中的甲醛和NAD类似物进入宿主细胞后，启动该生物催化体系。
将编码PpFADH-L218V的基因和编码DLDH-V152R/N213E的基因，分别由启动子GPD、PGK和终止子Hspt、Tnos控制，将上述两种表达盒整合到pZPK载体上获得工程质粒。
将上述工程质粒通过ATMT转化导入圆红冬胞酵母获得工程菌株R.toruloidesWJT 007，用pH6.0的含有20g/L葡萄糖、10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨的YEPD培养基培养工程菌WJT 007表达上述两种功能蛋白，在28℃、200rpm的摇床中培养48h，2000×g离心6min收集菌体，用浓度50mM、pH 7.5的Tris-Cl洗涤重悬菌体，将菌体密度调整到3g菌体干重/L。参照实施例11方法使细胞透性化，获得透性化细胞。
上述浓度50mM、pH 7.5的Tris-Cl重悬的透性化工程菌悬液中加入10mM丙酮酸、10mM甲醛、0.1mM的NTD，在30℃、200rpm的摇床中厌氧反应2h。取100μL样品，加入900μL乙腈水混合液(乙腈：水＝4:1)终止反应。
参照实施例5的方法利用离子色谱系统分析，结果表明反应液含1.9mM甲醛、4.2mM乳酸、5.1mM丙酮酸。
在只添加甲醛和NTD中的一种及不添加甲醛和NTD的对照实验中，乳酸浓度分别为1.2mM、0.7mM和0.6mM。
实施例16说明，在圆红冬胞酵母催化过程中胞内甲醛脱氢酶可以通过氧化甲醛提供还原态的NAD类似物，被DLDH-V152R用作辅酶应用于还原反应，乳酸的积累量与不添加甲醛和NTD的对照实验相比有所提高，因此可作为一种通过提供氧化还原力调控微生物体内乳酸代谢强度的方式。
按照实施例16的方法，用甲醛脱氢酶突变体PpFADH-V263S/E266C(见之前专利，申请号201811154805.6)在圆红冬胞酵母催化过程中胞内甲醛脱氢酶通过氧化甲醛提供还原态的NAD类似物，被DLDH-V152R用作辅酶应用于还原反应，乳酸的积累量为3.0mM。说明甲醛脱氢酶突变体PpFADH-L218V在里氏木霉全细胞催化过程中胞内甲醛脱氢酶通过氧化甲醛提供还原态的NAD类似物，被DLDH-V152R/N213E用做辅酶应用于还原反应，乳酸的积累量要高于甲醛脱氢酶突变体PpFADH-V263S/E266C。
实施例17：甲醛脱氢酶突变体晶体解析
PpFADH未突变的晶体结构在PDB网站(PDB ID 1KOL，https://www.rcsb.org/structure/1KOL)，而突变后的PpFADH，分别将甲醛脱氢酶突变体PpFADH-A192R/L236V/L223V和PpFADH-A192R/L236V/L223T与NCD进行晶体解析，以获得含有配体NCD的晶体结构。
纯化后的甲醛脱氢酶突变体蛋白，采用座滴法，选取Hampton Research andWizard公司的结晶筛选试剂盒进行筛选。用于衍射的晶体培养条件为0.1M硫酸铵，0.1MTris(pH 7.0)，10％聚乙二醇单乙醚5000，蛋白浓度6mg/mL，温度30℃。晶体浸母液中，添加5mM NCD，然后进行低温处理、数据收集。所获得的晶体结构如图1或图2所示，表明在上述突变后，甲醛脱氢酶的结构改变主要在辅因子结合空腔处，其更贴合NAD类似物，而不易与NAD结合，从而改变了偏好性。
本申请中氨基酸的三个字母缩写、一个字母缩写对应关系如下表2所示：
表2本申请中氨基酸的一个字母缩写、三个字母缩写对应关系
以上所述，仅是本申请的几个实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。
序列表
<110> 中国科学院大连化学物理研究所
<120> 一种甲醛脱氢酶突变体及其应用
<130> DD200755I
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<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 398
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ser Gly Asn Arg Gly Val Val Tyr Leu Gly Ala Gly Lys Val Glu Val
1 5 10 15
Gln Lys Ile Asp Tyr Pro Lys Met Gln Asp Pro Arg Gly Lys Lys Ile
20 25 30
Glu His Gly Val Ile Leu Lys Val Val Ser Thr Asn Ile Cys Gly Ser
