CN111217744A - 一种d-氨基酸基nad+类似物及其合成和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一类基于D‑氨基酸的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)类似物及其合成方法与应用。D‑氨基酸基NAD+类似物的结构通式为
Figure DDA0001879636420000011
D‑氨基酸基NAD+类似物是利用1‑(2’,4’‑二硝基苯基)‑3‑氨甲酰基吡啶和D‑α‑氨基酸为原料，在碱催化下合成的；D‑氨基酸基NAD+类似物可以作为NAD(P)依赖型氧化还原酶的辅酶。本发明方法具有以下优点：合成D‑氨基酸基NAD+类似物的反应条件温和，原料简单易得，反应产物完全保留原料D‑α‑氨基酸的立体结构，不发生消旋。本发明得到的NAD+类似物可用于生物催化、生物分析化学、代谢工程和合成生物学研究中。

Description

一种D-氨基酸基NAD+类似物及其合成和应用
技术领域
本发明涉及一类NAD+类似物及其合成与应用，属于烟酰胺类辅酶类似物的合成及应用领域。
背景技术
氧化还原酶需要氧化还原辅因子提供接受或提供电子以及氢质子，氧化还原辅因子主要包括烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(辅酶I，NAD)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(辅酶II，NADP)黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、黄素单核苷酸(FMN) 等。而80％的氧化还原酶都需要NAD(H)作为辅因子，10％的氧化还原酶需要NADP(H)作为辅因子。烟酰胺类辅因子价格非常昂贵，限制了氧化还原酶在工业中的应用。为了降低工业成本，需要用廉价易得的NAD(P)的类似物替代天然辅因子(Chinese Journal of Bioprocess Engineering，2004，3，1-8)。所以利用烟酰胺辅因子类似物(mNADs)作为酶的辅因子的研究受到了广泛的关注 (ACSCatalysis，2014，4，788-797)。
烟酰胺辅因子类似物的结构改变主要有两个方面：一是改变天然辅因子烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的腺嘌呤二核苷酸(AD)部分，将烟酰胺1位 N的取代基改变为结构简单的基团，比如烷基或芳基，称为合成mNADs；二是保留二核苷酸结构改变吡啶环上3位氨甲酰基为其他酰基基团或改变腺嘌呤基团为其他基团，称为保守mNADs。结构简单的合成mNADs是通过卤代烷烃或卤代芳烃烃将烟酰胺或其类似物在1位N上进行烷基化，得到N取代烟酰胺或其类似物卤化盐(mNAD+s)，然后在碱性条件下用连二亚硫酸钠还原为mNADHs(Helvetica ChimicaActa，1937，20，418-423)。保守mNADs，可以利用NAD酶(NADase)催化3-酰基取代的吡啶类似物和天然辅因子 (NAD(P))之间的反应，得到只有吡啶环上3位发生改变的保守mNADs (Analytical Biochemistry，1991，195，57-62)。也可以用化学合成焦磷酸酯的方法，利用PPh3/(PyS)2在N-甲基咪唑存在情况下活化烟酰胺单核苷酸(NMN)，使其可以与另外一分子腺嘌呤基团经过修饰或改变的单核苷酸快速反应生成焦磷酸酯形式的保守mNADs(Chinese Journal of Organic Chemistry，2014，34， 54-64)。
结构简单的合成mNADs和结构保守的mNADs都已成功应用于氧化还原酶催化的酶促反应中。Knox研究了硫辛酰胺脱氢酶可利用l-甲基-1，4(2H)-烟酰胺为辅因子催化还原苯甲醌，首次证明简单烟酰胺辅因子类似物可以作为活性辅因子类似物，用于烟酰胺辅因子依赖型的氧化还原酶中(Biochemical Pharmacology，1995，49，1641-1647)。Ryan将细胞色素P450 BM-3氧化酶进行突变，并将两种合成烟酰胺类似物1-苯甲基-1，4(2H)-烟酰胺和1-(4-甲氧基苄基)-1，4(2H)-烟酰胺作为突变体与野生型的辅因子催化。发现P450 BM-3在1064位的Trp突变为Ser的突变体和966位Arg突变为His的突变体利用利用辅因子类似物的催化效率与野生型利用天然NAD+的效率基本一致 (ChemBioChem，2008，9，25792582)。Paul将一系列mNADHs替代烯酮还原酶ERs中天然辅因子NAD(P)H，发现辅因子类似物可以替代天然NAD(P)H，保持催化反应的催化效率和立体选择性(Organic Letters，2013，15，180-183)。 Anderson将3位丁酰基、硫代氨甲酰基或其他基团取代的吡啶化合物与天然 NAD+通过NAD酶作用得到的保守mNAD+s，并将所得产物作为单独的辅因子应用到马肝醇脱氢酶中，结果发现吡啶环上3位丁酰基取代的半合成 mNAD+s作为马肝醇脱氢酶的辅因子时，酶催化氧化乙醇到乙醛的效率是利用天然NAD+时的8倍，而3位硫代氨甲酰基取代的类似物是其3.5倍(Journal of Biological Chemistry，1959，234，1219-1225)。本组将烟酰胺辅因子的腺嘌呤部分改变为氟胞嘧啶得到烟酰胺氟胞嘧啶二核苷酸(NFCD+)，并将其用于苹果酸酶(ME)和D-乳酸脱氢酶(DLDH)的突变体中，发现两种酶的突变体对 NFCD+的亲和力及催化活性比对天然NAD+的更大，而野生型对NFCD+的亲和力远小于NAD+(Journal of theAmerican Chemical Society，2011，133， 20857-20862)。
