CN101040044B - 吡咯并喹啉醌依赖性葡糖脱氢酶的热稳定突变体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种PQQ依赖性s-GDH突变蛋白，其特征在于在122位和124位中的至少一个中存在氨基酸赖氨酸，其中这些位置对应于由乙酸钙不动杆菌(A.calcoaceticus)s-GDH野生型序列(SEQ ID NO：2)已知的氨基酸位置。本发明还公开了编码这种突变s-GDH的基因，以及这些s-GDH突变体的不同用途，具体地说是用于测定样品中的葡萄糖浓度的用途。

Description

吡咯并喹啉醌依赖性葡糖脱氢酶的热稳定突变体
本发明涉及一种PQQ依赖性s-GDH突变蛋白，其特征在于在122位和124位中的至少一个中存在氨基酸赖氨酸，其中这些位置对应于由乙酸钙不动杆菌(A.calcoaceticus)s-GDH野生型序列(SEQ ID NO：2)已知的氨基酸位置，本发明还公开了此突变s-GDH的编码基因以及这些s-GDH突变体的不同用途，特别是测定样品中葡萄糖浓度的用途。
发明领域：
血糖浓度测定在糖尿病的临床诊断和管理中极为重要。全世界约1.5亿人患慢性病糖尿病，据WHO推测至2025年数字会加倍。尽管糖尿病易于诊断和治疗，但连续的长期管理需要快速且精确地报告血糖浓度的低成本诊断工具。PQQ依赖性葡糖脱氢酶(EC 1.1.5.2)催化其中葡萄糖被氧化为葡糖酸内酯的反应。因此，该类型酶用于检测血糖。这些工具中的一种是基于可溶性葡糖脱氢酶(s-GlucDOR，EC 1.1.5.2)的诊断条，所述可溶性葡糖脱氢酶是一种最初来源于乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)的含吡咯并喹啉醌的酶。
醌蛋白利用醌作为辅因子以将醇、胺和醛糖氧化成它们相应的内酯、醛和醛糖酸(aldolic acid)(Duine，J .A.，Energy generation and theglucose dehydrogenase pathway in Acinetobacter，载于“The Biology ofAcinetobacter”(1991)295-312，New York，Plenum Press；Duine，J.A.，EurJ Biochem 200(1991)271-84，Davidson，VL.，“Principles andapplications of quinoprotems”(1993)，全书，New York，Marcel Dekker；Anthony，C.，Biochem.J.320(1996)697-711；Anthony，C.和Ghosh，M.，Current Science 72(1997)716-727；Anthony，C.，Biochem.Soc.Trans.26(1998)413-417；Anthony，C.和Ghosh，M.，Prog.Biophys.Mol.Biol.69(1998)1-21)。在醌蛋白中，含有非共价结合辅因子2，7，9-三羧基-1H-吡咯并[2，3-f]喹啉-4，5-二酮(PQQ)的醌蛋白构成最大的亚组(Duine1991，参见上文)。迄今为止已知的所有细菌醌葡糖脱氢酶都属于该亚组，其中PQQ为辅因子(Anthony和Ghosh 1997，参见上文；Goodwin，P.M.和Anthony，C.，Adv.Microbiol.Physiol.40(1998)1-80；Anthony，C.，Adv.in Phot.and Resp.15(2004)203-225)。
两种类型的PQQ依赖性葡糖脱氢酶(EC 1.1.5.2)已在细菌中被表征：一种是膜结合的(m-GDH)；另一种是可溶性的(s-GDH)。两种类型均不共有任何显著的序列同源性(Cleton-Jansen，A.M.等，Mol GenGenet 217(1989)430-6；Cleton-Jansen，A.M.等，Antonie VanLeeuwenhoek 56(1989)73-9；Oubrie，A.等，Proc Natl Acad Sci USA 96(1999)11787-91)。它们在其动力学以及其免疫学特性方面也是不同的(Matsushita，K.等，Bioscience Biotechnol.Biochem.59(1995)1548-1555)。m-GDH广布于革兰氏阴性细菌中，然而，仅仅在不动杆菌属(Acinetobacter)菌株如乙酸钙不动杆菌(A.calcoaceticus)(Duine，J.A.，1991a；Cleton-Jansen，A.M.等，J.Bacteriol.170(1988)2121-2125；Matsushita和Adachi，1993)和鲍氏不动杆菌(A.baumannii)(JP 11243949)的壁膜间隙中发现了s-GDH。
通过搜索序列数据库，在大肠杆菌K-12和蓝细菌(Synechocystissp.)中已鉴定出两个与全长乙酸钙不动杆菌s-GDH同源的序列。另外，分别在铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)和百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)(Oubrie等，1999a，b，c)以及中间肠杆菌(Enterobacter intermedium)(Kim，C.H.等，Current Microbiol.47(2003)457-461)的基因组中也发现了两个与乙酸钙不动杆菌s-GDH同源的不完全序列。这四种尚未表征的蛋白质导出的氨基酸序列与乙酸钙不动杆菌s-GDH密切相关，其中位于推定活性位点的许多残基是绝对保守的。这些同源蛋白可能具有相似的结构并且催化相似的PQQ依赖性反应(Oubrie等，1999a，b，c；Oubrie A.，Biochim.Biophys.Acta1647(2003)143-151；Reddy，S.，和Bruice，T.C.，J.Am.Chem.Soc.126(2004)2431-2438；Yamada，M.等，Biochim.Biophys.Acta 1647(2003)185-192)。
已经发现细菌s-GDH和m-GDH具有相当不同的序列和不同的底物专一性。例如，乙酸钙不动杆菌含有两种不同的PQQ依赖性葡糖脱氢酶：一种称为m-GDH，在体内有活性，另一种称为s-GDH，仅可显示体外活性。Cleton-Jansen等，1988；1989a，b克隆出编码所述两种GDH酶的基因并且测定了这两种GDH基因的DNA序列。在m-GDH和s-GDH之间没有明显的同源性，证实m-GDH和s-GDH代表两种完全不同分子的事实(Laurinavicius，V.等，Biologija(2003)31-34)。
