CN108473966A - 来自类球红细菌的突变体3-羟基丁酸脱氢酶及其相关方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及相对于野生型3‑HBDH性能改善的突变体3‑羟基丁酸脱氢酶(3‑HBDH),编码该突变体3‑HBDH的核酸,包含该突变体3‑HBDH或该核酸的细胞,测定样品中3‑羟基丁酸的量或浓度的方法,和用于测定样品中3‑羟基丁酸的量或浓度的装置。
Description
发明领域
本发明涉及相对于野生型3-HBDH性能改善的突变体3-羟基丁酸脱氢酶(3-HBDH),编码该突变体3-HBDH的核酸,包含该突变体3-HBDH或该核酸的细胞,测定样品中3-羟基丁酸的量或浓度的方法,和用于测定样品中3-羟基丁酸的量或浓度的装置。
发明背景
酮体在肝中生成,主要来自脂肪酸的氧化,并输出至外周组织以用作能源。它们对于没有其它实质性非葡萄糖衍生能源的脑特别重要。两种主要的酮体是3-羟基丁酸和乙酰乙酸。在生化上,酮体代谢的异常可以细分成三个范畴:酮症(ketosis),低酮性低血糖症(hypoketotic hypoglycemia),和3-羟基丁酸/乙酰乙酸比异常。
3-羟基丁酸/乙酰乙酸比的异常升高通常暗示源自低氧-缺血或其它起因的肝细胞线粒体基质的非氧化状态。
酮症的存在在正常情况下暗示脂质能量代谢已被激活且脂质降解的整个途径是完整的。在罕见病例中,酮症反应没有能力利用酮体。酮症在禁食期间,在长时间锻炼之后,及在采用高脂肪食谱时是正常的。在新生儿期,婴儿和妊娠(脂质能量代谢特别活跃的时间)期间,容易发生酮症。
酮症的病理学起因包括糖尿病,儿童期的酮症性低血糖,皮质类固醇或生长激素缺乏,酒精或水杨酸中毒,和数种先天代谢错误。
当脂解升高时,例如在胰岛素缺乏(糖尿病;特别是I型糖尿病)中,当胰高血糖素浓度升高时及在禁食状态,酮体形成升高。在此类情况中,小于7mg/dl的正常生理性浓度能升高至大于10倍。在过去几年里,已经证明3-羟基丁酸是用于监测胰岛素疗法的一项极其可靠的参数。
具有低血糖症的患者中酮症的缺失是异常的且提示高胰岛素血症或脂肪能量代谢的先天错误任一的诊断。
因而,酮体是一种感兴趣的诊断靶,特别是对于糖尿病。因此,当前需要稳健且敏感的针对酮体,尤其是3-羟基丁酸的测试系统。3-羟基丁酸对丙酮或乙酰乙酸的比在正常情况下是3:1。在酮酸中毒中,该比升高至6:1至12:1。合适的3-HBDH应当能够开发针对3-羟基丁酸的定量测试。
发明概述
令人惊讶地,已经发现来自类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)的3-羟基丁酸脱氢酶的多种突变体显示改善的性能,特别是升高的热稳定性和/或底物和/或辅因子亲和力。如实施例中显示的,野生型酶中有许多位点容许相对于野生型酶提高突变体的热稳定性和/或底物和/或辅因子亲和力的突变。
发明人鉴定了野生型3-HBDH中可观量的氨基酸,它们的替代相对于野生型HBDH提高所得突变体的性能(见例如实施例的表1A和1B)。特别地,可以替代氨基酸以提高热稳定性和任选的底物和/或辅因子(对于3-羟基丁酸和/或NAD或NAD的衍生物,例如卡巴-NAD(carba-NAD))亲和力。那些位点的合适的例子包括SEQ ID NO:1的位置66,109 113,125,140,144,145,195,197,217,223,232,239,250和/或257。通过组合上述或别的位点处的突变能进一步提高突变体3-HBDH的性能(见表2A和2B)。那些突变体的特别合适的例子包括那些具有下述突变的(缩写的定义见下文):
-125Phe;
-144Arg;
-232Cys;
-250Met;
-230Leu和250Met;
-37Tyr和250Met;
-37Tyr,230Leu和250Met;
-202Gly,230Leu和250Met;
-37Tyr,145Gly,230Leu和250Met;或
-37Tyr,195Gln,230Leu和250Met
(见实施例)。
发明详述
因而,在第一个方面,本发明涉及一种相对于野生型3-HBDH性能改善的来自类球红细菌的突变体3-羟基丁酸脱氢酶(3-HBDH)。优选地,相对于野生型3-HBDH性能改善的来自类球红细菌的突变体3-HBDH包含与SEQ ID NO:1(来自类球红细菌的3-HBDH;野生型3-HBDH)的氨基酸序列至少80%同一的氨基酸序列且相对于野生型3-HBDH具有与SEQ ID NO:1的位置250对应的位置处的至少一处氨基酸替代。更加优选地,与SEQ ID NO:1的位置250对应的位置的氨基酸用Met(250Met)或Ile(250Ile),特别是用Met(250Met)替代。已经证明该位置和替代对于改善突变体3-HBDH的性能是有利的(见表1A和1B)且可以与别的突变组合(见表2A和2B)。因而,特别合适的突变体包括那些具有下述突变的:
-250Met;
-230Leu和250Met;
-37Tyr和250Met;
-37Tyr,230Leu和250Met;
-202Gly,230Leu和250Met;
-37Tyr,145Gly,230Leu和250Met;或
-37Tyr,195Gln,230Leu和250Met
(见实施例)。
3-羟基丁酸脱氢酶(3-HBDH)(EC 1.1.1.30)属于氧化还原酶家族,具体是与作为辅因子的NAD或衍生物一起催化3-羟基丁酸盐/3-羟基丁酸酯/(R)-3-羟基丁酸/3-羟基丁酸(3-HB)立体特异性氧化成乙酰乙酸的一种酶:
这一类酶的系统名称是(R)-3-羟基丁酸:NAD+氧化还原酶((R)-3-hydroxybutanoate:NAD+oxidoreductase)。常用的其它名称包括NAD+-β-羟基丁酸脱氢酶(NAD+-beta-hydroxybutyrate dehydrogenase),羟基丁酸氧化还原酶(hydroxybutyrateoxidoreductase),β-羟基丁酸脱氢酶(beta-hydroxybutyrate dehydrogenase),D-β-羟基丁酸脱氢酶(D-beta-hydroxybutyrate dehydrogenase),D-3-羟基丁酸脱氢酶(D-3-hydroxybutyrate dehydrogenase),D-(-)-3-羟基丁酸脱氢酶(D-(-)-3-hydroxybutyratedehydrogenase),β-羟基丁酸脱氢酶(beta-hydroxybutyric acid dehydrogenase),3-D-羟基丁酸脱氢酶(3-D-hydroxybutyrate dehydrogenase),和β-羟基丁酸脱氢酶(beta-hydroxybutyric dehydrogenase)。这种酶参与酮体的合成和降解和丁酸代谢,而且它可用于测定样品,诸如血液样品中的酮体。
术语“野生型3-HBDH”涉及3-HBDH,因为它典型地天然发生。来自紫色光合细菌类球红细菌的野生型3-HBDH在大肠杆菌中克隆且在1999年进一步描述(DE 19815685 A1)。然而,该酶特征在于相当低的稳定性(导致短贮存期),这在生物技术,生物医学和诊断应用中是不利的。特别地,如果有意使用先前制备的酶的话,短贮存期对该酶的可应用性具有负面影响。这特别包括通常大规模制备,贮存,然后销售(例如以更小批次)的商业性产品,诸如酶制剂,试剂盒,测试条等。另外,显然想要提高该酶对底物和/或辅因子的亲和力。升高的亲和力和/或稳定性会提高该酶在生物技术应用和装置中的性能。类球红细菌的典型发生野生型3-HBDH的公认氨基酸序列在下文中作为SEQ ID NO:1给出。
术语“来自类球红细菌的突变体3-羟基丁酸脱氢酶(3-HBDH)”涉及其氨基酸序列因至少一处突变,即一处或多处氨基酸替代,添加,删除或其组合,特别是至少一处替代而与来自类球红细菌的野生型3-HBDH,特别是SEQ ID NO:1的氨基酸序列不同的3-HBDH酶。
术语“相对于野生型3-HBDH性能改善的”意味着该突变体酶的性能相对于来自类球红细菌的野生型3-HBDH改善。如果该突变体酶以任何条件(例如贮存后,在特定的pH,与特定的缓冲液一起,于选定的温度,与特定的辅因子(例如卡巴-NAD)一起,以特定的底物或辅因子浓度等)具有更高的性能,例如更高的将3-HB转变成乙酰乙酸的活性,那么性能得到改善。更高的性能尤其可以是升高的稳定性(诸如热稳定性)和/或对于一种或多种底物/辅因子(例如卡巴-NAD和/或3-HB)的亲和力。优选地,如果该突变体酶例如在以给定条件(例如贮存,缓冲液条件,温度,辅因子或底物浓度)施加压力后具有与没有在这些条件下受压的活性相比更高的将3-HB转变成乙酰乙酸的相对剩余活性,和/或如果该突变体酶例如具有更高的相对活性(即在亚饱和浓度的活性/在饱和浓度的活性),那么性能得到改善。
来自类球红细菌的野生型3-HBDH的序列作为SEQ ID NO:1显示:SEQ ID NO:1(来自类球红细菌的3-HBDH)
因而,作为SEQ ID NO:1,上文给出天然发生野生型3-HBDH的一个优选例子。
如果将一处或多处突变引入野生型序列中,尤其是SEQ ID NO:1的序列,那么获得突变体3-HBDH。就本发明的突变体3-HBDH而言,注意到该突变体是功能上有活性的且显示相对于野生型3-HBDH改善的性能。这意味着该突变体维持其将3-HB转变成乙酰乙酸的酶功能。另外,优选至少稳定性和任选酶对底物和/或辅因子的亲和力升高。该突变体因一处或多处氨基酸替代,添加和/或删除,尤其是至少一处或多处替代而与野生型3-HBDH不同。
依照本发明的突变体3-HBDH的序列(任选在上文规定的替代以外还)包含一处或多处氨基酸替代,删除或添加,尤其是一处或多处替代,特别是一处或多处保守氨基酸替代。