已报道的NAD+类似物能够用作氧化还原酶的辅酶，但不能被酶特异性的识别，需要对酶进行突变后，才能特异性识别，提高酶反应速率。所以设计不同结构廉价易得的NAD+类似物，再对酶进行定向进化，使酶能有效识别NAD+类似物，降低生产成本。
发明内容
针对上述问题，本发明所要解决的技术问题在于设计合成一类NAD类似物，使其能有效的被氧化还原酶识别，作为氧化还原酶的辅酶，催化氧化还原反应。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种D-氨基酸基NAD+类似物，其特征在于：D-氨基酸基NAD+类似物的结构式如下：
Figure BDA0001879636410000031
其中，以氨基酸羧基为1位碳，类似物2位碳原子手性中心的立体构型为R，取代基R为C1-C5的烷基或C1-C5中的H被-OH、-COOH、-CONH2、-SCH3、
Figure BDA0001879636410000032
Figure BDA0001879636410000033
中的一种或二种以上取代的烷基，取代位置为烷基远离1位碳的末端或次末端(从末端数第二个碳)碳原子上。
所述的D-氨基酸基NAD+类似物包括但不限于以下化合物中的一种或二种以上：
Figure BDA0001879636410000034
Figure BDA0001879636410000035
D-氨基酸基NAD+类似物的合成方法，其特征在于：D-氨基酸基NAD+类似物是以1-(2，4-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐和D--氨基酸为原料，在碱催化下合成的。
所述合成D-氨基酸基NAD+类似物的原料D--氨基酸包括但不限于以下结构中的一种或二种以上：
Figure BDA0001879636410000036
Figure BDA0001879636410000037
所述的碱为乙酸钠、甲酸钠、三乙胺、三丙胺或三丁胺中的一种或两种以上；1-(2，4-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐、D--氨基酸和碱三者的摩尔当量比为1∶1～1.1∶1～2；反应温度为20～40；合成NAD+类似物的溶剂为甲醇、水、或甲醇与水任意体积比例的混合物。
所述的D-氨基酸基NAD+类似物可作为NAD(P)依赖型氧化还原酶的辅酶，用于催化相应底物转化为产物。
所述的氧化还原酶包括但不限于苹果酸酶、亚磷酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、甲酸脱氢酶、甲醛脱氢酶、甲醇脱氢酶、1，3-丙二醇脱氢酶中的一种或两种以上：
其中对应的底物包括但不限于苹果酸及苹果酸盐、亚磷酸及亚磷酸盐、乳酸及乳酸盐、甲酸及甲酸盐、甲醛、甲醇、1，3-丙二醇中的一种或两种以上。
利用D-氨基酸基NAD+类似物为辅因子，以一种NAD(P)依赖型氧化还原酶为生产酶，偶联另一种NAD(P)依赖型氧化还原酶为再生酶，可实现D-氨基酸基NAD+类似物的再生循环。
本发明中NAD+类似物的编号为D-Xyz-NAD，其中D为氨基酸立体构型， Xyz为氨基酸的三字母简写；本发明中NAD+类似物还原产物的编号为 D-Xyz-NADH，其中D为氨基酸立体构型，Xyz为氨基酸的三字母简写。
本发明合成的NAD类似物，结构简单且稳定，反应产物完全保留原料D-- 氨基酸的立体结构，不发生消旋，反应条件温和，合成路线简单且成本低，能够被多种依赖于烟酰胺辅因子氧化还原酶突变体识别，进一步对氧化还原酶进行突变，提高酶对类似物的活性，具有工业应用的潜在价值，有望降低生产成本。
本发明得到的NAD+类似物可用于生物催化、生物分析化学、代谢工程和合成生物学研究中。
具体实施方式
以下实施例有助于了解本专利，但不局限于本发明的内容。
本发明所使用的苹果酸酶来自大肠杆菌K12(UniProt code P26616)，D- 乳酸脱氢酶来自Lactobacillus helveticus(Uniprot code P30901)，亚磷酸脱氢酶来自Ralstonia sp.strain 4506(Uniprot code G4XDR8)，甲酸脱氢酶来自 Pseudomonassp.101(Uniprot code P33160)，甲醛脱氢酶来自Pseudomonas putida(Uniprot codeP46154)，甲醇脱氢酶来自Bacillus stearothermophilus (Uniprot code P42327)，1，3-丙二醇脱氢酶来自Klebsiellapneumoniae(Uniprot code Q7WRJ3)。本发明所用到的突变脱氢酶是利用
Figure BDA0001879636410000051