已经将得自乙酸钙不动杆菌的s-GDH基因在大肠杆菌中克隆。在被导入细胞后，s-GDH穿过细胞质膜被转运到壁膜间隙(Duine，J.A.，Energy generation and the glucose dehydrogenase pathway inAcinetobacter，载于“The Biology of Acinetobacter”(1991)295-312，NewYork，Plenum Press；Matsushita，K.和Adachi，O.，Bacterial quinoproteinsglucose dehydrogenase and alcohol dehydrogenase，载于“Principles andapplications of Quinoproteins”(1993)47-63，New York，MarcelDekker)。同得自乙酸钙不动杆菌的天然s-GDH一样，在大肠杆菌中表达的s-GDH也是一种同二聚体，其中每个单体具有一个PQQ分子和三个钙离子(Dokter，P.等，Biochem.J.239(1986)163-167；Dokter，P.等，FEMS Microbiol.Lett.43(1987)195-200；Dokter，P.等，Biochem.J.254(1988)131-138；Olsthoorn，A.J.和Duine，J.A.，Arch.Biochem.Biophys.336(1996)42-48；Oubrie，A.，等，J.Mol.Biol.289(1999)319-333；Oubrie，A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 96(1999)11787-11791；Oubrie，A等.，Embo J.18(1999)5187-5194)。s-GDH将各种单糖和二糖氧化成相应的酮，酮再进一步水解成醛糖酸，并且s-GDH还能够将电子提供给PMS(吩嗪硫酸甲酯)(phenazine metosulfate)、DCPIP(2，6-二氯酚靛酚)、WB(Wurster氏蓝)、短链泛酸例如泛醌Q1和泛醌Q2(Matsushita，K.等，Biochem.28(1989)6276-6280；Matsushita，K.等，Antonie Van Leeuwenhoek 56(1989)63-72)、某些人工电子纳体例如N-甲基二甲基苯基吡唑酮鎓硫酸甲酯(Olsthoorn，A.J.和Duine，J.A.，Arch.Biochem.Biophys.336(1996)42-48；Olsthoorn，A.J.和Duine，J.A.，Biochem.37(1998)13854-13861)和导电聚合物(Ye，L.等，Anal.Chem.65(1993)238-41)。鉴于s-GDH针对葡萄糖的高比活(Olsthoorn，A.J.和Duine，J.A.，(1996)，参见上文)及其广泛的人工电子纳体特异性，所述酶非常适合于各种分析应用，特别适合用于诊断应用中葡萄糖测定的(生物)传感器或测试条(Kaufmann，N.等，Development andevaluation of a new system for determining glucose from fresh capillaryblood and heparinized blood，载于“Glucotrend”(1997)1-16，BoehringerMannheim GmbH；Malinauskas，A.等；Sensors and Actuators，B：Chemical 100(2004)395-402)。
葡萄糖氧化可以被至少三组相当不同的酶(即NAD/P依赖性葡糖脱氢酶、黄素蛋白葡糖氧化酶或醌蛋白GDH)催化(Duine，J.A.，Biosens.Bioelectronics 10(1995)17-23)。已经观察到还原型s-GDH的相当慢的自动氧化，证明对于s-GDH而言，氧是一种非常差的电子纳体(Olsthoom和Duine，1996)。s-GDH可以有效地将电子由还原型醌提供给介导物，如PMS、DCPIP、WB和短链泛醌，例如Q1和Q2，但它不可以有效地将电子直接提供给氧。
用于监测例如糖尿病患者血液、血清和尿中葡萄糖水平的传统测试条和传感器使用葡萄糖氧化酶。该酶的性能依赖于氧浓度。在具有不同空气氧浓度的不同海拔高度进行的葡萄糖检测可产生假性结果。PQQ依赖性葡糖脱氢酶的主要优点是其与氧无关。这一重要特征例如要论于US 6,103,509，在所述专利中，对膜结合GDH的某些特征进行了研究。
对该领域的一个重要贡献是将s-GDH与合适的介导物在一起使用。基于s-GDH的测定方法和测试条装置详细地公开于US5,484,708。该专利还包含关于建立测定和用于葡萄糖测量的基于s-GDH的测试条生产的详细信息。其中所述方法以及所引用的文献中所述的方法都通过引用结合到本文中。
与该领域相关并且包含关于具有葡糖脱氢酶活性的酶的各种应用模式的具体信息的其它专利或申请是US 5,997,817、US 6,057,120、EP 620 283和JP 11-243949-A。
使用s-GDH和当发生反应时产生颜色变化的指示剂的商业系统(Kaufmann等，1997，参见上文)是由Roche Diagnostics GmbH提供的Glucotrend
Figure G05834780020070416D000051
系统。
尽管使用PQQ依赖性s-GDH有以上讨论的优点，但也不得不考虑其在葡萄糖测定中的缺点。与m-GDH相比，所述酶具有相当广的底物谱。也就是说，s-GDH不仅氧化葡萄糖，而且氧化若干其它糖类，包括麦芽糖、半乳糖、乳糖、甘露糖、木糖和核糖(Dokter等，1986a；Oubrie A.，Biochim.Biophys.Acta 1647(2003)143-151)。针对非葡萄糖的糖类的反应性在某些情况下可损害测定血糖水平的准确度。具体地说，用艾考糊精(葡萄糖聚合物)治疗的腹膜透析患者可能在其体液例如血液中含有高水平的其它糖、尤其是麦芽糖(Wens，R.等，Perit.Dial.Int.18(1998)603-609)。
因此，临床样品例如得自糖尿病患者、尤其是肾脏并发症患者且尤其是透析患者的临床样品可能含有显著水平的其它糖、尤其是麦芽糖。得自这类危急患者的样品的葡萄糖测定结果可能被麦芽糖损害(Frampton，J.E.，和Plosker，G.L，Drugs 63(2003)2079-2105)。
在文献中有关试图产生表现出底物专一性改变的修饰PQQ依赖性s-GDH的报道极少。Igarashi，S.等，Biochem.Biophys.Res.Commun.264(1999)820-824报道了在位置Glu277上引入一个点突变产生底物专一性模式改变的突变体。
Sode，EP 1 176 202报道，s-GDH中的某些氨基酸取代产生对葡萄糖的亲和性提升的突变s-GDH。在EP 1 167 519中，同一作者就稳定性提升的突变s-GDH进行了报道。此外，同一作者在JP2004173538中就对葡萄糖的亲和性提升的其它s-GDH突变体进行了报道。
Kratzsch，P.等，WO 02/34919报道，与其它糖类底物相比，尤其是与麦芽糖相比，s-GDH对葡萄糖的专一性可由s-GDH某些位置的氨基酸取代来提升。核心和关键是氨基酸位348上的置换。例如和底物麦芽糖相比，例如在348位含甘氨酸而不是野生型s-GDH中存在的苏氨酸的突变s-GDH对底物葡萄糖具有极大提升的选择性。
但是，尽管已报道了葡萄糖专一性的非常大的提升，但似乎这种提升经常与s-GDH稳定性的下降联系在一起。例如，愈发明显的是，在348位含氨基酸取代的s-GDH突变体的专一性提升损害了稳定性，尤其是损害了热稳定性。然而，稳定性例如在生产和长期储存(例如葡萄糖测试条)当中是关键。
因此，非常需要并且临床要求这种s-GDH突变形式：其特征在于合理的热稳定性，或合理的热稳定性以及对作为底物的葡萄糖的专一性提升。
本发明的任务是提供与野生型酶相比或与专一性提升但稳定性受累的突变体相比热稳定性得到显著提升的新型s-GDH突变体或变异体。
业已发现，有可能显著提升野生型s-GDH以及设计用于提升葡萄糖专一性的s-GDH突变体(例如在348位突变的s-GDH)的热稳定性，并至少部分地克服了上述问题。
通过提供如下文和所附权利要求书中详述的本发明突变s-GDH已显著提升了热稳定性。由于新型s-GDH的提升的热稳定性，所以有可能使各种应用领域中的葡萄糖测定取得显著技术进步。