在本发明的一个实施方案中,依照本发明的突变体3-HBDH可以包含一处或多处氨基酸替代,特别是有限数目的替代(例如多至50,40,30,20,尤其是10处氨基酸替代)。合适的替代在实施例中,特别是在表中给出。实施例中鉴定为适合于提高3-HBDH性能的所有替代可以在本发明中单独或彼此和/或与别的替代,例如保守替代组合使用。“保守氨基酸替代”指一个残基用具有相似侧链的不同残基替代,因而典型地涉及多肽中的氨基酸用相同或相似定义的氨基酸类别内的氨基酸替代。举例而非限制,具有脂肪族侧链的氨基酸可以用另一种脂肪族氨基酸,例如丙氨酸,缬氨酸,亮氨酸,和异亮氨酸替代;具有羟基侧链的氨基酸用另一种具有羟基侧链的氨基酸,例如丝氨酸和苏氨酸替代;具有芳香族侧链的氨基酸用另一种具有芳香族侧链的氨基酸,例如苯丙氨酸,酪氨酸,色氨酸,和组氨酸替代;具有碱性侧链的氨基酸用另一种具有碱性侧链的氨基酸,例如赖氨酸和精氨酸替代;具有酸性侧链的氨基酸用另一种具有酸性侧链的氨基酸,例如天冬氨酸或谷氨酸替代;和疏水性或亲水性氨基酸分别用另一种疏水性或亲水性氨基酸替换。保守氨基酸替代的例子包括下文所列那些:
在本发明的一个实施方案中,依照本发明的突变体3-HBDH可包含一处或多处氨基酸添加,特别是小(例如高至50,40,30,20,尤其是10处氨基酸)内部氨基酸添加。或者,添加可以通过将突变体3-HBDH组合入包含本发明的突变体3-HBDH的融合蛋白来实现。
融合蛋白是通过连接两个或更多个最初分开的蛋白质或肽而创建的蛋白质。这种规程产生具有自每一种原始蛋白质衍生的功能特性的多肽。因而,取决于预定用途,可以将3-HBDH与别的肽或蛋白质组合成融合蛋白。可以经由接头或间隔物来融合蛋白质,这提高蛋白质独立折叠并表现符合预期的可能性。尤其是在接头使得蛋白质纯化成为可能的情况中,蛋白质或肽融合物中的接头有时改造成具有蛋白酶或化学药剂的切割位点,从而能够释放两个分开的蛋白质。通过将原始蛋白质与诱导人工蛋白质二或多聚化的肽域(例如链霉亲合素或亮氨酸拉链)融合,可以经由遗传工程来制造二或多聚体融合蛋白。还可以用毒素或附着于它们的抗体来制造融合蛋白。其它融合物包括添加信号序列,诸如脂化信号序列,分泌信号序列,糖基化信号序列,易位信号肽等。
优选地,本发明的融合蛋白包含标签。标签出于各种目的而附着于蛋白质,例如为了容易纯化,帮助蛋白质正确折叠,防止蛋白质沉淀,改变层析特性,修饰蛋白质或标记蛋白质。标签的例子包括Arg标签,His标签,Strep标签,Flag标签,T7标签,V5肽标签,GST标签和c-Myc标签。
在本发明的一个实施方案中,依照本发明的突变体3-HBDH可包含一处或多处氨基酸删除,特别是N和/或C端删除。该删除可以是小的(例如高至50,40,30,20,尤其是10个氨基酸)。
在另一个实施方案中,依照本发明的突变体3-HBDH的序列可优选在上文规定的替代以外还包含一处或多处上文定义的删除,替代或添加的组合。
在本发明的一个优选实施方案中,该突变体3-HBDH包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列(来自类球红细菌的3-HBDH;野生型3-HBDH)至少80%同一的氨基酸序列。
如本文中使用的,术语“至少80%同一”或“至少80%序列同一性”意味着依照本发明的突变体3-HBDH的序列具有特征在于在100个氨基酸的区段内,至少80个氨基酸残基与相应野生型序列的序列同一的氨基酸序列。相应定义其它百分比的序列同一性。
依照本发明的序列同一性可以例如通过序列比较形式的序列比对方法来测定。序列比对方法是本领域公知的且包括各种程序和比对算法,它们已经描述于例如Pearsonand Lipman(1988)。此外,NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)自数个来源,包括(美国)国家生物技术信息中心(NCBI,Bethesda,MD)和在因特网上可得,与序列分析软件blastp,blastn,blastx,tblastn和tblastx联合使用。依照本发明的突变体相对于例如SEQ ID NO:1的氨基酸序列的同一性百分比典型地使用NCBI Blast blastp及标准设置来表征。或者,序列同一性可以使用软件GENEious及标准设置来测定。使用全局比对方案及自由末端缺口作为比对类型,和Blosum62作为代价矩阵,比对结果可以例如派生自软件Geneious(version R8)。
如上文详述的,在一个实施方案中,本发明的突变体3-HBDH包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列至少80%同一的氨基酸序列。在一个优选实施方案中,该突变体3-HBDH包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列任一项至少85%,90%,95%,96%,97%,98%,或99%同一的氨基酸序列或由其组成。序列同一性可以如上文所述来测定。
在另一个优选实施方案中,本发明的突变体相对于野生型3-HBDH具有至少一处氨基酸替代,其中该至少一处氨基酸替代在与SEQ ID NO:1的位置66,109,113,125,140,144,145,195,197,217,223,232,239,250和/或257,特别是至少SEQ ID NO:1的位置125,144,232和/或250,更加特别是至少SEQ ID NO:1的位置125,144,和/或250,尤其是至少SEQ IDNO:1的位置250对应的位置中的一个或多个处。已经在实施例中显示与SEQ ID NO:1的上述位置对应的位置处的氨基酸的替代提高稳定性和/或底物和/或辅因子亲和力(见例如表1A和1B)。这些位置处的替代可以彼此组合(也见实施例)。
优选地,相对于野生型3-HBDH性能改善的来自类球红细菌的突变体3-HBDH包含与SEQ ID NO:1(来自类球红细菌的3-HBDH;野生型3-HBDH)的氨基酸序列至少80%同一的氨基酸序列,相对于野生型3-HBDH具有与SEQ ID NO:1的位置250,优选250Met对应的位置处的至少一处氨基酸替代,且具有至少一处与SEQ ID NO:1的位置66,109 113,125,140,144,145,195,197,217,223,232,239和/或257,特别是至少SEQ ID NO:1的位置125,144和/或232,更加特别是至少SEQ ID NO:1的位置125和/或144中的一个或多个对应的位置处的别的氨基酸替代。
下面给出本发明的突变体3-HBDH的替代的特别合适的例子:
-SEQ ID NO:1的位置66用Tyr(66Tyr)或Asn(66Asn)替代;
-SEQ ID NO:1的位置109用Glu(109Glu)替代;
-SEQ ID NO:1的位置113用Thr(113Thr)替代;
-SEQ ID NO:1的位置125用Phe(125Phe)替代;
-SEQ ID NO:1的位置140用Val(140Val)替代;
-SEQ ID NO:1的位置144用Arg(144Arg)替代;
-SEQ ID NO:1的位置145用Gly(145Gly)替代;
-SEQ ID NO:1的位置195用Gln(195Gln)或Leu(195Leu)替代;
-SEQ ID NO:1的位置197用Ile(197Ile)替代;
-SEQ ID NO:1的位置217用Val(217Val)替代;
-SEQ ID NO:1的位置223用Val(223Val)替代;
-SEQ ID NO:1的位置232用Cys(232Cys),Tyr(232Tyr),或Trp(232Trp),尤其是232Cys替代;
-SEQ ID NO:1的位置239用Tyr(239Tyr)或Trp(239Trp)替代;
-SEQ ID NO:1的位置250用Met(250Met)替代;和/或
-SEQ ID NO:1的位置257用Met(257Met),或Gln(257Gln)替代。
此外,上述替代可以与下述替代中的一个或多个组合:
-SEQ ID NO:1的位置37用Tyr(37Tyr)替代;
-SEQ ID NO:1的位置202用Gly(202Gly)替代,和/或
-SEQ ID NO:1的位置230用Leu(230Leu)替代,
其中这些优选与250Met组合。
在本发明的一个特别优选实施方案中,
a)该突变体3-HBDH至少具有与SEQ ID NO:1的位置对应的突变125Phe,144Arg,232Cys,和/或250Met,特别是125Phe,144Arg,和/或250Met,更加特别是250Met;或
b)该突变体3-HBDH具有与SEQ ID NO:1的位置对应的突变
-125Phe;
-144Arg;
-232Cys;
-250Met;
-230Leu和250Met;
-37Tyr和250Met;
-37Tyr,230Leu和250Met;
-202Gly,230Leu和250Met;
-37Tyr,145Gly,230Leu和250Met;和/或
-37Tyr,195Gln,230Leu和250Met;或
c)该突变体3-HBDH仅仅具有与SEQ ID NO:1的位置对应的突变
-125Phe;
-144Arg;
-232Cys;
-250Met;
-230Leu和250Met;
-37Tyr和250Met;
-37Tyr,230Leu和250Met;
-202Gly,230Leu和250Met;
-37Tyr,145Gly,230Leu和250Met;或
-37Tyr,195Gln,230Leu和250Met。
在本发明的一个甚至更加特别优选实施方案中,该突变体包含与SEQ ID NO:1(来自类球红细菌的3-HBDH;野生型3-HBDH)的氨基酸序列至少80%同一的氨基酸序列,相对于野生型3-HBDH具有至少一处与SEQ ID NO:1的位置250对应的位置处的氨基酸替代,优选250Met,且
a)至少具有与SEQ ID NO:1的位置对应的突变125Phe,144Arg,和/或
232Cys,特别是125Phe和/或144Arg;或
b)该突变体3-HBDH具有与SEQ ID NO:1的位置对应的突变
-125Phe;
-144Arg;
-232Cys;
-250Met;
-230Leu和250Met;
-37Tyr和250Met;