单位点突变试剂盒引入氨基酸突变得到突变型苹果酸酶(ME-L310R/Q401C)、突变型乳酸脱氢酶(DLDH-V152R)、突变型亚磷酸脱氢酶(PDH-I151R)、突变型甲酸脱氢酶(FDH-L257R)、突变型甲醛脱氢酶(FADH-E265R)、突变型甲醇脱氢酶 (MDH-D136R)、突变型1，3-丙二醇脱氢酶(PDOR-G186R)。本发明所使用的上述氧化还原酶都是按文献(Protein Expression and Purification，2007，53， 97-103)方法表达纯化。
氧化还原酶的底物以及相应产物的检测：利用美国戴安公司ICS-2500离子色谱系统在ED50脉冲电化学检测模式下分析测定反应溶液中苹果酸，乳酸，丙酮酸或亚磷酸等底物和对应产物的含量。使用IonPac AS11-HC阴离子交换分析柱(200mm×4mm)，IonPacAG11-HC阴离子交换保护柱(50mm×4mm)。分析条件：流动相为24mM NaOH，流速1mL/min，柱温：30℃，进样量25L。其中，苹果酸保留时间为10.24min，丙酮酸保留时间为5.21min，D-乳酸保留时间为7.74min，亚磷酸保留时间为23.42min，磷酸保留时间为31.40min，甲酸保留时间为3.64min。
甲醛、甲醇、3-羟基丙醛及1，3-丙二醇采用天美GC-7890F气相色谱分析，分析柱为极性柱FFAP石英毛细管柱(30m×0.32mm×0.4m)；柱温190℃，进样器温度250℃，检测器(FID)温度280℃；进样量0.2L；载气N2 40 mL/min，H2 40.6mL/min，空气130mL/min；分流进样，柱前压0.22Mpa。通过标准品，对照标准样品进行定性，采用面积归一法确定相对含量。其中，3- 羟基丙醛保留时间为12.4min，1，3-丙二醇保留时间为14.68min处，甲醛保留时间2.18min，甲醇保留时间3.8min。
2，4-二硝基氯苯工业上是以氯苯为原料经间歇式硝化中的两步法制备而得，可直接购买商品化试剂。
实施例1
1-(2，4-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐是按文献(The Journal ofOrganic Chemistry，2012，77，73197329)方法合成的，步骤如下：将烟酰胺 (0.244g，2mmol)和2，4-二硝基氯苯(1.215g，6mmol)加到25mL圆底烧瓶中，加热到90，反应2h，待反应冷却至室温，加入甲醇溶解，加入乙醚重结晶，重复3次，真空干燥得到棕色泡沫状固体1-(2，4-二硝基苯基)-3- 氨甲酰基吡啶氯化盐。1H NMR(400MHz，D2O)9.60(s，1H)，9.34(d，J＝2.4 Hz，1H)，9.28(d，J＝6.4Hz，1H)，9.21(d，J＝8.4Hz，1H)，8.88(dd，J＝8.8，2.4Hz， 1H)，8.43(dd，J＝8.4，6.4Hz，1H)，8.20(d，J＝8.8Hz，1H).13C NMR(101MHz，D2O)164.97，149.80，147.51，147.31，145.64，142.74，138.33，134.16，131.13， 130.75，128.59，122.76.
实施例2
向含有D-酪氨酸(D-Tyr，189.6mg，1.03mmol)的2mL水溶液中，滴加含有1-(2，4-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐(324.7mg，1mmol)的2 mL甲醇溶液，滴加完毕后，向反应中加入乙酸钠(82.0mg 1mmol)，反应液颜色由橙色变为紫色，20下搅拌24h后，TLC检测，原料1-(2，4-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐不再减少，未完全反应，过滤除去反应液中的不溶物，滤液减压浓缩除溶剂，硅胶柱层析纯化，棕色泡沫状固体D-Tyr-NAD。1H NMR(400MHz，MeOD)9.29(s，1H)，8.92(d，J＝6.0Hz，1H)，8.83(d，J＝ 8.0Hz，1H)，8.01(dd，J＝8.0，6.0Hz，1H)，6.87(d，J＝8.4Hz，2H)，6.56(d，J＝8.4Hz，2H)，5.50(dd，J＝11.6，4.4Hz，1H)，3.75(dd，J＝15.0，4.4Hz，1H)，3.39 (dd，J＝15.0，11.6Hz，1H).
实施例3
向含有D-酪氨酸(D-Tyr，189.6mg，1.03mmol)的2mL水溶液中，滴加含有1-(2，4-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐(324.7mg，1mmol)的2 mL水溶液，滴加完毕后，向反应中加入甲酸钠(136.0mg，2mmol)，反应液颜色由橙色变为紫色，30下搅拌24h后，TLC检测，原料1-(2，4-二硝基苯基、)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐不再减少，未完全反应，过滤除去反应液中的不溶物，滤液减压浓缩除溶剂，硅胶柱层析纯化，棕色泡沫状固体D-Tyr-NAD。1H NMR(400MHz，MeOD)9.29(s，1H)，8.92(d，J＝6.0Hz，1H)，8.83(d，J＝ 8.0Hz，1H)，8.01(dd，J＝8.0，6.0Hz，1H)，6.87(d，J＝8.4Hz，2H)，6.56((d，J＝ 8.4Hz，2H)，5.50(dd，J＝11.6，4.4Hz，1H)，3.75(dd，J＝15.0，4.4Hz，1H)，3.39 (dd，J＝15.0，11.6Hz，1H).
