ES2366479T3 - Mutantes termoestables de la glucosa deshidrogenasa dependiente de quinona de pirroloquinolina. - Google Patents

Abstract

Proteína mutante de la s-GDH dependiente de PQQ que presenta una mayor estabilidad térmica que la s- GDH de tipo salvaje, caracterizada porque en por lo menos una de las posiciones 122 y 124, se encuentra presente el aminoácido lisina, en la que dichas posiciones corresponden a las posiciones aminoácidas conocidas de la secuencia de tipo salvaje de la s-GDH de A. calcoaceticus SEC ID nº 2 y en la que dicha proteína presenta una identidad de por lo menos 90% respecto a la secuencia SEC ID nº 2.

Description

La presente invención se refiere a una proteína mutante de s-GDH dependiente de PQQ caracterizada porque en por lo menos una de las posiciones 122 y 124 se encuentra presente el aminoácido lisina, en la que dichas posiciones corresponden a las posiciones aminoácidas conocidas de la s-GDH de secuencia de tipo salvaje de A. calcoaceticus (SEC ID nº 2); también da a conocer genes codificantes de dicha s-GDH mutante, y diferentes aplicaciones de dichos mutantes de s-GDH, particularmente para determinar la concentración de glucosa en una muestra.

Campo de la invención:

La determinación de la concentración de glucosa sanguínea resulta extremadamente importante en el diagnóstico clínico y en el control de la diabetes. Aproximadamente 150 millones de personas en todo el mundo sufren la enfermedad crónica de la diabetes mellitus, un número que podría doblarse para el 2025 según la OMS. Aunque la diabetes se diagnóstica y trata con facilidad, un control de largo plazo exitoso requiere herramientas diagnósticas de bajo coste que informen rápida y exactamente de las concentraciones de glucosa en sangre. La glucosa deshidrogenasas dependientes de PQQ (EC 1.1.5.2) catalizan una reacción en la que se oxida la glucosa en gluconolacona. En consecuencia, se utiliza este tipo de enzima en la medición del azúcar en sangre. Una de dichas herramientas es una tira diagnóstica basada en la glucosa deshidrogenasa soluble (s-GlucDOR, EC 1.1.5.2), un enzima que contiene quinona de pirroliquinolina originalmente derivada de Acinetobacter calcoaceticus.

Las quinoproteínas utilizan quinona como cofactor para oxidar alcoholes, aminas y aldosas en sus lactonas, aldehídos y ácidos aldólicos correspondientes (Duine J.A., Energy generation and the glucose dehydrogenase pathway in Acinetobacter, en: “The Biology of Acinetobacter”, 295 a 312, New York, Plenum Press, 1991; Duine J.A., Eur. J. Biochem. 200:271-284, 1991; Davidson V.L., en: “Principles and applications of quinoproteins”, el libro completo, New York, Marcel Dekker, 1993; Anthony C., Biochem. J. 320:697-711, 1996; Anthony C. y Ghosh M., Current Science 72:716-727, 1997; Anthony C., Biochem. Soc. Trans. 26:413-417, 1998; Anthony C. y Ghosh M., Prog. Biophys. Mol. Biol. 69:1-21, 1998. Entre las quinoproteínas, aquéllas que contienen el cofactor no unido covalentemente 2,7,9-tricarboxi-1H-pirrolo[2,3-f]quinolín-4,5-diona (PQQ) constituye el subgrupo más grande (Duine, 1991, supra). Todas las quinona-glucosa deshidrogenasas bacterianas conocidas hasta el momento pertenecen a dicho subgrupo con PQQ como cofactor (Anthony y Ghosh, supra, 1997; Goodwin P.M. y Anthony C., Adv. Microbiol. Physiol. 40:1-80, 1998; Anthony C., Adv. in Phot. and Resp. 15:203-225, 2004).

Se han caracterizado dos tipos de glucosa deshidrogenasa dependiente de PQQ (EC 1.1.5.2) en bacterias: una se encuentra unida a membrana (m-GDH); la otra es soluble (s-GDH). Ambos tipos no comparten ninguna homología significativa de secuencia (Cleton-Jansen A.M. et al., Mol. Gen. Genet. 217:430-436, 1989; Cleton-Jansen A.M. et al., Antonie Van Leeuwenhoek 56:73-79, 1989; Oubrie A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96:11787-11791, 1999). También son diferentes con respecto a tanto sus propiedades cinéticas como a sus propiedades inmunológicas (Matshushita K. et al., Bioscience Biotechnol. Biochem. 59:1548-1555, 1995). Las m-GDHs son comunes en las bacterias Gram-negativas; sin embargo, las s-GDHs se han encontrado únicamente en el espacio periplasmático de las cepas de Acinetobacter, tales como A. calcoaceticus (Duine J.A., 1991a; Cleton-Jansen A.M. et al., J. Bacteriol. 170:2121-2125, 1988; Matsushita y Adachi, 1993) y A. baumannii (patente JP nº 11243949).

Mediante la búsqueda de bases de datos de secuencias, se han identificado dos secuencias homólogas de la s-GDH de A. calcoaceticus de longitud completa en E. coli K-12 y en Synechocystis sp. Además, también se han encontrado dos secuencias incompletas homólogas de la s-GDH de A. calcoaceticus en el genoma de P. aeruginosa y de Bordetella pertussis (Oubrie et al. 1999a, b, c) y Enterobacter intermedium (Kim C.H. et al., Current Microbiol. 47:457-461, 2003), respectivamente. Las secuencias de aminoácidos deducidas de dichas cuatro proteínas no caracterizadas se encuentran estrechamente relacionadas con la s-GDH de A. calcoaceticus, con muchos residuos en el sitio activo putativo absolutamente conservados. Dichas proteínas homólogas probablemente presentan una estructura similar y catalizan reacciones dependientes de PQQ similares (Oubrie et al., 1999a, b, c; Oubrie A., Biochim. Biophys. Acta 1647:143-151, 2003; Reddy S. y Bruice T.C., J. Am. Chem. Soc. 126:2431-2438, 2004; Yamada M. et al., Biochim. Biophys. Acta 1647:185-192, 2003).

Las s-GDHs y m-GDHs bacterianas se ha encontrado que presentan secuencias bastante diferentes y diferente especificidad de sustrato. Por ejemplo, A. calcoaceticus contiene dos glucosa deshidrogenasas dependientes de PQQ, una denominada m-GDH que se encuentra activa in vivo, y la otra denominada s-GDH para la que sólo puede demostrarse actividad in vitro. Cleton-Jansen et al., 1988, 1989a, b, clonaron los genes codificantes de dos enzimas GDH y determinaron las secuencias de ADN de los dos genes GDH indicados. No existe ninguna homología evidente entre m-GDH y s-GDH que corrobora el hecho de que m-GDH y s-GDH representan dos moléculas completamente diferentes (Laurinavicius V. et al., Biologija, 31-34, 2003).

El gen de la s-GDH de A. calcoacetius ha sido clonado en E. coli. Tras su producción en la célula, la s-GDH se trasloca a través de la membrana citoplasmática hacia el interior del espacio periplásmico (Duine J.A., Energy generation and the glucose dehydrogenase pathway in Acinetobacter, en: “The Biology of Acinetobacter”, 295-312, 1991, New York, Plenum Press; Matsushita K. y Adachi O., Bacterial quinoproteins glucose dehydrogenase and alcohol deshydrogenase, en: “Principles and applications of Quinoproteins”, 47-63, 1993, New York, Marcel Dekker). Al igual que la s-GDH nativa de A. calcoaceticus, la s-GDH recombinante expresada en E. coli es un homodímero, con una molécula de PQQ y tres iones calcio en cada monómero (Dokter P. et al., Biochem. J. 239:163-167, 1986; Dokter P. et al., FEMS Microbiol. Lett. 43:195-200, 1987; Dokter P. et al., Biochem. J. 254:131-138, 1988; Olsthoorn

A.J.

y Duine J.A., Arch. Biochem. Biophys. 336:42-48, 1996; Oubrie A. et al., J. Mol. Biol. 289:319-333, 1999; Oubrie

A.

et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96:11787-11791, 1999; Oubrie A. et al., Embo J. 18:5187-5194, 1999). La s-GDH oxida un amplio abanico de monosacáridos y disacáridos en las cetonas correspondientes, que se hidrolizan adicionalmente en los ácidos aldónicos, y también es capaz de donar electrones al PMS (metosulfato de fenazina), DCPIP (2,6-diclorofenolindofenol), WB (azul de Wurster) y ubiquinonas de cadena corta tales como ubiquinona Q1 y ubiquinona Q2 (Matsushita K. et al., Biochem. 28:6276-6280, 1989; Matsushita K. et al., Antonie Van Leeuwenhoek 56:63-72, 1989), varios aceptores electrónicos artificiales tales como metilsulfato de N-metil-azonio (Olsthoorn A.J: y Duine J.A., Arch. Biochem. Biophys. 336:42-48, 1996; Olsthoorn A.J. y Duine J.A., Biochem. 37:13854-13861, 1998) y polímeros electroconductores (Ye L. et al., Anal. Chem. 65:238-241, 1993). En vista de la elevada actividad específica de la s-GDH hacia la glucosa (Olsthoorn A.J. y Duine J.A., 1996, supra) y su amplia especificidad de aceptor electrónico artificial, el enzima resulta muy adecuado para aplicaciones analíticas, particularmente para su utilización en (bio)sensores o tiras de ensayo para la determinación de la glucosa en aplicaciones diagnósticas (Kaufmann N. et al., Development and evaluation of a new system for determining glucose from fresh capillary blood and heparinized blood, en: “Glucotrend”, 1-16, 1997, Boehringer Mannheim GmbH; Malinauskas A. et al., Sensors and Actuators, B: Chemical 100:395-402, 2004).

La oxidación de la glucosa puede ser catalizada por como mínimo tres grupos de enzimas bastante diferentes, es decir, por las glucosa deshidrogenasas dependientes de NAD/P, por las flavoproteínas glucosa oxidasas o por las quinoproteínas GDHs (Duine J.A., Biosens. Bioelectronics 10:17-23, 1995). Se ha observado una autooxidación bastante lenta de la s-GDH reducida, demostrando que el oxígeno es un aceptor electrónico muy pobre para la s-GDH (Olsthoorn y Duine, 1996). La s-GDH puede donar eficientemente electrones desde la quinona reducida a mediadores tales como PMS, DCPIP, WB y ubiquinonas de cadena corta tales como Q1 y Q2, pero no puede donar eficientemente electrones directamente al oxígeno.

