CN103122371A

CN103122371A - 稳定的nad/nadh衍生物

Info

Publication number: CN103122371A
Application number: CN2012105592209A
Authority: CN
Inventors: J.霍恩斯; D.海因德尔; C.霍恩; C.加斯勒－迪特谢
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2005-07-28
Filing date: 2006-07-28
Publication date: 2013-05-29
Anticipated expiration: 2026-07-28
Also published as: EP2364989B1; BRPI0614217A2; CA2614792C; KR20110028522A; PT2364989E; US9399790B2; CA2614792A1; KR20140003637A; US20160326567A1; JP5129133B2; KR101035524B1; DK1907408T3; ES2461266T3; KR101483899B1; AU2011200465B2; KR20120044372A; PL1907408T3; EP2364988A1; AU2011200465A1; CN101233144A

Abstract

本发明涉及式(I)的稳定的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD/NADH)或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP/NADPH)衍生物、这些衍生物的酶配合物和它们在生物化学检测方法和试剂盒方面的用途。

Description

稳定的NAD/NADH衍生物

本申请是申请号为200680027359.1的中国专利申请的分案申请，要求2005年7月28日的优先权。

技术领域

本发明涉及稳定的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD/NADH)或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP/NADPH)衍生物、这些衍生物的酶配合物和它们在生物化学检测方法和试剂盒方面的用途。

背景技术

生物化学分析学的测量系统是临床相关分析方法的重要部分。这主要涉及直接或者间接在酶的辅助下进行测定的分析物的测定，例如代谢物或者底物。该分析物在酶-辅酶配合物的辅助下进行转化，和随后进行定量测定。在该方法中，预测定的分析物与适宜的酶和辅酶接触，其中酶主要以催化量使用。通过酶反应，辅酶得到改变，例如被氧化或者还原。该方法可以直接或者通过介体得到电化学或者光度检测。标定提供了意欲进行测定的分析物的测量值和浓度之间的直接相关性。

辅酶是共价或者非共价与酶连接的有机分子，并且通过分析物的转化得到改变。辅酶的突出实例为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)，通过还原它们分别形成NADH或NADPH。

现有技术已知的测量系统的特征在于在时间上有限的贮存期限，和为了获得该储存期限，对环境有特殊要求，比如，冷却或者干燥储存。由此，由不正确的、未注意的、不完善的存储导致的错误结果对于某些应用形式可能存在，例如，在其中最终用户自身进行测试的情形中，比如葡萄糖自我监控。特别是，由于开放初始包装过长时间导致干燥剂耗尽，会导致测量误差，该测量误差在一些系统中，消费者几乎不能辨认。

可以用于升高生物化学测量系统稳定性的已知测量是使用稳定的酶，例如，使用得自于喜温有机体的酶。还可以通过化学修饰使酶稳定，例如交联或者诱变。此外，还可以将酶稳定剂(比如海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮和血清清蛋白)加入或者将酶包装入聚合物网络中，例如通过光致聚合作用。

还意图通过使用稳定的介体改良生物化学测量系统的储存期限。由此，通过使用具有最低可能氧化还原电势的介体，测试的特异性会升高和反应期间的干扰会被消除。然而，酶/辅酶配合物的氧化还原电势构成了介体的氧化还原电势的下限。如果降低到该下限之下，与介体的该反应将被延迟，或者甚至被阻止。

另外地，还可以使用无介体的生物化学测量系统，其中，对辅酶(比如辅酶NADH)直接进行检测。然而，所述测量系统的缺点是比如NAD和NADP的辅酶是不稳定的。

NAD和NADP是碱不稳定(basenlabile)的分子，其降解途径描述在文献(N.J.Oppenheimer in The Pyridine Nucleotide Coenzyms AcademicPress，New York，London 1982，J.Everese，B.Anderson，K.You，Editors，Chapter 3，第56-65页)中。ADP-核糖基本上在NAD或者NADP通过裂解核糖和吡啶单元之间的糖基键接的降解期间形成。然而，还原形式的NADH和NADPH对酸不稳定：例如，差向异构化是已知的降解途径。在上述两种情形中，NAD/NADP和NADH/NADPH的不稳定性是由于核糖和吡啶单元之间的糖基键的不稳定性。但是，即使在并不剧烈的条件下(比如在含水溶液中)，辅酶NAD或NADP仅仅通过环境湿度进行水解。当测量分析物时，该不稳定性会导致不精确。

一系列NAD/NADP衍生物描述在，例如，B.M.Anderson in thePyridine Nucleotide Coenzymes，Academic Press New York，London 1982，J.Everese，B.Anderson，K.You，Editors，Chapter 4中。然而，酶对这些衍生物中的大多数接受并不良好。为此，先前用于诊断性测试的唯一衍生物是3-乙酰基吡啶腺嘌呤二核苷酸(乙酰基NAD)，其最早描述在1956年(N.O.Kaplan，J.Biol.Chem.(1956)，221，823)。还表明酶对该辅酶的接受低，并且该辅酶在氧化还原电势上表现出变化。

其它具有修饰吡啶基团的NAD衍生物的使用描述在WO 01/94370中。然而，烟酰胺基团的修饰通常对催化反应具有直接影响。在大多数情形中，该影响是负的。

在另一稳定性构思中，为了影响糖基键的稳定性，对核糖单元进行变化。该方法不直接干扰烟酰胺基团的催化反应。然而，当酶强烈和专一性结合至核糖单元时，可能存在间接作用。就此而论，Kaufmann等人在WO 98/33936和US 5,801,006或WO 01/49247中公开了一系列硫代核糖(Thioribose)-NAD衍生物。然而，烟酰胺核糖单元的修饰和衍生物在酶反应中的活性之间的相关性先前并未得到证明。

CarbaNAD，不具有糖基(Glycosyl)键的衍生物在1988年进行了首次描述(J.T.Slama，Biochemistry 1989，27，183和Biochemistry 1989，28，7688)。在该衍生物中，核糖被carbacyclic糖单元取代。虽然carbaNAD被描述为脱氢酶的底物，但是，其活性迄今在临床中在生物化学检测方法中并未得到证实。

类似方法后来由G.M.Blackburn，Chem.Comm.，1996，2765进行了描述，以制备具有亚甲基双膦酸酯连接物而不是天然焦磷酸酯的carbaNAD。亚甲基双膦酸酯对磷酸酶表现出更高的稳定性，被用作ADP核糖基环化酶的抑制剂。其目的并不是使其对水解的稳定性升高(J.T.Slama，G.M.Blackburn)。