实施例4
向含有D-酪氨酸(D-Tyr，189.6mg，1.03mmol)的2mL甲醇溶液中，滴加含有1-(2，4-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐(324.7mg，1mmol)的 2mL甲醇溶液，滴加完毕后，加入三乙胺1mmol，40下搅拌24h后，TLC 检测，原料D-酪氨酸反应完全。过滤除去反应液中的不溶物，滤液减压浓缩除溶剂，硅胶柱层析纯化，棕色泡沫状固体D-Tyr-NAD。1H NMR(400MHz，MeOD)9.29(s，1H)，8.92(d，J＝6.0Hz，1H)，8.83(d，J＝8.0Hz，1H)，8.01(dd， J＝8.0，6.0Hz，1H)，6.87(d，J＝8.4Hz，2H)，6.56((d，J＝8.4Hz，2H)，5.50(dd，J ＝11.6，4.4Hz，1H)，3.75(dd，J＝15.0，4.4Hz，1H)，3.39(dd，J＝15.0，11.6Hz， 1H).HRMS：calculated forC15H15N2O4 +287.1026，found 287.1022.比旋度
Figure DEST_PATH_GDA0001940110170000071
Figure DEST_PATH_GDA0001940110170000072
比旋度
Figure DEST_PATH_GDA0001940110170000073
是利用旋光度测定仪在波长589nm、温度20、浓度2.0 mg/mL的水溶液中测得。
实施例5
向含有D-亮氨酸(D-Leu，131.2mg，1mmol)的2mL甲醇溶液中，滴加含有1-(2，4-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐1-(2，4-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐(，324.7mg，1mmol)的2mL甲醇溶液，滴加完毕后，加入三丙胺1mmol，分别在反应0h、4h、9h分三次加入，室温下搅拌24h后， TLC检测，原料1-(2，4-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐1-(2，4-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐反应完全。过滤除去反应液中的不溶物，滤液减压浓缩除溶剂，硅胶柱层析纯化，淡黄色粉沫状固体D-Leu-NAD(201mg， 73.8％)。1H NMR(400MHz，MeOD)9.48(s，1H)，9.19(d，J＝6.0Hz，1H)，8.96 (d，J＝8.0Hz，1H)，8.18(dd，J＝8.0，6.4Hz，1H)，5.35(dd，J＝10.0，5.6Hz，1H)， 2.372.19(m，2H)，1.40-1.33(m，1H)，1.00(d，J＝6.8Hz，3H)，0.93(d，J＝6.4 Hz，3H).13C NMR(101MHz，MeOD)170.65，163.93，146.40，144.33，143.89， 133.95，127.35，75.23，41.44，24.91，21.76，20.23.HRMS：calculatedfor C12H17N2O3 +237.1234，found 237.1239.比旋度
Figure DEST_PATH_GDA0001940110170000074
比旋度测定方法同
实施例4。
实施例6
向含有D-甲硫氨酸(D-Met，164.1mg，1.1mmol)的2mL甲醇溶液中，滴加含有1-(2，4-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐(324.7mg，1mmol)的 2mL甲醇溶液，滴加完毕后，加入三丁胺1mmol，分别在反应0h、4h、9h 分三次加入，室温下搅拌24h后，TLC检测，原料1-(2，4-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐1-(2，4-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐反应完全。过滤除去反应液中的不溶物，滤液减压浓缩除溶剂，硅胶柱层析纯化，棕色泡沫状固体D-Met-NAD(244mg，95.6％)。1H NMR(400MHz，MeOD)9.45(s，1H)， 9.16(d，J＝6.4Hz，1H)，8.97(d，J＝8.0Hz，1H)，8.18(dd，J＝8.0，6.4Hz，1H)， 5.47(dd，J＝9.6，4.8Hz，1H)，2.852.71(m，1H)，2.642.49(m，2H)，2.43 2.33(m，1H)，2.03(s，3H).13C NMR(101MHz，D2O)171.78，165.81，146.68， 144.63，144.30，133.70，128.07，74.77，30.90，29.24，13.69.HRMS：calculated for C11H15N2O3S+255.0798，found 255.0800.比旋度
Figure DEST_PATH_GDA0001940110170000081
比旋度测定方法同实施例4。
实施例7
向含有D-谷氨酰胺(D-Gln，160.8mg，1.1mmol)的2mL甲醇溶液中，滴加含有1-(2，4-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐(324.7mg，1mmol)的2mL甲醇溶液，滴加完毕后，加入三乙胺1mmol，分别在反应0h、4h、9h 分三次加入，室温下搅拌48h后，TLC检测，原料1-(2，4-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐反应完全Gln-NAD(253mg，88.2％)。过滤除去反应液中的不溶物，滤液减压浓缩除溶剂，硅胶柱层析纯化，棕色泡沫状固体D-Gln-NAD。1H NMR(400MHz，MeOD)9.21(s，1H)，8.89(d，J＝5.6Hz，1H)，8.71(d，J＝ 8.0Hz，1H)，7.987.89(m，1H)，5.13(dd，J＝9.2，5.0Hz，1H)，2.55(td，J＝12.7， 6.6Hz，1H)，2.29(td，J＝15.8，7.0Hz，1H)，2.07(t，J＝6.8Hz，2H).13C NMR(101 MHz，D2O)176.77，171.38，165.78，146.66，144.76，144.31，133.65，128.07， 75.81，31.49，28.36.HRMS：calculated for C11H14N3O4 +252.0979，found 252.0976. 比旋度