本发明的改良型s-GDH突变体可以巨大优势用于生物样品中葡萄糖的特异性检测或测试，尤其是通过测试条装置或通过生物传感器进行的特异性检测或测试。
发明概述：
本发明涉及一种PQQ依赖性s-GDH突变蛋白，其特征在于在122位和124位中的至少一个中存在氨基酸赖氨酸，其中这些位置对应于由乙酸钙不动杆菌(A.calcoaceticus)s-GDH野生型序列(SEQ ID NO：2)已知的氨基酸位置。
编码本发明的s-GDH突变蛋白的多核苷酸序列以及含这种多核苷酸序列的表达载体和含所述表达载体的宿主细胞也代表本发明的优选实施方案。
本发明还涉及本发明的突变体在葡萄糖检测方法中的用途，尤其是在通过测试条装置或用生物传感器进行的葡萄糖检测方法。
提供以下实施例、参考文献、序列表和附图以有助于理解本发明，本发明的真正范围在所附权利要求书中叙述。应理解，可对所述方法进行各种修改而不违背本发明的精神。
附图简述：
图1：按照序列同源性比对的乙酸钙不动杆菌PQQ依赖性s-GDH(上面)和鲍氏不动杆菌s-GDH(下面)的蛋白质序列。
图2：在实施例1中提及的、分别含可溶性PQQ依赖性葡糖脱氢酶的野生型或突变型DNA序列的pACSGDH载体的说明。
图3：在实施例1中提及的、含可溶性PQQ依赖性葡糖脱氢酶的野生型DNA序列的pACSGDH载体的核苷酸(DNA)序列(SEQ IDNO：16)。
发明详述：
在第一个实施方案中，本发明涉及一种PQQ依赖性s-GDH的突变蛋白，其特征在于在122位和124位中的至少一个中存在氨基酸赖氨酸，其中这些位置对应于由乙酸钙不动杆菌s-GDH野生型序列(SEQ ID NO：2)已知的氨基酸位置。
如上所述，具有葡糖脱氢酶活性(膜结合的和可溶性的)的两种完全不同的醌蛋白酶类型一起被分组在EC 1.1.5.2下。这两种类型似乎互不相关。
对于本发明而言，只有可溶性形式的GDH(s-GDH)是有关的，下文讨论其改良变体。
本领域知道，可溶性PQQ依赖性葡糖脱氢酶的野生型DNA序列可以从不动杆菌属(Acinetobacter)的菌株中分离出来。最优选的是从乙酸钙不动杆菌模式菌株LMD 79.41中分离出来。该野生型s-GDH(成熟蛋白)的多肽序列和DNA序列分别在SEQ ID NO：2和SEQ IDNO：1中给出。不动杆菌属的其它LMD菌株也可以用作野生型s-GDH的来源。可以将这类序列与从乙酸钙不动杆菌中获得的序列进行序列比对，并进行序列比较。如例如以上对大肠杆菌K-12所述(Oubrie，A.等，J.Mol.Biol.289(1999)319-333)，筛选其它细菌菌株的DNA文库，以鉴定在这类基因组中与s-GDH相关的序列似乎也是可行的。可以用这类序列和尚未鉴定的同源序列来产生具有提升的热稳定性的s-GDH突变体。
通过引用由s-GDH野生型序列SEQ ID NO：2已知的氨基酸位置非常详细地描述了本发明的成果，所述s-GDH野生型序列分离自乙酸钙不动杆菌模式菌株LMD 79.41。对应于SEQ ID NO：2位置的不同s-GDH分离株中的氨基酸位置易于通过合适的序列比较鉴别。
优选运用GCG软件包10.2版(Genetics Computer Group，Inc.)的PileUp程序进行s-GDH序列与SEQ ID NO：2野生型序列的多重比对和比较。PileUp使用Feng，D.F.和Doolittle，R.F.，J.Mol.Evol.25(1987)351-360的渐进式比对法的简化形式建立多重序列比对，因此限定了用于相同、相似或不同氨基酸残基的记分矩阵。该方法以两个最相似序列的成对比对开始，产生两个比对序列的聚类。该聚类然后可与比对序列的下一个最相关序列或聚类比对。序列的两个聚类可通过两个单个序列的成对比对的简单延伸来比对。通过一系列渐进式成对比对实现最终比对，所述渐进式成对比对包含愈发不相似的序列和聚类，直至所有序列都已纳入最终的成对比对中。可见，在其它同源s-GDH分子中的氨基酸位置易于被鉴别为对应于SEQ ID NO：2中给出的乙酸钙不动杆菌s-GDH的位置。这就是本文给出的氨基酸位置应被视为SEQ ID NO：2的氨基酸位置或在另一个同源s-GDH分子中与其对应的位置的原因。
在本发明意义上，术语“突变体”或“变异体”是指与相应的野生型序列相比，在对应于SEQ ID NO：2的122位或124位表现出至少一个氨基酸取代的s-GDH蛋白，其中存在于野生型中的氨基酸被赖氨酸取代。s-GDH突变体可包含其它取代和/或缺失和/或插入，前提是本发明的s-GDH突变体与SEQ ID NO：2的s-GDH的差异不超过50个氨基酸，例如其表现出总共至多50个氨基酸取代。
如上所述，葡萄糖专一性的提升似乎在很大程度上可能以稳定性降低为代价。本领域专家会认识到，稳定性可涉及不同方面，分别例如储存温度和/或储存时间。短期温度应力模型常用于评价稳定性。本发明的稳定性以此短期温度应力模型评价，因此称为热稳定性。热稳定性通过检测样品的无应力和有应力的s-GDH酶活性来测定。通过将无应力样品活性设定为100％，应力处理后的剩余活性可以百分率计算。对于具有提升的底物专一性的s-GDH突变体，选择65℃、30分钟。使用这些条件，野生型酶剩下其原始活性的约80％，而葡萄糖专一性提升的大部分突变体在实施此短期应力模型后仅剩下其初始酶活性的10％或以下。
业已发现，s-GDH的两个位置似乎对实现热稳定性的显著提升相当关键，即122位和124位。还已经发现，只有20个天然氨基酸之一的氨基酸赖氨酸的取代才对热稳定性具有显著作用。赖氨酸在122位和/或124位的取代提升了野生型s-GDH酶的热稳定性。野生型酶无论如何也是相当稳定的，但122位和/或124位中的赖氨酸进一步提升了热稳定性。显著相关的是以下事实：业已发现这些取代还对先前为提升葡萄糖专一性但以热稳定性降低为代价而生产的突变体的热稳定性具有显著作用。
在一个优选实施方案中，本发明的s-GDH突变体在122位包含赖氨酸，所述位置对应于由乙酸钙不动杆菌野生型s-GDH(SEQ IDNO：2)已知的位置122。
在另一个优选实施方案中，本发明的s-GDH突变体在124位包含赖氨酸，所述位置对应于由乙酸钙不动杆菌野生型s-GDH(SEQ IDNO：2)已知的位置124。
在再另一个优选实施方案中，本发明的s-GDH突变体在122位和124位包含赖氨酸，所述位置分别对应于由乙酸钙不动杆菌野生型s-GDH(SEQ ID NO：2)已知的位置122和124。
如上所述，关键是可以提升葡萄糖专一性提升的s-GDH突变体(例如WO 02/34919公开的突变体)的热稳定性。业已发现并证实，这可通过在122位和/或124位以赖氨酸取代天然氨基酸完成。在一个非常优选的实施方案中，本发明因此涉及一种s-GDH突变体，其在122位和/或124位中含有赖氨酸。另外含有一个或多个产生葡萄糖专一性提升(尤其是和麦芽糖相比)的其它修饰。
本发明的一个优选突变体的特征在于，相对于分离自乙酸钙不动杆菌的s-GDH野生型酶，其对葡萄糖的底物专一性相比于至少一种其它选定糖底物提升达至少两倍，同时热稳定性是由野生型酶检测的热稳定性的至少20％。
为了计算底物专一性或交叉反应性，一种容易的方法是将用葡萄糖作为底物测量的活性定为100％，并比较用其它所选糖测量的活性和葡萄糖数值。有时为了不累赘，仅仅使用术语专一性，而不一方面特别提及葡萄糖，另一方面特别提及所选其它糖底物。
本领域专家将会认识到，最好采用严格限定的测定条件以等摩尔浓度的所研究底物分子进行酶活性比较。否则必须对浓度差进行校正。
必须选择标准化和严格限定的测定条件，以便评价底物专一性(的提升)。s-GDH对葡萄糖作为底物以及对其它所选糖底物的酶活性如实施例章节所述进行测量。