发明内容

由此，本发明的目的是提供特别是用于测定葡萄糖的稳定生物分析测量系统，其避免了NAD/NADP水解的敏感性，并且同时在酶反应中具有作为辅酶的活性。

该目的通过测定分析物的测试元件得到实现的，其包含(i)辅酶依赖的酶或者所述酶的底物，和(ii)作为辅酶的以下通式(I)的化合物：

其中

A＝腺嘌呤或者其类似物，

T＝在各种情况下独立地表示O，S，

U＝在各种情况下独立地表示OH、SH、BH₃ ^-、BCNH₂ ^-，

V＝在各种情况下独立地表示OH或者磷酸酯基，

W＝COOR、CON(R)₂、COR、CSN(R)₂，其中R在各种情况下独立地表示H或者C₁-C₂-烷基，

X₁，X₂＝在各种情况下独立地表示O、CH₂、CHCH₃、C(CH₃)₂、NH、NCH₃，

Y＝NH、S、O、CH₂，

Z＝含有5个C原子的环状基团的残基，所述环状基团任选含有选自O、S和N的杂原子并且任选具有一个或者多个取代基，和残基CR4₂，其中CR4₂键接在环状基团和X₂上，其中

R4＝在各种情况下独立地表示H、F、Cl、CH₃，

条件是Z和吡啶残基不通过糖苷键连接，

或者其盐或者任选的还原形式。

在优选的实施方案中，W＝CONH₂或者COCH₃。

优选在Z上的取代基选自OH、F、Cl和任选氟化或者氯化或/和OH-取代的C₁-C₂烷基，O-C₁-C₂-烷基。

在优选的实施方案中，第一残基V为OH和第二残基V为磷酸酯基。任选一个OH基团和一个磷酸酯基可以与它们键接的碳原子形成环。

在优选的实施方案中，提供用于测定葡萄糖的测试元件，其包括葡萄糖脱氢酶和如上所述的通式(I)化合物或者其盐。

令人惊讶地，根据本发明的化合物对水解稳定，在酶检测方法中是良好的底物，并且可以用于生物化学诊断。该发现与绝大多数迄今已知的NAD/NADP衍生物形成了对比，因为这些衍生物通常在酶检测方法中仅仅稳定非常短的时间。

根据本发明的化合物相对于现有技术的优点为：

-高稳定性，

-高酶活性，

-简单和经济节约地合成，

-它们可以用于所有迄今已知的生物化学检测方法中。

迄今已知的生物化学检测方法的缺点可以通过利用本发明提供稳定的NAD/NADP衍生物得到基本避免，优选本发明结合稳定制剂(Rezeptur)使用，比如，例如通过将酶包装入聚合物网络中。此外，它不需要使用稳定添加剂。这是特别有利的，因为其所涉及的反应活性物质的数目越低，所获得的用于分析物测定的稳定制剂的可能性就更大。

本发明提供了包括一系列稳定的NAD/NADP衍生物的测试元件，所述NAD/NADP衍生物具有在测试元件上用作辅酶的充分酶活性。

稳定的NAD/NADP衍生物可以通过一般已知的合成方法制备。对此，通过Zincke化学过程将环状氨基醇的氨基转化为吡啶

盐衍生物。随后，使伯OH基团进行磷酸化和使其偶联在活化的AMP衍生物上，从而形成NAD衍生物。另外地，还可以首先使伯OH基团进行磷酸化，然后可以通过Zincke反应将氨基转化为吡啶。

另一合成路线是活化伯醇，从而形成甲苯磺酸盐或者碘化物，随后烷基化ADP。

根据本发明的测试元件的优选实施方案包括例如具有以下通式(I’)的化合物：

其中

A＝腺嘌呤或者其类似物，

T＝在各种情况下独立地表示O，S，

U＝在各种情况下独立地表示OH、SH、BH₃ ^-、BCNH₂ ^-，

V＝在各种情况下独立地表示OH或者磷酸酯基，

Y＝NH、S、O、CH₂，

Z＝饱和或者不饱和的碳环或者杂环五元环，特别是通式(II)化合物

其中单键或者双键可以存在于R5’和R5”之间，

R4＝在各种情况下独立地表示H、F、Cl、CH₃，

R5＝CR4₂，

如果单键存在于R5’和R5”之间，那么

R5′＝O，S，NH，NC₁-C₂-烷基，CR4₂，CHOH，CHOCH₃，

R5″＝CR4₂，CHOH，CHOCH₃，

如果双键存在于R5’和R5”之间，那么R5’＝R5”＝CR4，

R6，R6’＝在各种情况下独立地表示CH、CCH₃，

或者其盐或者任选的还原形式。

以下通式(I”)化合物是本发明的另一主题：

其中

A＝腺嘌呤或者其类似物，

T＝在各种情况下独立地表示O，S，

U＝在各种情况下独立地表示OH、SH、BH₃ ^-、BCNH₂ ^-，

V＝在各种情况下独立地表示OH或者磷酸酯基，

Y＝NH、S、O、CH₂，

其中单键或者双键可以存在于R5’和R5”之间，

R4＝在各种情况下独立地表示H、F、Cl、CH₃，

R5＝CR4₂，

如果单键存在于R5’和R5”之间，那么

R5′＝O，S，NH，NC₁-C₂-烷基，CR4₂，CHOH，CHOCH₃，

R5″＝CR4₂，CHOH，CHOCH₃，

如果双键存在于R5’和R5”之间，那么R5’＝R5”＝CR4，

R6，R6’＝在各种情况下独立地表示CH、CCH₃，

条件是，如果R5＝CH₂，T＝O，U＝在各种情况下OH，V＝OH，W＝CONH₂，X＝O和Y＝O，那么R5’和R5”不同时是CHOH，

或者其盐或者任选的还原形式。

在优选的实施方案中，根据本发明的化合物含有腺嘌呤类似物(比如C₈-取代和N₆-取代的腺嘌呤)，去氮杂(Deaza)变体(比如7-去氮杂)，氮杂变体(比如8-氮杂)或者其组合(比如7-去氮杂或者8-氮杂)，或者碳环类似物，比如间型霉素，其中7-去氮杂变体可以在7位被卤素、C₁-C₆-炔基、C₁-C₆-烯基或者C₁-C₆-烷基取代。

在进一步优选的实施方案中，化合物含有腺苷类似物，所述腺苷类似物包括例如2-甲氧基去氧核糖、2’-氟去氧核糖、己糖醇、阿卓糖醇或者多环类似物(比如二环-、LNA-和三环-糖)而不是核糖。

特别是，(二)磷酸盐氧还可以被等电(isotronisch)取代，比如，例如O^-被S^-或BH₃ ^-，O被NH、NCH₃或CH₂和＝O被＝S取代。

在优选的实施方案中，根据本发明化合物的至少一个残基U不同于OH，和特别优选至少一个残基U＝BH₃ ^-。

特别优选的实施方案是衍生物硼烷并(Borano)carbaNAD、c-戊基NAD、吡咯基NAD、呋喃基NAD、carbaNAD环磷酸盐、carbaNADP、吡咯烷基NAD以及含有它们的测试元件：