Figure DEST_PATH_GDA0001940110170000082
比旋度测定方法同实施例4。
实施例8
向含有D-谷氨酸(D-Glu，161.8mg，1.1mmol)的2mL甲醇溶液中，滴加含有1-(2，4-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐(324.7mg，1mmol) 的2mL甲醇溶液，滴加完毕后，加入三乙胺1mmol，分别在反应0h、4h、 9h分三次加入，室温下搅拌48h后，TLC检测，原料1-(2，4-二硝基苯基)-3- 氨甲酰基吡啶氯化盐反应完全。过滤除去反应液中的不溶物，滤液减压浓缩除溶剂，硅胶柱层析纯化，棕色泡沫状固体D-Glu-NAD(154mg，53.5％)。1H NMR (400MHz，MeOD)9.25(s，1H)，8.95(d，J＝6.0Hz，1H)，8.78(d，J＝8.4Hz， 1H)，8.137.98(m，1H)，5.17(dd，J＝9.2，6.0Hz，1H)，2.62(dq，J＝13.4，7.4Hz， 1H)，2.412.14(m，3H).13C NMR(101MHz，D2O)177.52，171.61，165.84，146.63，144.71，144.24，133.66，128.06，75.85，31.58，28.28.HRMS：calculated for C11H14N2O5 +253.0819，found 253.0820.比旋度
Figure DEST_PATH_GDA0001940110170000083
比旋度测定方法同
实施例4。
实施例9
向含有D-赖氨酸(D-Lys，164.1mg，1.1mmol)的2mL甲醇溶液中，滴加含有1-(2，4-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐(324.7mg，1mmol) 的2mL甲醇溶液，滴加完毕后，加入三乙胺1mmol，分别在反应0h、4h、 9h分三次加入，室温下搅拌24h后，TLC检测，原料1-(2，4-二硝基苯基)-3- 氨甲酰基吡啶氯化盐反应完全。过滤除去反应液中的不溶物，滤液减压浓缩除溶剂，硅胶柱层析纯化，棕色泡沫状固体D-Lys-NAD(104mg，48.5％)。1H NMR (400MHz，D20)9.27(s，2H)，9.03(d，J＝6.0Hz，1H)，8.98(d，J＝6.0Hz，1H)， 8.92(d，J＝8.0Hz，1H)，8.87(d，J＝8.0Hz，1H)，8.278.09(m，2H)，5.28(dd，J ＝9.2，5.6Hz，1H)，4.65(t，J＝7.4Hz，2H)，2.43-2.57(m，1H)，2.41 2.23(m，1H)， 2.16 2.05(m，2H)，1.47(dd，J＝10.0，5.2Hz，1H)，1.28(dd，J＝10.4，6.2Hz，1H). 13C NMR(101MHz，D2O)165.81，146.31，144.50，144.27，143.96，133.95， 133.72，128.39，128.07，76.14，61.71，31.70，29.79，22.18.HRMS：calculated for C18H22N4O4 2+ 358.1630，found 179.0815.比旋度
Figure DEST_PATH_GDA0001940110170000091
比旋度测定方法同实施例4。
实施例10
向含有D-组氨酸(D-His，170.8mg，1.1mmol)的2mL甲醇溶液中，滴加含有1-(2，4-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐(324.7mg，1mmol)的 2mL甲醇溶液，滴加完毕后，加入三乙胺1mmol，分别在反应0h、4h、9h 分三次加入，室温下搅拌24h后，TLC检测，原料1-(2，4-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐反应完全。过滤除去反应液中的不溶物，滤液减压浓缩除溶剂，硅胶柱层析纯化，棕色泡沫状固体D-His-NAD(168mg，56.4％)。1H NMR (400MHz，D2O)9.10(s，1H)，8.86(d，J＝6.2Hz，1H)，8.82(dd，J＝8.0，1.3Hz， 1H)，8.07(dd，J＝8.0，6.2Hz，1H)，7.53(d，J＝0.9Hz，1H)，6.80(s，1H)，5.58(dd， J＝10.6，4.7Hz，1H)，3.69(dd，J＝15.6，4.7Hz，1H)，3.53(dd，J＝15.6，10.6Hz， 1H).13C NMR(101MHz，D2O)171.00，165.58，146.60，144.31，144.22，136.32， 133.17，132.41，127.68，116.40，76.20，30.95.HRMS：calculated for C12H13N4O3 + 261.0982，found 261.0984.比旋度
Figure DEST_PATH_GDA0001940110170000092
比旋度测定方法同实施例4。
实施例11
向含有D-苯丙氨酸(D-Phe，181.7mg，1.1mmol)的2mL甲醇溶液中，滴加含有1-(2，4-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐(324.7mg，1mmol)的 2mL甲醇溶液，滴加完毕后，加入三乙胺1mmol，分别在反应0h、4h、9h 分三次加入，室温下搅拌24h后，TLC检测，原料1-(2，4-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐反应完全。过滤除去反应液中的不溶物，滤液减压浓缩除溶剂，硅胶柱层析纯化，棕色泡沫状固体D-Phe-NAD(110.2mg，36.0％)。1H NMR(400MHz，MeOD)9.34(s，1H)，8.98(d，J＝6.0Hz，1H)，8.82(d，J＝8.0Hz， 1H)，8.00(dd，J＝8.0，6.4Hz，1H)，7.29(d，J＝4.4Hz，1H)，7.207.04(m，5H)， 5.60(dd，J＝11.6，4.4Hz，1H)，3.88(dd，J＝14.8，4.4Hz，1H)，3.50(dd，J＝15.2， 11.6Hz，1H).13C NMR(101MHz，MeOD)169.48，163.68，146.64，144.59， 143.78，135.80，133.50，129.11，128.66，128.57，128.41，127.07，126.98，77.86， 39.10.HRMS：calculated for C15H15N2O3 + 271.1077，found 271.1074.比旋度