35 40 45
Asp Gln His Met Val Arg Gly Arg Thr Thr Ala Gln Val Gly Leu Val
50 55 60
Leu Gly His Glu Ile Thr Gly Glu Ile Val Glu Lys Gly Arg Asp Val
65 70 75 80
Glu Arg Met Gln Ile Gly Asp Leu Val Ser Val Pro Phe Asn Val Ala
85 90 95
Cys Gly Arg Cys Arg Ser Cys Lys Glu Met His Thr Gly Val Cys Leu
100 105 110
Thr Val Asn Pro Ala Arg Ala Gly Gly Ala Tyr Gly Tyr Val Asp Met
115 120 125
Gly Asp Trp Thr Gly Gly Gln Ala Glu Tyr Val Leu Val Pro Tyr Ala
130 135 140
Asp Phe Asn Leu Leu Lys Leu Pro Glu Arg Asp Lys Ala Met Glu Lys
145 150 155 160
Ile Arg Asp Leu Thr Cys Leu Ser Asp Ile Leu Pro Thr Gly Tyr His
165 170 175
Gly Ala Val Thr Ala Gly Val Gly Pro Gly Ser Thr Val Tyr Val Ala
180 185 190
Gly Ala Gly Pro Val Gly Leu Ala Ala Ala Ala Ser Ala Arg Leu Leu
195 200 205
Gly Ala Ala Cys Val Ile Val Gly Asp Leu Asn Pro Ala Arg Leu Ala
210 215 220
His Ala Lys Ser Gln Gly Phe Glu Val Val Asp Leu Ser Lys Asp Thr
225 230 235 240
Pro Leu His Glu Gln Ile Val Asp Ile Leu Gly Glu Pro Glu Val Asp
245 250 255
Cys Ala Ile Asp Ala Val Gly Phe Glu Ala Arg Gly His Gly His Glu
260 265 270
Gly Ala Lys His Glu Ala Pro Ala Thr Val Leu Asn Ser Leu Met Gln
275 280 285
Val Thr Arg Val Ala Gly Asn Ile Gly Ile Pro Gly Leu Tyr Val Thr
290 295 300
Glu Asp Pro Gly Ala Val Asp Ala Ala Ala Lys Ile Gly Ala Leu Ser
305 310 315 320
Ile Arg Phe Gly Leu Gly Trp Ala Lys Ser His Ser Phe His Thr Gly
325 330 335
Gln Thr Pro Thr Met Lys Tyr Asn Arg Gln Leu Met Gln Ala Ile Met
340 345 350
Trp Asp Arg Ile Asn Ile Ala Glu Val Val Gly Val Gln Val Ile Asn
355 360 365
Leu Asp Gln Ala Pro Glu Gly Tyr Gly Glu Phe Asp Ala Gly Val Pro
370 375 380
Lys Lys Phe Val Ile Asp Pro His Lys Met Trp Gly Ala Ala
385 390 395
<210> 2
<211> 1194
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tctggcaatc gtggagtggt atatctcggc gccggcaagg tcgaggtgca gaagatcgac 60
tacccgaaaa tgcaggaccc acgcggcaag aagatcgagc acggcgtgat cctgaaggtg 120
gtctccacca acatctgcgg ctccgaccag cacatggtcc gcggtcgcac cactgcccag 180