硼烷并carba NAD

环戊基NAD

吡咯基NAD

呋喃基NAD

carba NAD环磷酸盐

carba NADP

吡咯烷基NAD

分析物的生物化学检测，例如在体液比如血液、血清、血浆或者尿中或者在废水或食品的样品中的参数在诊断学上是至关重要的。在这项测试中，意欲进行测定的分析物与适宜的酶和辅酶接触。

由此，本发明的另一主题是由根据本发明的化合物联合适宜的酶组成的酶-辅酶配合物。

任何可以通过氧化还原反应检测的生物学或者化学物质都可以作为分析物进行测定，例如为辅酶依赖的酶的底物或者辅酶依赖的酶自身的物质。分析物的优选实例为葡萄糖、乳酸、苹果酸、甘油、醇、胆固醇、甘油三酸酯、抗坏血酸、半胱氨酸、谷胱甘肽、肽、脲、铵、水杨酸盐、丙酮酸盐、5’-核苷酸酶、肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、二氧化碳等等。

对于酶底物的检测，优选测试元件除了辅酶之外，还含有适于检测底物的酶。适宜的酶为例如脱氢酶，选自葡萄糖脱氢酶(E.C.1.1.1.47)、乳酸脱氢酶(E.C.1.1.1.27，1.1.1.28)、苹果酸脱氢酶(E.C.1.1.1.37)、甘油脱氢酶(E.C.1.1.1.6)、乙醇脱氢酶(E.C.1.1.1.1)、α-羟基丁酸酯脱氢酶、山梨醇脱氢酶或者氨基酸脱氢酶(例如L-氨基酸脱氢酶(E.C.1.4.1.5)。其它适宜的酶为氧化酶(比如葡萄糖氧化酶(E.C.1.1.3.4)或者胆固醇氧化酶(E.C.1.1.3.6)或者转氨酶(比如天冬氨酸盐或者丙氨酸转氨酶)、5’-核苷酸酶或者肌酸激酶。

对于酶的检测，优选测试元件除了辅酶之外，还含有适于检测酶的酶底物。

本发明的另一主题是根据本发明的化合物或者根据本发明的酶-辅酶配合物用于通过酶反应检测样品中的分析物的用途。就此而论，特别优选在葡萄糖脱氢酶(GlucDH)辅助下进行的葡萄糖的检测。

辅酶(即根据本发明的化合物)通过与分析物反应(如果分析物为酶底物)或者通过分析物-催化的反应(如果分析物为酶)所产生的变化原则上可以以任何种类和方式进行检测。基本上所有现有技术中已知的用于检测酶反应的方法都可以使用。然而，辅酶的变化优选通过光学方法进行检测。光学检测方法包括例如，吸收、荧光、圆二色性(CD)、光学旋光性色散(ORD)、折射等等的测定。辅酶的变化特别优选通过测量荧光进行检测。荧光测量是高度灵敏的，并且甚至能够检测小型系统中本身低浓度的分析物。

液体测试可用于检测分析物，其中试剂例如在含水或者非水液体中以溶液或者悬浮液的形式存在的试剂或者存在为粉末或者冻干剂的试剂。然而，还可以应用干燥测试，在这种情形中，将试剂应用于载体、试验条上。所述载体可以例如为含有被意欲进行测定的样品液体润湿的吸收

或/和可膨胀材料的试验条。

然而，其中含有酶-辅酶配合物的凝胶基质还可以用作检测试剂(参见DE 10221845A1)。

在这种情况下，酶可以与根据本发明的化合物一起聚合入基质内，或者在聚合反应之后，基质可以在酶存在下与辅酶溶液接触，从而形成相应的酶-辅酶配合物。

本发明的另一主题涉及试剂盒和它用于检测分析物的应用。所述试剂盒可以含有根据本发明的化合物、适宜的酶和适宜的反应缓冲液。适宜的酶已经进行了描述。根据本发明的试剂盒可以以多种方式使用，并且可以用于检测分析物，比如葡萄糖、乳酸、苹果酸、甘油、醇、胆固醇、甘油三酸酯、抗坏血酸、半胱氨酸、谷胱甘肽、肽、脲、铵、水杨酸盐、丙酮酸盐、5’-核苷酸酶、CK、LDH和二氧化碳等等。优选的是含有根据本发明的化合物和葡萄糖脱氢酶(E.C.1.1.1.47)的试剂盒，以检测血液中的葡萄糖。

根据本发明的试剂盒可用于检测在无水或者液体测试中的分析物。

本发明的另一主题涉及用于分析物的荧光光度(fluorometrischen)或者光度检测的试验条。所述试验条含有如上所述的作为辅酶的化合物和适宜的酶或者固定在吸收或/和可膨胀材料上的酶底物。适宜的物质可以，例如选自纤维素、塑料等等。

本发明的另一主题包含用于检测分析物的方法，该方法包括以下步骤：

(a)使样品和包含辅酶的根据本发明的测试元件或者试剂盒接触，和

(b)检测分析物，例如基于辅酶的变化的分析物。

本发明的另一优点是辅酶的荧光发射显示出深色移动，由此存在低的测试元件的其它物质或/和样品的荧光发射干扰。

所述的本发明主题的所有优选实施方案还意图用于本发明的其它主题中，比如，例如，根据本发明化合物的优选实施方案中。

本发明将通过以下附图和实施例进行更详尽地阐明。

附图说明

附图

图1

carbaNAD(cNAD)的合成方法的图。

图2

在8℃和37℃下压制NAD的结果的图。

图3

在8℃和37℃下压制carbaNAD的结果的图。

图4

通过烷基化ADP合成硼烷并NAD的方法的图，其中在Y＝BH₃的情形中，仅仅ADP的β磷酸盐得到烷基化。

图5

合成吡咯烷基NAD(pNAD)的方法的图。相应反应步骤的化合物编号和产率紧挨结构式进行了描述。

图6A/6B

NAD和pNAD(图6A)和NADH或pNADH(图6B)的吸收光谱。

图7

作为GlucDH配合物的NADH和pNADH的荧光光谱(发射光谱)。

图8

作为GlucDH配合物的NADH和pNADH的荧光光谱(激发光谱)。

图9

NAD和pNAD稳定性的对比。

图10A/10B/10C

NAD和cNAD(图10A)或NADH和cNADH(图10B和10C)的吸收光谱。

图11

作为GlucDH配合物的NADH和cNADH的荧光光谱。

具体实施方式

实施例

稳定的NAD/NADH衍生物的试验制备

稳定的NAD/NADH衍生物的制备基于作为实施例的carbaNAD(化合物9，图1)和吡咯烷NAD(化合物18，图5)的制备进行了表明。其它衍生物可以利用适当的合成方法进行制备。作为原料试剂使用的相应氨基醇已知于文献中：