Figure DEST_PATH_GDA0001940110170000101
比旋度测定方法同实施例4。
实施例12
向含有D-缬氨酸(D-Val，128.8mg，1.1mmol)的2mL甲醇溶液中，滴加含有1-(2，4-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐(324.7mg，1mmol)的2 mL甲醇溶液，滴加完毕后，加入三乙胺1mmol，分别在反应0h、4h、9h 分三次加入，室温下搅拌24h后，TLC检测，原料1-(2，4-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐反应完全。过滤除去反应液中的不溶物，滤液减压浓缩除溶剂，硅胶柱层析纯化，得产物D-Val-NAD(255mg，98.5％)。1H NMR(400MHz， D2O)9.36(s，1H)，9.14(d，J＝6.4Hz，1H)，8.94(d，J＝8.0Hz，1H)，8.22(dd，J＝ 8.0，6.4Hz，1H)，4.90(d，J＝9.3Hz，1H)，2.66(，m，1H)，1.12(d，J＝6.7Hz，3H)， 0.84(d，J＝6.7Hz，3H).13C NMR(101MHz，D2O)171.59，165.88，146.42， 144.45，143.99，133.52，127.92，82.81，31.74，18.64，17.62.HRMS：calculated for C11H15N2O3 + 223.1077，found 223.1079.比旋度
Figure DEST_PATH_GDA0001940110170000102
比旋度测定方法同实施例4。
实施例13
向含有D-异亮氨酸(D-Ile，144.3mg，1.1mmol)的2mL甲醇溶液中，滴加含有1-(2，4-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐(324.7mg，1mmol)的 2mL甲醇溶液，滴加完毕后，加入三乙胺1mmol，分别在反应0h、4h、9h 分三次加入，室温下搅拌24h后，TLC检测，原料1-(2，4-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐反应完全。过滤除去反应液中的不溶物，滤液减压浓缩除溶剂，硅胶柱层析纯化，得产物D-Ile-NAD(96mg，35.2％)。1H NMR(400MHz， D20)9.37(s，1H)，9.15(d，J＝6.0Hz，1H)，8.93(d，J＝8.0Hz，1H)，8.21(dd，J＝ 8.0，6.4Hz，1H)，4.97(d，J＝9.2Hz，1H)，2.48-240.(m，1H)，1.28-1.17(m，2H)， 1.09(d，J＝6.7Hz，3H)，0.83(t，J＝7.4Hz，3H).13C NMR(101MHz，D2O) 171.56，165.79，146.46，144.41，144.03，133.49，127.93，81.74，37.66，24.49，14.91， 9.94.HRMS：calculated for C12H17N2O3 + 237.1234，found 237.1235.比旋度
Figure DEST_PATH_GDA0001940110170000103
Figure DEST_PATH_GDA0001940110170000104
比旋度测定方法同实施例4。
实施例14
向含有D-丝氨酸(D-Ser，115.6mg，1.1mmol)的2mL甲醇溶液中，滴加含有1-(2，4-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐(324.7mg，1mm0l)的2 mL甲醇溶液，滴加完毕后，加入三乙胺1mmol，分别在反应0h、4h、9h 分三次加入，室温下搅拌24h后，TLC检测，原料1-(2，4-二硝基苯基、)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐反应完全。过滤除去反应液中的不溶物，滤液减压浓缩除溶剂，硅胶柱层析纯化，未得产物D-Ser-NAD，核磁共振分析沉淀，确定沉淀为产物Ser-NAD(148mg，60.2％)。1H NMR(400MHz，D2O)9.37(s，1H)，9.11 (d，J＝6.4Hz，1H)，8.96(d，J＝8.0Hz，1H)，8.23(dd，J＝8.0，6.4Hz，1H)，5.52 (dd，J＝7.2，3.6Hz，1H)，4.43(dd，J＝13.0，7.2Hz，1H)，4.34(dd，J＝13.0，3.6Hz， 1H).13C NMR(101MHz，D2O)169.51，165.93，147.05，144.65，144.55，133.44， 127.80，77.27，61.74.HRMS：calculated for C9H11N2O4 +211.0713，found 211.0714. 比旋度
Figure DEST_PATH_GDA0001940110170000111
比旋度测定方法同实施例4。
实施例15
向含有D-苏氨酸(D-Thr，131.0mg，1.1mmol)的2mL甲醇溶液中，滴加含有1-(2，4-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐(324.7mg，1mmol)的2 mL甲醇溶液，滴加完毕后，加入三乙胺1mmol，分别在反应0h、4h、9h 分三次加入，室温下搅拌24h后，TLC检测，原料1-(2，4-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐反应完全。过滤除去反应液中的不溶物，滤液减压浓缩除溶剂，硅胶柱层析纯化，得产物D-Thr-NAD(177mg，68.1％)。1H NMR(400MHz， D2O)9.38(s，1H)，9.13(d，J＝6.4Hz，1H)，8.97(d，J＝8.0Hz，1H)，8.22(dd，J＝ 8.0，6.4Hz，1H)，5.27(d，J＝4.6Hz，1H)，4.84(dd，J＝6.4，4.6Hz，1H)，1.16(d，J ＝6.4Hz，3H).13C NMR(101MHz，D2O)169.85，165.88，147.60，145.10，144.56， 133.13，127.54，80.62，67.20，18.94.HRMS：calculated for C10H13N2O4 + 225.0870， found 225.0876.比旋度