-37Tyr,230Leu和250Met;
-202Gly,230Leu和250Met;
-37Tyr,145Gly,230Leu和250Met;和/或
-37Tyr,195Gln,230Leu和250Met;或
c)该突变体3-HBDH仅仅具有与SEQ ID NO:1的位置对应的突变
-250Met;
-230Leu和250Met;
-37Tyr和250Met;
-37Tyr,230Leu和250Met;
-202Gly,230Leu和250Met;
-37Tyr,145Gly,230Leu和250Met;或
-37Tyr,195Gln,230Leu和250Met。
在本发明的一个优选实施方案中,该突变体3-HBDH包含与SEQ ID NO:1至11任一项的氨基酸序列至少85%,90%,95%,96%,97%,98%,或99%同一的氨基酸序列或由其组成,特别是其中该突变体3-HBDH包含选自由SEQ ID NO:2至11组成的组的序列或由其组成。
如上文详述的,SEQ ID NO:1的序列涉及野生型3-HBDH。SEQ ID NO:2至11的序列是优选突变体的序列。SEQ ID NO:5至11的序列是高度优选突变体的序列。突变体的序列和所实现的替代在“序列”一节中显示。序列同一性可以如上文所述来测定。
在本发明的一个优选实施方案中,相对于野生型3-HBDH性能改善是
-相对于野生型3-HBDH,稳定性升高,尤其是热稳定性;和/或
-相对于野生型3-HBDH,底物亲和力升高,尤其是对于3-羟基丁酸;和/或
-相对于野生型3-HBDH,辅因子亲和力升高,尤其是对于NAD或其衍生物,特别是其中该衍生物是卡巴-NAD。
术语“相对于野生型3-HBDH,稳定性升高,尤其是热稳定性”意味着突变体3-HBDH在某种条件,尤其是于升高的温度不太倾向于丧失(酶)活性。酶的稳定化,包括避免变性机制以维持它们作为催化剂的全部潜力,是生物技术中的一项重要目标。由于酶应用的数目越来越多,酶稳定化具有显著的重要性。稳定性的升高容许持久的可用性(例如更久的贮存,更长时间的可用性等)。突变体相对于野生型升高的稳定性可以通过比较两种酶(野生型和突变体)的剩余活性来测定,例如在贮存或暴露于特定条件(例如升高的温度,干燥,缓冲液,或盐)后(绝对剩余活性)。或者,如果突变体例如具有更高的将3-HB转变成乙酰乙酸的相对剩余活性,那么稳定性与野生型相比得到改善。相对剩余活性可以通过将在以给定条件(例如贮存时间,温度)贮存后的剩余或残留活性与贮存前的初始活性比较来测定。或者,如果突变体例如具有与野生型酶相比更高的将3-HB转变成乙酰乙酸的剩余活性,那么稳定性得到改善。相对剩余活性可以通过比较野生型和突变体酶在给定条件(例如贮存时间,温度)贮存后的剩余或残留活性来测定。
术语酶活性及其测定是本领域技术人员公知的。酶活性一般定义为单位时间里底物转变的量。酶活性的SI单位是开特(katal)(1开特=1mol s-1)。一种更加实用且常用的值是酶单位(U)=1μmol min-1。1U对应于16.67纳开特且定义为每分钟里催化1毫摩尔底物转变的酶量。酶的比活性是每毫克总蛋白质的酶活性(表述为μmol min-1mg-1)。
酶活性可以在测量随时间的底物或辅因子消耗或产物形成的测定法中测定。存在测量底物和产物浓度的多种不同方法,而且可以以数种不同方式测定许多酶,正如本领域技术人员知道的。在本发明中,例如将所讨论的3-HBDH与3-羟基丁酸和辅因子(例如NAD或其衍生物,诸如卡巴-NAD)一起温育并监测辅因子的转变(NAD变成NADH或卡巴-NAD变成卡巴-NADH)。监测可以例如通过测量340nm处的吸光度来进行。所获得的每分钟吸光度变化(dE/min)代表酶活性。详情见实施例2。
在本发明的一个优选实施方案中,突变体3-HBDH的稳定性相对于没有突变的相应3-HBDH升高可以表述为突变体的半衰期(t1/2(突变体))相对于相应的野生型3HBDH的半衰期(t1/2(野生型))延长。酶的半衰期(t1/2)指示当时初始活性(t=0时的活性)的50%丧失且之后剩余活性占到50%的时间量。因而,稳定性升高导致突变体的半衰期相对于相应的野生型延长。稳定性的升高可以以t1/2(突变体)/t1/2(野生型)来测定。百分比半衰期延长可以以[t1/2(突变体)/t1/2(野生型)–1]*100来测定。
在本发明的一个高度优选实施方案中,突变体3-HBDH的稳定性相对于没有突变的相应3-HBDH升高可以以施压温育(于例如64℃例如30分钟或实施例中给出的任何其它条件)后的剩余活性相对于施压温育/贮存前的初始活性来测定和表述(见实施例)。为此,可以监测酶促反应(例如于室温以340nm达5分钟)并可以为每一份样品计算单位时间里的吸光度变化(例如dE/min)。可以将对施压样品获得的值与相应的未施压样品(设置为100%活性的值)比较并以百分比活性{[dE/min(施压样品)/dE/min(未施压样品)]*100}计算。因而,突变体的值比用野生型酶获得的值要高代表热稳定性的改善。如果[突变体的%剩余活性]-[野生型的%剩余活性]>0,那么稳定性升高。或者,突变体的剩余活性还可以以百分比活性表述且可以如下计算:[突变体的%剩余活性]/[野生型的%剩余活性]*100%。如果所得值>100%,那么突变体的稳定性相对于野生型升高。实施例2中详细描述了一种特别适合于测定稳定性的测试。照此,稳定性可以以剩余活性表述且以[dE/min(施压样品)]/[dE/min(未施压样品)]*100计算。实施例2中给出了更多详情。用突变体获得的值比用野生型酶获得的值要高代表突变体的稳定性升高。
优选地,稳定性升高至少10%,20%,30%或40%,优选至少50%,75%或100%,仍然更加优选至少125%,150%,175%或200%,尤其是250%和最优选300%。
此外,于更高的温度进行酶促反应有商业优势。因而,优选突变体的热稳定性升高。这意味着突变体对升高的温度的抗性相对于野生型要高。热稳定性的升高特别可以如实施例,例如实施例2和3中所示来测定。一般地,可以将突变体和野生型酶于升高的温度(例如超出50℃,诸如54℃或64℃)预温育限定时间(诸如10分钟或30分钟),之后将突变体将3-HB转变成乙酰乙酸的剩余活性与野生型酶的剩余活性比较。如果突变体的剩余活性比野生型的要高,那么突变体具有升高的热稳定性。
实施例中详述了一种适合于测定升高的热稳定性的方法。施压条件的例示性条件可以是于50-90℃,特别是于50-64℃(例如50℃,或54℃或64℃)预温育30分钟,之后用62.22mM 3-羟基丁酸;4.15mM cNAD;0.1%Triton X-100;200mM Hepes pH 9.0或150mM 3-羟基丁酸;5mM cNAD;0.1%Triton X-100;70mM Mops pH 7.5测试。
术语“相对于该野生型3-HBDH,底物亲和力升高,尤其是对于3-羟基丁酸”意味着突变体对转变成乙酰乙酸的底物3-羟基丁酸盐/3-羟基丁酸酯/3-羟基丁酸(3-HB)的亲和力升高。为了测定,可以监测酶促反应(例如于室温以340nm达5分钟)并可以为每一份样品计算dE/min。如果突变体例如具有更高的对底物,特别是3-HB的绝对或相对亲和力,那么突变体的亲和力与野生型相比升高。突变体与野生型相比的亲和力可以通过比较两种酶(野生型和突变体)的绝对亲和力来测定(绝对比较)且可以以百分比活性{[dE/min(突变体)/dE(野生型)]*100}(%)计算。或者,突变体与野生型相比的亲和力可以通过比较两种酶(野生型和突变体)的相对亲和力来测定(相对比较)。野生型或突变体的相对亲和力可以通过相对于饱和底物浓度时的亲和力设置亚饱和底物浓度时的亲和力来测定。如实施例2和3中详述的,对3-羟基丁酸的亲和力可以在底物量减少(即以亚饱和浓度)的活性测定法中测定,例如用1.94mM 3-羟基丁酸(别的例示性条件:4.15mM cNAD;0.1%Triton X-100;200mMHepes pH 9.0)。实施例2中详细描述了一种特别适合于测定亲和力的测试。照此,亲和力可以以相对活性表述且以[dE/min(亚饱和底物浓度)]/[dE/min(饱和底物浓度)]*100计算。实施例2中给出了别的详情。用突变体获得的值比用野生型酶获得的值要高代表突变体的亲和力升高。
升高的亲和力与更低的Km值有关。米氏(Michaelis)常数Km是酶反应速率为最大值的一半时的底物浓度且是底物对酶的亲和力的一项倒数度量。
术语“相对于野生型3-HBDH,辅因子亲和力升高,尤其是对于NAD或其衍生物,特别是其中该衍生物是卡巴-NAD”意味着将3-HB转变成乙酰乙酸所需要的突变体对辅因子(NAD或其衍生物,尤其是卡巴-NAD)的亲和力升高。如实施例2和3中详述的,对辅因子的亲和力可以在辅因子量减少(即低于饱和)的活性测定法中测定,例如用0.032mM cNAD(别的例示性条件:62.22mM 3-羟基丁酸;0.1%Triton X-100;200mM Hepes pH 9.0)或0.5mM cNAD。上文关于底物亲和力给出的详情类似地适用于辅因子亲和力。实施例2中详细描述了一种特别适合于测定亲和力的测试。
特别地,本发明的突变体3-HBDH特征在于该突变体3-HBDH具有相对于野生型3-HBDH升高至少2倍的稳定性,优选升高至少3倍的稳定性,优选升高至少4倍的稳定性,更加优选升高至少5倍的稳定性;和/或特征在于该突变体3-HBDH具有相对于野生型3-HBDH升高的底物和/或辅因子亲和力,特别是升高的对(i)3-羟基丁酸和/或(ii)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)或其功能活性衍生物的亲和力和/或特别是其中该底物和/或辅因子亲和力升高至少5%,更加特别是至少10%,仍然更加特别是至少15%或20%。
在另一个方面,本发明涉及一种核酸,其编码上文描述的本发明的突变体3-HBDH。