根据对葡萄糖或所选不同糖(优选麦芽糖)的酶活性的这些测量结果，评价交叉反应性(及其提升)。
s-GDH对所选糖的(交叉)反应性的百分比如下计算：
交叉反应性[％]＝(对所选糖的活性/对葡萄糖的活性)×100％。
按照以上公式，野生型s-GDH对麦芽糖的(交叉)反应性测定为约105％(参见实施例7)。
按照以下公式，计算(提升的)专一性：
Figure G05834780020070416D000111
与野生型酶相比，s-GDH形式对葡萄糖的专一性相对于麦芽糖(麦芽糖/葡萄糖)提升达至少10倍，因此s-GDH形式用麦芽糖作为底物具有的活性至多为用葡萄糖作为底物所测定活性的10.5％。或者，如果例如突变s-GDH对麦芽糖的交叉反应性为20％(如上所述测定和计算)，则与野生型s-GDH相比，该突变体因此具有5.25倍提升的底物专一性(麦芽糖/葡萄糖)。
术语对底物的“比活”在本领域众所周知，优选用来描述每蛋白量的酶活性。采用葡萄糖或其它糖作为底物来测定GDH分子比活的各种方法对本领域而言是已知的(Igarashi，S.等，(1999)参见上文)。实施例8中详细描述了一种可用于这种测量的优选方法。
尽管有可能选择许多不同的糖分子并研究在与任何这种所选糖分子相比时的s-GDH葡萄糖专一性，但最好选择临床上相关的糖分子进行这种比较。优选的所选糖选自甘露糖、阿洛糖、半乳糖、木糖和麦芽糖。优选选择麦芽糖或半乳糖，并测试相比于半乳糖或麦芽糖的情况下突变s-GDH对葡萄糖底物专一性的提升。在一个更优选的实施方案中，所选糖为麦芽糖。
在一个优选实施方案中，本发明的PQQ依赖性s-GDH突变蛋白在122位和/或124位包含赖氨酸，另外在选自以下的一个或多个位置含一个或多个氨基酸取代：位置16、22、65、76、116、120、127、143、168、169、171、177、224、227、230、231、245、246、255、277，287、294、295、299、302、305、307、308、317、321、323、341、348、349、354、355、364、378、422、425、428和438。以上位置的大部分先前已被证明影响s-GDH对葡萄糖(相比于其它所选糖)的专一性，尤其是在和麦芽糖底物相比的情况下。WO 02/34919的完整公开内容通过引用纳入本文中。
如在WO 02/34919中的描述，在对应于分离自乙酸钙不动杆菌的野生型序列的s-GDH序列348位中，氨基酸取代可用于显著提升s-GDH的葡萄糖专一性。在一个特别优选的实施方案中，本发明涉及在122位和/或124位含赖氨酸以及在348位含氨基酸取代的s-GDH突变体。优选348位的残基苏氨酸用选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸的氨基酸残基取代。在一个更优选的实施方案中，甘氨酸用于取代348位的苏氨酸。术语T348G是技术人员知晓的，指348位的苏氨酸被甘氨酸取代。
在另一个优选实施方案中，在122位和/或124位含赖氨酸的变异体s-GDH的特征在于，428位的氨基酸残基天冬酰胺用选自亮氨酸、脯氨酸和缬氨酸的氨基酸残基取代。更优选通过脯氨酸在428位取代。
本发明的一组优选的s-GDH变异体在122位和/或124位包含赖氨酸，该变异体的特征进一步在于348位的氨基酸残基苏氨酸和428位的氨基酸天冬酰胺均被取代，其中优选的取代基是以上概述的任一个。
在122位和/或124位包含赖氨酸的本发明突变体可选地还可被进一步修饰，以在对应于由乙酸钙不动杆菌已知的s-GDH野生型序列(SEQ ID NO：2)的169、171、245、341和/或349位的氨基酸位置包含一个或多个氨基酸取代。
在本发明变异体中在对应于由乙酸钙不动杆菌已知的s-GDH野生型序列(SEQ ID NO：2)169位的氨基酸被取代的情况下，优选天然氨基酸亮氨酸被苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸取代。更优选通过苯丙氨酸在169位取代。
在本发明变异体中在对应于由乙酸钙不动杆菌已知的s-GDH野生型序列(SEQ ID NO：2)171位的氨基酸被取代的情况下，优选天然氨基酸酪氨酸被选自丙氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸的氨基酸取代。更优选通过甘氨酸在171位取代。
在本发明变异体中在对应于由乙酸钙不动杆菌已知的s-GDH野生型序列(SEQ ID NO：2)245位的氨基酸被取代的情况下，优选天然氨基酸谷氨酸被天冬氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺取代。更优选通过天冬氨酸在245位取代。
在本发明变异体中在对应于由乙酸钙不动杆菌已知的s-GDH野生型序列(SEQ ID NO：2)341位的氨基酸被取代的情况下，优选天然氨基酸甲硫氨酸被缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸取代。更优选通过缬氨酸在341位取代。
在本发明变异体中在对应于由乙酸钙不动杆菌已知的s-GDH野生型序列(SEQ ID NO：2)349位的氨基酸被取代的情况下，优选天然氨基酸缬氨酸被丙氨酸或甘氨酸取代。更优选通过丙氨酸在349位取代。
还已发现通过在428位和429位之间插入氨基酸有可能进一步提升s-GDH变异体的底物专一性。这种在氨基酸428和氨基酸429之间包含氨基酸插入的突变体还代表了用于产生同时表现出提升的稳定性以及提升的专一性的突变体的优选原料。在一个优选实施方案中，本发明涉及在s-GDH的122位和/或124位包含赖氨酸以及在s-GDH的428位和429位之间包含氨基酸插入的突变s-GDH。
在又一个优选实施方案中，本发明的s-GDH突变体除了在122位和/或124位具有赖氨酸以外，还在氨基酸残基428和429之间具有插入，并在选自以下的位置包含至少两个氨基酸取代：位置171、245、341、348和349，所述位置对应于由乙酸钙不动杆菌已知的s-GDH野生型序列(SEQ ID NO：2)的氨基酸位置。
在再一个优选实施方案中，本发明的s-GDH突变体除了在122位和/或124位具有赖氨酸以外，还在氨基酸残基428和429之间具有插入，并在选自以下的位置包含至少三个氨基酸取代：位置171、245、341、348和349，所述位置对应于由乙酸钙不动杆菌已知的s-GDH野生型序列(SEQ ID NO：2)的氨基酸位置。
技术专家会认识到，有可能进行氨基酸取代，例如沉默突变，其对s-GDH特性的影响未达显著程度。但是，本发明变异体与SEQ IDNO：2相比具有不超过50个氨基酸交换。优选地，所述变异体包含20个或以下的氨基酸取代，更优选存在仅10个氨基酸取代或更少的取代。
本发明的某些具体s-GDH变异体在实施例章节给出。具有低葡萄糖干扰和可接受热稳定性的s-GDH变异体包括分别在以下位置具有取代的突变体：65+122+124+171+245+341+348+426+428+430+436、65+122+124+171+245+341+348+426+428+430和122+124+171+245+246+341+348+425+428。这3个变异体代表了本发明的进一步优选的实施方案。
氨基酸序列分析揭示，一方面来自乙酸钙不动杆菌以及另一方面来自鲍氏不动杆菌的野生型s-GDH中发现的序列基序，似乎在本发明所鉴定和显示的对于改进热稳定性极为相关的122位和124位周围非常保守。