Las tiras de ensayo y sensores tradicionales para el seguimiento del nivel de glucosa en sangre, suero y orina, por ejemplo de pacientes diabéticos, utilizan la glucosa oxidasa. El rendimiento del enzima depende de la concentración de oxígeno. Las mediciones de la glucosa a diferentes altitudes con diferentes concentraciones de oxígeno en el aire pueden conducir a resultados falsos. La ventaja principal de las glucosa deshidrogenasas dependientes de PQQ es su independencia del oxígeno. Esta importante característica se comenta, por ejemplo, en la patente US nº 6.103.509, en la que se han investigado algunas características de las GDHs unidas a membrana.

Una contribución importante al campo ha sido la utilización de s-GDH conjuntamente con mediadores apropiados. Se dan a conocer en detalle en la patente US nº 5.484.708 algunos métodos y dispositivos de tira de ensayo. Esta patente también contiene información detallada sobre la preparación de ensayos y la producción de tiras de ensayo basadas en s-GDH para la medición de la glucosa.

Los métodos descritos en dicha patente, así como en los documentos citados, se encuentran comprendidos en la presente memoria como referencia.

Otras patentes o solicitudes relacionadas con el campo y que comprenden información específica sobre diversos modos de aplicaciones para enzimas con actividad de glucosa deshidrogenasa son las patentes US nº 5.997.817, US nº 6.057.120, EP nº 0 620 283 y JP nº 11-243949-A.

Un sistema comercial que utiliza s-GDH y un indicador que produce un cambio de color al producirse la reacción (Kaufmann et al., supra, 1997) es el sistema Glucotrend® distribuido por Roche Diagnostics GmbH.

A pesar de las ventajas anteriormente comentadas de la utilización de una s-GDH dependiente de PQQ, también debe considerarse una desventaja para la determinación de la glucosa. El enzima presenta un espectro de sustratos bastante amplio en comparación con la m-GDH. Es decir, la s-GDH oxida no sólo la glucosa sino también varios otros azúcares, incluyendo la maltosa, la galactosa, la lactosa, la manosa, la xilosa y la ribosa (Dokter et al. 1986a; Oubrie A., Biochim. Biophys. Acta 1647:143-151, 2003). La reactividad hacia los azúcares diferentes de la glucosa puede en determinadas casos perjudicar la exactitud de la determinación de los niveles de glucosa en sangre. En particular, los pacientes sometidos a diálisis peritoneal tratados con icodextrina (un polímero de la glucosa) pueden contener en sus líquidos corporales, por ejemplo en la sangre, niveles elevados de otros azúcares, especialmente de maltosa (Wens R. et al., Perit. Dial. Int. 18:603-609, 1998).

Por lo tanto, las muestras clínicas, por ejemplo las obtenidas de pacientes diabéticas, especialmente de pacientes con complicaciones renales y especialmente de pacientes sometidos a diálisis, pueden contener niveles significativos de otros azúcares, especialmente de maltosa. Las determinaciones de glucosa en muestras obtenidas de dichos pacientes críticos pueden resultar alteradas por la maltosa (Frampton J.E. y Plosker G.L., Drugs 63:20792105, 2003).

Existen pocos informes en la literatura sobre intentos para producir s-GDHs dependientes de PQQ modificadas que presenten una especificidad de sustrato alterada. Igarashi S. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 264:820-824, 1999, informan de que la introducción de una mutación puntual en la posición Glu277 conduce a la producción de mutantes con un perfil alterado de especificidad de sustrato.

Sode, patente EP nº 1.176.202, informa de que determinadas sustituciones de aminoácidos dentro de la s-GDH conducen a una s-GDH mutante con una afinidad mejorada para la glucosa. En la patente EP nº 1.167.519, el mismo autor informa de una s-GDH mutante con una estabilidad mejorada. Además, el mismo autor informa en la patente JP nº 2004/173538 de otras s-GDHs mutantes con afinidad mejorada para la glucosa.

En el documento EP nº A-1.367.120 se dan a conocer s-GDH de Acinetobacter calcoacetius modificadas, por ejemplo con las mutaciones Q76N, Q76E, Q76T, Q76M, Q76G ó Q76K. Dichos enzimas mutados mutados presentan una actividad inferior sobre disacáridos y/o una estabilidad térmica inferior en comparación con el enzima de tipo salvaje.

Kratzsch P. et al., patente WO nº 02/34919, informan de que la especificidad de la s-GDH para la glucosa en comparación con otros sustratos azúcares, especialmente en comparación con la maltosa, puede mejorarse mediante sustituciones de aminoácidos en determinadas posiciones de la s-GDH. Resulta crucial una sustitución en la posición aminoácida 348. Una s-GDH mutante que comprende, por ejemplo, una glicina en la posición 348 en lugar de una treonina, tal como se encuentra presente en la s-GDH de tipo salvaje, presenta una selectividad extremadamente mejorada para el sustrato glucosa, comparado con, por ejemplo, el sustrato maltosa. Sin embargo, mientras que se ha informado de bastantes mejoras en la especificidad de glucosa, aparentemente dichas mejoras frecuentemente corren en paralelo con una estabilidad reducida de la s-GDH. Por ejemplo, se ha puesto de manifiesto que la especificidad mejorada de un mutante de s-GDH que comprende una sustitución de aminoácido en la posición 348 se produce a expensas de una menor estabilidad, especialmente a expensas de una menor estabilidad térmica. Sin embargo, la estabilidad resulta crucial, por ejemplo durante la producción y para un almacenamiento de largo plazo, por ejemplo de tiras de ensayo de glucosa.

Por lo tanto, existe una gran demanda y necesidad clínica de formas mutantes de la s-GDH que proporcionen una estabilidad térmica razonable o tanto una estabilidad térmica razonable como una especificidad mejorada para la glucosa como sustrato.

Es el objetivo de la presente invención proporcionar nuevos mutantes o variantes de la s-GDH con una estabilidad térmica mejorada significativamente en comparación con el enzima de tipo salvaje o en comparación con un mutante que presente especificidad mejorada pero una estabilidad reducida.

Se ha encontrado que resulta posible mejorar significativamente la estabilidad térmica de la s-GDH de tipo salvaje, así como de mutantes de s-GDH diseñados para una especificidad mejorada para la glucosa, por ejemplo de una s-GDH mutada en la posición 348, y por lo menos superar parcialmente los problemas anteriormente indicados.

La estabilidad térmica se ha mejorado significativamente al proporcionar una s-GDH mutante según la presente invención tal como se describe en detalle posteriormente en la presente memoria y en las reivindicaciones adjuntas. Debido a la estabilidad térmica mejorada de las nuevas formas de s-GDH, ha resultado posible realizar un avance técnico significativo en las determinaciones de la glucosa en diversos campos de aplicación.

Los mutantes de s-GDH mejorados según la presente invención pueden utilizarse de manera muy ventajosa para la detección o medición específica de la glucosa en muestras biológicas, especialmente utilizando dispositivos de tira de ensayo o biosensores.

Descripción resumida de la invención:

La presente invención se refiere a una proteína mutante de s-GDH dependiente de PQQ caracterizada porque en por lo menos una de las posiciones 122 y 124 se encuentra presente el aminoácido lisina, en la que dichas posiciones corresponden a las posiciones aminoácidas conocidas de la s-GDH de secuencia de tipo salvaje de A. calcoaceticus (SEC ID nº 2).

Las secuencias polinucleótidas codificantes de una proteína mutante de s-GDH según la presente invención, así como un vector de expresión que comprende dicha secuencia polinucleótida y una célula huésped que comprende dicho vector de expresión también representan realizaciones preferentes de la invención.

La invención se refiere además a la utilización de un mutante según la presente invención en un método de medición de la glucosa, especialmente utilizando un dispositivo de tiras de ensayo o con un biosensor.

Los ejemplos, referencias, listado de secuencias y figuras siguientes se proporcionan con el fin de ayudar a la comprensión de la presente invención, el alcance real de la cual se proporciona en las reivindicaciones adjuntas. Debe entenderse que resulta posible llevar a cabo modificaciones de los procedimientos indicados sin apartarse del espíritu de la invención.

Descripción de las figuras

Figura 1:Las secuencias proteicas de la s-GDH dependiente de PQQ de A. calcoaceticus (parte superior) y de la s-GDH de A. baumannii (parte inferior) alineadas según la homología de secuencia.

Figura 2: Ilustración del vector pACSGDH al que se hace referencia en el Ejemplo 1 que contiene las secuencias de ADN de tipo salvaje o mutadas, respectivamente, de la glucosa deshidrogenasa soluble dependiente de PQQ. Figura 3: Secuencia de nucleótidos (ADN) del vector pACSGDH al que se hace referencia en el Ejemplo 1 que contiene la secuencia de ADN de tipo salvaje de la glucosa deshidrogenasa soluble dependiente de PQQ (SEC ID nº 16).

Descripción detallada de la invención:

En una primera realización, la invención se refiere a una proteína mutante de la s-GDH dependiente de PQQ caracterizada porque en por lo menos una de las posiciones 122 y 124 se encuentra presente el aminoácido lisina, en la que dichas posiciones corresponden a las posiciones aminoácidas conocidas de la secuencia de tipo salvaje de la s-GDH de A. calcoaceticus (SEC ID nº 2).

Tal como se ha comentado anteriormente, dos tipos de enzima quinoproteína completamente diferentes con actividad de glucosa deshidrogenasa (unida membrana y soluble) se agrupan juntas bajo EC 1.1.5.2. Estos dos tipos aparentemente no están relacionados entre sí.

Para el propósito de la presente invención únicamente resulta relevante la forma soluble de GDH (s-GDH) y las variantes mejoradas de la misma se comentan posteriormente en la presente memoria.

