ES2370812T3 - Variantes de glucosa dehidrogenasa soluble, dependiente de pirroloquinolina quinona. - Google Patents

Abstract

Mutante de forma soluble de EC 1,199,17, también conocida como dehidrogenasa de glucosa soluble dependiente de PQQ (s-GDH) estando caracterizado dicho mutante porque, con respecto a la enzima de tipo natural correspondiente y con respecto, como mínimo, a otro sustrato de azúcar seleccionado, tiene, como mínimo dos veces, una mayor especificidad de sustrato incrementada, para la glucosa, de manera que dicha mejora de la especificidad se calcula de acuerdo con la fórmula: actividad mutante glucosa actividad azúcar seleccionado tipo natural especificidad (mejora) = -------------------------------------------X----------------------------------------------------actividad glucosa tipo natural actividad mutante azúcar seleccionado, en la que dicho mutante comprende una sustitución de residuo de aminoácido en la posición de aminoácido correspondiente a la posición 348 de la secuencia de tipo natural de s-GDH conocida desde A. Calcoaceticus (SEQ ID NO: 24).

Description

Variantes de glucosa dehidrogenasa soluble, dependiente de pirroloquinolina quinona

La presente invención se refiere a variantes mejoradas de glucosa dehidrogenasa soluble (s-GDH), dependientes de pirroloquinolina quinona (PQQ), a genes que codifican s-GDH mutadas, a proteínas mutantes de s-GDH con especificidad mejorada de sustrato para la glucosa y a diferentes aplicaciones de estas variantes de s-GDH particularmente para determinar concentraciones de azúcar, especialmente de glucosa, en una muestra.

Se han caracterizado dos tipos de glucosa dehidrogenasa (EC 1.1.99.17) dependientes de PQQ: Una es (m-GDH) unida a membrana y la otra es soluble (s-GDH). Ninguno de estos tipos comparte ninguna homología de secuencia significativa (Cleton-Jansen, A. M., y otros, Mol Gen Genet 217 (1989) 430-6; Cleton-Jansen, A. M., y otros, Antonie Van Leeuwenhoek 56 (1989) 73-9; Oubrie, A., y otros, Proc Natl Acad Sci U S A 96 (1999) 11787-91). También son distintas respecto a su cinética y también a sus propiedades inmunológicas (Matsushita, K., y otros, Bioscience Biotechnology & Biochemistry 59 (1995) 1548-1555).

Las quinoproteínas utilizan quinona como co-factor para oxidar alcoholes, aminas y aldosas a sus correspondientes lactonas, aldehídos y ácidos aldólicos (Duine, J. A. Energy generation and the glucose dehydrogenase pathway in Acinetobacter in "The Biology of Acinetobacter" (1991) 295-312, New York, Plenum Press; Duine, J. A., Eur J Biochem 200 (1991) 271-84, Davidson, V. L. -in "Principles and applications of quinoproteins" (1993), todo el libro, New York, Marcel Dekker; Anthony, C., Biochem J 320 (1996) 697-711 ;Anthony, C. and Ghosh, M., Current Science 72 (1997) 716-727; Anthony, C., Biochem Soc Trans 26 (1998) 413-7; Anthony, C. and Ghosh, M., Prog Biophys Mol Biol 69 (1998) 1-21). Entre las quinoproteínas, las que contienen el co-factor unido de forma no covalente 2,7,9tricarboxi-1H-pirrolo [2,3-f]quinolina-4,5-diona (PQQ) constituyen el subgrupo más importante (Duine 1991, supra). Todas las dehidrogenasas de glucosa bacterianas conocidas hasta el momento pertenecen a este subgrupo siendo PQQ el grupo protésico (Anthony y Ghosh 1997, supra, Goodwin y Anthony 1998, supra).

En las bacterias hay dos tipos completamente distintos de glucosa dehidrogenasas dependientes de PQQ (EC1.1.99.17): el tipo soluble (s-GDH) y el tipo unido a membrana (m-GDH) (Duine y otros, 1982; Matsushita y otros, 1989a,b). Los m-GDH están extendidos entre las bacterias gram-negativas, las s-GDH, no obstante, se han encontrado solamente en el especio periplasmático de cepas de Acinetobacter, tales como A. calcoaceticus (Duine, 1991a; Cleton-Jansen y otros, 1988; Matsushita y Adachi, 1993) y A. Baumannii (JP 11243949).

Por investigación de bases de datos de secuencias se han identificado dos secuencias homólogas a la A. calcoaceticus s-GDH de longitud completa en E.coli K-12 y Synechocystis sp. Además, se han encontrado también dos secuencias incompletas homólogas de A. calcoaceticus s-GDH en el genoma de P.aeruginosa y Bordetella pertussis (Oubrie y otros 1999a), respectivamente. Las secuencias de aminoácidos deducidas de estas cuatro proteínas no caracterizadas están íntimamente relacionadas con A. calcoaceticus s-GDH con muchos residuos en el lugar putativamente activo conservados de manera absoluta. Estas proteínas homólogas es probable que tengan una estructura similar y que catalicen reacciones similares dependientes de PQQ (Oubrie y otros, 1999a).