如本文中使用的,术语“核酸”一般涉及编码本发明的突变体3-HBDH且可以是可变长度的任何核苷酸分子。本发明的核酸的例子包括但不限于质粒,载体,或任何种类的DNA和/或RNA片段,它们可以通过标准分子生物学规程来分离,包括例如离子交换层析。本发明的核酸可用于转染或转导特定细胞或生物体。
本发明的核酸分子可以是RNA的形式,诸如mRNA或cRNA,或DNA的形式,包括例如cDNA和基因组DNA,例如通过克隆获得的或通过化学合成技术生成的或其组合。DNA可以是三链的,双链的或单链的。单链DNA可以是编码链,也称作有义链,或者它可以是非编码链,也称作反义链。如本文中使用的,核酸分子还格外指单和双链DNA,作为单和双链DNA的混合物的DNA,和作为单和双链区的混合物的RNA,包含DNA和RNA的杂合分子,它可以是单链的,或更加典型地是双链的,或三链的,或单和双链区的混合物。另外,如本文中使用的,核酸分子指包含RNA或DNA或RNA和DNA二者的三链区。
另外,核酸可以含有一个或多个修饰碱基。此类核酸还可以含有修饰,例如核糖-磷酸主链中的,用于提高此类分子在生理环境中的稳定性和延长半衰期。如此,主链为了稳定性或其它原因而经过修饰的DNA或RNA是“核酸分子”,因为该特征意图是在本文中的。此外,仅仅举两个例子,包含不常见碱基,诸如肌苷,或修饰碱基,诸如三苯甲基化碱基的DNA或RNA在本发明的背景内是核酸分子。会领会,已经对DNA和RNA进行极其多种修饰用来满足本领域技术人员知道的许多有用目的。如本文中使用的,术语核酸分子涵盖此类化学上,酶学上或代谢上修饰形式的核酸分子,以及病毒和细胞,包括简单和复杂细胞特征性的化学形式的DNA和RNA,等等。
而且,编码本发明的突变体3-HBDH的核酸分子可以使用标准技术诸如标准克隆技术功能性连接至任何期望序列,诸如调节序列,前导序列,异源标志物序列或异源编码序列以创建融合蛋白。
本发明的核酸可以是最初在体外或在培养的细胞中形成的,一般是通过用内切核酸酶和/或外切核酸酶和/或聚合酶和/或连接酶和/或重组酶或熟练从业人员知道的用于生成核酸的其它方法操作核酸。
本发明的核酸可以包含在表达载体中,其中该核酸可操作连接至能够促进该核酸在宿主细胞中表达的启动子序列。
如本文中使用的,术语“表达载体”一般指可用于在细胞中表达感兴趣蛋白质的任何种类的核酸分子(还见上文关于本发明的核酸的详情)。特别地,本发明的表达载体可以是本领域技术人员知道的适合于在特定宿主细胞(包括但不限于哺乳动物细胞,细菌细胞,和酵母细胞)中表达蛋白质的任何质粒或载体。本发明的表达构建物还可以是编码本发明的3-HBDH,且随后用于克隆入相应载体以确保表达的核酸。用于蛋白质表达的质粒和载体是本领域公知的,而且可以商购自多个供应商,包括例如Promega(Madison,WI,USA),Qiagen(Hilden,Germany),Invitrogen(Carlsbad,CA,USA),或MoBiTec(Germany)。蛋白质表达方法是本领域技术人员公知的且例如描述于Sambrook et al.,2000(MolecularCloning:A laboratory manual,Third Edition)。
载体可另外包括允许其在宿主细胞中复制的核酸序列,诸如复制起点,一种或多种治疗性基因和/或选择标记基因和本领域已知的其它遗传元件,诸如指导所编码的蛋白质转录,翻译和/或分泌的调节元件。载体可用于转导,转化或感染细胞,由此引起细胞表达那些对细胞而言天然的核酸和/或蛋白质以外的。载体任选包括帮助实现核酸进入细胞的物质,诸如病毒颗粒,脂质体,蛋白质包衣诸如此类。本领域知道众多类型的适宜表达载体用于通过标准分子生物学技术表达蛋白质。此类载体选自常规载体类型,包括昆虫,例如杆状病毒表达,或酵母,真菌,细菌或病毒表达系统。本领域知道众多类型的其它适宜表达载体也可用于这个目的。用于获得此类表达载体的方法是公知的(参见例如Sambrook等人,见上文)。
如上文详述的,编码本发明的突变体3-HBDH的核酸可操作连接至适合于驱动蛋白质在宿主细胞中表达的序列以确保蛋白质表达。然而,本发明内涵盖请求保护的表达构建物可代表中间产物,其随后克隆入合适的表达载体以确保蛋白质表达。本发明的表达载体可进一步包含所有种类的核酸序列,包括但不限于聚腺苷酸化信号,剪接供体和剪接受体信号,居间序列,转录增强子序列,翻译增强子序列,药物抗性基因诸如此类。任选地,药物抗性基因可以可操作连接至内部核糖体进入位点(IRES),它可以是细胞周期特异性的或细胞周期不依赖性的。
如本文中使用的,术语“可操作连接”一般意味着基因元件排列成使得它们为了它们的预定目的协作发挥功能,例如转录由启动子启动并穿过编码本发明蛋白质的DNA序列行进。就是说,RNA聚合酶将编码融合蛋白的序列转录成mRNA,然后剪接并翻译成蛋白质。
如在本发明的背景中使用的,术语“启动子序列”一般指与下游编码序列可操作连接的任何种类的调节性DNA序列,其中所述启动子能够在细胞中结合RNA聚合酶并启动所编码的可读框转录,由此驱动所述下游编码序列表达。本发明的启动子序列可以是本领域技术人员知道的任何种类的启动子序列,包括但不限于组成性启动子,诱导型启动子,细胞周期特异性启动子,和细胞类型特异性启动子。
本发明的另一个方面涉及一种细胞,其包含本发明的突变体3-HBDH或本发明的核酸。在本发明的一个实施方案中,在本发明的背景中使用包含该突变体的细胞。该细胞优选是宿主细胞。本发明的“宿主细胞”可以是适合于应用重组DNA技术的任何种类的生物体,而且包括但不限于适合于表达一种或多种重组蛋白质的所有类别的细菌和酵母菌株。宿主细胞的例子包括例如各种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或大肠埃希氏菌/大肠杆菌(E.coli)菌株。多种大肠杆菌细菌宿主细胞是本领域技术人员知道的且包括但不限于诸如DH5-α,HB101,MV1190,JM109,JM101,或XL-1blue等菌株,它们可商购自多个供应商,包括例如Stratagene(CA,USA),Promega(WI,USA)或Qiagen(Hilden,Germany)。实施例中也描述了一种特别合适的宿主细胞,即大肠杆菌XL-1Blue细胞。可用作宿主细胞的枯草芽孢杆菌菌株包括例如1012野生型:leuA8metB5trpC2hsdRM1和168Marburg:trpC2(Trp-),它们例如商购自MoBiTec(Germany)。
依照本发明的宿主细胞的培养是熟练技术人员知道的一种例行规程。就是说,可以通过重组手段将编码本发明的突变体3-HBDH的核酸导入合适的宿主细胞以生成相应蛋白质。这些宿主细胞可以是能容易培养的任何种类的合适细胞,优选细菌细胞,诸如大肠杆菌。在第一步,这种办法可以包括将相应基因克隆入合适的质粒载体。质粒载体广泛用于基因克隆,而且能容易地导入(即转化)入已经变成感受态的细菌细胞。在相应宿主细胞中表达蛋白质后,可以依靠化学或机械细胞裂解来破坏细胞,它们是本领域技术人员公知的,而且包括但不限于例如低渗盐处理,洗涤剂处理,匀浆,或超声波处理。
在另一个方面,本发明涉及一种测定样品中3-羟基丁酸的量或浓度的方法,该方法包括
a)在有益于3-HBDH活性的条件下使该样品与本发明的突变体3-HBDH接触;
b)使3-羟基丁酸与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)或其功能活性衍生物反应其;并
c)测定NAD或其衍生物的氧化还原状态的变化,
由此测定该样品中3-羟基丁酸的量或浓度。
上述方法基于3-HBDH可用于依照下述方案催化3-HB转变成乙酰乙酸的事实:
在本发明的方法的第一步中,使样品与本发明的3-HBDH接触。样品与突变体3-HBDH的接触可以是直接的(例如在液体测定法中)或间接的(例如在传感器系统中,其中样品中只有(含有分析物的)一部分接触3-HBDH)。
显然接触应当在有益于3-HBDH活性的条件下进行,即容许该酶将3-HB转变成乙酰乙酸。温育步骤可以自约5秒钟至数小时变化,优选约10秒钟至约10分钟。然而,温育时间会取决于测定法格式,溶液体积,浓度诸如此类。通常,测定法会于环境温度或伴随进行的其它测试格式要求的温度(例如25℃至38℃;诸如30℃或37℃)进行,尽管它可以在一个温度范围上进行,诸如10℃至40℃。
任选地,可以将酶在与样品接触之前固定至或固定化入支持层以便于测定法。支持层的例子包括玻璃或塑料,例如微量滴定板,玻璃显微镜载片或盖片,棍,珠,或微珠,膜(例如在测试条中使用)和生物传感器层形式的。
样品可以是怀疑含有3-HB的任何样品,特别是来自受试者的样品。术语“来自受试者的样品”包括自任何给定受试者,特别是人分离的所有生物学流体,排泄物和组织。在本发明的背景中,此类样品包括但不限于血液,血清,血浆,乳头抽吸物,尿液,精液,精水,精浆,前列腺液,排泄物,泪液,唾液,汗液,活检,腹水,脑脊液,乳液,淋巴,支气管和其它灌洗样品,或组织提取物样品。优选地,该受试者是动物(包括人),更加优选哺乳动物,仍然更加优选人。优选地,该样品是体液,特别是血液样品或尿液样品。
典型地,血液样品是在本发明的背景中使用的优选测试样品。为此,可以自静脉采集血液,通常是肘的内侧或手的背侧或指尖。特别地,在婴儿或幼童中,可以使用称作刺血针的尖锐工具来刺破皮肤并使之出血。可以将血液收集到例如移液管或套管中,或载片或测试条上。
在接触和3-HB转变(如果存在的话)后,测定由3-HBDH介导的NAD或衍生物的氧化还原状态的变化,由此测定样品中的3-HB。显然,所生成的NADH或其衍生物的量和所消耗的NAD或其衍生物的量与样品中存在的3-HB的量有关。因而,NAD的氧化还原状态的变化包括测定NAD和/或NADH的量或浓度以及二者的比。同样应用于NAD衍生物。
本领域知道多种用于测定NADH/NAD或其衍生物的方法,而且可以使用这些中的任一项。
用于测定NADH/NAD或其衍生物的例示性方法包括电化学方法(例如如US 6,541,216中描述的)或光学方法(例如通过测量NAD/NADH转变,这通过例如340nm或365nm处的光吸收或通过基于还原酶的测定法,其形成萤光素,然后光学量化)。如果使用电化学方法,那么a)可以使NADH/NAD或其衍生物在测量电极上直接反应或b)NADH/NAD或其衍生物在第一个步骤中与另外的氧化还原介导物反应(它以与NADH/NAD或其衍生物的氧化还原状态的限定关系改变它的氧化还原状态),并且此氧化还原介导物在后续步骤中在测量电极上反应。