Es conocido de la técnica que la secuencia de ADN de tipo salvaje de una glucosa deshidrogenasa soluble dependiente de PQQ puede aislarse a partir de cepas de Acinetobacter. Resulta más preferente el aislamiento del tipo de la cepa LMD 79.41 de Acinetobacter calcoaceticus. La secuencia polipeptídica de dicha s-GDH de tipo salvaje (la proteína madura) se proporciona en SEC ID nº 2 y la secuencia de ADN, en SEC ID nº 1, respectivamente. También pueden utilizarse otras cepas LMD de Acinetobacter como fuente de la s-GDH de tipo salvaje. Dichas secuencias pueden alinearse con la secuencia obtenida de A. calcoaceticus y realizar las comparaciones entre las secuencias. Aparentemente también resulta viable cribar bibliotecas de ADN de otras cepas bacterianas, tales como, por ejemplo, las descritas para E. coli K-12 (Oubrie A. et al., J. Mol. Biol. 289:319-333, 1999) e identificar las secuencias relacionadas con s-GDH en dichos genomas. Dichas secuencias y secuencias homólogas no identificadas todavía pueden utilizarse para generar variantes de s-GDH con estabilidad térmica mejorada.

Los resultados de la presente invención se describen en mayor detalle haciendo referencia a las posiciones aminoácidas conocidas de la secuencia SEC ID nº 2, la secuencia de tipo salvaje de s-GDH aislada del tipo de la cepa LMD 79.41 de Acinetobacter calcoaceticus. Las posiciones aminoácidas en aislados de diferentes s-GDH correspondientes a las posiciones en la secuencia SEC ID nº 2 se identifican fácilmente mediante la comparación entre las secuencias apropiadas.

La alineación múltiple y comparación de una secuencia de s-GDH con la secuencia de tipo salvaje de la secuencia SEC ID nº 2 preferentemente se lleva a cabo con el programa PileUp de la versión 10.2 del paquete del GCG (Genetics Computer Group, Inc.). PileUp crea una alineación de múltiples secuencias utilizando una simplificación del método de alineación progresiva de Feng D.F. y Doolittle R.F., J. Mol. Evol. 25:351-360, 1987, y las matrices de puntuación para residuos aminoácidos idénticos, similares o diferentes se definen de acuerdo con lo anteriormente expuesto. Este procedimiento se inicia con la alineación por parejas de las dos secuencias más similares, produciendo una agrupación de dos secuencias alineadas. A continuación, esta agrupación puede alinearse con la siguiente secuencia o agrupación de secuencias alineadas más relacionada. Pueden alinearse dos agrupaciones de secuencias mediante una simple extensión de la alineación por parejas de dos secuencias individuales. La alineación final se consigue mediante una serie de alineaciones progresivas por parejas que incluye secuencias y agrupaciones crecientemente diferentes, hasta incluir todas las secuencias en la alineación por parejas final. De esta manera, las posiciones aminoácidas en otras moléculas homólogas de s-GDH pueden identificarse fácilmente como correspondientes a las posiciones proporcionadas para la s-GDH de A. calcoaceticus en la secuencia SEC ID nº 2. Debido a lo anterior, las posiciones aminoácidas proporcionadas en la presente memoria deben entenderse como posiciones aminoácidas de secuencia SEC ID nº 2 ó como las posiciones correspondientes a las mismas en otra molécula homóloga de s-GDH.

El término “mutante” o “variante” en el sentido de la presente invención se refiere a una proteína de s-GDH que, en comparación con una secuencia de tipo salvaje correspondiente, muestra por lo menos una sustitución de aminoácido en una posición correspondiente a la posición 122 ó 124 de la secuencia SEC ID nº 2, en la que el aminoácido presente en el tipo salvaje se sustituye por lisina. La s-GDH mutante puede comprender otras sustituciones y/o deleciones y/o inserciones, con la condición de que una s-GDH mutante de la invención no difiera en más de 50 aminoácidos de la s-GDH de secuencia SEC ID nº 2, por ejemplo que muestra como máximo 50 sustituciones de aminoácido en total.

Tal como se ha indicado anteriormente, las mejoras de la especificidad de glucosa aparentemente resultan posibles principalmente a expensas de una menor estabilidad. Tal como apreciará el experto en la materia, la estabilidad podría relacionarse con diferentes aspectos, tales como la temperatura de almacenamiento y/o el tiempo de almacenamiento, respectivamente. Los modelos de estrés térmico a corto plazo se utilizan con frecuencia para evaluar la estabilidad. La estabilidad según la presente invención se evalúa en dicho modelo de estrés térmico a corto plazo y se denomina de esta manera, estabilidad térmica. La estabilidad térmica se determina mediante la medición de la actividad del enzima s-GDH no estresado y estresado en una muestra. Fijando la actividad no estresada de la muestra en 10%, puede calcularse en porcentaje la actividad restante tras el tratamiento de estrés. Para los mutantes de la s-GDH con especificidad de sustrato mejorada, se seleccionó 65ºC durante 30 minutos.

5 Mediante la utilización de dichas condiciones, el enzima de tipo salvaje presentaba aproximadamente 80% de su actividad original, mientras que la mayoría de los mutantes con especificidad mejorada para la glucosa presentan únicamente 10% o menos de su actividad enzimática inicial tras llevar a cabo dicho modelo de estrés a corto plazo.

Se ha encontrado que dos posiciones de la s-GDH aparentemente resultan cruciales para conseguir mejoras significativas en términos de estabilidad térmica, es decir, las posiciones 122 y 124. También se ha encontrado que únicamente la sustitución por uno de los 20 aminoácidos naturales, el aminoácido lisina, presenta un efecto drástico sobre la estabilidad térmica. La sustitución por la lisina en la posición 122 y/o 124 mejora la estabilidad térmica del enzima s-GDH de tipo salvaje. El enzima de tipo salvaje es bastante estable pero la estabilidad térmica se mejora adicionalmente con una lisina en la posición 122 y/o 125. Lo que resulta de relevancia significativa es el hecho de que se ha encontrado que dichas sustituciones también presentan un efecto pronunciado sobre la estabilidad

15 térmica de mutantes que previamente habían sido generados para mejorar la especificidad para la glucosa, aunque a expensas de una estabilidad térmica reducida.

En una realización preferente, la s-GDH mutante según la presente invención comprende una lisina en la posición 122, correspondiendo dicha posición a la posición 122 conocida de la s-GDH de A. calcoaceticus de tipo salvaje (secuencia SEC ID nº 2).

En otra realización preferente, la s-GDH mutante según la presente invención comprende una lisina en la posición 124, correspondiendo dicha posición a la posición 124 conocida de la s-GDH de A. calcoaceticus de tipo salvaje (secuencia SEC ID nº 2).

En todavía otra realización preferente, la s-GDH mutante según la presente invención comprende una lisina en las posiciones 122 y 124, correspondiendo dichas posiciones a las posiciones 122 y 124, respectivamente, conocidas

25 de la s-GDH de A. calcoaceticus de tipo salvaje (secuencia SEC ID nº 2).

Tal como se ha indicado anteriormente, resulta crucial que pueda mejorarse la estabilidad térmica de las s-GDH mutantes con especificidad mejorada para la glucosa, por ejemplo de los mutantes dados a conocer en la patente WO nº 02/34919. Se ha encontrado y se ha demostrado que lo anterior puede conseguirse mediante la sustitución de los aminoácidos naturales por una lisina en la posición 122 y/o 124. En una realización muy preferente, por lo tanto, la presente invención se refiere a una s-GDH mutante que comprende una lisina en la posición 122 y/o 124 y que además comprende una o más otras modificaciones que conducen a una especificidad mejorada para la glucosa, especialmente en comparación con la maltosa.

Un mutante preferente según la presente invención se caracteriza porque, respecto al enzima s-GDH de tipo salvaje tal como se aísla a partir de A. calcoaceticus, presenta una especificidad de sustrato mejorada por lo menos dos

35 veces en comparación con por lo menos otro sustrato azúcar seleccionado y simultáneamente presenta una estabilidad térmica que es por lo menos 20% de la estabilidad térmica medida para el enzima de tipo salvaje.

Con el fin de calcular la especificidad de sustrato o la reactividad cruzada, un modo sencillo es fijar la actividad medida con glucosa como sustrato en 100% y comparar la actividad medida con el otro azúcar seleccionado con el valor obtenido con glucosa. En ocasiones, con el fin de evitar redundancias, se utiliza simplemente el término especificidad sin hacer especial referencia a la glucosa, por una parte, y otro sustrato azúcar seleccionado, por otra parte.

El experto en la materia podrá apreciar que la comparación entre actividades enzimáticas se realiza mejor a concentraciones equimolares de las moléculas de sustrato investigadas utilizando condiciones de ensayo bien definidas. De otro modo deberán realizarse correcciones para las diferencias de concentración.

45 Deben seleccionarse condiciones de ensayo estandarizadas y bien definidas con el fin de evaluar (las mejoras de) la especificidad de sustrato. La actividad enzimática de la s-GDH para la glucosa como sustrato, así como para otros sustratos azúcar seleccionados, se mide tal como se describe en la sección de Ejemplos.

Basándose en dichas mediciones de la actividad enzimática para la glucosa o para un azúcar diferente seleccionado, preferentemente la maltosa, se evalúa la reactividad cruzada (y las mejoras de la misma).

La reactividad (cruzada) de la s-GDH para un azúcar seleccionado en porcentaje se calcula como:

imagen1

Se determinó como aproximadamente 105% la reactividad (cruzada) para la maltosa de la s-GDH de tipo salvaje según la fórmula anteriormente indicada (ver el Ejemplo 7). La especificidad (mejorada) se calculó según la fórmula siguiente: 6

imagen1

En comparación con el enzima de tipo salvaje, una forma de s-GDH con una mejora de por lo menos 10 veces de especificidad para la glucosa frente a la maltosa (maltosa/glucosa) con maltosa como sustrato presenta, de acuerdo con lo anterior, como máximo 10,5% de la actividad medida con glucosa como sustrato. Alternativamente, en el caso de que, por ejemplo, una s-GDH mutante presente una reactividad cruzada para la maltosa de 20% (determinada y calculada tal como se ha indicado anteriormente), dicho mutante en comparación con la s-GDH de tipo salvaje presenta, por lo tanto, una especificidad de sustrato (maltosa/glucosa) mejorada en 5,25 veces.

La expresión “actividad específica” para un sustrato es bien conocida de la técnica, preferentemente se utiliza para describir la actividad enzimática por unidad de cantidad de proteína. Diversos métodos son conocidos de la técnica para la determinación de la actividad específica de las moléculas de GDH, utilizando glucosa u otros azúcares como sustratos (Igarashi S. et al., supra, 1999). Un método preferente disponible para dicha medición se describe en detalle en el Ejemplo 8.