gtcggcctgg tcctgggcca cgaaatcacc ggcgagatcg tcgagaaggg ccgtgacgtc 240
gagcgcatgc agattggcga cctggtctcg gtgccattca acgtcgcctg tggccgctgc 300
cgctcctgca aggaaatgca caccggtgtc tgcctcaccg tcaaccctgc ccgcgctggc 360
ggtgcctatg gttacgtcga catgggcgac tggaccggcg gccaggccga gtacgtgctg 420
gtgccgtacg ccgacttcaa cctgctgaaa ctgcccgagc gcgacaaggc catggaaaag 480
atccgtgacc tgacctgcct gtctgacatc ctgcctactg gttaccacgg tgccgtgact 540
gccggcgttg gcccaggcag caccgtctac gttgccggtg ccggcccggt cggtttggct 600
gccgctgcct cggcacgtct gctgggcgct gcttgcgtca tcgttggcga cctcaaccca 660
gcccgcctgg ctcacgccaa gtcccagggt ttcgaagtgg tcgacctgtc caaggacacc 720
ccgctgcacg agcagatcgt cgatatcctc ggcgagcctg aagtggactg cgccatcgac 780
gccgttggct tcgaggcccg cggccatggc cacgaaggtg ccaagcatga agcgccagct 840
accgtgctga actcgctgat gcaggttacc cgcgttgccg gcaacatcgg tatcccgggc 900
ctgtacgtga ccgaagaccc gggtgcggtg gatgctgccg ccaagatcgg cgcgctgagc 960
attcgcttcg gcctgggctg ggcaaaatcg cacagcttcc acaccggcca gaccccgacc 1020
atgaagtaca accgccagct gatgcaggcg atcatgtggg atcgaatcaa catcgctgaa 1080
gtggttggtg tgcaggtgat caacctggat caggcgccgg aaggttatgg cgagttcgat 1140
gcgggtgtgc cgaagaagtt cgttattgac ccgcacaaaa tgtggggtgc ggcg 1194
Claims (32)
1.一种甲醛脱氢酶突变体，其特征在于，所述甲醛脱氢酶突变体选自以SEQ ID NO.1所示的野生型甲醛脱氢酶为基础进行如下突变后的突变体中的任一种：
第192位的A突变为R；或
第236位的L突变为V；或
第223位的L突变为V；或
第223位的L突变为T；或
第218位的L突变为V；或
第267位的R突变为V；或
第192位的A突变为R、第236位的L突变为V；或
第192位的A突变为R、第236位的L突变为V、第223位的L突变为V；或
第192位的A突变为R、第236位的L突变为V、第223位的L突变为T；或
第192位的A突变为R、第236位的L突变为V、第218位的L突变为V、第267位的R突变为V；或
第236位的L突变为V、第223位的L突变为V；或
第218位的L突变为V、第223位的L突变为V。
2.一种核酸，其特征在于，所述核酸编码如权利要求1所述的甲醛脱氢酶突变体中的任一种。
3.根据权利要求2所述的一种核酸，其特征在于，所述核酸选自以SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列为基础进行如下突变后的突变体中的任一种：
第192个密码子GCC突变为AGA；或
第236个密码子CTG突变为GTG；或
第223个密码子CTG突变为GTT；或
第223个密码子CTG突变为ACG；或
第218个密码子CTC突变为GTT；或
第267个密码子CGC突变为GTT；或
第192个密码子GCC突变为AGA、第236个密码子CTG突变为GTG；或
第192个密码子GCC突变为AGA、第236个密码子CTG突变为GTG、第223个密码子CTG突变为GTT；或
第192个密码子GCC突变为AGA、第236个密码子CTG突变为GTG、第223个密码子CTG突变为ACG；或第192个密码子GCC突变为AGA、第236个密码子CTG突变为GTG、第218个密码子CTC突变为GTT、第267个密码子CGC突变为GTT；或