包含氨基酸序列TYNKSTD(SEQ ID NO：3)的PQQ依赖性s-GDH变异体代表本发明的优选实施方案，在所述变异体中天冬酰胺(N)或丝氨酸(S)被赖氨酸取代。SEQ ID NO：3对应于乙酸钙不动杆菌野生型s-GDH的位置120-126，或对应于鲍氏不动杆菌野生型s-GDH的位置120-126，但在122位(＝Xaa1)或124位(＝Xaa2)或这两个位置中包含赖氨酸，由此分别替代天然氨基酸天冬酰胺或/和丝氨酸(乙酸钙不动杆菌)。
本领域知道产生突变蛋白的多种可能性。基于公开了赖氨酸在突变s-GDH的122位和/或124位中极端重要性的本发明重大发现，技术人员现在可以容易地生产带有这些和其它有利修饰的s-GDH的其它合适变异体。这种变异体例如可通过称为随机诱变(Leung，D.W.等，Technique 1(1989)11-15)和/或定向诱变(Hill，D.E.等，MethodsEnzymol 155(1987)558-68)的方法获得。产生具有所需特性蛋白的一种替代方法是提供含有来自至少两种不同来源的序列元件的嵌合构建体，或者全合成合适的s-GDH基因。本领域已知的这些方法可以与本发明中公开的信息联合使用，以提供s-GDH突变体或变异体，其包含额外的氨基酸取代，所述取代与公开的在例如SEQ ID NO：2的122位和/或124位上极为重要的赖氨酸组合。
例如可通过从分离自乙酸钙不动杆菌模式菌株LMD 79.41的s-GDH基因开始以及通过从同源序列开始，生产本发明的s-GDH变异体。在本申请的正文中，术语“同源的”是指包含的s-GDH氨基酸序列与SEQ ID NO：2相比具有至少90％的同一性。换句话说，在运用Pileup程序进行合适的比对后，这种同源s-GDH的至少90％氨基酸与SEQ ID NO：2中所述氨基酸相同。
要理解的是，DNA序列和氨基酸序列的变异天然存在，或者可以采用本领域已知方法有意引入。这些变异可以在总体序列中导致至多10％的氨基酸差异，所述差异是由于与SEQ ID NO：2相比所述序列中一个或多个氨基酸残基的缺失、取代、插入、倒位或添加所致。这种氮基酸取代可以例如基于所涉及残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性方面的相似性来进行。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；具有不带电荷的极性头基或非极性头基、具有相似亲水性数值的氨基酸包括下述氨基酸：亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。考虑的其它变异包括前述多肽的盐和酯以及前述多肽的前体，例如甲硫氨酸具有N末端取代的前体N-甲酰甲硫氨酸，其用作前导序列。可实施这种变异而不偏离本发明的范围和精神。
按照现有技术中已知的方法或者按照实施例章节给出的方法，有可能获得编码如上讨论的任何s-GDH突变体的多核苷酸序列。因此，本发明也包括编码如上所述的本发明s-GDH突变蛋白的分离多核苷酸序列。
本发明还包括表达载体，其包含本发明的核酸序列，该序列有效连接至能够引导其在宿主细胞中表达的启动子序列。
本发明还包括表达载体，其包含本发明的核酸序列，该序列有效连接至能够引导其在宿主细胞中表达的启动子序列。优选载体是诸如图2和图3所示pACSGDH的质粒。
可用于本发明的表达载体通常含有复制起点、用于选择的抗生素抗性、用于表达的启动子和s-GDH基因变异体的全部或部分。所述表达载体还可以包括本领域已知的其它DNA序列，例如信号序列(用于更好地折叠、转运入周质或分泌)、用于更好地调节表达的诱导物或用于克隆的切割位点。
选定表达载体的特征必须与待使用的宿主细胞匹配。例如，当在大肠杆菌细胞系统中克隆时，表达载体应含有从大肠杆菌细胞基因组中分离的启动子(例如lac或trp)。可使用合适的复制起点例如ColE1质粒复制起点。合适的启动子包括例如lac和trp。还优选所述表达载体包括编码选择标记的序列，例如抗生素抗性基因。作为选择标记，可以方便地使用氨苄青霉素抗性或卡那霉素抗性。所有这些材料都是本领域已知的，并且是市售的。
含有所需编码序列和控制序列的合适表达载体可以采用本领域已知的标准重组DNA技术来构建，所述技术中的许多技术描述于Sambrook等，载于“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”(1989)Cold Spring Harbor，NY，Cold Spring Harbour Laboratory Press。
另外，本发明还涉及含有表达载体的宿主细胞，所述表达载体包含编码全部或部分突变s-GDH的DNA序列。所述宿主细胞优选含有一种表达载体，其包含以下DNA序列之一的全部或部分，所述DNA序列编码具有实施例2-8中所示的一个或多个突变的突变s-GDH。合适的宿主细胞包括例如可得自Pomega(2800 Woods HollowRoad，Madison，WI，USA)的大肠杆菌HB101(ATCC 33694)、可得自Stratagene(11011 North Torrey Pine Road，La Jolla，CA，USA)等的XL1-Blue MRF。
可通过本领域已知的各种方法，将表达载体导入宿主细胞中。例如，通过聚乙二醇介导的原生质体转化法(Sambrook等，1989，参见上文)，可用表达载体进行宿主细胞转化。然而，也可以使用用于将表达载体导入宿主细胞中的其它方法，例如电穿孔、基因枪注射(biolistic injection)或原生质体融合。
一旦已将含有s-GDH变异体的表达载体导入合适的宿主细胞中，则可以在允许目标s-GDH变异体表达的条件下培养所述宿主细胞。可通过即抗生素选择容易地鉴别含目标表达载体的宿主细胞，其中所述表达载体具有编码全部或部分突变s-GDH的DNA序列。s-GDH变异体的表达可通过不同方法鉴别，例如检测s-GDH mRNA转录物的生产、用免疫学方法检测基因产物或检测基因产物的酶活性。优选应用酶测定。
本发明还教导了s-GDH变异体的产生和筛选。随机诱变和饱和诱变如本领域所知来进行。筛选变异体的热稳定性(无热应力处理的活性与热应力处理后的剩余活性对比)。所选择的测定条件适于确保可以测定例如由单个氨基酸取代引起的预期小增加。选择或筛选合适突变体的一种优选模式在实施例3中给出。相比于起始酶(突变型或野生型)的任何变化或改进都可被清楚检测。
当然，应当理解，并不是所有的表达载体和DNA调节序列都能同样地用来表达本发明的DNA序列。对于同一表达系统而言，也不是所有的宿主细胞都可以同样地起作用。然而，在不需过度不当实验的情况下，本领域技术人员采用本文中提供的指南会在表达载体、DNA调节序列和宿主细胞中做出合适的选择。
本发明还涉及生产本发明s-GDH变异体的方法，所述方法包括在适合于生产本发明突变s-GDH的条件下培养本发明的宿主细胞。对于细菌宿主细胞而言，典型培养条件是含有碳和氮源、合适抗生素和诱导剂(取决于所使用的表达载体)的液体培养基。典型的合适抗生素包括氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素等。典型诱导剂包括IPTG、葡萄糖、乳糖等。
优选本发明的多肽通过在表达突变s-GDH编码DNA序列的宿主细胞中生产来获得。本发明的多肽也可通过体外翻译mRNA来获得，该mRNA由编码突变s-GDH的DNA序列编码。例如，可以如上所述合成所述DNA序列，将其插入到合适的表达载体中，所述表达载体进而可以用于体外转录/翻译系统。
包含以上定义和描述的分离多核苷酸的表达载体代表本发明的另一个优选实施方案，其中所述分离多核苷酸与能够在无细胞肽合成系统中启动其表达的启动子序列有效连接。
然后，可以采用各种常规蛋白质纯化技术分离并纯化例如通过如上所述的方法生产的多肽。例如可以使用色谱法，例如离子交换色谱、凝胶过滤色谱和亲和色谱。