2-氨基-1，4-脱水-2，3-双脱氧-L-苏式-戊糖醇：Huryn，Donna M.；Sluboski，Barbara C.；Tam，Steve Y.；Todaro，Louis J.；Weigele，Manfred.Tetrahedron Letters(1989)，30(46)，6259-62。

3-氨基-(1R，3S)-环戊烷甲醇，Beres，J.；Sagi，G.；Tomoskozi，I.；Gruber，L.；Gulacsi，E.；Otvos，L.；Tetrahedron Letters(1988)，29(22)，2681-4。

A)carbaNAD的制备

I.1R-(-)-外-顺式-5，6-二羟基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-酮(1)

在11圆底烧瓶中，将16.4g(147mmol)1R-(-)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮的400ml丙酮溶液加入到22.5g(167mmol)N-甲基-吗啉-N-氧化物的80ml去离子水溶液中。在冰上冷却下，在15分钟内，将15ml(1.2mmol)2.5％的四氧化锇的叔丁醇溶液加入其中。随后，在室温下将上述混合物搅拌过夜。

在旋转蒸发器中，通过蒸馏除去溶剂。将其与100ml一起搅拌，并且再次在旋转蒸发器上进行蒸馏。然后，将其溶于600ml去离子水中，并且将35g活性碳加入其中。在所得混合物剧烈搅拌1小时，然后将其滤过Seitz深床过滤器K 250。通过在旋转蒸发器中进行蒸馏，将水从滤液中除去。产品不经进一步纯化即可使用。

DC(Merck硅胶60F-254)：乙酸乙酯/甲醇/冰醋酸7∶2∶1R_f 0.75(原料)，0.53(1)。用TDM着色/在氯气室中展开。

*TDM试剂：溶液1∶10g N，N，N’，N’-四甲基-4，4’-二氨基-二苯甲烷的40ml冰醋酸和200ml去离子水溶液。溶液2：20g氯化钾在400ml去离子水中。溶液3：将0.3g茚三酮溶解在10ml冰醋酸中，并且加入90ml去离子水。终止试剂：溶液1和2的混合物，并且加入6ml溶液3。

II.1R-(-)-外-顺式-5，6-二甲基亚甲基二氧基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-酮(2)

在200ml绝对乙醇中，将粗产品1在回流下加热到沸腾1小时。加入400ml(3.26mol)二甲氧基丙烷和250mg(2.2mmol)盐酸吡啶之后，将混合物进一步加热沸腾回流15分钟。在加入10ml饱和碳酸氢钠溶液之后，在旋转蒸发器中，在真空下将溶液蒸发至干燥。将500ml氯仿、150ml饱和氯化钠溶液和75ml饱和碳酸氢钠溶液加入到所得残余物中，并且将其转移到分液漏斗中。通过振摇进行提取之后，将其放置过夜，在此期间进行相分离。

将有机相分离，和所得水相各自用200ml氯仿进一步提取两次。用硫酸镁对合并的有机相进行干燥。在通过过滤除去干燥剂之后，在旋转蒸发器上，通过减压蒸馏将溶剂除去。所得粗产品(24.9g＝92％)不需要进一步纯化即可使用。

DC(Merck硅胶60F-254)：乙酸乙酯/甲醇/冰醋酸7∶2∶1R_f 0.84。用TDM着色/在氯气室中展开。

III.1R-(-)-4-N-叔丁氧羰基-外-顺式-5，6-二甲基亚甲基二氧基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-酮(3)

在氩气下，将41.5g(190mmol)连二碳酸二叔丁酯和0.83g(6.8mmol)4-二甲基氨基吡啶加入到24.9g(135.7mmol)粗产品2的450ml绝对氯仿溶液中。在搅拌下对上述混合物进行加热沸腾回流，直至气体产生停止为止。将所得混合物滤过填充有40g硅胶60和用氯仿平衡的柱。用100ml氯仿洗涤。在旋转蒸发器上，通过在减压下进行蒸馏，将溶剂从滤液中除去。在10mbar和40℃下，将所得粗产品干燥60分钟。其不经进一步纯化即可使用。

DC(Merck硅胶60F-254)：乙酸乙酯/己烷3∶2R_f＝0.85。用TDM着色/在氯气室中展开。

IV.(-)-(1R，2R，3S，4R)-4-(N-叔丁氧羰基)氨基-2，3-二甲基-亚甲基二氧基-1-(羟甲基)环戊烷(4)

在室温下，在搅拌下将粗产品3溶于400ml四氢呋喃中，并且将80ml去离子水加入其中。冷却至4℃之后，将5.3g硼氢化钠一次加入其中并且将其搅拌过夜，在此期间使混合物缓慢升温至室温。将100ml乙醇加入其中，并且在室温下将其搅拌6小时。在旋转蒸发器上，通过在减压下进行蒸馏将溶剂除去。将300ml饱和氯化钠溶液和650ml乙酸乙酯加入其中，并且将其转移到分液漏斗中。将有机相分离，和所得水相再次用350ml乙酸乙酯洗涤。用硫酸镁对合并的有机相进行干燥。在通过过滤除去干燥剂之后，在旋转蒸发器上，通过减压蒸馏将溶剂蒸馏除去。通过柱色谱法和硅胶60(柱h＝93cm，d＝10cm，洗脱液THF/己烷1∶3，然后THF/己烷2∶3，流速3l/h)对所得粗产品(42.2g)进行纯化。收集得到40ml级份。通过DC(Merck硅胶60F-254：乙酸乙酯/己烷3∶2R_f＝0.45.用TDM着色/在氯气室中展开)对所得级分进行监控。在旋转蒸发器上，通过在真空中进行蒸馏将溶剂从合并的产品级分中除去，产率：24.9g。

V.(-)-(1R，2R，3S，4R)-4-氨基-2，3-二羟基-1-(羟甲基)环戊烷(5)

将8ml去离子水加入到11.0g(38.6mmol)产品4中，然后将80ml三氟乙酸加入其中。在室温下将其剧烈搅拌6小时，在此期间形成澄清的浅黄色溶液。将200ml去离子水加入其中，并且在旋转蒸发器上，在真空下对其进行蒸发。再次将200ml去离子水加入其中，并且在旋转蒸发器上，在真空下再次对其进行蒸发。将所得粗产品溶于在超声波浴中的100ml去离子水中并且进行过滤。将所得滤液应用到Dowex 1X8(100-200网目，OH形式)离子交换剂柱(15x 4.9cm)和用水洗脱，在此期间，在300ml体积中，约150ml之后产品得到洗脱(pH 10.4)。通过DC(Merck硅胶60F-254：丁醇/冰醋酸/水5∶2∶3R_f＝0.42，用TDM着色/在氯气室中展开)对所得级分进行监控。在旋转蒸发器上，通过在真空中进行蒸馏将溶剂从合并的产品级分中除去，产率：5.2g无色油。