第236个密码子CTG突变为GTG、第223个密码子CTG突变为GTT；或
第218个密码子CTC突变为GTT、第223个密码子CTG突变为GTT。
4.一种载体，其特征在于，所述载体包含权利要求2或3所述的核酸的表达盒。
5.一种宿主，其特征在于，所述宿主的细胞内包含权利要求4所述的载体。
6.根据权利要求5所述的宿主，其特征在于，所述宿主包括原核微生生物和/或真核微生生物。
7.根据权利要求6所述的宿主，其特征在于，所述原核微生物包括大肠杆菌和/或乳酸乳球菌；
所述真核微生物包括酿酒酵母、里氏木霉或圆红冬胞酵母中至少一种。
8.根据权利要求5所述的宿主，其特征在于，所述宿主的细胞内表达有NTT4核苷酸转运蛋白和/或AtNDT2核苷酸转运蛋白。
9.根据权利要求5所述的宿主，其特征在于，所述宿主的细胞内表达有酿酒酵母醇脱氢酶、羟基丁酮脱氢酶、苹果酸脱氢酶突变体MDH-L6R中的至少一种；
所述苹果酸脱氢酶突变体MDH-L6R的来源为登录号为Genbank CAA68326的苹果酸脱氢酶MDH，突变位点为第6位氨基酸由L突变成R。
10.根据权利要求5所述的宿主，其特征在于，所述宿主的细胞内表达有苹果酸酶突变体ME-L310R/Q401C；
所述苹果酸酶突变体ME-L310R/Q401C的来源为登录号为NCBI no .NP_415996 .1的苹果酸酶ME，突变位点为第310位氨基酸由L突变成R、第401位氨基酸由Q突变成C。
11.根据权利要求5所述的宿主，其特征在于，所述宿主的细胞内表达有乳酸脱氢酶突变体DLDH-V152R、乳酸脱氢酶突变体V152R/I177R/A212G、乳酸脱氢酶突变体V152R/I177S/A212D、乳酸脱氢酶突变体V152R/N213E或乳酸脱氢酶突变体V152R/I77K/N213I中至少一种；
所述乳酸脱氢酶突变体DLDH-V152R的来源为登录号为GeneBank No.CAA47255.1，PDBID:2DLD的乳酸脱氢酶DLDH，突变位点为第152位氨基酸由V突变成R；
所述乳酸脱氢酶突变体V152R/I177R/A212G的来源为登录号为GeneBankNo.CAA47255.1，PDB ID:2DLD的乳酸脱氢酶DLDH，突变位点为第152位氨基酸由V突变成R、第177位氨基酸由I突变成R、第212位氨基酸由A突变成G；
所述乳酸脱氢酶突变体V152R/I177S/A212D的来源为登录号为GeneBankNo.CAA47255.1，PDB ID:2DLD的乳酸脱氢酶DLDH，突变位点为第152位氨基酸由V突变成R、第177位氨基酸由I突变成S、第212位氨基酸由A突变成D；
所述乳酸脱氢酶突变体V152R/N213E的来源为登录号为GeneBank No.CAA47255.1，PDBID:2DLD的乳酸脱氢酶DLDH，突变位点为第152位氨基酸由V突变成R、第213位氨基酸由N突变成E；
所述乳酸脱氢酶突变体V152R/I77K/N213I的来源为登录号为GeneBankNo.CAA47255.1，PDB ID:2DLD的乳酸脱氢酶DLDH，突变位点为第152位氨基酸由V突变成R、第177位氨基酸由I突变成K、第213位氨基酸由N突变成I。
12.根据权利要求1所述的甲醛脱氢酶突变体、权利要求2或3所述的核酸、权利要求4所述的载体、权利要求5～11任一项所述的宿主在利用甲醛类化合物还原NAD类似物反应中的应用。
13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述NAD类似物选自具有式I～III任一所示的结构式的物质中的任一种；
式I；
式Ⅱ；
式III。
14.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述甲醛类化合物包括甲醛和/或氘代甲醛。
15.根据权利要求1所述的甲醛脱氢酶突变体、权利要求2或3所述的核酸、权利要求4所述的载体、权利要求5～11任一项所述的宿主在酶催化底物还原中的应用；
所述酶选自苹果酸酶突变体ME-L310R/Q401C；乳酸脱氢酶突变体DLDH-V152R、乳酸脱氢酶突变体V152R/I177R/A212G、乳酸脱氢酶突变体V152R/I177S/A212D、乳酸脱氢酶突变体V152R/N213E、乳酸脱氢酶突变体V152R/I77K/N213I、酿酒酵母醇脱氢酶、羟基丁酮脱氢酶、苹果酸脱氢酶突变体MDH-L6R中的任一种；