本发明的改良s-GDH变异体的主要应用之一是用于测试条，以监测糖尿病患者的血糖水平。如上所述，PQQ依赖性葡糖脱氢酶对氧的不敏感性是超越葡萄糖氧化酶的巨大优势。现在，使用具有提升的热稳定性以及提升的葡萄糖专一性这二者的新型s-GDH变异体，可显著降低由于例如待分析样品中可能存在的麦芽糖、半乳糖和/或其它相关糖引起的干扰。当然，可研究多种样品。体液如血清、血浆、肠液或尿液是这类样品的优选来源。
本发明还包括使用本发明的s-GDH突变体检测、测定或测量样品中葡萄糖的方法。尤其优选的是，用于检测样品中葡萄糖的改进方法的特征在于，使用传感器或测试条装置进行葡萄糖的所述检测、测定或测量。
用于检测或测量样品中葡萄糖的装置也属于本发明范围，所述装置包含符合本发明的s-GDH突变体以及所述测量需要的其它试剂。
热稳定性提升的本发明s-GDH变异体还可以非常有利地用于生物传感器中(D′Costa，E.J.等，Biosensors 2(1986)71-87；Laurinavicius，V.等，Analytical Letters 32(1999)299-316；Laurinavicius，V.等，Monatshefte fuer Chemie 130(1999)1269-1281；Malinauskas，A.等，Sensors and Actuators，B：Chemical 100(2004)395-402)，以在线监测样品中或反应器中的葡萄糖。对于此目的，所述s-GDH变异体例如可用于包被具有锇络合物的氧不敏感玻璃电极，该锇络合物含氧化还原导电环氧化物网格(Ye等，1993，参见上文)，以更加准确地测定葡萄糖浓度。
在以下实施例中，所有的试剂、限制性酶和其它材料都得自RocheDiagnostics Germany，除非具体说明其它商业来源，并且按照供应商提供的说明来使用。DNA纯化、表征和克隆所使用的操作和方法在本领域众所周知(Ausubel，F.等，载于“Current protocols in molecularbiology”(1994)，Wiley)，并且可根据技术人员的要求进行修改。
以下实施例进一步说明本发明。这些实施例不是用来限制本发明范围，而是提供对本发明的进一步理解。
实施例1
野生型乙酸钙不动杆菌可溶性PQQ依赖性葡糖脱氢酶在大肠杆菌中的克隆和表达
按照标准方法从乙酸钙不动杆菌菌株LMD 79.41中分离出s-GDH基因。将野生型s-GDH基因亚克隆到含有用于可调节表达的mgl启动子的质粒中(参见专利申请WO 88/09373)。将新的构建体称为pACSGDH(参见图2和图3)。将所述重组质粒导入选自大肠杆菌组的宿主生物体中。然后在合适条件下培养这些生物体，选择显示s-GDH活性的菌落。
采用QIAGEN Plasmid Maxi Kit(Qiagen)，按照生产商的方案，从200ml上述克隆的过夜培养物中分离质粒pACSGDH。将该质粒重悬于1ml双蒸水中。使用Beckman DU 7400光度计测定质粒浓度。
产量为600μg。然后，通过琼脂糖凝胶电泳测定质粒的量。
实施例2：
诱变PCR
为了在所述s-GDH基因中产生随机突变，进行诱变PCR(聚合酶链反应)。pACSGDH质粒和编码突变酶(来自诱变PCR的PCR产物)的DNA序列用限制性酶SphI和Eco RI消化。凝胶纯化所述产物。连接经消化的DNA序列，用等份连接反应混合物转化感受态大肠杆菌细胞。随后在含有氨苄青霉素的LB平板上选择转化体。
选择单个菌落，让其在含有氨苄青霉素的LB培养基中生长过夜，然后进行筛选(参见实施例3)。
诱变PCR反应混合物：
40ng pACSGDH
1×无MgCl2的缓冲液(Roche Diagnostics GmbH，目录号1699 105)
dCTP，dTTP 1mM
dATP，dGTP 0.2mM(Roche Diagnostics GmbH，目录号1969 064)
40pmol GF23-引物(5′-CGC GCA CGC GCA TGC CGC CGA TGT TC)(＝SEQ ID NO：4)
40pmol GR23(5′-GAC GGC CAG TGA ATT CTT TTC TA)(＝SEQ IDNO：5)
7mM MgCl2
0.6mM MnCl2
5U Taq DNA聚合酶(Roche Diagnostics GmbH，目录号1146 165)
Gene Amp PCR System 2400(Perkin Elmer)，30个循环：95℃，1分钟，45℃2分钟，72℃2分钟
-采用得自Roche Diagnostics GmbH的High Pure PCR ProductPurification Kit(高纯度PCR产物纯化试剂盒(目录号1 732 676))，按照生产商的方案纯化PCR产物。
-PCR片段用25U SphI(Roche Diagnostics GmbH，目录号606 120)在1×缓冲液H(Roche Diagnostics GmbH，目录号1417991)中于37℃消化过夜；加入25U EcoRI(Roche Diagnostics GmbH，目录号703737)，再消化3.5小时。
-50μg pACSGDH用180U SphI和180U EcoRI在1×缓冲液H中于37℃消化4小时。
-采用琼脂糖凝胶(0.8％)将经消化的pACSGDH和经消化的片段进行凝胶电泳
-采用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAquick凝胶提取试剂盒)(Qiagen，目录号28706)，按照生产商的方案，提取所述DNA分子。
-使用Beckman DU 7400光度计，测定片段和消化载体的浓度。
-通过琼脂糖凝胶电泳测定纯化产物的量。
-使用1U T4-DNA连接酶(Roche Diagnostics GmbH，目录号481220)，将100ng消化过的载体与140ng mPCR片段在20μl体积中于16℃连接过夜。
-使用BioRad E.coli Pulser(BioRad大肠杆菌脉冲仪(BioRad))，用1μl连接反应物以2.5KV在0.2cm电穿孔槽中电穿孔电感受态XL1F细胞(Stratagene)。
-在1ml LB中于37℃生长1小时后，将细菌平板接种到LB-氨苄青霉素琼脂平板(100μg/ml氨苄青霉素)上，于37℃生长过夜。
-50％的表达克隆产生有酶活性的s-GDH，对其进行以下筛选方法。
实施例3：
热稳定性筛选
将上述琼脂平板上的突变菌落拣选入含200μl LB-氨苄青霉素-培养基/孔的微量滴定板(MTP)中，于37℃保温过夜。这些平板称为母板。
从每个母板转移5μl样品/孔至每孔含5μl B(B＝Bacterial ProteinExtraction Reagent(细菌蛋白提取试剂)；Pierce No.78248))的MTP中，进行细胞破碎，然后加入240μl的0.0556mM吡咯并喹啉醌(PQQ)、50mM Hepes、15mM CaCl2pH 7.0/孔，用以活化s-GDH。为完成全酶形成，将MTP于25℃保温2小时，然后于10℃保温过夜。该平板称为工作板。
从工作板转移2×10μl样品/孔至两个空的MTP中。一个MTP经受短时间温度应力(于70℃达30分钟/培养箱)。在冷却至室温后，用含30mM葡萄糖的90μl介导物溶液测试经受应力的和未处理的MTP(参见实施例8)。
计算dE/分钟，将未受应力样品的数值设定为100％活性。将受温度应力的MTP所获得的数值与未处理的数值对比，并以活性百分率计算((例如：受温度应力的dE/分钟/未处理的dE)*100)。这等同于以剩余活性百分率表示的(变异)酶的热稳定性。为了补偿由于保温期间MTP中的热分布波动引起的结果偏差，在专用孔中加入野生型酶作为各个板的参比。