Aunque resulta posible seleccionar muchas moléculas de azúcar diferentes e investigar la especificidad para la glucosa de la sGDH en comparación con cualquiera de dichas moléculas de azúcar seleccionadas, resulta preferente seleccionar una molécula de azúcar clínicamente relevante para dicha comparación. Los azúcares seleccionados preferentes se seleccionan de entre el grupo que consiste de manosa, alosa, galactosa, xilosa y maltosa. Preferentemente, se selecciona la maltosa o la glucosa y se somete a ensayo una s-GDH mutante para especificidad de sustrato mejorada para la glucosa en comparación con la galactosa o la maltosa. En una realización adicionalmente preferente, el azúcar seleccionado es la maltosa.

En una realización preferente, una proteína mutante de la s-GDH dependiente de PQQ según la presente invención comprende una lisina en la posición 122 y/o 124 y además una o más sustituciones de aminoácido en una o más posiciones seleccionadas de entre el grupo que consiste de las posiciones 16, 22, 65, 76, 116, 120, 127, 143, 168, 169, 171, 177, 224, 227, 230, 231, 245, 246, 255, 277, 287, 294, 295, 299, 302, 305, 307, 308, 317, 321, 323, 341, 348, 349, 354, 355, 364, 378, 422, 425, 428 y 438. La mayoría de las posiciones anteriormente indicadas se ha demostrado previamente que influyen sobre la especificidad de la s-GDH para la glucosa en comparación con otros azúcares seleccionados, especialmente en comparación con el sustrato maltosa. La exposición total de la patente WO nº 02/34919 se incluye en la presente memoria como referencia.

Tal como se describe en la patente WO nº 02/34919, una sustitución del aminoácido en la posición 348 de la secuencia de la s-GDH correspondiente a la secuencia de tipo salvaje aislada a partir de A. calcoaceticus, puede utilizarse para mejorar significativamente la especificidad para la glucosa de la s-GDH. En una realización especialmente preferente, la presente invención se refiere a una s-GDH mutante que comprende una lisina en la posición 122 y/o 124 y una sustitución de aminoácido en la posición 348. Preferentemente, el residuo treonina en la posición 348 se sustituye por un residuo aminoácido seleccionado de entre el grupo que consiste de alanina, glicina y serina. En una realización más preferente, se utiliza glicina para sustituir la treonina en la posición 348. El término T348G es conocido por el experto en la materia e indica que la treonina en la posición 348 ha sido sustituida por glicina.

En una realización preferente adicional, la s-GDH variante que comprende una lisina en la posición 122 y/o 124 se caracteriza porque el residuo aminoácido asparagina en la posición 428 se sustituye por un residuo aminoácido seleccionado de entre el grupo que consiste de leucina, prolina y valina. Resulta más preferente la sustitución en la posición 428 por prolina.

Un grupo de variantes de s-GDH preferentes según la presente invención que comprenden una lisina en la posición 122 y/o 124 se caracteriza adicionalmente por que el residuo aminoácido treonina en la posición 348 y el aminoácido asparagina en la posición 428 han sido sustituidos los dos, en el que las sustituciones preferentes son las que se han indicado de manera general anteriormente. Los mutantes según la presente invención que comprenden una lisina en la posición 122 y/o 124 opcionalmente pueden modificarse adicionalmente para que comprendan una o más sustituciones de aminoácido en las posiciones aminoácidas correspondientes a las posiciones 169, 171, 245, 341 y/o 349 de la s-GDH de secuencia de tipo salvaje conocida de A. calcoaceticus (SEC ID nº 2).

En el caso de que el aminoácido correspondiente a la posición 169 de la s-GDH de secuencia de tipo salvaje conocida de A. calcoaceticus (SEC ID nº 2) se haya sustituido en una variante de la presente invención, resulta preferente que el aminoácido natural leucina se sustituya por fenilalanina, tirosina o triptófano. Resulta más preferente la sustitución en la posición 169 por fenilalanina.

En el caso de que el aminoácido correspondiente a la posición 171 de la s-GDH de secuencia de tipo salvaje conocida de A. calcoaceticus (SEC ID nº 2) se haya sustituido en una variante de la presente invención, resulta preferente que se sustituya el aminoácido natural tirosina por un aminoácido seleccionado de entre el grupo que consiste de alanina, metionina y glicina. Resulta más preferente la sustitución en la posición 171 por la glicina.

En el caso de que el aminoácido correspondiente a la posición 245 de la s-GDH de secuencia de tipo salvaje conocida de A. calcoaceticus (SEC ID nº 2) se haya sustituido en una variante de la presente invención, resulta preferente que se sustituya el aminoácido natural ácido glutámico por ácido aspártico, asparagina o glutamina. Resulta más preferente la sustitución en la posición 245 por ácido aspártico.

En el caso de que el aminoácido correspondiente a la posición 341 de la s-GDH de secuencia de tipo salvaje conocida de A. calcoaceticus (SEC ID nº 2) se haya sustituido en una variante de la presente invención, resulta preferente que se sustituya el aminoácido natural metionina por valina, alanina, leucina o isoleucina. Resulta más preferente la sustitución en la posición 341 por valina.

En el caso de que el aminoácido correspondiente a la posición 349 de la s-GDH de secuencia de tipo salvaje conocida de A. calcoaceticus (SEC ID nº 2) se haya sustituido en una variante de la presente invención, resulta preferente que se sustituya el aminoácido natural valina por alanina o glicina. Resulta más preferente la sustitución en la posición 349 por alanina.

También se ha encontrado que resulta posible mejorar adicionalmente la especificidad de sustrato de una variante de s-GDH mediante la inserción de un aminoácido entre la posición 428 y 429. Dichos mutantes que comprenden una inserción de aminoácido entre el aminoácido 428 y el aminoácido 429 también representan un material de partida preferente para generar mutantes que muestran tanto una estabilidad mejorada como también una especificidad mejorada. En una realización preferente, la presente invención se refiere a una s-GDH mutante que comprende una lisina en la posición 122 y/o 124, así como una inserción de aminoácido entre la posición 428 y la posición 429 de la s-GDH.

En una realización preferente adicional, la s-GDH mutante según la presente invención, además de presentar una lisina en la posición 122 y/o 124, porta una inserción entre los residuos aminoácidos 428 y 429 y comprende por lo menos dos sustituciones de aminoácido seleccionadas de entre el grupo que consiste de las posiciones 171, 245, 341, 348 y 349, correspondientes a las posiciones aminoácidas de la s-GDH de secuencia de tipo salvaje conocida de A. calcoaceticus (SEC ID nº 2).

En todavía otra realización preferente, la s-GDH mutante según la presente invención, además de presentar una lisina en la posición 122 y/o 124, porta una inserción entre los residuos aminoácidos 428 y 429 y comprende por lo menos tres sustituciones de aminoácido seleccionadas de entre el grupo que consiste de las posiciones 171, 245, 341, 348 y 349, correspondientes a las posiciones aminoácidas de la s-GDH de secuencia de tipo salvaje conocida de A. calcoaceticus (SEC ID nº 2).

Tal como apreciará el experto en la materia, resulta posible realizar sustituciones de aminoácidos, por ejemplo mutaciones silenciosas, que no influyan sobre las propiedades de la s-GDH en grado significativo. La variante según la presente invención presentará, sin embargo, no más de 50 intercambios de aminoácidos en comparación con la secuencia SEC ID nº 2. Preferentemente, la variante comprenderá 20 ó menos sustituciones de aminoácidos, más preferentemente comprenderá sólo 10 sustituciones de aminoácidos o un número todavía inferior de sustituciones.

Se proporcionan algunas variantes específicas de s-GDH según la presente invención en la sección de Ejemplos. Las variantes de s-GDH con baja interferencia de glucosa y estabilidad térmica aceptable comprenden mutantes con sustituciones en las posiciones siguientes: 65+122+124+171+245+341+348+426+428+430+436, 65+122+124+171+245+341+348+426+428+430 y 122+124+171+245+246+341+348+425+428, respectivamente. Dichas tres variantes representan realizaciones preferentes adicionales de la presente invención.

El análisis de secuencias de aminoácidos ha revelado que los motivos de secuencia encontrados en la s-GDH de tipo salvaje de A. calcoaceticus, por una parte, y en A. baumannii, por la otra, aparentemente resultan muy conservadoras en torno a las posiciones 122 y 124, que resultan de gran relevancia para mejorar la estabilidad térmica tal como se ha identificado y demostrado en la presente invención.

Una variante de s-GDH dependiente de PQQ, que comprende la secuencia de aminoácidos TYNKSTD (SEC ID nº 3), en la que se sustituye la asparagina (N) o la serina (S) por una lisina representa una realización preferente de la presente invención. La secuencia SEC ID nº 3 corresponde a las posiciones 120 a 26 de la s-GDH de tipo salvaje de

A. calcoaceticus o a las posiciones 120 a 126 de la s-GDH de tipo salvaje de A. baumannii, aunque comprende una lisina en la posición 122 (=Xaa1) o en la posición 124 (=Xaa2) o en las dos posiciones indicadas, sustituyendo de esta manera los aminoácidos naturales asparagina y/o serina, respectivamente (A. calcoaceticus).

Son conocidas de la técnica numerosas posibilidades para producir proteínas mutantes. Basándose en los importantes resultados de la presente invención, que da a conocer la importancia crítica de una lisina en la posición 122 y/o 124 de una s-GDH mutante, el experto en la materia ahora podría producir fácilmente variantes apropiadas adicionales de s-GDH que porten ésta y otras modificaciones favorables. Dichas variantes pueden obtenerse, por ejemplo, mediante los métodos conocidso como mutagénesis aleatoria (Leung D.W. et al., Technique 1:11-15, 1989) y/o mutagénesis sitio-dirigida (Hill D.E. et al., Methods Enzymol. 155:558-568, 1987). Un método alternativo para producir una proteína con las propiedades deseadas es proporcionar constructos quiméricos que contienen elementos de secuencia procedentes de por lo menos dos fuentes diferentes o para sintetizar por completo un gen de s-GDH apropiado. Dichos procedimientos conocidos de la técnica pueden utilizarse en combinación con la información dada a conocer en la presente invención para proporcionar mutantes o variantes de s-GDH que comprenden, por ejemplo, sustituciones adicionales de aminoácidos en combinación con la importancia crítica dada a conocer de una lisina en la posición 122 y/o 124, por ejemplo de la secuencia SEC ID nº 2.