所述苹果酸酶突变体ME-L310R/Q401C的来源为登录号为NCBI no .NP_415996 .1的苹果酸酶ME，突变位点为第310位氨基酸由L突变成R、第401位氨基酸由Q突变成C；
所述乳酸脱氢酶突变体DLDH-V152R的来源为登录号为GeneBank No.CAA47255.1，PDBID:2DLD的乳酸脱氢酶DLDH，突变位点为第152位氨基酸由V突变成R；
所述乳酸脱氢酶突变体V152R/I177R/A212G的来源为登录号为GeneBankNo.CAA47255.1，PDB ID:2DLD的乳酸脱氢酶DLDH，突变位点为第152位氨基酸由V突变成R、第177位氨基酸由I突变成R、第212位氨基酸由A突变成G；
所述乳酸脱氢酶突变体V152R/I177S/A212D的来源为登录号为GeneBankNo.CAA47255.1，PDB ID:2DLD的乳酸脱氢酶DLDH，突变位点为第152位氨基酸由V突变成R、第177位氨基酸由I突变成S、第212位氨基酸由A突变成D；
所述乳酸脱氢酶突变体V152R/N213E的来源为登录号为GeneBank No.CAA47255.1，PDBID:2DLD的乳酸脱氢酶DLDH，突变位点为第152位氨基酸由V突变成R、第213位氨基酸由N突变成E；
所述乳酸脱氢酶突变体V152R/I77K/N213I的来源为登录号为GeneBankNo.CAA47255.1，PDB ID:2DLD的乳酸脱氢酶DLDH，突变位点为第152位氨基酸由V突变成R、第177位氨基酸由I突变成K、第213位氨基酸由N突变成I；
所述苹果酸脱氢酶突变体MDH-L6R的来源为登录号为Genbank CAA68326的苹果酸脱氢酶MDH，突变位点为第6位氨基酸由L突变成R。
16.一种还原型NAD类似物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：在甲醛脱氢酶突变体存在下，利用甲醛类化合物将NAD类似物还原，获得所述还原型NAD类似物；
所述甲醛脱氢酶突变体选自权利要求1所述的甲醛脱氢酶突变体中的至少一种；
所述NAD类似物选自式I～III所示的物质中的至少一种；
式I；
式Ⅱ；
式III。
17.根据权利要求16所述的一种还原型NAD类似物的制备方法，其特征在于，所述还原的条件包括：在pH 4～9的缓冲体系中，甲醛脱氢酶突变体为1μg/mL～6000μg/mL，NAD类似物为0.001mM～30mM、甲醛类化合物为1mM～1000mM。
18.根据权利要求16所述的一种还原型NAD类似物的制备方法，其特征在于，所述还原的条件包括：反应温度为10～40℃，反应时间为2～120min。
19.一种还原型NAD类似物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：在宿主存在下，利用甲醛类化合物将NAD类似物还原，获得所述还原型NAD类似物，
所述宿主选自权利要求5～11任一项所述的宿主中的任一种；
所述NAD类似物选自式I～III所示的物质中的至少一种；
式I；
式Ⅱ；
式III。
20.一种苹果酸的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
在甲醛脱氢酶突变体、甲醛类化合物、NAD类似物存在下，利用苹果酸酶突变体ME-L310R/Q401C将丙酮酸还原，得到所述苹果酸；
所述甲醛脱氢酶突变体选自权利要求1所述的甲醛脱氢酶突变体中的至少一种；
所述NAD类似物选自式I～III所示的物质中的至少一种；
式I；
式Ⅱ；
式III；
所述苹果酸酶突变体ME-L310R/Q401C的来源为登录号为NCBI no .NP_415996 .1的苹果酸酶ME，突变位点为第310位氨基酸由L突变成R、第401位氨基酸由Q突变成C。
21.根据权利要求20所述的一种苹果酸的制备方法，其特征在于，所述还原的条件包括：在pH 4～9的缓冲体系中，甲醛类化合物为1～10mM、丙酮酸为1～100mM、NAD类似物为0.001～1mM、甲醛脱氢酶突变体为0.01～0.5mg/mL和ME-L310R/Q401C为0.01～1mg/mL。
22.根据权利要求21所述的一种苹果酸的制备方法，其特征在于，所述缓冲体系中还包括：MnCl2为0.01～2mM、碳酸氢钠为1～100mM。
23.根据权利要求20所述的一种苹果酸的制备方法，其特征在于，所述还原的条件包括：反应温度为5～40℃，反应时间为2～240min。
24.一种苹果酸的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
将含有甲醛类化合物、NAD类似物、宿主的培养液反应，得到所述苹果酸；