Figure DEST_PATH_GDA0001940110170000112
比旋度测定方法同实施例4。
实施例16
向含有D-天冬酰胺(D-Asn，145.3mg，1.1mmol)的2mL甲醇溶液中，滴加含有1-(2，4-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐(324.7mg，1mmol)的 2mL甲醇溶液，滴加完毕后，加入三乙胺1mmol，分别在反应0h、4h、9h 分三次加入，室温下搅拌24h后，TLC检测，原料1-(2，4-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐反应完全。过滤除去反应液中的不溶物，滤液减压浓缩除溶剂，硅胶柱层析纯化，得产物D-Asn-NAD(54mg，19.7％)。1H NMR(400MHz， D2O)9.38(s，1H)，9.10(d，J＝6.4Hz，1H)，94(d，J＝8.0Hz，1H)，8.22(dd，J＝ 8.0，6.4Hz，1H)，5.75(dd，J＝10.4，4.0Hz，1H)，3.54(dd，J＝17.0，4.0Hz，1H)， 3.37(dd，J＝17.0，10.4Hz，1H).13C NMR(101MHz，D2O)173.17，170.67， 165.80，146.92，144.68，144.57，133.58，127.93，72.36，37.62.HRMS：calculated for C10H12N3O4 + 238.0822，found 238.0826.比旋度
Figure DEST_PATH_GDA0001940110170000113
比旋度测定方法同实施例4。
实施例17
向含有D-色氨酸(D-Trp，224.6mg，1.1mmol)的2mL甲醇溶液中，滴加含有1-(2，4-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐(324.7mg，1mmol)的2 mL甲醇溶液，滴加完毕后，加入三乙胺1mmol，分别在反应0h、4h、9h 分三次加入，室温下搅拌24h后，TLC检测，原料1-(2，4-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐反应完全。过滤除去反应液中的不溶物，滤液减压浓缩除溶剂，硅胶柱层析纯化，得产物D-Trp-NAD(165mg，47.8％)。1H NMR(400MHz， D2O)8.66(s，1H)，8.45(d，J＝6.4Hz，1H)，8.28(d，J＝8.0Hz，1H)，7.57(dd，J＝ 8.0，6.24Hz，1H)，7.25(d，J＝8.0Hz，2H)，7.19(d，J＝8.0Hz，2H)，7.04(t，J＝7.8 Hz，2H)，6.92(t，J＝7.8Hz，2H)，6.86(s，1H)，5.44(dd，J＝10.0，4.6Hz，1H)，3.71 (dd，J＝15.5，4.6Hz，1H)，3.51(dd，J＝15.5，10.0Hz，1H).13C NMR(101MHz，D2O)171.20，164.92，146.11，143.79，143.35，135.82，132.14，126.98，126.11， 124.52，122.16，119.53，117.52，111.87，107.65，76.51，29.13.HRMS：calculated for C17H16N3O3 + 310.1186，found 310.1192.比旋度
Figure DEST_PATH_GDA0001940110170000121
比旋度测定方法同实施例4。
实施例18
向含有D-精氨酸(D-Arg，191.6mg，1.1mmol)的2mL甲醇溶液中，滴加含有1-(2，4-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐(324.7mg，1mmol)的 2mL甲醇溶液，滴加完毕后，加入三乙胺1mmol，分别在反应0h、4h、9h 分三次加入，室温下搅拌24h后，TLC检测，原料1-(2，4-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐反应完全。过滤除去反应液中的不溶物，滤液减压浓缩除溶剂，硅胶柱层析纯化，得产物D-Arg-NAD(285mg，90.5％)。1H NMR(400MHz， D20)9.34(s，1H)，9.10(d，J＝5.6Hz，1H)，8.96(d，J＝7.8Hz，1H)，8.308.23 (m，1H)，5.50(dd，J＝8.8，5.0Hz，1H)，3.60(dd，J＝14.0，4.8Hz，1H)，3.30- 3.15(m，1H)，2.60-2.50(m，1H)，2.41-2.27(m，1H)，1.831.65(m，1H)，1.48- 1.35(m，1H).13C NMR(101MHz，D2O)165.69，165.56，156.64，146.58，145.06， 144.30，133.81，128.39，74.65，40.16，29.29，24.74.HRMS：calculated for C12H19N5O3 2+ 281.1477，found 140.5738.比旋度
Figure DEST_PATH_GDA0001940110170000122
比旋度测定方法同实施例4。
实施例19
类似物稳定性实验。在50mM pH 8、9、10、11的碳酸氢钠缓冲液(氘水) 中，加入NAD或NAD类似物，至各化合物终浓度为10mM，在37℃下保温1.0 h。核磁共振分析，测定NAD或NAD类似物降解情况。此外，按文献(Enzyme and Microbial Technology，2014，5859，75-79)方法，测定NAD及NAD类似物在E.coli BW25113全细胞溶液以及细胞裂解液上清中37℃下保温1.0h，HPLC 测定NAD或NAD类似物降解情况。结果如表1所示可见，不论在不同pH缓冲液中还是在全细胞溶液或细胞裂解液上清中，NAD类似物都具有更好的稳定性。
表1.NAD及其类似物降解率
Figure BDA0001879636410000123
Figure BDA0001879636410000131