VI.烟酰胺的Zincke盐(6)

在氮气下将58.6g二硝基氯苯熔化，然后将29.32g烟酰胺加入到所得熔化物中。在110℃下将其加热2.5小时。通过回流冷凝器将500ml3∶2(v/v)乙醇/水混合物加入其中，并且对其进行加热沸腾回流，直至溶液得到形成为止。在室温下搅拌过夜之后，将150ml 50％乙醇/水和100ml水加入其中，将其转移到分液漏斗中，并且每次用500ml氯仿洗涤三次。将300ml和50g活性炭加入到分离的水相中，在室温下搅拌1小时，然后将其滤过Seitz深床过滤器K 700。在旋转蒸发器上，在真空中将滤液浓缩至约100ml，期间浴温必须不能超过20℃。用300ml水对其进行稀释，并且在搅拌下，在室温下将70g四氟硼化钠加入其中。在甲醇/水中对所得沉淀进行重结晶。通过过滤将结晶物除去，用少量丙酮洗涤，然后用乙醚洗涤，在40℃下在高真空下将其干燥24小时(产率21.1g，23％)。通过DC(Merck硅胶60F-254：丁醇/冰醋酸/水5∶2∶3，R_f＝0.56)对所得级分进行监控。

VII.(-)-(1R，2R，3S，4R)-4-(3-甲酰氨基(Carboxamido)吡啶-1-基)-2，3-二羟基-1-(羟甲基)环戊烷(6)＝carba烟酰胺单核苷＝carbaNMN

在室温下在搅拌下，在90分钟内，将4.5g(31mmol)环戊基胺5的110ml无水甲醇溶液滴加加入到15.3g(40.7mmol)Zincke盐6的110ml无水甲醇溶液中。将1ml二异丙基乙胺加入其中，然后在室温下将其搅拌两天。将500ml水加入其中，转移到分液漏斗中，每次用200ml二氯甲烷洗涤，洗涤两次。在旋转蒸发器上，通过在真空下进行蒸馏，将水从分离的水相中除去。将所得残余物吸收在100ml水中，并且借助于柱色谱法在Sephadex C25(Na+形式)上进行纯化：柱70x 7.5cm，缓冲液A(去离子水)至缓冲液B(0.35M NaCl水溶液，流速200ml/h)洗脱。收集得到15ml级分，并且通过DC(Merck硅胶60F-254：丁醇/冰醋酸/水5∶2∶3，R_f＝0.22)对所得级分进行监控。

在旋转蒸发器上，通过在真空中进行蒸馏将溶剂从合并的产品级分中除去。将含盐残余物与500ml热乙醇一起煮沸。对其进行热过滤，在室温下将其放置12小时。通过过滤将沉淀除去，并且在旋转蒸发器上，通过在真空下进行蒸馏，将溶剂从滤液中除去。产量7g。

VIII.(-)-(1R，2R，3S，4R)-4-(3-甲酰氨基吡啶-1-基)-2，3-二羟基-1-(phosphatoyl甲基1)环戊烷(6)＝carba NMN-单磷酸盐

在0℃下，将20ml磷酰氯(phosphoroxychlorid)和50ml磷酸三甲酯的混合物加入到7g(27.7mmol)carbaNMN的80ml无水磷酸三甲酯悬浮液中。在0℃下将其搅拌2小时，然后在室温下搅拌2小时。在冰上冷却下，将300ml水加入其中，并且在旋转蒸发器上，在真空下将混合物蒸发至10ml。将其吸收在100ml水中、进行过滤并且借助于柱色谱法在Sephadex C25(NEt3H+形式)上进行纯化：柱66x 9cm，缓冲液A(去离子水)至缓冲液B(0.60M乙酸铵)洗脱，流速200ml/h。收集得到15ml级分，并且通过DC(Merck硅胶60F-254板：异丁酸/氨/水66∶1∶33，R_f＝0.25)对所得级分进行监控。在旋转蒸发器上，通过在真空中进行蒸馏将溶剂从合并的产品级分中除去。将所得残余物溶于100ml水中，并且进行冷冻干燥。将该过程重复三次。产量4.0g。

IX.carbaNAD(9)

在室温下，在1小时内，将1.25g(30mmol)AMP吗啉盐的40ml绝对DMF溶液滴加加入到3.31g(10mmol)carbaNMN单磷酸盐的40ml绝对DMF溶液和78ml(39mmol)3.5％四唑的绝对乙腈溶液的混合物中。在室温下将上述混合物搅拌2天。

使用10％KHCO₃水溶液将pH值调节为6.5，同时在干冰/丙酮上进行冷却。用500ml水对其进行稀释，并且在旋转蒸发器上将其小心地真空浓缩至干燥。将所得残余物溶于150ml去离子水中，并且在SephadexQAE 25(NEt3H+形式)上通过柱色谱法进行纯化：柱65x 4.5cm，缓冲液A(去离子水)至缓冲液B(1M三乙基碳酸铵)洗脱，流速200ml/h：收集得到15ml级分并且通过DC(Merck硅胶60F-254板：异丁酸/氨/水66∶1∶33，R_f 0.47)进行监控。

在旋转蒸发器上，通过在真空中进行蒸馏将溶剂从合并的产品级分中蒸馏除去。将所得残余物溶于100ml水中，并且进行冷冻干燥。将该过程重复三次。产量1.1g。

carbaNAD稳定性的测试

在pH 8下，在0.1M磷酸钾缓冲液中，对10mM carbNAD或NAD溶液进行压制。在0.25、75和175小时之后，通过HPLC色谱法对含量进行确定。

缓冲液A：100mM KHPO₄+10mM四丁基硫酸氢铵，pH 6.9；

缓冲液B：缓冲液A+乙腈1∶1，

流速1.0ml/min；检测：254nm

RP18柱L 125，直径4.6mm，

梯度：40分钟内35％缓冲液B，保持2分钟，然后在3分钟内改变为0％缓冲液A。

在压制到各种时间之后的HPLC面积百分比示于图2和3中。

分解产物(烟酰胺，ADP-核糖，AMP，ADP和NAD的未知分解产物以及cNAD的未知分解产物Y1和Y2)的存在表明相对于NAD而言，cNAD非常稳定。

B)吡咯烷基-NAD的制备

I.pNAD第一阶段(化合物10)的合成

将反式-N-叔丁氧羰基-O-甲磺酰基-4-羟基-L-脯氨醇(prolinol)(35.4g，120mmol)溶于500ml DMF中，并且将溶于75ml水中的叠氮化钠(15.6g，240mmol)加入其中，在70℃下加热5小时。随后在室温下将其进一步搅拌过夜，将混合物倾倒入1000ml饱和氯化钠溶液中并且用乙酸乙酯提取。乙酸乙酯溶液用Na₂SO₄进行干燥并且随后对其进行蒸发。