NAD和NADP均是碱基不安定分子,其降解路径在文献中有描述(参见例如N.J.Oppenheimer in The Pyridine Nucleotide Coenzymes Academic Press,New York,London 1982,J.Everese,B.Anderson,K.Yon,Editors,chapter 3,pages 56-65)。因此,已经开发且可商购NADH/NAD的衍生物。一些衍生物描述于the Pyridine NucleotideCoenzymes,Academic Press New York,London 1982,Eds.J.Everese,B.Anderson,K.You,Chapter 4;WO 01/94370;WO 98/33936;和US 5,801,006。
优选地,使用卡巴-NAD(cNAD)作为NAD的衍生物。在卡巴-NAD中,核糖受到一个卡巴环(carbacyclic)糖单元取代。卡巴-NAD具有下面的结构(I):
该化合物,其生成和用途详细描述于WO 2007/012494,WO 2011/012270和WO2014/195363。本发明中的辅因子优选是卡巴-NAD。在本发明的一个实施方案中,辅因子是明确援引的WO 2011/012270的式III中公开的NAD的功能活性衍生物。在本发明的一个实施方案中,使用NADP代替NAD。
本发明的方法可以在所谓的液体或湿测试中,例如在小杯中,或作为所谓的干测试在适宜的试剂载体上进行,必需的测试试剂由此存在于固体载体中或上,优选可吸收或可膨胀材料。
或者/另外,3-HBDH可以是传感器,测试条,测试元件,测试条装置或液体测试的一部分。
传感器是测量物理/化学数量并将它转变成能由观察者或通过仪器读出的信号的实体。在本发明中,3-HBDH可以是传感器的一部分。传感器将3-HB和NAD或其衍生物转变成乙酰乙酸和NADH或其衍生物,其进一步转变成信号,诸如颜色的变化或例如在显示器或监视器上显示的值。
在一个实施方案中,传感器可包含3-HBDH和电流测定装置以测定样品中的3-HB。还有,可使用与电化学流动室偶联的微量透析系统进行样品或受试者中3-HB的连续监测。流动室的工作电极可以用电极表面上的氧化还原聚合物膜中固定化的3-HBDH准备。电化学3-HB传感器与微量透析直接偶联消除对将样品等分试样转移至具有柱后氧化酶反应物的液体层析系统的需要。来自微量透析探针的透析液中的3-HB可以在酶电极处选择性检测,没有来自其它氧化种类的任何显著干扰。而且,酶偶联的生物传感器在本领域已有描述。照此,可以将3-HBDH偶联至表面(例如通过将3-HBDH/石墨混合物印刷到电镀石墨垫上或通过在碳粒,镀铂碳粒,碳/锰二氧化物颗粒,玻璃状碳上吸附或固定化突变体3-HBDH,或将它与碳糊电极混合等)。
测试条或测试元件是用于测定样品内靶物质的存在和/或数量的分析或诊断装置。标准测试条可包含一个或多个不同反应区带或垫,其包含在与样品接触时起反应(例如改变颜色)的试剂。测试条在例如来自US 6,541,216,EP 262445和US 4816224的许多实施方案中是已知的。普遍知道进行测定方法需要的一种或多种试剂(例如酶)存在于固体载体层上或中。作为载体层,尤其优选可吸收和/或可膨胀材料,它们被要分析样品液体弄湿。例子包括明胶,纤维素和合成纤维羊毛状物层。
本发明的3-HBDH还可以是液体测试的一部分。液体测试是其中测试成分在液体介质中反应的测试。通常,在实验室分析学领域,液体试剂基于水,例如缓冲盐溶液以提供所涉及的酶的活性。液体通常适合具体预定用途。为了进行液体测试,所有测试成分在液体中溶解并组合(或反之依然)。用于进行此类测试的典型容器包括管形瓶,多孔板,小杯,器皿(vessel),试剂杯,管等。
在本发明的一个实施方案中,可以将本发明的3-HBDH固定化。固定化的典型方法包括共价结合至例如膜,封装在聚合物中,交联至支持性基质或固定化在溶胶-凝胶基质(例如玻璃,诸如硅酸盐玻璃)中或吸附到多孔基底上。适合于固定化酶的方法是本领域知道的(参见例如Lillis et al.,2000,Sensors and Actuators B 68:109-114)。
在本发明的一个优选实施方案中,该方法进一步包括测定葡萄糖的量或浓度。在本发明的另一个实施方案中,该方法包括测定丙酮和/或乙酰乙酸的量或浓度;和/或测定葡萄糖的量或浓度。测定这些化合物在诊断上述疾病和医学状况中特别相关。用于测定这些化合物的方法是本领域公知的。另外,用于多重分析物分析的系统和方法参见WO 2014/068024。
相应地和优选地,本发明的方法进一步特征在于
a)其中测定NAD或其衍生物的氧化还原状态的变化包括测定(i)NAD或其衍生物和/或(ii)NADH或其衍生物的浓度;和/或
b)其中测定NAD或其衍生物的氧化还原状态的变化是电化学地或光学地;和/或
c)其中该方法进一步包括测定乙酰乙酸和/或丙酮的量或浓度;和/或
d)其中该方法进一步包括测定葡萄糖的量或浓度;和/或
e)其中该NAD的衍生物是卡巴-NAD;和/或
f)其中该突变体3-HBDH是传感器,测试条,测试元件,测试条装置或液体测试的一部分;和/或
g)其中该样品是体液,特别是血液样品或尿液样品。
在仍有另一个方面,本发明涉及本发明的突变体3-HBDH用于测定样品中3-羟基丁酸的量或浓度的用途。
就本发明的用途而言,要提到本公开文本的其它方面的背景中使用的术语,例子和具体实施方案,它们也适用于这个方面。特别地,依照本发明的突变体3-HBDH可以如关于本发明的方法详述地那样使用。
还有,在另一个方面,本发明涉及一种用于测定样品中3-羟基丁酸的量或浓度的装置,其包含本发明的突变体3-HBDH和任选的所述测定需要的别的成分。
就本发明的装置而言,要提到本公开文本的其它方面的背景中使用的术语,例子和具体实施方案,它们也适用于这个方面。特别地,依照本发明的突变体3-HBDH可以如上文详述地那样使用。
本发明的3-HBDH可以是用于测定样品中的3-HB的装置的一部分。该装置可以是适用于这个目的的任何装置。该装置可以是可用于测定3-HB的机器或工具。优选地,该装置是传感器,优选电化学传感器,或测试条。上文和下面描述例示性装置:
该装置可以是传感器,例如生物传感器,它是组合生物学成分(这里是依照本发明的3-HBDH)与检测剂成分,特别是物理化学检测剂成分,用于检测分析物的分析装置。
生物传感器对于自生物学样品,特别是血液测定各种分析物(包括3-HB)的浓度是特别有用的。基于电化学测试条格式的例示性生物传感器描述于美国专利No.5,413,690;5,762,770和5,997,817。
在本发明的(生物)传感器中,在3-HBDH和NAD或衍生物存在下3-HB转变成乙酰乙酸及NAD或衍生物的氧化还原状态的变化可以通过换能器或检测器元件来监测。
特别地,3-HB传感器已经与其它传感器组合,例如用于测定葡萄糖,丙酮,乙酰乙酸,胆固醇,甘油三酯,脲,血气或电解质等。显然,本发明的突变体3-HBDH也可用于这些多分析物装置。
如上文详述的,该传感器优选是电化学或光学传感器。电化学传感器基于化学信号(在这里是3-HB的存在)翻译成电信号(例如电流)。合适的电极能以电信号测量3-HB介导的NADH或其衍生物生成。
合适的光学传感器能测量3-HBDH介导的NAD或其衍生物的氧化还原状态变化。信号可以是NAD/NADH介导的光的吸收/发射。
在本发明的3-HBDH以外,本发明的装置还可包含所述测定需要或有用的一种或多种别的成分,诸如其它试剂。该成分可以是本发明的方法和装置的背景中描述的那些中的任一项。另外,这可以包括指导手册,刺血针装置,毛细吸管,别的酶,底物和/或对照溶液等。
优选地,本发明的装置特征在于该装置是或包含传感器,优选电化学传感器或光学传感器,或测试条,特别是测试条和/或容许测定样品中葡萄糖的量或浓度。就本发明的装置而言,还要提到上文描述的术语,例子和具体实施方案。
除非另有定义,本文中使用的所有技术和科学术语和任何首字母缩写具有与本发明所属领域的普通技术人员的普遍理解相同的含义。分子生物学的常用术语的定义可以见Benjamin Lewin,Genes V,Oxford University Press出版,1994(ISBN 0-19-854287-9);Kendrew et al.(eds.),The Encyclopedia of Molecular Biology,Blackwell ScienceLtd.出版,1994(ISBN 0-632-02182-9);和Robert A.Meyers(ed.),Molecular Biologyand Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference,VCH Publishers,Inc.出版,1995(ISBN 1-56081-569-8)。
本发明并不限于本文中描述的特定方法,方案,和试剂,因为它们可以变化。虽然与本文中描述的相似或等同的任何方法和材料可用于实施本发明,但是本文中描述了优选的方法和材料。而且,本文中使用的术语仅仅用于描述特定实施方案的目的且并不意图限制本发明的范围。
如本文和所附权利要求书中使用的,单数形式“一个”,“一种”,和“该”包括复数所指物,除非上下文另有明确说明。类似地,词语“包含”,“含有”和“涵盖”要囊括而非排外地解读。类似地,词语“或”意图包括“和”,除非上下文另有明确说明。术语“多数”指2或更多。
下面的实施例意图例示本发明的各个实施方案。因此,所讨论的具体修饰不解释为限制本发明的范围。对本领域技术人员会是显而易见的是,可以在不背离本发明的范围的情况下进行各种等同,变化,和修饰,而且,因而理解此类等同实施方案包括在本文中。
实施例
实施例1:建立3-HBDH突变体的文库