鉴别出以下突变体：
  酶   70℃、30分钟后的剩余活性％   氨基酸交换
  野生型   3-20％   -
  突变体A   9-30％   N122K、L202I
剩余活性的可变性源于MTP孔中不一致的热分布、加热过程中全酶分解为脱辅基酶和辅酶以及在热应力后自发地再组装为全酶。尽管如此，突变体A也一直显示出高于野生型酶的剩余酶活性值。
实施例4：
s-GDH突变体A编码基因的测序
分离含热稳定性高于野生型的s-GDH突变体A基因的质粒(高纯度质粒分离试剂盒，Roche Diagnostics GmbH，No.1754785)，采用ABI Prism Dye Terminator Sequencing Kit和ABI 3/73和3/77测序仪(Amersham Pharmacia Biotech)对该质粒测序。
使用以下引物：
有义链：
GDH 1：5′-TTA ACG TGC TGA ACA GCC GG-3′(＝SEQ ID NO：6)
GDH 2：5′-ATA TGG GTA AAG TAC TAC GC-3′(＝SEQ ID NO：7)
结果：
发现了已列于实施例3的表中的突变体A的氨基酸交换。
实施例5：
通过饱和诱变获得的s-GDH突变体
进行饱和诱变，以观察突变体A中的两个或仅一个氨基酸交换是否造成热稳定性提升。此外，所述方法允许人们观察在所鉴别位置的其它氨基酸交换是否可增强发现的作用。使用QuickChange定点诱变试剂盒(Stratagene，目录号200518)分别地连续取代野生型s-GDH蛋白的122位和202位的野生型氨基酸。
用于诱变的5′-引物和3′-引物相互互补，并且在中心位置含有NNN。这3个随机合成的核苷酸处于目标位置(分别为122或202)，其侧翼是每个末端的12-16个核苷酸，所述核苷酸与模板的有义和反义DNA链相同。引物含有NNN来代替所述密码子，因此所述寡核苷酸编码每个可能的密码子。
分别对122位和202位的每一个进行一个PCR反应。
按照手册进行PCR反应和DpnI限制性内切核酸酶消化。
此后，用1μl每个反应物电穿孔XL1F细胞。让细胞生长，如上所述测定所述克隆的s-GDH活性。
为了增加统计学可能性，在此评价中覆盖全部20个可能的氨基酸取代，对每个位置筛选200个克隆(参见实施例3)。
其中使用以下引物：
对于122位
有义链5′-TCGTTATACCTATNNNAAATCAACAGATA-3′(SEQ IDNO：8)
反义链5′-TATCTGTTGATTTNNNATAGGTATAACGA-3′(SEQ ID：NO：9)
对于202位
有义链5′-TAAAGTACTACGCNNNAATCTTGATGGAA-3′(SEQ IDNO：10)
反义链5′-TTCCATCAAGATTNNNGCGTAGTACTTTA-3′(SEQ IDNO：11)
结果：
在202位的氨基酸交换不改变热稳定性。只有在122位的摆动产生具有增强的热稳定性的克隆。最佳交换是N122K。
实施例6：
产生和麦芽糖相比具有对葡萄糖的高底物专一性以及增强的热稳定性的突变体
在WO 02/34919中，已鉴别出几个在s-GDH的不同位置的氨基酸交换，并表明和例如麦芽糖相比，其增强对葡萄糖的底物专一性。此外，氨基酸交换T348G与在例如169、171、245、341和/或349位的其它位置氨基酸取代组合进一步增强底物专一性。选择这些描述的突变体中的几个，以通过导入已发现的氨基酸交换N122K提升其热稳定性。点突变通过使用以下引物完成。
有义链5′-TCGTTATACCTATAAGAAATCAACAGATA-3′(SEQID NO：12)
反义链5′-TATCTGTTGATTTCTTATAGGTATAACGA-3′(SEQID：NO：13)
应用如实施例3所述的对热稳定性的相同筛选，只是保温温度由70℃降至65℃，时间为30分钟。
结果：
  酶   麦芽糖/葡萄糖(30mM糖中的百分率)   65℃、30分钟后％剩余活性   氨基酸交换
  野生型   105％   80％   -
  模板B/0   4％   5％   Y171G+E245D+M341V+T348G+in429P
  突变型B/1   4％   10％   N122K+Y171G+E245D+M341V+T348G+in429P
  模板C/0   2％   10％   Y171G+E245D+M341V+T348G+A426S+N428P+Q430M
  突变型C/1   2％   20％   N122K+Y171G+E245D+M341V+T348G+A426S+N428P+Q430M
  模板D/0   4％   20％   Y171G+E245D+Q246H+M341V+T348G+T425V+N428P
  突变型D/1   4％   30％   Y171G+N122K+E245D+Q246H+M341V+T348G+T425V+N428P
由此清晰可见，对于全部突变体类型，额外的氨基酸交换N122K
在选择的应力模型中产生增强的热稳定性，没有影响底物专一性。
实施例7：
产生具有高底物专一性和进一步增强的热稳定性的突变体
在如WO 02/34919所述筛选增强的底物专一性的同时，使用m-PCR和饱和诱变在随机位置如上所述扩展热稳定性的筛选参数谱。
用与麦芽糖(2％)相比对葡萄糖具有高底物专一性、具有氨基酸交换Y171G+E245D+M341V+T348G+N428P的突变体E/0开始，发现了一个新的氨基酸交换S124K。
然后，将此新的氨基酸交换应用于实施例6的含N122K的已改进突变体，使用以下引物：
有义链5′-CCTATAAGAAAAAGACAGATACGCTCG-3′(SEQ IDNO：14)
反义链5′-CGAGCGTATCTGTCTTTTTCTTATAGG-3′(SEQ ID：NO：15)
结果：
  酶   麦芽糖/葡萄糖(30mM糖中的百分率)   65℃、30分钟后％剩余活性   氨基酸交换
  野生型   105％   80％   -
  突变体B/1   4％   10％   N122K+Y171G+E245D+M341V+T348G+in429P
  突变体B/2   4％   15％   N122K+S124K+Y171G+E245D+M341V+T348G+in429P
  突变体C/1   2％   20％   N122K+Y171G+E245D+M341V+T348G+A426S+N428P+Q430M
  突变体C/2   2％   25％   N122K+S124K+Y171G+E245D+M341V+T348G+A426S+N428P+Q430M
  突变体D/1   4％   30％   N122K+Y171G+E245D+Q246H+M341V+T348G+T425V+N428P
  突变体D/2   4％   40％   N122K+124K+Y171G+E245D+Q246H+M341V+T348G+T425V+N428P
  突变体E/0   2％   10％   Y171G+E245D+M341V+T348G+N428P
  突变体E/1   2％   20％   Y171G+S124K+E245D+M341V+T348G+N428P
上述结果表明，N122K位和S124K位上的氨基酸交换对突变体的热稳定性具有额外的正面作用。
实施例8：
野生型或变异s-GDH的纯化以及各自酶活性的分析