形成32.8g(＞100％)残余物(理论值：29g)。

在DC和MS监控之后，对粗产品进行直接处理。为了进行监控，在KG 60F254板(流动的溶剂：乙酸乙酯/用茚三酮喷雾)上进行薄层色谱法：反式-N-叔丁氧羰基-O-甲磺酰基-4-羟基-L-脯氨醇，R_f：0.49

产品R_f：0.78

MS ESI ES+242

产品的等同性还通过NMR分析得到了证实。

*反式-N-叔丁氧羰基-O-甲磺酰基-4-羟基-L-脯氨醇市场购买自Sanochemia Pharmazeutika AG，Cat.No.P-719。

II.pNAD第二阶段(化合物11)的合成

将化合物10(120mmol)与500ml甲醇和2.0g Pd-碳(10％浓度)混合，并且在30mbar下氢化12小时。在该方法中，反应烧瓶用H₂充溢若干次，通过抽吸过滤将催化剂除去并且对其进行浓缩。

无色油得到形成(应当对该油立即进行进一步处理，因为它对空气具有高度敏感性)。

MS ESI ES+217存在

DC(异己烷/乙酸乙酯1/1/KG 254F/茚三酮)：产品保持在开始位置。

产品的等同性还通过NMR分析得到了证实。

III.pNAD第三阶段(化合物12)的合成

将120mmol化合物11(MW：216.28)混合在500ml含有NaHCO₃(11.0g，130mmol)和Fmoc氯化物(33.8g，130mmol)的二烷中，并且在室温下将其搅拌过夜。通过过滤将所得盐除去，对溶液进行蒸发和在硅胶柱(异己烷和异己烷/EE 8/21/1)上对所得残余物进行纯化。

主要馏分得到39.0g＝74.1％*(理论值＝52.6g)。

DC(KG 60F254，流动溶剂异己烷/乙酸乙酯2∶1)：R_f 0.13

MS ESI ES+439/+339

产品的等同性还通过NMR分析得到了证实。

*产量是指第一阶段的洗脱物。

IV.pNAD第四阶段(化合物13)的合成

将得自于阶段3的化合物12(7.08g，16.1mmol)溶于80ml磷酸三甲酯中，并且随后在冰浴中将其冷却至0℃。将与磷酸三甲酯混合的POCl₃(在13ml磷酸三甲酯中的13ml新近蒸馏的POCl₃)加入到滴液漏斗中，并且在氩气下，在20分钟内将其分批加入。在放热反应中，温度升高至最高达5℃。随后将2.6ml吡啶加入其中，并且在0℃和氩气下，将其进一步搅拌40分钟。

将反应溶液小心地滴加加入到800ml冰冷的1M三乙基碳酸氢铵溶液(pH＝8)中。在加入完成之后，将其进一步搅拌1小时。随后，将轻微浑浊的溶液滴加加入(迅速加入)到1l饱和NaCl溶液中。将其进一步搅拌过夜，从而改良结晶。通过过滤将沉淀除去。通过Diaion柱对所得残余物进行脱盐。为了实现该目的，将500g Diaion加入到异丙醇/水1/1中，并且使其溶胀过夜。将Diaion填充入柱中，并且用水进行冲洗。在100ml pH 3.5(乙酸)的水中形成残余物的浆液，随后将其施加到柱上并且用水(pH 3.5)冲洗，直至不含氯化钠为止。然后，用25％异丙醇(pH 3.5)在柱上对该物质进行洗脱。在室温下，在高真空中对溶液进行蒸发。

残余物＝2.6g＝31.3％

DC RP8F254/MeOH/水9/1

MS ESI ES-517.13

产品的等同性还通过NMR分析得到了证实。

V.pNAD第五阶段(化合物14)的合成

在室温下，将得自于阶段4的化合物13(4.10g，7.9mmol)的250ml甲醇和83ml 25％氨水的混合物搅拌过夜，并且在室温下在真空中进行蒸发。将所得残余物吸收在200ml水中，并且用100ml乙酸乙酯搅拌三次。通过过滤将不溶性组分除去；将澄清的水相分离并且在室温下再次对其进行蒸发。

残余物＝2.56g＝100％

MS ESI ES-295

为了除去NH₃阳离子，将残余物溶于2x Hünig’s碱中，并且每次都在高真空下对其进行蒸发。

VI.pNAD第六阶段(化合物15)的合成

使Zinke盐(2.66g，8.99mmol)部分溶于50ml甲醇中，并且在搅拌的同时，将溶于50ml甲醇中的得自于阶段5的化合物14(2.56g，8.31mmol)滴加加入其中。上述混合物变为红色，并且慢慢被溶解。在室温下进一步将其搅拌过夜，并且通过过滤将沉淀除去。在真空中对滤液进行蒸发、吸收在100ml水中并且用乙酸乙酯提取三次。

乙酸乙酯相含有副产品二硝基苯胺，水相含有产品和剩余的Zincke盐。在室温下，在真空中对水相进行蒸发，并且将10ml水加入到获得的残余物中，在磁力搅拌器上将其搅拌10分钟，并且通过过滤将不溶性组分除去。产品仍然为溶解形式。将所得溶液施加到已经用水冲洗过的Diaion HP20柱(1000ml)上，并且用1000ml水冲洗两次。随后用水/5％异丙醇对其进行冲洗，在室温下对肯定的(positive)级分(通过DC RP8MeOH/W 9/1检测)进行蒸发。将所得残余物与异丙醇一起研磨，并且在乙醚的辅助下进行抽吸过滤。

残余物＝1.60g＝47.9％

DC RP8254MeOH/W 9/1

MS ES-400.1/ES+402.0还显示出双重质量

产品的等同性还通过NMR分析得到了证实。

VIIa.pNAD阶段7a(化合物16)的合成

对AMP酸(一磷酸腺苷-游离酸)(10g，27.5mmol)的60ml甲醇(用钠干燥的)和5.3ml(60mmol)吗啉(新近蒸馏的)的混合物进行搅拌，直至澄清溶液得到形成为止。随后将17g(82.5mmol)N，N’-二环已基碳化二亚胺(DCC)加入其中，并且在室温下将其搅拌过夜，同时排除水份。对形成的沉淀(DCH)进行抽吸过滤，并且在30℃下对滤液进行旋转蒸发。随后，将其与150ml H₂O/150ml乙醚一起进行搅拌，并且再次进行过滤。将各相分离之后，所得水相再次用每次75ml乙醚提取两次。随后，在室温下对水相进行旋转蒸发。将所得残余物另外溶解在吡啶中两次，每次都在高真空下进行旋转蒸发。