通过分子生物学的常用方法,合成来自类球红细菌的3-羟基丁酸脱氢酶(3-HBDH)的基因(Database UniProtKB-D0VWQ0),克隆入载体pKKt5并转化入大肠杆菌菌株XL-1Blue。
在该酶的许多氨基酸位置上应用饱和诱变。诱变是通过与QuikChange定点诱变试剂盒(Agilent Technologies目录200518)一起应用随机合成引物而实现的。
用于诱变的5′和3′引物彼此互补且含有NNN(随机合成寡核苷酸),用于中心位置中的氨基酸交换。此随机创建密码子的侧翼是每端12至16个核苷酸。这些核苷酸的序列与氨基酸替代的密码子侧翼的cDNA链或互补cDNA链同一。通过将突变基因转化入大肠杆菌菌株Xl-Blue并在琼脂板上于37℃培养过夜来创建突变体文库。
实施例2:测定来自第一轮诱变的3-HBDH突变体(具有单一氨基酸替代的突变体)的特性
对如实施例1中所述生成的3-HBDH突变体文库筛选下述酶特性:
-热稳定性
-对3-羟基丁酸的亲和力
-对c-NAD(卡巴-NAD=人工辅因子,参见US20120130062A1)的亲和力
将上文所述琼脂板上的突变体菌落挑取入装有200μl LB-氨苄青霉素培养基/孔的微量滴定板并于37℃温育过夜。这些板称作母板。对于每一个氨基酸位置,挑取两块母板以确保包括每一种可能的交换。
自每一块母板转移40μl样品/孔至装有200μl 0.1%Triton X-100;500mM NaCl;200mM Hepes pH 9.0;2%B-Per/孔(B-PER=细菌蛋白质提取试剂Pierce No.78248)的微量滴定板并于40℃温育30分钟进行细胞破坏。此板称作工作板。
自工作板转移4x 20μl样品/孔至四块空的微量滴定板。这些之一用62.22mM 3-羟基丁酸;4.15mM cNAD;0.1%Triton X-100;200mM Hepes pH 9.0于室温测试并称作参照测量。其它微量滴定板在不同条件下测试并将所获得的数值与参照板比较,以百分比计。
测量下述参数:
-热稳定性:将微量滴定板于50℃温育30分钟(除非另外指明),之后用62.22mM 3-羟基丁酸;4.15mM cNAD;0.1%Triton X-100;200mMHepes pH 9.0测试
-对3-羟基丁酸的亲和力:底物量减少(即低于底物饱和)的活性测定法。用1.94mM3-羟基丁酸;4.15mM cNAD;0.1%Triton X-100;200mMHepes pH 9.0测量
-对cNAD的亲和力:辅因子量减少(即低于饱和)的活性测定法。用62.22mM 3-羟基丁酸;0.032mM cNAD;0.1%Triton X-100;200mM Hepes pH 9.0测量
于室温于340nm对酶促反应监测5分钟并对每一块工作板中的每一个空腔计算dE/min。将来自参照测量的值设置为100%活性。将用其它三块板(热稳定性,对3-羟基丁酸或cNAD的亲和力)获得的值与参照比较并以百分比活性((dE/min参数/dE/min参照)*100)计算。每一块母板在突变体以外还含有野生型酶作为对照以更好地评估特性的改善或恶化。
如下计算以剩余活性表述的热稳定性:
用突变体获得的值比用野生型酶获得的值要高代表突变体的热稳定性升高。
如下计算以活性比表述的底物亲和力:
当与更少底物(低于底物饱和)反应时,具有更高底物亲和力的突变体会显示比具有更低底物亲和力的突变体更高的活性。用突变体获得的值比用野生型酶获得的值要高代表突变体的底物亲和力升高。
相应计算以活性比表述的辅因子亲和力:
将低于0.001dE/min的数据设置为零,产生“零”值。
相对于野生型酶的结果在表1A和1B中汇总。
在第一轮饱和诱变中发现了下述突变体。
表1A:各种单一突变体相对于称作WT的野生型3-HBDH的热稳定性和亲和力
(+=改善;o=相似;-=降低;nt=未测试)
表1B:3-HBDH的各种单一突变体的热稳定性和亲和力
*作为与1.94/62.22mM 3-HB和0.032/4.15mM cNAD的活性比(%)给出
**作为于50℃温育30分钟后的剩余活性(%)给出
表显示了热稳定性改善常常对底物和/或辅因子亲和力有影响。发现四个位置改善稳定性和亲和力参数二者:SEQ ID NO:1的位置125,144,232和250。
选择具有交换V250M的例示性突变体用于通过组合找到的另外位置的进一步优化。
实施例3:自第二轮诱变(具有氨基酸替代V250M/I和任选的别的氨基酸替代的突变体)筛选3-HBDH突变体
除非另外指明,如实施例2中详述地进行实验。在第二轮诱变中,将选定的替代组合入变体WT+V250M中。结果在表2A和2B中汇总:
表2A:多种具有氨基酸替代V250M或V250I的突变体的热稳定性(54℃,30分钟)和亲和力
*作为与1.94/62.22mM 3-HB和0.032/4.15mM cNAD的活性比(%)给出
**作为于54℃温育30分钟后的剩余活性(%)给出(除非另外指明)
nt未测试
表2A显示多重替代(在V250M以外)显示进一步升高的稳定性。对突变体WT+G230L+V250M,WT+F37Y+V250M,WT+F37Y+G230L+V250M和WT+D202G+G230L+V250M特别感兴趣,因为它们还显示较好的3-HB亲和力。
将例示性变体WT+F37Y+G230L+V250M与找到的其它位置进一步组合。结果在表2B中汇总:
表2B:多种具有氨基酸替代F37Y,G230L和V250M的突变体的热稳定性(64℃,30分钟)和亲和力
*作为与1.94/62.22mM 3-HB和0.032/4.15mM cNAD的活性比(%)给出
**作为于64℃温育30分钟后的剩余活性(%)给出
表2B显示突变体WT+F37Y+G230L+V250M的稳定性可通过添加替代P195Q或A145G来进一步提高,它们还显示可接受的3-HB和cNAD亲和力。
序列
序列表
<110> 豪夫迈·罗氏有限公司(F. Hoffmann-La Roche AG)
<120> 来自类球红细菌的突变体3-羟基丁酸脱氢酶及其相关方法和用途
<130> R69993PC
<160> 11
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 257
<212> PRT
<213> 类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)
<400> 1
Met Asp Leu Asn Gly Lys Arg Ala Ile Val Thr Gly Ser Asn Ser Gly
1 5 10 15
Ile Gly Leu Gly Cys Ala Glu Glu Leu Ala Arg Ala Gly Ala Glu Val
20 25 30
Val Ile Asn Ser Phe Thr Asp Arg Asp Glu Asp His Ala Leu Ala Glu
35 40 45
Lys Ile Gly Arg Glu His Gly Val Ser Cys Arg Tyr Ile Ala Ala Asp
50 55 60
Met Ser Asp Gly Glu Ala Cys Arg Ala Leu Ile Glu Thr Ala Gly Gly
65 70 75 80
Cys Asp Ile Leu Val Asn Asn Ala Gly Ile Gln His Val Ser Ser Ile
85 90 95
Glu Glu Phe Pro Val Gly Lys Trp Asn Ala Ile Leu Ala Ile Asn Leu
100 105 110
Ser Ser Ala Phe His Thr Thr Ala Ala Ala Leu Pro Gly Met Arg Ala
115 120 125
Lys Gly Trp Gly Arg Ile Val Asn Ile Ala Ser Ala His Gly Leu Thr
130 135 140
Ala Ser Pro Tyr Lys Ser Ala Tyr Val Ala Ala Lys His Gly Val Val
145 150 155 160
Gly Phe Thr Lys Val Thr Ala Leu Glu Thr Ala Gly Lys Gly Ile Thr
165 170 175
Cys Asn Ala Ile Cys Pro Gly Tyr Val Leu Thr Pro Leu Val Glu Ala
180 185 190
Gln Ile Pro Asp Gln Met Lys Ala His Asp Met Asp Arg Glu Thr Val
195 200 205
Ile Arg Glu Val Met Leu Asp Arg Gln Pro Ser Arg Gln Phe Ala Thr
210 215 220
Thr Gly Gln Ile Gly Gly Thr Val Val Phe Leu Cys Ser Gly Ala Ala
225 230 235 240
Asp Gln Ile Thr Gly Thr Thr Ile Ser Val Asp Gly Gly Trp Thr Ala
245 250 255
Leu
<210> 2
<211> 257
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变体3-HBDH
<400> 2
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Ile Gly Leu Gly Cys Ala Glu Glu Leu Ala Arg Ala Gly Ala Glu Val
20 25 30
Val Ile Asn Ser Phe Thr Asp Arg Asp Glu Asp His Ala Leu Ala Glu
35 40 45
Lys Ile Gly Arg Glu His Gly Val Ser Cys Arg Tyr Ile Ala Ala Asp