Una variante de s-GDH según la presente invenicón puede producirse, por ejemplo, partiendo de un gen de s-GDH aislado del tipo de la cepa LMD 79.41 de Acinetobacter calcoaceticus, así como partiendo de una secuencia homóloga. En el contexto de la presente solicitud, el término “homólogo” pretende comprender una secuencia de aminoácidos de s-GDH con una identidad de por lo menos 90% en comparación con la secuencia SEC ID nº 2. En otras palabras, tras la alineación correcta utilizando el programa PileUp, por lo menos 90% de los aminoácidos de dicha s-GDH homóloga son idénticos a los aminoácidos indicados en la secuencia SEC ID nº 2.

Se entenderá que las variaciones de las secuencias de ADN y de aminoácidos existen naturalmente, o pueden introducirse intencionadamente utilizando métodos conocidos de la técnica. Dichas variaciones pueden resultar en como máximo 10% de diferencias de aminoácidos en la secuencia total debidas a deleciones, sustituciones, inserciones, inversiones o adiciones de uno o más residuos aminoácidos en dicha secuencia en comparación con la secuencia SEC ID nº 2. Pueden realizarse dichas sustituciones de aminoácidos basándose, por ejemplo, en la similitud de polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o la naturaleza anfipática de los residuos implicados. Por ejemplo, entre los aminoácidos de carga negativa se incluyen el ácido aspártico y el ácido glutámico; entre los aminoácidos de carga positiva se incluyen la lisina y la arginina; entre los aminoácidos con grupos de cabeza polar sin carga o grupos de cabeza no polares que presentan valores de hidrofilicidad similares se incluyen los siguientes: leucina, isoleucina, valina, glicina, alanina, asparagina, glutamina, serina, treonina, fenilalanina y tirosina. Entre otras variaciones contempladas se incluyen las sales y ésteres de los polipéptidos anteriormente indicados, así como los precursores de los polipéptidos anteriormente indicados, por ejemplo precursores que presentan una sustitución N-terminal, tal como metionina o N-formilmetionina que se utiliza como secuencia líder. Pueden realizarse dichas variaciones sin apartarse innecesariamente del alcance y espíritu de la presente invención.

Según procedimientos conocidos del estado de la técnica o según procedimientos proporcionados en la sección de ejemplos, resulta posible obtener secuencias polinucleótidas codificantes de cualquiera de las s-GDHs mutantes tal como se ha comentado anteriormente. Por lo tanto, la invención comprende también secuencias polinucleótidas aisladas codificantes de proteínas s-GDH mutantes según la presente invención tal como se ha indicado anteriormente.

La presente invención incluye además un vector de expresión que comprende una secuencia de ácidos nucleicos según la presente invención operablemente ligada a una secuencia promotora capaz de dirigir su expresión en una célula huésped.

La presente invención incluye además un vector de expresión que comprende una secuencia de ácidos nucleicos según la presente invención operablemente ligada a una secuencia promotora capaz de dirigir su expresión en una célula huésped. Los vectores preferentes son plásmidos tales como pACSGDH mostrados en las figuras 2 y 3.

Los vectores de expresión que resultan útiles en la presente invención típicamente contienen un origen de replicación, una resistencia antibiótica para la selección, un promotor para la expresión y la totalidad o parte de la variante del gen de s-GDH. Los vectores de expresión también pueden incluir otras secuencias de ADN conocidas de la técnica, tales como secuencias de señal (para una mejora del plegado, transporte hacia el periplasma o secreción), inductores para una modulación mejor de la expresión, o sitios de corte para la clonación.

Las características del vector de expresión seleccionado deben ser compatibles con la célula huésped que debe utilizarse. Por ejemplo, durante la clonación en un sistema de células E. coli, el vector de expresión debería contener promotores aislados a partir del genoma de las células E. coli (por ejemplo lac o trp). Pueden utilizarse orígenes de replicación adecuados, tales como el origen de replicación ColE1 de plásmido. Entre los promotores adecuados se incluyen, por ejemplo, lac y trp. También resulta preferente que el vector de expresión incluya una secuencia codificante de un marcador de selección tal como un gen de resistencia antibiótica. A modo de marcadores seleccionables puede utilizarse convenientemente la resistencia a la ampicilina o la resistencia a la canamicina. Todos dichos materiales son conocidos de la técnica y se encuentran disponibles comercialmente. Pueden construirse vectores de expresión adecuados que contengan las secuencias codificantes y de control deseados, utilizando técnicas de ADN recombinante estándares conocidas de la técnica, muchas de las cuales se describen en Sambrook et al., en: “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1989.

La presente invención se refiere además a células huésped que contienen un vector de expresión que comprende una secuencia de ADN codificante de la totalidad o parte de la s-GDH mutante. Las células huésped preferentemente contienen un vector de expresión que comprende la totalidad o parte de una de las secuencias de ADN codificantes de una s-GDH mutante que presenta una o más mutaciones mostradas en los Ejemplos 2 a 8. Entre las células huésped adecuadas se incluyen, por ejemplo, E. coli HB101 (ATCC nº 33694) disponibles de Promega (2800 Woods Hollow Road, Madison, WI, USA), XL1-Blue MRF’, disponible de Stratagene (11011 Nort Torrey Pine Road, La Jolla, CA, USA) y similares.

Pueden introducirse vectores de expresión en células huésped mediante diversos métodos conocidos de la técnica. Por ejemplo, la transformación de células huésped con vectores de expresión puede llevarse a cabo mediante el método de transformación de protoplasto mediada por polietilenglicol (Sambrook et al. supra, 1989). Sin embargo, también pueden utilizarse otros métodos para introducir vectores de expresión en células huésped, por ejemplo la electroporación, la inyección de bolo, o la fusión de protoplasto.

Tras introducir un vector de expresión que contiene una variante de s-GDH en una célula huésped apropiada, ésta puede cultivarse bajo condiciones que permitan la expresión de las variantes de s-GDH deseadas. Las células huésped que contienen el vector de expresión deseado con la secuencia de ADN codificante de la totalidad o parte de la s-GDH mutante pueden identificarse fácilmente mediante selección con antibióticos. La expresión de las variantes de s-GDH puede identificarse mediante diferentes métodos, tales como la medición de la producción de transcritos de ARNm de s-GDH, la detección del producto génico inmunológicamente, o la detección de la actividad enzimática del producto génico. Preferentemente se utiliza un ensayo enzimático.

La presente invención también enseña la generación y cribado de mutantes de s-GDH. La mutagénesis aleatoria y la mutagénesis de saturación se llevan a cabo tal como es conocido de la técnica. Las variantes se criban para estabilidad térmica (actividad sin tratamiento de estrés térmico en comparación con la actividad restante tras el tratamiento de estrés térmico). Las condiciones de ensayo seleccionadas se adaptan para garantizar que puedan medirse las pequeñas mejoras esperadas producidas por, por ejemplo, la sustitución de un único aminoácido. Un modo preferente de selección o cribado de mutantes apropiados se proporciona en el Ejemplo 3. Cualquier cambio o mejora en comparación con el enzima de partida (mutante o de tipo salvaje) puede detectarse claramente.

Evidentemente debe entenderse que no todos los vectores de expresión y secuencias reguladoras de ADN funcionarán igualmente bien para expresar las secuencias de ADN de la presente invención. Asimismo, tampoco funcionarán bien con el mismo sistema de expresión todas las células huésped. Sin embargo, un experto ordinario en la materia realizará una selección apropiada de entre los vectores de expresión, secuencias reguladoras de ADN y células huésped utilizando las guías proporcionadas en la presente memoria sin necesidad de experimentación indebida.

La invención también se refiere a un procedimiento para producir variantes de s-GDH de la presente invención, que comprende cultivar una célula huésped de la invención bajo condiciones adecuadas para la producción de la s-GDH mutante de la invención. Para las células huésped bacterianas, las condiciones de cultivo típicas son un medio líquido que contiene fuentes de carbono y nitrógeno, y el agente antibiótico y de inducción adecuado (dependiendo del vector de expresión utilizado). Entre los antibióticos apropiados típicos se incluyen ampicilina, canamicina, cloranfenicol, tetraciclina y similares. Entre los agentes de inducción típicos se incluyen IPTG, glucosa, lactosa y similares.

Resulta preferente que los polipéptidos de la presente invención se obtengan mediante la producción en células huésped que expresan una secuencia de ADN codificante de la s-GDH mutante. Los polipéptidos de la presente invención también pueden obtenerse mediante traducción in vitro del ARNm codificado por una secuencia de ADN codificante de la s-GDH mutante. Por ejemplo, las secuencias de ADN pueden sintetizarse tal como se ha indicado anteriormente e insertarse en un vector de expresión adecuado que, a su vez, puede utilizarse en un sistema de transcripción/traducción in vitro.

Un vector de expresión que comprende un polinucleótido aislado tal como se ha definido e indicado anteriormente operablemente ligado a una secuencia promotora capaz de promover su expresión en un sistema de síntesis de péptidos libre de células representa otra realización preferente de la presente invención.

Los polipéptidos producidos mediante, por ejemplo, procedimientos tales como los indicados anteriormente, seguidamente puede aislarse y purificarse utilizando diversas técnicas rutinarias de purificación de proteínas. Por ejemplo pueden utilizarse procedimientos cromatográficos tales como la cromatografía de intercambio iónico, la cromatografía de filtración en gel y la cromatografía de afinidad.

Unas de las aplicaciones principales de las variantes de s-GDH mejoradas de la presente invención es la utilización en tiras de ensayo para el seguimiento del nivel de glucosa en sangre en pacientes diabéticos. La insensibilidad de la glucosa deshidrogenasa dependiente de PQQ al oxígeno resulta, tal como se ha comentado anteriormente, una gran ventaja sobre la glucosa oxidasa. La interferencia debido a, por ejemplo, la maltosa, la galactosa y/o otros azúcares relacionados que pueden encontrarse presentes en una muestra que debe analizarse, ahora puede reducirse significativamente utilizando las nuevas variantes de s-GDH que presentan tanto una estabilidad térmica mejorada como también una especificidad mejorada hacia la glucosa. Evidentemente deben investigarse muchos tipos de muestra. Los líquidos corporales tales como suero, plasma, líquido intestinal u orina son fuentes preferentes para dichas muestras. La invención también comprende un método para detectar, determinar o medir la glucosa en una muestra utilizando una s-GDH mutante según la presente invención. Resulta especialmente preferente que el método mejorado de detección de glucosa en una muestra se caracteriza porque dicha detección, determinación o medición de la glucosa se lleva a cabo utilizando un dispositivo sensor o de tira de ensayo.