VII.pNAD第七阶段(化合物17)的合成

在室温下，将AMP吗啉盐(morpholidat)(得自于阶段7a的化合物16)(2.53g，3.61mmol)、得自于阶段6的化合物15(1.60g，3.98mmol)、0.2M*MnCl₂的甲酰胺溶液(27.1ml，5.42mmol)和无水MgSO₄(0.87g，7.95mmol)的混合物搅拌过夜，在此时间之后，通过DC(RP8MeOH/W 9/1)确定其大部分上进行了转化。用乙腈使反应混合物沉淀并且进行抽吸过滤。

残余物＝5.3g(理论值2.64g)**

MS，ESI ES-729.3＝产品，ES-415＝AMP吗啉盐的阳离子，ES-400.2/ES+402.1残余的化合物15(阶段6)

DC RP 8F254R_f 0.085

*为了制备该溶液，将2516mg无水MnCl₂溶于100ml 99.99％甲酰胺中，同时进行搅拌，随后将4A分子筛加入其中。

**将所得残余物进一步处理为粗产品。

VIII.pNAD第八阶段(化合物18，吡咯烷基-NAD)的合成

将5.0ml三氟乙酸(TFA)加入到500mg得自于阶段7的化合物17(粗产品，含有约50％盐)中，并且在室温下将其搅拌1小时，随后通过蒸发进行浓缩。500mg无色油以残余物的形式得到形成。

MS ESI ES-729.24(需要加入NH₃)

200mg和300mg的两份各自以2步分离的步骤进行纯化：

第一分离步骤：Fraktogel EMD SO₃-s柱：D(内部)＝14mm L(填充)＝85mm

I.条件

(流速5ml/min)a)100ml H₂O

b)200ml 0.25M H₂SO₄

c)100ml H₂O

d)200ml1M氨溶液

e)100ml H₂O

II.分离：a)应用200mg溶于5ml H₂O中的物质

b)用H₂O→0.2M NH₄HCO₃溶液的梯度洗脱。(流动溶剂A＝250ml H₂O，装入Erlenmeyer烧瓶中，在磁力搅拌器上进行搅拌，

以5ml/min的速度泵到柱上

流动溶剂B＝0.2M NH₄HCO₃溶液，以2.5ml/min泵送到A)。

III.分馏：a)各自3ml的级分

b)第一峰杂质

c)在约70ml初步洗脱物质之后的第二峰

IV.重建条件：a)100ml 1M铵溶液

b)100ml H₂O

第二分离步骤：

Diaion HP20，柱D(内部)＝30mm L(填充)130mm，用100ml H₂O和100ml H₂O/5％异丙醇洗脱。

物质已经由水相洗脱；仅仅杂质存在于异丙醇部分中。

根据分析HPLC，获得3种级分：F1＝13.5mg，F2＝5.5mg，F3＝11.5mg，总共＝30.5mg＝12.2％。

与吡咯烷基NAD(化合物18)的等同性通过NMR分析得到了证实。

pNAD的葡萄糖脱氢酶测定

为了测定pNAD作为葡萄糖脱氢酶(GlucDH)辅因子的作用，在0.1m Tris/0.2M NaCl(pH 8.5)缓冲液中进行GlucoseDH活性测定。葡萄糖的浓度为80mM。使用的pNAD或作为NAD的浓度为0.05-0.5mM。向其中加入10mg/ml(pNAD)或者0.002mg/ml(NAD)[分别83或者0.017μm]GlucDH。所述测定在室温下进行，其中酶反应通过记录吸收光谱以定期时间间隔进行监控。示于表1中的值是指在4分钟之后的吸收测量值。

表1

(p)NAD(mM)	U/ml	％活性	使用的[GlucDH]
				0.05NAD	539	100	0.002mg/ml
0.4NAD	1556	100	0.002mg/ml

0.05pNAD	0.00017	0.00003	10μl 10mg/ml
				0.4pNAD	0.0024	0.00015	10μl 10mg/ml

pNAD和pNADH的吸收光谱

NAD和pNAD或NADH和pNADH的吸收光谱示于图6A和6B中。

NAD和pNAD在260nm下显示出最大吸收。同NADH相比，pNADH，即GlucDH活性测定之后的pNAD的最大吸收显示出大约10nm的红移(图6B)。

作为GlucDH配合物的NADH和pNADH的荧光光谱另外示于图7和8中。在各种情形中，光谱在GlucDH活性测定之后进行记录。图7显示了在340和370nm的激发波长下，NADH/pNADH-GlucDH配合物的发射光谱。NADH和pNADH在370nm激发波长下的发射光谱是相似的。图8显示了NADH/pNADH-GlucDH配合物在460nm的发射波长下的激发光谱。pNADH显示出比NADH更宽的激发光谱。光谱同样在GlucDH活性测定之后进行记录。

pNAD稳定性的研究

为了测定与NAD相比pNAD的稳定性，将相同量NAD和pNAD各自吸收在0.15M KPO₄，1M NaCl缓冲液(pH 7.0)中，并且在50℃下进行温育。NAD或pNAD的降解通过HPLC进行监控。图9显示了在零时间时，同(p)NAD量相比的(p)NAD量的百分比面积。该图表明，同NAD相比，pNAD非常稳定。

C)carbaNAD环磷酸盐(19)的制备

将79mg(0.1mmol)O5’-(羟基-吗啉代-磷酰基)-O₂’，O₃’-羟基-磷酰基-腺苷、N-环己基-吗啉-4-碳亚胺酸carbonimid环己胺盐二水合物(通过与吡啶共蒸发进行干燥)(Morphat等人，J.Am.Chem.Soc.83；1961；663-675)、44mg(0.105mmol)carbaNMN单磷酸盐和随后的25mg无水硫酸镁加入到0.74ml 0.2M氯化锰的绝对甲酰胺溶液中。在氩气下，在密闭的反应容器中将混合物搅拌三天，随后在搅拌的同时将其加入到10ml乙腈中。通过过滤将沉淀除去，在RP 18Hypersil ODS上通过RP色谱法进行纯化，250x 21.2mM，5μm柱，使用0％B～100％B梯度60分钟：洗脱液A：0.1M三乙基乙酸铵，洗脱液B：0.1M三乙基乙酸铵和乙腈的1∶4混合物，流速：10ml/min。通过在260nm下进行检测对洗脱进行监控。为了除去三乙基乙酸铵，对主组分进行收集和进行冷冻干燥5次。用Dowex 50WX2将三乙基铵盐转化为游离酸，随后将其转化为锂盐。产量：10mg。