实施例20
分别称取15种D-氨基酸基NAD+类似物10.0mg溶于5mL水中，分别加入5 倍摩尔当量的连二亚硫酸钠和5倍当量的碳酸钠，40反应30min后稀释100 倍，紫外可见分光光度计200-700全波长扫描检测还原型旋光性NADH类似物的最大吸收波长max和摩尔吸光系数，结果如表2所示。
表2.旋光性NADH类似物的max和
Figure BDA0001879636410000132
实施例21
氧化还原酶对D-氨基酸基NAD+类似物的活性。将突变型氧化还原酶 (ME-L310R/Q401C、DLDH-V152R、PDH-I151R、FDH-L257R、FADH-E265R、 MDH-D136R或PDOR-G186R)配制成1mg/mL的溶液。
配制0.19mL反应体系：50mM pH 7.5 HEPES，5mM底物(苹果酸、亚磷酸、乳酸、甲酸、甲醛、甲醇或1，3-丙二醇)2mM的NAD+或D-氨基酸基NAD+类似物。
酶活性分析时在0.19mL反应体系中快速加入10L酶液 (ME-L310R/Q401C、DLDH-V152R、PDH-1151R、FDH-L257R、FADH-E265R、 MDH-D136R或PDOR-G186R)，混匀后置于紫外分光光度计中，在25条件下连续检测340nm(NAD+为辅因子时)或357nm(D-氨基酸基NAD+类似物为辅因子时)吸光值。酶活力单位定义为25条件下每分钟生成1mol还原型 NADH或还原型基于D-氨基酸的NADH类似物所需的酶量。测得结果如表3所示。
表3.氧化还原酶对D-氨基酸基NAD+类似物的活性
Figure BDA0001879636410000133
Figure BDA0001879636410000141
实施例22
氧化还原酶利用D-氨基酸基NAD+类似物催化底物转化。1mL反应体系如下：100mMpH 7.5HEPES，5mM底物(苹果酸钠、亚磷酸钠、乳酸钠、甲酸钠、甲醛、甲醇、1，3-丙二醇)，5mM的NAD+或D-氨基酸基NAD+类似物， 20U突变型氧化还原酶(ME-L310R/Q401C、DLDH-V152R、PDH-I151R、 FDH-L257R、FADH-E265R、MDH-D136R、PDOR-G186R)，37反应4h，取600L反应液用0.22m滤膜过滤，利用离子色谱或气相色谱分析底物转化效率，结果如表4所示。
表4.氧化还原酶利用D-氨基酸基NAD+类似物的反应结果
Figure BDA0001879636410000142
实施例23
突变型亚磷酸脱氢酶(I151R)作为再生酶，利用亚磷酸为辅底物，构建再生NADH或还原型NAD类似物的循环体系，突变型乳酸脱氢酶(V152R) 作为产物酶，用于生成D-乳酸。10mL反应体系：50mM pH 7.5 HEPES，20mM 丙酮酸，2mM NAD类似物，50mM亚磷酸，50U/mL突变型亚磷酸脱氢酶，20U/mL突变型乳酸脱氢酶，30下反应，离子色谱监测反应1h、6h、12h、24h、36h时反应中D-乳酸的生产情况。对照实验利用野生型亚磷酸脱氢酶、野生型乳酸脱氢酶和NAD。结果如表4所示。
表5.酶偶联反应D-乳酸的产率
Figure BDA0001879636410000151
本发明合成的NAD类似物，结构简单且稳定，合成路线简单且成本低，能够被多种依赖于烟酰胺辅因子氧化还原酶突变体识别，进一步对氧化还原酶进行突变，提高酶对类似物的活性，具有工业应用的潜在价值，有望降低生产成本。

Claims (8)

1.一种D-氨基酸基NAD+类似物，其特征在于：D-氨基酸基NAD+类似物的结构式如下：
Figure FDA0001879636400000011
其中，以氨基酸羧基为1位碳，类似物2位碳原子手性中心的立体构型为R，取代基R为C1-C5的烷基或C1-C5中的H被-OH、-COOH、-CONH2、-SCH3、
Figure FDA0001879636400000012
中的一种或二种以上取代的烷基，取代位置为烷基远离1位碳的末端或次末端(从末端数第二个碳)碳原子上。
2.根据权利要求1所述的D-氨基酸基NAD+类似物，其特征在于：类似物包括但不限于以下化合物中的一种或二种以上：
Figure FDA0001879636400000013
Figure FDA0001879636400000014
3.一种权利要求1或2所述的D-氨基酸基NAD+类似物的合成方法，其特征在于：D-氨基酸基NAD+类似物是以1-(2’,4’-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐和D-α-氨基酸为原料，在碱催化下合成的。
4.根据权利要求3所述的D-氨基酸基NAD+类似物的合成方法，其特征在于：所述合成D-氨基酸基NAD+类似物的原料D-α-氨基酸包括但不限于以下结构中的一种或二种以上：
Figure FDA0001879636400000021
Figure FDA0001879636400000022
5.根据权利要求3或4所述的D-氨基酸基NAD+类似物的合成方法，其特征在于：所述的碱为乙酸钠、甲酸钠、三乙胺、三丙胺或三丁胺中的一种或两种以上；1-(2’,4’-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐、D-α-氨基酸和碱三者的摩尔当量比为1：1～1.1:1～2；反应温度为20～40℃；合成NAD+类似物的溶剂为甲醇、水、或甲醇与水任意体积比例的混合物。
6.一种权利要求1或2所述的D-氨基酸基NAD+类似物的应用，其特征在于：可作为NAD(P)依赖型氧化还原酶的辅酶，用于催化相应底物转化为产物。
7.根据权利要求6所述的D-氨基酸基NAD+类似物的应用，其特征在于：所述的氧化还原酶包括但不限于苹果酸酶、亚磷酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、甲酸脱氢酶、甲醛脱氢酶、甲醇脱氢酶、1,3-丙二醇脱氢酶中的一种或两种以上；
其中对应的底物包括但不限于苹果酸及苹果酸盐、亚磷酸及亚磷酸盐、乳酸及乳酸盐、甲酸及甲酸盐、甲醛、甲醇、1,3-丙二醇中的一种或两种以上。
8.根据权利要求6或7所述的D-氨基酸基NAD+类似物的应用，其特征在于：利用D-氨基酸基NAD+类似物为辅因子，以一种NAD(P)依赖型氧化还原酶为生产酶，偶联另一种NAD(P)依赖型氧化还原酶为再生酶，可实现D-氨基酸基NAD+类似物的再生循环。
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