También se encuentra comprendido dentro del alcance de la presente invención un dispositivo para la detección o medición de glucosa en una muestra que comprende una s-GDH mutante según la presente invención, así como otros reactivos necesarios para dicha medición.

Las variantes de s-GDH con estabilidad térmica mejorada de la presente invención también pueden utilizarse muy ventajosamente en biosensores (D’Costa E.J. et al., Biosensores 2:71-87, 1986; Laurinavicius V. et al., Analytical Letters 32:299-316, 1999; Laurinavicius V. et al., Monatshefte fuer Chemie 130:1269-1281, 1999; Malinauskas A. et al., Sensors and Actuators, B: Chemical 100:395-402, 2004) para el seguimiento en línea de la glucosa en una muestra o en un reactor. Con este fin, las variantes de s-GDH pueden utilizarse, por ejemplo, para recubrir un electrodo vítreo insensible al oxígeno con un complejo de osmio que contiene una red epoxi de conducción redox (Ye et al., supra, 1993) para la determinación más exacta de la concentración de glucosa.

En los ejemplos siguientes, todos los reactivos, enzimas de restricción y otros materiales se obtuvieron de Roche Diagnostics, Alemania, a menos que se especifiquen otras fuentes comerciales, y se utilizaron según las instrucciones proporcionadas por los suministradores. Las operaciones y métodos utilizados para la purificación, caracterización y clonación del ADN son bien conocidos de la técnica (Ausubel F. et al., en: "Current protocols in molecular biology" (Wiley, 1994) y pueden adaptarse según requiera el experto en la materia.

Los ejemplos siguientes ilustran adicionalmente la presente invención. Estos ejemplos no pretenden limitar el alcance de la presente invención, sino permitir una mejor comprensión de la misma.

Ejemplo 1

Clonación y expresión en E. coli de la glucosa deshidrogenasa dependiente de PQQ soluble de A. calcoaceticus de tipo salvaje

Se aisló el gen de s-GDH de Acinetobacter calcoaceticus cepa LMD 79.41 siguiendo procedimientos estándares. Se subclonó el gen de s-GDH de tipo salvaje en un plásmido que contenía el promotor mgI para una expresión ajustable (ver la solicitud de patente WO nº 88/09373). El nuevo constructo se denominó pACSGDH (ver las figuras 2 y 3). Se introdujeron los plásmidos recombinantes en un organismo huésped seleccionado de entre el grupo de E. coli. A continuación, se cultivaron dichos organismos bajo condiciones apropiadas y se seleccionaron las colonias que mostraban actividad de s-GDH.

Se aisló el plásmido pACSGDH a partir de un cultivo de 200 ml durante la noche del clon indicado anteriormente utilizando el kit QIAGEN Plasmid Maxi (Qiagen) siguiendo el protocolo del fabricante. Se resuspendió el plásmido en 1 ml de agua bidestilada. Se determinó la concentración del plásmido utilizando un fotómetro Beckman DU 7400.

El rendimiento fue de 600 μg. A continuación, se determinó la calidad del plásmido mediante electroforesis en gel de agarosa.

Ejemplo 2:

PCR mutagénica

Para generar mutaciones aleatorias en el gen de s-GDH, se llevó a cabo una PCR (reacción en cadena de la polimerasa) mutagénica. Se digirieron el plásmido pACSGDH y la secuencia de ADN codificante de los enzimas mutados (producto de PCR de la PCR mutagénica) con los enzimas de restricción SphI y EcoRI. Los productos se purificaron en gel. Las secuencias de ADN digeridos se ligaron y se utilizó una alícuota de la mezcla de reacción de ligación para transformar células E. coli competentes. A continuación, se seleccionaron los transformantes en placas LB que contenían ampicilina. Se seleccionaron colonias individuales, se cultivaron durante la noche en medio LB que contenía ampicilina y se sometieron a cribado (ver el Ejemplo 3).

Mezcla de reacción de PCR mutagénica:

40 ng de pACSGDH

1x tampón sin MgCl2 (Roche Diagnostics GmbH, nº de cat. 1699 105)

dCTP, dTTP 1 mM

dATP, dGTP 0,2 mM (Roche Diagnostics GmbH, nº de cat. 1969 064),

40 pmoles de cebador GF23 (5’-CGC GCA CGC GCA TGC CGC CGA TGT TC)(= SEC ID nº 4), 40 pmoles de GR23 (5’-GAC GGC CAG TGA ATT CTT TTC TA) (= SEC ID nº 5), MgCl2 7 mM

MnCl2 0,6 mM

5 U de ADN polimerasa Taq (Roche Diagnostics GmbH, nº de cat. 1146 165) sistema de PCR de amp. genica 2400 (Perkin Elmer), 30 ciclos: 95ºC durante 1 minuto, 45ºC durante 2 minutos, 72ºC durante 2 minutos

 Purificación de los productos de PCR utilizando el kit de purificación de productos de PCR de alta pureza de Roche Diagnostics GmbH (nº de cat. 1.732.676) siguiendo el protocolo del fabricante.

 Digestión de los fragmentos de PCR con 25 U de SphI (Roche Diagnostics GmbH, nº de cat. 606 120) en 1x tampón H (Roche Diagnostics GmbH, nº de cat. 1.417.991) a 37ºC durante la noche; adición de 25 U de

EcoRI (Roche Diagnostics GmbH, nº de cat. 703.737) y la digestión adicional durante 3,5 horas.

 Digestión de 50 pg de pACSGDH con 180 U de SphI y 180 U de EcoRI en 1x de tampón H durante 4 horas a 37ºC.

 Electroforesis en gel de pACSGDH digerido y de los fragmentos digeridos utilizando geles de agarosa (al 5 0,8%).

 Extracción de las moléculas de ADN utilizando el kit de extracción en gel QIAquick (Qiagen, nº de cat. 28706) siguiendo el protocolo del fabricante.

 Determinación de la concentración de los fragmentos y del vector digerido utilziando un fotómetro Beckman DU 7400.

10  Determinación de la calidad de los productos purificados mediante electroforesis en gel de agarosa.

 Ligación de 100 ng de vector digerido con 140 ng de fragmentos de mPCR utilizando 1 U de ADN ligasa de T4 (Roche Diagnostics GmbH, nº de cat. 481 220) en un volumen de 20 μl a 16ºC durante la noche.

 Electroporación de células XL1F electrocompetentes (Stratagene) con 1 μl de la reacción de ligación con 2,5 kV en cubetas de 0,2 cm utilizando un pulsador para E. coli de BioRad (BioRad).

15  Tras el cultivo en 1 ml de LB a 37ºC durante una hora, se sembraron bacterias en placas de LB-agar más ampicilina (100 μg/ml de ampicilina) y se cultivaron durante la noche a 37ºC.

 50% de los clones expresados produjeron s-GDH enzimáticamente activa que se sometió al método de cribado siguiente.

Ejemplo 3:

20 Cribado para estabilidad térmica

Las colonias mutantes en las placas de agar indicadas anteriormente se introdujeron en placas de microtitulación (MTPs) que contenían 200 μl de medio LB-ampicilina/pocillo y se incubaron durante la noche a 37ºC. Estas placas se denominaron placas maestras.

De cada placa maestra, se transfirieron 5 μl de muestra/pocillo a una MTP que contenía 5 μl per/pocillo de B

25 (B=reactivo de extracción de proteínas bacterianas; Pierce nº 78248) para la rotura celular y se añadieron 240 μl de quinona de pirroloquinolina (PQQ) 0,0556 mM, Hepes 50 mM, CaCl2 15 mM, pH 7,0/pocillo para la activación de s-GDH. Para completar la formación del holoenzima, se incubó la MTP a 25ºC durante 2 horas y a 10ºC durante la noche. Esta placa se denomina placa de trabajo.

De la placa de trabajo se transfirieron 2x10 μl de muestra/cavidad a dos MTPs vacías. Se sometió una MTP a un

30 estrés térmico de corta duración (30 minutos a 70ºC/incubador). Tras enfriar hasta la temperatura ambiente, se sometieron a ensayo las MTP sometidas a estrés y no tratadas con 90 μl de solución de mediador que contenía glucosa 30 mM (ver el Ejemplo 8).

Se calculó la dE/minuto y se fijó en 100% de actividad los valores de las muestras no sometidas a estrés. Los valores obtenidos con la MTP sometida a estrés térmico se compararon con los valores no tratados y se calcularon

35 como porcentaje de actividad (por ejemplo: dE/minuto tratamiento térmico/dE no tratado)*100). Esto es equivalente a la estabilidad térmica del enzima (variante) expresada en porcentaje de actividad restante. Con el fin de compensar las desviaciones de los resultados debidas a una fluctuación en la distribución del calor en las MTPs durante la incubación, se añadió enzima de tipo salvaje como referencia a cada placa en cavidades dedicadas.

Se identificó el mutante siguiente:

Enzima

% de actividad restante tras 30 minutos a 70ºC Intercambios de aminoácidos

Tipo salvaje

3-20% -

Mutante A

9-30 % N122K, L202I

La variabilidad de la actividad restante se debe a la distribución irregular del calor en los pocillos en la MTP y a la degradación del holoenzima durante el calentamiento a apoenzima y coenzima y el reensamblado espontáneo a holoenzima tras el estrés térmico. Sin embargo, el mutante A mostró consistentemente un valor más alto de la actividad enzimática restante que el enzima de tipo salvaje.

Ejemplo 4:

Secuenciación del gen codificante de la s-GDH mutante A

Se aisló el plásmido que contenía el gen para la s-GDH mutante A, que presentaba una estabilidad térmica más alta que el tipo salvaje (kit de aislamiento de plásmido de alta pureza, Roche Diagnostics GmbH, nº 1754785) y se secuenció utilizando un kit de secuenciación de pigmento-terminador ABI Prism y secuenciador ABI 3/73 y 3/77 (Amersham Pharmacia Biotech).