培养大肠杆菌细胞(LB-Amp，37℃)，收集并重悬浮在磷酸钾缓冲液pH 7.0中。通过French Press passage(700-900bar)进行细胞破碎。在离心后将上清液上样到用10mM磷酸钾缓冲液pH 7.0平衡的S-Sepharose(Amersham Pharmacia Biotec)柱。洗涤后，使用0-1M NaCl盐梯度洗脱s-GDH。合并表现出s-GDH活性的级分，对磷酸钾缓冲液pH 7.0透析，并在再平衡的S-Sepharose柱上再层析。合并活性级分，使用Superdex
Figure G05834780020070416D000271
200柱(Amersham)进行凝胶过滤。合并活性级分，在加入CaCl2(3mM终浓度)后储存于-20℃。
分别对纯化的野生型和变异s-GDH进行酶检测和蛋白测定。
使用Pierce的Protein Assay Reagent 23225号(以BSA、30分钟、37℃做校准曲线)进行蛋白质测定。
用0.0556mM吡咯并喹啉醌(PQQ)、50mM Hepes、15mM CaCl2pH 7.0将s-GDH样品稀释至1mg蛋白/ml，并于25℃保温30分钟，用于再制或活化。
在活化后，用50mM Hepes、15mM CaCl2 pH 7.0将样品稀释至约0.02U/ml，将50μl各种稀释过的样品加入到1000μl含0.315mg/ml作为介导物的(4-(二甲基氧膦基甲基)-2-甲基-吡唑并-[1.5a]-咪唑-3-基)-(4-亚硝基苯)-胺(参见专利US 5,484,708)和30mM糖的0.2M柠檬酸盐缓冲溶液(pH 5.8；于25℃)中。
在25℃的前5分钟中监测620nm的消光度。
1单位酶活性对应于在上述测定条件下1mMol介导物/分钟的转变。
计算：活性＝(总体积*dE/分钟[U/ml])：(ε*样品体积*1)
(ε＝消光系数；ε620nm＝30[1*mmol-1*cm-1])。
分别用葡萄糖和麦芽糖(Merck，Germany)进行所述测定。
结果：
  酶  M/G(30mM糖中的百分率)   U/mg蛋白   氨基酸交换
  野生型  105％   800
  B/2  4％   106   N122K+S124K+Y171G+E245D+M341V+T348G+in429P
  C/0  2％   435   Y171G+E245D+M341V+T348G+A426S+N428P+Q430M
  C/2  2％   450   N122K+S124K+Y171G+E245D+M341V+T348G+A426S+N428P+Q430M
  D/2  4％   441   N122K+S124K+Y171G+E245D+Q246H+M341V+T348G+T425V+N428P
实施例9：
有或没有氨基酸交换N122K和S124K的纯化突变体的温度稳定性比较
对野生型、突变体C/0和C/2(实施例8)的纯化s-GDH样品实施可选的温度应力模型，该模型类似于生产和/或运输的温度应力条件。制备1mg酶蛋白/20mM磷酸钾pH 7.0、0.016mg PQQ/ml的溶液，以活化s-GDH。在于室温保温30分钟后，测定对葡萄糖的初始活性(参见实施例8)，将样品于48℃的水浴中保温。在30分钟温度应力后，检测剩余活性，并以百分率计算(与初始活性对比)。
结果：
  酶   剩余活性
  野生型   99％
  C/0   66％
  C/2   94％
在这些选择性温度应力条件下也可以清晰看出N122K和S124K位置上的氨基酸交换的作用以及产生的温度稳定性的改良。
实施例10：
在有或无麦芽糖的情况下测定葡萄糖
在有或没有麦芽糖的情况下可分别将野生型s-GDH和s-GDH变异体B/2、C/2和D/2应用于葡萄糖测定。参比样品含有50mg葡萄糖/dl。“试验”样品分别含有50mg葡萄糖/dl以及100或200mg/dl麦芽糖。每一测定使用具有相同量的GDH活性(例如5U/ml；活性如在实施例8中测定)的酶溶液。
在比色杯中混合：
1ml 0.315mg(4-(二甲基氧膦基甲基)-2-甲基-吡唑并-[1.5a]-咪唑-3-基)-(4-亚硝基苯)-胺ml/0.2M柠檬酸pH 5.8
0.033ml参比或测试样品
通过将0.050ml s-GDH酶溶液(其是s-GDH过量的，用于转变葡萄糖)加入比色杯中开始该测定。监测620nm的吸光度变化。2-5分钟后，观察到恒定值，计算dE/5分钟。用野生型s-GDH测量参比样品获得的数值设定为100％。将其它数值与该参比值进行比较，计算百分率。
显然，当使用新型也更稳定的本发明s-GDH变异体时，测试样品中检测到较少的麦芽糖干扰。
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Figure IYZ000001854080900041
Figure IYZ000001854080900051
Figure IYZ000001854080900061
Figure IYZ000001854080900071
Figure IYZ000001854080900081
Figure IYZ000001854080900091
Figure IYZ000001854080900101
Figure IYZ000001854080900121
Figure IYZ000001854080900131

Claims (1)

1.一种热稳定性提高的PQQ依赖性s-GDH突变蛋白，其在SEQ ID NO: 2的基础上将122位和124位中的至少一个取代为赖氨酸。
2. 权利要求1的突变体，所述突变体在选自以下的一个或多个位置另外含有一个或多个氨基酸取代：位置16、22、65、76、116、120、127、143、168、169、171、177、224、227、230、231、245、246、255、277、287、294、295、299、302、305、307、308、317、321、323、341、348、349、354、355、364、378、422、425、428和438。
3. 权利要求2的突变体，其中所述一个或多个另外的氨基酸取代为在348位的取代。
4. 权利要求2的突变体，其中所述一个或多个另外的氨基酸取代为在428位的取代。
5. 权利要求2的突变体，其中所述一个或多个另外的氨基酸取代为在348位和428位两者的取代。
6. 权利要求3的突变体，其中348位的苏氨酸被丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸取代。
7. 一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码权利要求1-6中任一项的s-GDH突变蛋白。
8. 一种包含权利要求7的分离的多核苷酸的表达载体，所述多核苷酸有效连接至能够启动所述多核苷酸在宿主细胞中表达的启动子序列。
9. 一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求8的表达载体。
10. 一种生产s-GDH变异体的方法，所述方法包括在适合于生产所述酶变异体的条件下培养权利要求9的宿主细胞。
11. 一种使用权利要求1-6中任一项的s-GDH突变体检测、测定或测量样品中葡萄糖的方法，所述方法包括使所述样品与所述突变体接触。
12. 权利要求11的方法，所述方法的进一步特征在于所述葡萄糖的检测、测定或测量使用传感器或测试条装置进行。
13. 一种用于检测或测量样品中的葡萄糖的装置，所述装置包含权利要求1-6中任一项的s-GDH突变体和所述测量需要的其它试剂。
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