50 55 60
Met Ser Asp Gly Glu Ala Cys Arg Ala Leu Ile Glu Thr Ala Gly Gly
65 70 75 80
Cys Asp Ile Leu Val Asn Asn Ala Gly Ile Gln His Val Ser Ser Ile
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100 105 110
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Ala Ser Pro Tyr Lys Ser Ala Tyr Val Ala Ala Lys His Gly Val Val
145 150 155 160
Gly Phe Thr Lys Val Thr Ala Leu Glu Thr Ala Gly Lys Gly Ile Thr
165 170 175
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195 200 205
Ile Arg Glu Val Met Leu Asp Arg Gln Pro Ser Arg Gln Phe Ala Thr
210 215 220
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Leu
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变体3-HBDH
<400> 3
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Ile Gly Leu Gly Cys Ala Glu Glu Leu Ala Arg Ala Gly Ala Glu Val
20 25 30
Val Ile Asn Ser Phe Thr Asp Arg Asp Glu Asp His Ala Leu Ala Glu
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Met Ser Asp Gly Glu Ala Cys Arg Ala Leu Ile Glu Thr Ala Gly Gly
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Lys Gly Trp Gly Arg Ile Val Asn Ile Ala Ser Ala His Gly Leu Arg
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Ala Ser Pro Tyr Lys Ser Ala Tyr Val Ala Ala Lys His Gly Val Val
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Leu
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<211> 257
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变体3-HBDH
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Ile Gly Leu Gly Cys Ala Glu Glu Leu Ala Arg Ala Gly Ala Glu Val
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Ala Ser Pro Tyr Lys Ser Ala Tyr Val Ala Ala Lys His Gly Val Val
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<211> 257
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变体3-HBDH
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100 105 110
Ser Ser Ala Phe His Thr Thr Ala Ala Ala Leu Pro Gly Met Arg Ala
115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
Gly Phe Thr Lys Val Thr Ala Leu Glu Thr Ala Gly Lys Gly Ile Thr
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225 230 235 240
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245 250 255
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<211> 257
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变体3-HBDH
<400> 6
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Ile Gly Leu Gly Cys Ala Glu Glu Leu Ala Arg Ala Gly Ala Glu Val
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Val Ile Asn Ser Phe Thr Asp Arg Asp Glu Asp His Ala Leu Ala Glu
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<213> 人工序列
<220>
<223> 突变体3-HBDH
<400> 7
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Ile Gly Leu Gly Cys Ala Glu Glu Leu Ala Arg Ala Gly Ala Glu Val
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<220>
<223> 突变体3-HBDH
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Val Ile Asn Ser Tyr Thr Asp Arg Asp Glu Asp His Ala Leu Ala Glu
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<213> 人工序列
<220>
<223> 突变体3-HBDH
<400> 9
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<210> 10
<211> 257
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变体3-HBDH
<400> 10
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Glu Glu Phe Pro Val Gly Lys Trp Asn Ala Ile Leu Ala Ile Asn Leu
100 105 110
Ser Ser Ala Phe His Thr Thr Ala Ala Ala Leu Pro Gly Met Arg Ala
115 120 125
Lys Gly Trp Gly Arg Ile Val Asn Ile Ala Ser Ala His Gly Leu Thr
130 135 140
Gly Ser Pro Tyr Lys Ser Ala Tyr Val Ala Ala Lys His Gly Val Val
145 150 155 160
Gly Phe Thr Lys Val Thr Ala Leu Glu Thr Ala Gly Lys Gly Ile Thr
165 170 175
Cys Asn Ala Ile Cys Pro Gly Tyr Val Leu Thr Pro Leu Val Glu Ala
180 185 190
Gln Ile Pro Asp Gln Met Lys Ala His Asp Met Asp Arg Glu Thr Val
195 200 205
Ile Arg Glu Val Met Leu Asp Arg Gln Pro Ser Arg Gln Phe Ala Thr
210 215 220
Thr Gly Gln Ile Gly Leu Thr Val Val Phe Leu Cys Ser Gly Ala Ala
225 230 235 240
Asp Gln Ile Thr Gly Thr Thr Ile Ser Met Asp Gly Gly Trp Thr Ala
245 250 255
Leu
<210> 11
<211> 257
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变体3-HBDH
<400> 11
Met Asp Leu Asn Gly Lys Arg Ala Ile Val Thr Gly Ser Asn Ser Gly
1 5 10 15
Ile Gly Leu Gly Cys Ala Glu Glu Leu Ala Arg Ala Gly Ala Glu Val
20 25 30
Val Ile Asn Ser Tyr Thr Asp Arg Asp Glu Asp His Ala Leu Ala Glu