Se utilizaron los cebadores siguientes:

Cadena de sentido:

GDH 1: 5’-TTA ACG TGC TGA ACA GCC GG-3’ (= SEC ID nº 6)

GDH 2: 5’-ATA TGG GTA AAG TAC TAC GC -3’ (= SEC ID nº 7)

Resultado:

Se encontraron los intercambios de aminoácidos del mutante A ya listados en la tabla del Ejemplo 3.

Ejemplo 5:

s-GDH mutantes obtenidos mediante mutagénesis de saturación

Se llevó a cabo la mutagénesis de saturación para ver si uno o ambos intercambios de aminoácidos en el mutante A eran responsables de la mejora de la estabilidad térmica. Además, el método permite averiguar si el efecto encontrado puede potenciarse con otros intercambios de aminoácidos en las posiciones identificadas. El kit de mutagénesis sitio-dirigida QuikChange (Stratagene, nº de cat. 200518) se utilizó para sustituir sucesivamente aminoácidos de tipo salvaje en las posiciones 122 y 202 de la proteína s-GDH de tipo salvaje, respectivamente.

Los cebadores 5' y 3' utilizados para la mutagénesis eran complementarios entre sí y contenían NNN en una posición central. Dichos 3 nucleótidos sintetizados aleatoriamente, que se encuentran en la posición deseada (122 ó 202, respectivamente) se encontraban flanqueados por 12 a 16 nucleótidos en cada extremo que eran idénticos a las cadenas de ADN de sentido y antisentido del molde. En lugar del codón, el cebador contenía NNN, por lo tanto los oligonucleótidos codifican todos los codones posibles.

Para cada una de las posiciones 122 y 202, respectivamente, se llevó a cabo una reacción de PCR.

Las reacciones de PCR y las digestiones con endonucleasa de restricción DpnI se llevaron a cabo según el manual. A continuación, se utilizó 1 μl de cada reacción para la electroporación de las células XL1F-. Se cultivaron las células y se determinaron las actividades de s-GDH tal como se ha indicado anteriormente.

Para incrementar la probabilidad estadística de que la totalidad de las 20 posibles sustituciones de aminoácidos se encontrasen cubiertas en dicha evaluación, se cribaron 200 clones (ver el Ejemplo 3) para cada posición. Se utilizaron los cebadores siguientes:

para la posición 122:

Cadena de sentido: 5’- TCGTTATACCTATNNNAAATCAACAGATA -3’ (SEC ID nº 8) Cadena antisentido 5’TATCTGTTGATTTNNNATAGGTATAACGA-3’ (SEC ID nº 9) para la posición 202:

Cadena de sentido: 5’-TAAAGTACTACGCNNNAATCTTGATGGAA-3’ (SEC ID nº 10) Cadena antisentido: 5’TTCCATCAAGATTNNNGCGTAGTACTTTA -3’ (SEC ID nº 11)

Resultados:

El intercambio de aminoácido en la posición 202 no modificó la estabilidad térmica. Únicamente el tambaleo en la posición 122 produjo clones con una estabilidad térmica incrementada. El mejor intercambio era N122K.

Ejemplo 6:

Generación de mutantes con elevada especificidad de sustrato para la glucosa en comparación con la maltosa y estabilidad térmica incrementada

En la patente WO nº 02/34919 se han identificado varios intercambios de aminoácidos en diferentes posiciones de la s-GDH y se ha demostrado que incrementan la especificidad de sustrato para la glucosa en comparación con, por ejemplo, la maltosa. Las combinaciones del intercambio de aminoácido T348G con sustituciones de aminoácidos en otras posiciones, por ejemplo en las posiciones 169, 171, 245, 341 y/o 349 incrementó la especificidad de sustrato adicionalmente. Se seleccionaron algunos de dichos mutantes descritos con el fin de mejorar su estabilidad térmica mediante la introducción del intercambio de aminoácido N122K encontrado. Se consiguió la mutación puntual mediante la utilización de los cebadores siguientes.

Cadena de sentido: 5’-TCGTTATACCTATAAGAAATCAACAGATA -3’ (SEC ID nº 12) Cadena antisentido: 5’-TATCTGTT-GATTTCTTATAGGTATAACGA-3’ (SEC ID nº 13) Se aplicó el mismo cribado para la estabilidad térmica, tal como en el Ejemplo 3 descrito, aunque se redujo la

temperatura de incubación de 70ºC a 65ºC en 30 minutos.

Resultados:

Enzima

Maltosa/Glucosa (30 mM de azúcar en %) % de actividad restante tras 30 minutos a 65ºC Intercambios de aminoácidos

Tipo salvaje

105 % 80 % -

Molde B/0

4 % 5 % Y171G+E245D+M341V+ T348G+in429P

Mutante B/1

4% 10 % N122K+Y171G+E245D+M341V+ T348G+in429P

Molde C/0

2 % 10 % Y171G+E245D+M341V+ T348G+A426S+N428P+Q430M

Mutante C/1

2 % 20 % N122K+Yl7lG+E245D+M341V+ T348G+A426S+N428P+Q430M

Molde D/0

4 % 20 % Y171G+E245D+Q246H+M341V+ T348G+T425V+N428P

Mutante D/1

4 % 30 % Y171G+N122K+E245D+Q246H+M341V+ T348G+T425V+N428P

Puede observarse claramente que en todos los tipos de mutante, el intercambio de aminoácido adicional N122K produjo un incremento de la estabilidad térmica en el modelo de estrés seleccionado sin afectar a la especificidad de 10 sustrato.

Ejemplo 7:

Generación de mutantes de elevada especificidad de sustrato y estabilidad térmica adicionalmente incrementada

Durante el cribado para una especificidad de sustrato incrementada, tal como se describe en, por ejemplo, la patente 15 WO nº 02/34919, la utilización de m-PCR y la mutagénesis de saturación en posiciones aleatorias, se expandió el espectro de los parámetros de cribado para la estabilidad térmica tal como se ha descrito anteriormente.

Partiendo de un mutante E/0 con elevada especificidad de sustrato para la glucosa en comparación con la maltosa (2%) con los intercambios de aminoácidos Y171G+E245D+M341V+T348G+N428P, se encontró un nuevo intercambio de aminoácido S124K.

20 A continuación, se aplicó dicho nuevo intercambio a los mutantes ya mejorados que contenían N122K del Ejemplo 6, utilizando los cebadores siguientes:

Cadena de sentido: 5’-CCTATAAGAAAAAGACAGATACGCTCG-3’ (SEC ID nº 14)

Cadena antisentido: 5’-CGAGCGTATCTGTCTTTTTCTTATAGG-3' (SEC ID nº 15)

Resultados:

25 Los resultados anteriormente proporcionados demuestran que los intercambios de aminoácidos en las posiciones N122K y S124K presentan un efecto positivo aditivo sobre la estabilidad térmica de los mutantes.

Enzima

Maltosa/Glucosa (30 mM de azúcar en %) % de actividad restante tras 30 minutos a 65ºC Intercambios de aminoácidos

Tipo salvaje

105 % 80 % -

Mutante B/1

4 % 10 % N122K+Y171G+E245D+M341V+ T348G+in429P

Mutante B/2

4 % 15 % N122K+S124K+Y171G+E245D+M341 V+ T348G+in429P

Mutante C/1

2 % 20 % N122K+Y171G+E245D+M341V+ T348G+A426S+N428P+Q430M

Mutante C/2

2 % 25 % N122K+S124K+Y171G+E245D+M341 V+ T348G+A426S+N428P+Q430M

Mutante D/1

4 % 30 % N122K+Y171G+E245D+Q246H+M341 V+ T348G+T425V+N428P

Mutante D/2

4 % 40 % N122K+124K+Y171G+E245D+Q246H +M341V+ T348G+T425V+N428P

Mutante E/0

2 % 10 % Y171G+E245D+M341V+ T348G+N428P

Mutante E/1

2% 20% Y171G+S124K+E245D+M341V+T348 G+N428P

Ejemplo 8:

5 Purificación de s-GDH de tipo salvaje o variante y análisis de la actividad enzimática, respectivamente

Se cultivaron células de E. coli (LB-Amp., 37ºC), se recolectaron y se resuspendieron en tampón fosfato potásico, pH 7,0. Se llevó a cabo la rotura celular mediante paso a través de una prensa francesa (700 a 900 bar).

Tras la centrifugación, se aplicó el sobrenadante a una columna de S-sefarosa (Amersham Pharmacia Biotec) equilibrada con tampón de fosfato potásico 10 mM, pH 7,0.

10 Tras el lavado, se eluyó la s-GDH utilizando un gradiente salino de NaCl 0 a 1 M. Las fracciones que mostraban actividad de s-GDH se agruparon, se dializaron frente a tampón de fosfato potásico, pH 7,0, y se cromatografiaron nuevamente en una columna de S-sefarosa reequilibrada. Las fracciones activas se agruparon y se sometieron a una filtración en gel utilizando una columna Superdex® 200 (Amersham). Las fracciones activas se agruparon y tras la adición de CaCl2 (concentración final: 3 mM), se almacenaron a -20ºC.

15

Ensayo enzimático y determinación de proteínas de s-GDH de tipo salvaje y variante purificadas, respectivamente.

La determinación de las proteínas se llevó a cabo utilizando el reactivo de ensayo de proteínas nº 23225 de Pierce (curva de calibración con BSA, 30 minutos a 37ºC).

20 Las muestras de s-GDH se diluyeron a 1 mg de proteína/ml con quinona de pirroloquinolina (PQQ) 0,0556 mM, Hepes 50 mM, CaCl2 15 mM, pH 7,0, y se incubaron a 25ºC durante 30 minutos para la reconstitución o activación. Tras la activación, las muestras se diluyeron con Hepes 50 mM, CaCl2 15 mM, pH 7,0, hasta aproximadamente 0,02 U/ml y se añadieron 50 μl de cada muestra diluida a 1.000 μl de una solución de tampón citrato 0,2 M (pH 5,8, a 25ºC) que contenía 0,315 mg de (4-(dimetilfosfinilmetil)-2-metil-pirazolo[1.5a]-imidazol-3-il)-(4-nitrosofenil)-amina (ver

25 la patente US nº 5.484.708)/ml como mediador y azúcar 30 mM).

Se realizó el seguimiento de la extinción a 620 nm durante los primeros 5 minutos a 25ºC. Una actividad enzimática de una unidad corresponde a la conversión de 1 mmol de mediador/minuto bajo las condiciones de ensayo anteriormente indicadas.

imagen2

Se llevó a cabo el ensayo con glucosa y maltosa (Merck, Alemania), respectivamente.