所述宿主选自权利要求10所述的宿主中的任一种；所述NAD类似物选自式I～III所示的物质中的至少一种；
式I；
式Ⅱ；
式III。
25.根据权利要求24所述的一种苹果酸的制备方法，其特征在于，所述培养液中，pH值为6～8，宿主的菌体密度OD 600nm为7～12，碳酸氢钠为1～15mM、丙酮酸为5～15mM、甲醛类化合物为1～10mM、NAD类似物为0.01～10mM。
26.根据权利要求24所述的一种苹果酸的制备方法，其特征在于，所述反应的条件包括：厌氧条件下，温度为10～42℃，转速为100～300rpm，时间为1～10h。
27.一种D-乳酸的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：在甲醛脱氢酶突变体、甲醛类化合物、NAD类似物存在下，利用乳酸脱氢酶突变体将丙酮酸还原，获得所述D-乳酸；
所述甲醛脱氢酶突变体选自权利要求1所述的甲醛脱氢酶突变体中的至少一种；
所述乳酸脱氢酶突变体选自DLDH-V152R、V152R/I177R/A212G、V152R/I177S/A212D、V152R/N213E或V152R/I77K/N213I中的至少一种；
所述NAD类似物选自式I～III所示的物质中的至少一种；
式I；
式Ⅱ；
式III；
所述DLDH-V152R的来源为登录号为GeneBank No.CAA47255.1，PDB ID:2DLD的乳酸脱氢酶DLDH，突变位点为第152位氨基酸由V突变成R；
所述V152R/I177R/A212G的来源为登录号为GeneBank No.CAA47255.1，PDB ID:2DLD的乳酸脱氢酶DLDH，突变位点为第152位氨基酸由V突变成R、第177位氨基酸由I突变成R、第212位氨基酸由A突变成G；
所述V152R/I177S/A212D的来源为登录号为GeneBank No.CAA47255.1，PDB ID:2DLD的乳酸脱氢酶DLDH，突变位点为第152位氨基酸由V突变成R、第177位氨基酸由I突变成S、第212位氨基酸由A突变成D；
所述V152R/N213E的来源为登录号为GeneBank No.CAA47255.1，PDB ID:2DLD的乳酸脱氢酶DLDH，突变位点为第152位氨基酸由V突变成R、第213位氨基酸由N突变成E；
所述V152R/I77K/N213I的来源为登录号为GeneBank No.CAA47255.1，PDB ID:2DLD的乳酸脱氢酶DLDH，突变位点为第152位氨基酸由V突变成R、第177位氨基酸由I突变成K、第213位氨基酸由N突变成I。
28.根据权利要求27所述的一种D-乳酸的制备方法，其特征在于，所述还原的条件包括：在pH 4～9的缓冲体系中，甲醛类化合物为1～10mM、丙酮酸为1～100mM、NAD类似物为0.001～0.5mM、甲醛脱氢酶突变体为0.01～0.5mg/mL和乳酸脱氢酶突变体为0.01～1mg/mL。
29.根据权利要求27所述的一种D-乳酸的制备方法，其特征在于，所述还原的条件包括：反应温度为5～40℃，反应时间为2～120min。
30.一种D-乳酸的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：将含有甲醛类化合物、NAD类似物、宿主的培养液反应，得到所述D-乳酸；
所述宿主选自权利要求11所述的宿主中的任一种；
所述NAD类似物选自式I～III所示的物质中的至少一种；
式I；
式Ⅱ；
式III。
31.根据权利要求30所述的一种D-乳酸的制备方法，其特征在于，所述培养液中，pH值为6～9，宿主的菌体密度OD 600nm为7～9，丙酮酸为5～15mM、甲醛类化合物为1～20mM、NAD类似物为0.01～10mM。
32.根据权利要求30所述的一种D-乳酸的制备方法，其特征在于，所述反应的条件为：厌氧条件下，转速为100～300rpm，温度为10～42℃，时间为1～10h。
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|---|
| 紫外诱变选育高效降解甲醛菌株及其降解特性;姚璐晔;食品科学;第36卷(第13期);全文 * |
| 高等植物醇脱氢酶及其基因家族研究进展;刘威;陈昊;靳亚忠;齐红岩;;植物生理学报(第10期);全文 * |
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| CN114621935A (zh) | 2022-06-14 |
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