35 40 45
Lys Ile Gly Arg Glu His Gly Val Ser Cys Arg Tyr Ile Ala Ala Asp
50 55 60
Met Ser Asp Gly Glu Ala Cys Arg Ala Leu Ile Glu Thr Ala Gly Gly
65 70 75 80
Cys Asp Ile Leu Val Asn Asn Ala Gly Ile Gln His Val Ser Ser Ile
85 90 95
Glu Glu Phe Pro Val Gly Lys Trp Asn Ala Ile Leu Ala Ile Asn Leu
100 105 110
Ser Ser Ala Phe His Thr Thr Ala Ala Ala Leu Pro Gly Met Arg Ala
115 120 125
Lys Gly Trp Gly Arg Ile Val Asn Ile Ala Ser Ala His Gly Leu Thr
130 135 140
Ala Ser Pro Tyr Lys Ser Ala Tyr Val Ala Ala Lys His Gly Val Val
145 150 155 160
Gly Phe Thr Lys Val Thr Ala Leu Glu Thr Ala Gly Lys Gly Ile Thr
165 170 175
Cys Asn Ala Ile Cys Pro Gly Tyr Val Leu Thr Pro Leu Val Glu Ala
180 185 190
Gln Ile Gln Asp Gln Met Lys Ala His Asp Met Asp Arg Glu Thr Val
195 200 205
Ile Arg Glu Val Met Leu Asp Arg Gln Pro Ser Arg Gln Phe Ala Thr
210 215 220
Thr Gly Gln Ile Gly Leu Thr Val Val Phe Leu Cys Ser Gly Ala Ala
225 230 235 240
Asp Gln Ile Thr Gly Thr Thr Ile Ser Met Asp Gly Gly Trp Thr Ala
245 250 255
Leu
Claims (15)
1.一种相对于野生型3-HBDH性能改善的来自类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)的突变体3-羟基丁酸脱氢酶(3-HBDH),其中该突变体包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列(来自类球红细菌的3-HBDH;野生型3-HBDH)至少80%同一的氨基酸序列且
其中该突变体相对于野生型3-HBDH具有与SEQ ID NO:1的位置250对应的位置处的至少一处氨基酸替代。
2.权利要求1的突变体3-HBDH,其中与SEQ ID NO:1的位置250对应的位置处的氨基酸用Met(250Met)或Ile(250Ile),特别是用Met(250Met)替代。
3.权利要求1或2的突变体3-HBDH,其中该突变体具有至少一处与SEQ ID NO:1的位置66,109 113,125,140,144,145,195,197,217,223,232,239和/或257,特别是至少SEQ IDNO:1的位置125,144和/或232,更加特别是至少SEQ ID NO:1的位置125和/或144对应的一个或多个位置处的别的氨基酸替代。
4.权利要求3的突变体3-HBDH,其中
-与SEQ ID NO:1的位置66对应的位置处的氨基酸用Tyr(66Tyr)或Asn(66Asn)替代;
-与SEQ ID NO:1的位置109对应的位置处的氨基酸用Glu(109Glu)替代;
-与SEQ ID NO:1的位置113对应的位置处的氨基酸用Thr(113Thr)替代;
-与SEQ ID NO:1的位置125对应的位置处的氨基酸用Phe(125Phe)替代;
-与SEQ ID NO:1的位置140对应的位置处的氨基酸用Val(140Val)替代;
-与SEQ ID NO:1的位置144对应的位置处的氨基酸用Arg(144Arg)替代;
-与SEQ ID NO:1的位置145对应的位置处的氨基酸用Gly(145Gly)替代;
-与SEQ ID NO:1的位置195对应的位置处的氨基酸用Gln(195Gln)或Leu(195Leu)替代;
-与SEQ ID NO:1的位置197对应的位置处的氨基酸用Ile(197Ile)替代;
-与SEQ ID NO:1的位置217对应的位置处的氨基酸用Val(217Val)替代;
-与SEQ ID NO:1的位置223对应的位置处的氨基酸用Val(223Val)替代;
-与SEQ ID NO:1的位置232对应的位置处的氨基酸用Cys(232Cys),Tyr(232Tyr),或Trp(232Trp),尤其是232Cys替代;
-与SEQ ID NO:1的位置239对应的位置处的氨基酸用Tyr(239Tyr)或Trp(239Trp)替代;
-与SEQ ID NO:1的位置250对应的位置处的氨基酸用Met(250Met)替代;和/或
-与SEQ ID NO:1的位置257对应的位置处的氨基酸用Met(257Met)或Gln(257Gln)替代。
5.权利要求4的突变体,其中
-与SEQ ID NO:1的位置37对应的位置处的氨基酸用Tyr(37Tyr)替代;
-与SEQ ID NO:1的位置202对应的位置处的氨基酸用Gly(202Gly)替代,和/或
-与SEQ ID NO:1的位置230对应的位置处的氨基酸用Leu(230Leu)替代;
特别是与250Met组合。
6.权利要求3至5任一项的突变体3-HBDH,
a)其中该突变体3-HBDH具有与SEQ ID NO:1的位置对应的突变
-125Phe;
-144Arg;
-232Cys;
-250Met;
-230Leu和250Met;
-37Tyr和250Met;
-37Tyr,230Leu和250Met;
-202Gly,230Leu和250Met;
-37Tyr,145Gly,230Leu和250Met;和/或
-37Tyr,195Gln,230Leu和250Met;或
b)其中该突变体3-HBDH只具有与SEQ ID NO:1的位置对应的突变
-250Met;
-230Leu和250Met;
-37Tyr和250Met;
-37Tyr,230Leu和250Met;
-202Gly,230Leu和250Met;
-37Tyr,145Gly,230Leu和250Met;或
-37Tyr,195Gln,230Leu和250Met。
7.权利要求1至6任一项的突变体3-HBDH,其中该突变体3-HBDH包含与SEQ ID NO:1至11任一项的氨基酸序列至少85%,90%,95%,96%,97%,98%,或99%同一的氨基酸序列或由其组成,
特别是其中该突变体3-HBDH包含选自由SEQ ID NO:5至11组成的组的序列或由其组成。
8.权利要求1至7任一项的突变体3-HBDH,其中相对于野生型3-HBDH的性能改善是
-相对于野生型3-HBDH,稳定性升高,尤其是热稳定性;和/或
-相对于野生型3-HBDH,底物亲和力升高,尤其是对于3-羟基丁酸;和/或
-相对于野生型3-HBDH,辅因子亲和力升高,尤其是对于NAD或其衍生物,特别是其中该衍生物是卡巴-NAD(carba-NAD)。
9.权利要求8的突变体3-HBDH,
特征在于该突变体3-HBDH具有相对于野生型3-HBDH升高至少2倍的稳定性,优选升高至少3倍的稳定性,优选升高至少4倍的稳定性,更加优选升高至少5倍的稳定性;和/或
特征在于该突变体3-HBDH具有相对于野生型3-HBDH升高的底物和/或辅因子亲和力,特别是升高的对于(i)3-羟基丁酸和/或(ii)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)或其功能活性衍生物的亲和力和/或特别是其中该底物和/或辅因子亲和力升高至少5%,更加特别是至少10%,仍然更加特别是至少15%或20%。
10.一种核酸,其编码权利要求1至9任一项的突变体3-HBDH。
11.一种细胞,其包含权利要求1至9任一项的突变体3-HBDH或权利要求10的核酸。
12.一种测定样品中3-羟基丁酸的量或浓度的方法,该方法包括
a)在有益于3-HBDH活性的条件下使该样品与权利要求1至9任一项的突变体3-HBDH接触;
b)使3-羟基丁酸与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)或其功能活性衍生物反应;并
c)测定NAD或其衍生物的氧化还原状态的变化;
由此测定该样品中3-羟基丁酸的量或浓度。
13.权利要求12的方法,
a)其中测定NAD或其衍生物的氧化还原状态的变化包括测定(i)NAD或其衍生物和/或(ii)NADH或其衍生物的浓度;和/或
b)其中测定NAD或其衍生物的氧化还原状态的变化是电化学地或光学地;和/或
c)其中该方法进一步包括测定乙酰乙酸和/或丙酮的量或浓度;和/或
d)其中该方法进一步包括测定葡萄糖的量或浓度;和/或
e)其中该NAD的功能活性衍生物是卡巴-NAD;和/或
f)其中该突变体3-HBDH是传感器,测试条,测试元件,测试条装置或液体测试的一部分;和/或
g)其中该样品是体液,特别是血液样品或尿液样品。
14.一种用于测定样品中3-羟基丁酸的量或浓度的装置,其包含权利要求1至9任一项的突变体3-HBDH和任选的所述测定需要的别的成分。
15.权利要求14的装置,
a)其中该装置是或包含传感器,优选电化学传感器或光学传感器,或测试条,特别是测试条和/或
b)其中该装置进一步容许测定该样品中葡萄糖的量或浓度。
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