Resultados:

Enzima

M/G (30 mM de azúcar, en %) U/mg de proteína Intercambios de aminoácidos

Tipo salvaje

105 % 800 -

B/2

4 % 106 N122K+S124K+Y171G+E245D+M341V+ T348G+in429P

C/0

2 % 435 Y171G+E245D+M341V+ T348G+A426S+N428P+Q430M

C/2

2 % 450 N122K+S124K+Y171G+E245D+M341V+ T348G+A426S+N428P+Q430M

D/2

4 % 441 N122K+S124K+Y171G+E245D+Q246H+M 341V+ T348G+T425V+N428P

Ejemplo 9:

5 Estabilidad térmica comparativa de mutantes purificados con y sin los intercambios de aminoácidos N122K y S124K

Las muestras de s-GDH purificadas de tipo salvaje, mutante C/0 y C/2 (Ejemplo 8) se sometieron a un modelo de estrés térmico alternativo que imitaba las condiciones de estrés térmico de producción y/o transporte. Se prepararon soluciones de 1 mg de proteína enzima/fosfato potásico 20 mM, pH 7,0, 0,016 mg de PQQ/ml con el fin de activar las

10 s-GDHs. Tras la incubación durante 30 minutos a temperatura ambiente, se determinó la actividad inicial hacia la glucosa (ver el Ejemplo 8) y se incubaron las muestras en el baño de agua a 48ºC. Tras 30 minutos de estrés térmico, se midió la actividad restante y se calculó en porcentaje (en comparación con la actividad inicial).

Resultados:

Enzima

Actividad restante

Tipo salvaje

99 %

C/0

66 %

C/2

94 %

15

El impacto de los intercambios de aminoácidos en las posiciones N122K y S124K y la mejora resultante de la estabilidad térmica pueden observarse claramente, también bajo dichas condiciones alternativas de estrés térmico.

Ejemplo 10:

Determinación de la glucosa en presencia o en ausencia de maltosa

20 La s-GDH de tipo salvaje y las variantes B/2, C/2 y D/2 de la s-GDH, respectivamente, pueden aplicarse a la determinación de la glucosa en presencia o en ausencia de maltosa. La muestra de referencia contenía 50 mg de glucosa/dl. Las muestras “de ensayo” contenían 50 mg de glucosa/dl y 100 ó 200 mg/dl de maltosa, respectivamente. Se utilizaron soluciones enzimáticas con las mismas cantidades de actividad de s-GDH (por ejemplo 5 U/ml; actividad según se determinó en el Ejemplo 8) para cada ensayo.

25 Se mezclaron en una cubeta: 1 ml 0,315 mg de (4-(dimetilfosfinilmetil)-2-metil-pirazolo-[1.5a]-imidazol-3-il)-(4nitrosofenil)-amina ml/citrato 0,2 M, pH 5,8 0,033 ml de referencia o muestra de ensayo

Se inició el ensayo mediante la adición de 0,050 ml de la solución de enzima s-GDH (que presenta un exceso de s-GDH para la conversión de la glucosa) a la cubeta. Se realizó un seguimiento del cambio de la absorbancia a 620 nm. Tras 2 a 5 minutos, se observaron valores constantes y se calculó la dE/5 minutos. Se fijó en 100% el valor

30 obtenido mediante la medición de la muestra de referencia con s-GDH de tipo salvaje. Se compararon los otros valores a dicho valor de referencia y se calcularon en %.

Se detectó un nivel claramente inferior de interferencia de la maltosa en las muestras de ensayo al utilizar las nuevas variantes, también más estables, de s-GDH según la presente invención. 16

Lista de referencias

imagen1

imagen1

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Roche Diagnostics GmbH 5 F. Hoffmann-La Roche AG

<120> Mutantes de glucosa deshidrogenasa dependiente de quinona de pirroloquinolina

<130> 22804 WO

<150> EP04024593

<151> 2004-10-15 10 <160> 16

<170> PatentIn versión 3.2

<210> 1

<211> 1362

<212> ADN 15 <213> Acinetobacter calcoaceticus

<220> 45

<221> CDS

<222> (1)..(1362)

<400> 1

imagen1

imagen1

imagen1

<210> 2

<211> 454

<212> PRT

<213> Acinetobacter calcoaceticus

<400> 2

imagen1

imagen1

imagen1

<210> 3

<211> 7

<212> PRT 5 <213> Artificial

<220>

<223> secuencia de aminoácidos modificada de s-GDH entre las posiciones 120 y 126

<220>

<221> misc_feature 10 <223> Asn en la posición 3 (122) y/o Ser en la posición 5 (124) es/son sustituido/sustituidos por Lys

<400> 3

imagen1

<210> 4

<211> 26 23

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador para la cadena de sentido de m-PCR

<400> 4 cgcgcacgcg catgccgccg atgttc 26

<210> 5

<211> 23

<212> ADN

<213> Artificial

<220> <223> Cebador para la cadena antisentido de m-PCR

<400> 5 gacggccagt gaattctttt cta 23

<210> 6

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220> <223> Cadena de sentido del cebador de secuenciación GDH 1

<400> 6 ttaacgtgct gaacagccgg 20

<210> 7

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220> 45

<223> Cadena de sentido de cebador de secuenciación GDH 2

<400> 7 atatgggtaa agtactacgc 20

<210> 8

<211> 29

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador para tambaleo en la posición 122 (cadena de sentido)

<220>

<221> misc_feature

<222> (14)..(16)

<223> n is a, c, g ó t

<400> 8 tcgttatacc tatnnnaaat caacagata 29

<210> 9

<211> 29

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador para tambaleo en la posición 122 (cadena antisentido)

<220>

<221> misc feature

<222> (14)..(16)

<223> n is a, c, g ó t

<400> 9 tatctgttga tttnnnatag gtataacga 29

<210> 10

<211> 29

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador para tambaleo en la posición 202 (cadena de sentido)

<220>

<221> misc feature

<222> (14)..(16)

<223> n is a, c, g ó t

<400> 10 taaagtacta cgcnnnaatc ttgatggaa 29

<210> 11

<211> 29

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador para tambaleo en la posición 202 (cadena antisentido)

<220>

<221> misc feature

<222> (14)..(16)

<223> n is a, c, g ó t

<400> 11 ttccatcaag attnnngcgt agtacttta 29

<210> 12

<211> 29

<212> ADN

<213> Artificial

<220> <223> Secuencia de cebador para la cadena de sentido N122K

<400> 12 tcgttatacc tataagaaat caacagata 29

<210> 13

<211> 29

<212> ADN

<213> Artificial

<220> <223> Secuencia de cebador para la cadena antisentido N122K

<400> 13 tatctgttga tttcttatag gtataacga 29

<210> 14

<211> 27

<212> ADN

<213> Artificial <220><223> Secuencia de cebador de la cadena de sentido N122K y S124K

<400> 14 cctataagaa aaagacagat acgctcg 27

<210> 15

<211> 27

<212> ADN

<213> Artificial <220><223> Secuencia de cebador de la cadena antisentido N122K y S124K

<400> 15 cgagcgtatc tgtctttttc ttatagg 27

<210> 16

<211> 4373

<212> ADN

<213> Artificial

<220> <223> Vector de secuencia pACSGDH

<400> 16

imagen1

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Claims (16)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Proteína mutante de la s-GDH dependiente de PQQ que presenta una mayor estabilidad térmica que la s-GDH de tipo salvaje, caracterizada porque en por lo menos una de las posiciones 122 y 124, se encuentra presente el aminoácido lisina, en la que dichas posiciones corresponden a las posiciones aminoácidas conocidas de la secuencia de tipo salvaje de la s-GDH de A. calcoaceticus SEC ID nº 2 y en la que dicha proteína presenta una identidad de por lo menos 90% respecto a la secuencia SEC ID nº 2.

2. 2.

   Mutante según la reivindicación 1, en el que el aminoácido en la posición 122 es una lisina.

3. 3.

   Mutante según la reivindicación 1, en el que el aminoácido en la posición 124 es una lisina.

4. 4.

   Mutante según la reivindicación 1, en el que el aminoácido lisina se encuentra presente tanto en la posición 122 como en la 124.

5. 5.

   Mutante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende además una o más sustituciones de aminoácidos en una o más posiciones seleccionadas de entre el grupo que consiste de las posiciones 16, 22, 65, 76, 116, 120, 127, 143, 168, 169, 171, 177, 224, 227, 230, 231, 245, 246, 255, 277, 287, 294, 295, 299, 302, 305, 307, 308, 317, 321, 323, 341, 348, 349, 354, 355, 364, 378, 422, 425, 428 y 438

6. 6.

   Mutante según la reivindicación 5, en el que dicha sustitución o sustituciones adicionales de aminoácidos es una sustitución en la posición 348.

7. 7.

   Mutante según la reivindicación 5, en el que dicha sustitución o sustituciones adicionales de aminoácidos es una sustitución en la posición 428.

8. 8.

   Mutante según la reivindicación 5, en el que dicha sustitución o sustituciones adicionales de aminoácidos es una sustitución tanto en la posición 348 como en la 428.

9. 9.

   Mutante según la reivindicación 6, en el que la treonina en la posición 348 se sustituye por alanina, glicina o serina.

10. 10.

    Polinucleótido aislado codificante de la proteína s-GDH mutante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

11. 11.

    Vector de expresión que comprende un polinucleótido aislado según la reivindicación 10 operablemente ligado a una secuencia promotora capaz de promover la expresión de dicho polinucleótido en una célula huésped.

12. 12.

    Célula huésped que comprende el vector de expresión según la reivindicación 11.

13. 13.

    Procedimiento para producir variantes de s-GDH que comprende cultivar la célula huésped según la reivindicación 12 bajo condiciones adecuadas para la producción de las variantes enzimáticas.

14. 14.

    Método para detectar, determinar o medir glucosa en una muestra utilizando una s-GDH mutante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, comprendiendo dicha mejora la puesta en contacto de la muestra con el mutante.

15. 15.

    Método según la reivindicación 14, caracterizado además porque dicha detcción, determinación o medición de glucosa se lleva a cabo utilizando un dispositivo sensor o de tira de ensayo.

16. 16.

    Dispositivo para la detección o medición de glucosa en una muestra que comprende una s-GDH mutante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y otros reactivos necesarios para dicha medición.