D)carbaNADP(20)的制备

在37℃下，在6小时内将三次四单位核糖核酸酶T2加入2.2mgcarbaNAD环磷酸盐锂盐(19)的1ml二-三-丙烷缓冲液(0.02M，pH 7.5)溶液中。在37℃下将混合物保持过夜。通过在65℃下加热20分钟使酶变性。在过滤之后，在RP 18Hypersil ODS上通过RP色谱法进行纯化，250x 21.2mm，5μm柱，使用0％B～100％B的梯度纯化60分钟。洗脱液A：0.1M三乙基乙酸铵；洗脱液B：0.1μ三乙基乙酸铵和乙腈的1∶4混合物；流速：10ml/min。通过在260nm下进行检测对洗脱进行监控。为了除去三乙基乙酸铵，对主级分进行收集和进行冷冻干燥5次。

质谱(MALDI Applied Biosystems Voyager System 6327：计算值742.45，实测值：743.17)。

E)cNAD的葡萄糖脱氢酶活性测定

如B)对pNAD所述，为了同NAD相比，进行对cNAD进行葡萄糖脱氢酶活性测定。为了实现该目的，使用0.1(cNAD)或0.002mg/ml(NAD)[分别0.83或0.017μm]的葡萄糖脱氢酶浓度。使用的量和结果示于表2中。

表2

(c)NAD(mM)	U/ml	％活性	使用的[GlucDH]
				0.05NAD	430	100	0.002mg/ml
0.1NAD	556	100	0.002mg/ml

0.05cNAD	2.7	0.63	0.1mg/ml
				0.1cNAD	5.3	0.95	0.1mg/ml

F)cNAD和cNADH的吸收光谱

图10A、10B或10C显示了NAD和cNAD的吸收光谱。NAD以及cNAD在260nm下具有最大吸收。图10B显示了NADH和cNADH的吸收光谱，其中在各种情形下，在葡萄糖脱氢酶活性测定之后对光谱进行记录。cNADH的最大吸收表现出20nm的红移。NADH和cNADH的其它吸收光谱示于图10C中，其中将相关葡萄糖脱氢酶活性测定的不同条件如图例中所述进行选择。

图11另外显示了作为GlucDH配合物的NADH和cNADH的荧光光谱。在葡萄糖脱氢酶活性测定之后，在370nm的激发波长下对光谱进行记录。当用GlucDH处理时，NADH以及cNADH显示出升高的荧光信号。

Claims

1.用于测定分析物的测试元件，其包括(i)辅酶依赖的酶或者所述酶的底物和(ii)作为辅酶的以下通式(I)化合物：

其中

A＝腺嘌呤或者其类似物，

T＝在各种情况下独立地表示O或S，

U＝在各种情况下独立地表示OH、SH、BH₃ ^-或BCNH₂ ^-，

V＝在各种情况下独立地表示OH或者磷酸酯基，

W＝COOR、CON(R)₂、COR或CSN(R)₂，其中R在各种情况下独立地表示H或者C₁-C₂-烷基，

X₁，X₂＝在各种情况下独立地表示O、CH₂、CHCH₃、C(CH₃)₂、NH或NCH₃，

Y＝NH、S、O或CH₂，

Z＝含有5个C原子的环状基团的残基，所述环状基团任选含有选自O、S和N的杂原子并且任选具有一个或者多个取代基，和残基CR4₂，其中CR4₂键接在环状基团和X2上，其中

R4＝在各种情况下独立地表示H、F、Cl或CH₃，

条件是Z和吡啶残基不通过糖苷键进行连接，

或者其盐或者任选的还原形式。

2.根据权利要求1的测试元件，其用于测定葡萄糖，其包含葡萄糖脱氢酶和作为辅酶的根据通式(I)的化合物或者其盐。

3.根据权利要求1或者2的测试元件，其特征在于，Z上的取代基选自F、Cl和任选氟化或者氯化或/和OH-取代的C₁-C₂-烷基、O-C₁-C₂-烷基。

4.根据权利要求1～3中任一项的测试元件，其包括作为辅酶的下列通式(I’)的化合物：

其中

A＝腺嘌呤或者其类似物，

T＝在各种情况下独立地表示O或S，

U＝在各种情况下独立地表示OH、SH、BH₃ ^-或BCNH₂ ^-，

V＝在各种情况下独立地表示OH或者磷酸酯基，

X₁，X₂＝在各种情况下独立地表示O、CH₂、CHCH₃、C(CH₃)2_、NH或NCH₃，

Y＝NH、S、O或CH₂，

Z＝通式(II)的饱和或者不饱和的碳环或者杂环五元环，

其中单键或者双键可以存在于R5’与R5”之间，其中

R4＝在各种情况下独立地表示H、F、Cl或CH₃，

R5＝CR4₂，

如果单键存在于R5’与R5”之间，那么

R5’＝O、S、NH、NC₁-C₂-烷基、CR4₂、CHOH或CHOCH₃，

R5”＝CR4₂、CHOH或CHOCH₃，

如果双键存在于R5’与R5”之间，那么

R5’＝R5”＝CR4，

R6，R6’＝在各种情况下独立地表示CH或CCH₃，

或者其盐或者任选的还原形式。

5.根据权利要求1～4中任一项的测试元件，其中W＝CONH₂或者COCH₃。

6.根据权利要求1～5中任一项的测试元件，为试验条的形式。

7.根据权利要求1～6中任一项的测试元件，其特征在于，酶为脱氢酶，其选自葡萄糖脱氢酶(E.C.1.1.1.47)、乳酸脱氢酶(E.C.1.1.1.27，1.1.1.28)、苹果酸脱氢酶(E.C.1.1.1.37)、甘油脱氢酶(E.C.1.1.1.6)、乙醇脱氢酶(E.C.1.1.1.1)、α-羟基丁酸酯脱氢酶、山梨醇脱氢酶或者氨基酸脱氢酶，例如L-氨基酸脱氢酶(E.C.1.4.1.5)。

8.根据权利要求1～7中任一项的测试元件，用于检测葡萄糖，其特征在于酶为葡萄糖脱氢酶。

9.根据权利要求1～8中任一项的测试元件，为干燥测试的形式。

10.根据权利要求1～9中任一项的测试元件用于测定分析物的用途，所述分析物选自葡萄糖、乳酸、苹果酸、甘油、醇、胆固醇、甘油三酸酯、抗坏血酸、半胱氨酸、谷胱甘肽、肽、脲、铵、水杨酸盐、丙酮酸盐、5’-核苷酸酶、肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)和二氧化碳。

11.用于检测分析物的方法，该方法包括以下步骤：

(a)使样品与根据权利要求1～9中任一项的测试元件接触，包括辅酶和

(b)检测分析物。

12.根据权利要求11的方法，其特征在于，对分析物进行光度或者荧光光度检测。

13.根据权利要求11或12的方法，其特征在于，所述样品是体液、废水或食品。