Las s-GDH y m-GDH bacterianas, se ha observado que poseen secuencias muy diferentes y diferente especificidad de sustrato. Por ejemplo, la A. calcoaceticus contiene dos dehidrogenasas de glucosa dependientes de PQQ distintas, una m-GDH que es activa in vivo y la otra, indicada s-GDH para la que se puede demostrar solamente actividad in vitro. Cleton-Jansen y otros, (1988;1989a,b) clonaron los genes que codifican para dos enzimas GDH y determinaron las secuencias de ADN de estos dos genes de GDH. No hay homología evidente entre m-GDH y s-GDH corroborando el hecho de que m-GDH y s-GDH representan dos moléculas completamente diferentes.

El gen de s-GDH procedente de A. calcoaceticus ha sido clonado en E. coli detrás de una secuencia líder y un promotor fuerte. Después de ser sintetizado en la célula, el s-GDH es trasladado a través de la membrana citoplasmática hacia dentro del espacio periplásmico (Duine, J. A. Energy generation and the glucose dehydrogenase pathway in Acinetobacter in "The Biology of Acinetobacter" (1991) 295-312, New York, Plenum Press, Matsushita, K. y Adachi, O. Bacteria quinoproteins glucose dehydrogenase and alcohol dehydrogenase in "Principles and applications of Quinoproteins" (1993) 47-63, New York, Marcel Dekker). Igual que los s-GDH nativos procedentes de A. calcoaceticus, s-GDH expresado en E. coli es también un homodímero con una molécula de PQQ y tres iones calcio por monómero (Dokter y otros, 1986 supra,1987 supra1988 supra; Olsthoorn, A. y J. Duine, J. A., Arch Biochem Biophys 336 (1996) 42-8; Oubrie, A., y otros, J Mol Biol 289 (1999) 319-33, Oubrie, A., y otros, Proc Natl Acad Sci U S A 96 (1999) 11787-91, Oubrie, A., y otros, Embo J 18 (1999) 5187-94). La s-GDH oxida una amplia gama de mono y disacáridos a las correspondientes cetonas que hidrolizan adicionalmente a los ácidos aldónicos y también es capaz de donar electrones a PMS (metosulfato de fenazina), DCPIP (2,6-diclorofenolindofenol), WB (Wurster’s blue) (Azul de Wurster) y ubiquinonas de cadena corta, tales como ubiquinona Q1 y ubiquinona Q2 (Matsushita, K., y otros, Biochemistry 28 (1989) 6276-80; Matsushita, K., y otros, Antonie Van Leeuwenhoek 56 (1989) 63-72), varios aceptadores de electrones artificiales tales como metil sulfato de N-metilfenazonio (Olsthoorn,

A. J. y Duine, J. A., Arch Biochem Biophys 336 (1996) 42-8 ; Olsthoorn, A. J. y Duine, J. A., Biochemistry 37 (1998) 13854-61) y polímeros electroconductores (Ye, L., y otros, Anal. Chem. 65 (1993) 238-41).

En vistas de la alta actividad específica de las s-GDH hacia la glucosa (Olsthoorn, A. J. y Duine, J. A., Arch Biochem Biophys 336 (1996) 42-8) y su amplia especificidad de aceptador de electrones artificial, la enzima es muy adecuada para aplicaciones analíticas, particularmente para su utilización en biosensores o tiras de pruebas para determinada acción de glucosa en aplicaciones de diagnóstico (Kaufmann y otros, 1997 supra).

La oxidación de la glucosa puede ser catalizada, como mínimo, por tres grupos de enzimas completamente distintas, es decir, por dehidrogenasas de glucosa enlazadas por covalente, dependientes de NAD, por flavoproteína glucosa oxidasa o por las GDH de quinoproteína (Duine 1995). Se ha observado una autooxidación más bien lenta de s-GDH reducidas, demostrando que el oxígeno es un mal aceptador de electrones para s-GDH (Olsthoorn y Duine 1996). La s-GDH puede ceder electrones eficazmente a PMS, DCPIP, WB y a ubiquinonas de cadena corta, tales como Q1 y Q2, pero no puede ceder eficazmente electrones directamente al oxígeno.

Las tiras tradicionales de pruebas y sensores para controlar el nivel de glucosa en sangre, suero y orina, por ejemplo, de pacientes diabéticos, utilizan glucosa oxidasa. No obstante, dado que la glucosa oxidasa transfiere sus electrones al oxígeno, es conocido que el oxígeno puede tener un impacto negativo en las mediciones de glucosa que se basan en esta enzima. La ventaja más importante de las dehidrogenasas de glucosa dependientes de PQQ es su independencia del oxígeno. Esta importante característica se explica, por ejemplo, en el documento US

6.103.509 en el que se han investigado algunas características de GDH unida a membrana.

Una importante aportación en este sector ha sido la utilización de s-GDH junto con sus sustratos apropiados. Se dan a conocer en detalle métodos de ensayo y dispositivo de banda de pruebas basados en s-GDH en el documento US

5.484.708. Esta patente contiene también información detallada en la organización de ensayos y producción de tiras de pruebas basadas en s-GDH para la medición de glucosa. Los métodos descritos en aquél documento, así como los documentos citados, se incluyen en el actual a título de referencia. Otras patentes o solicitudes relativas al sector y que comprenden información específica de varias modalidades de aplicaciones para enzimas con actividad dehidrogenasa de glucosa son los documentos US 5.997.817; US 6.057.120; EP 620 283; y JP 11-243949-A.

Un sistema comercial que utiliza s-GDH y un indicador que produce un cambio de color cuando tiene lugar la reacción (Kaufmann y otros, 1997) es el sistema Glucotrend® distribuido por Roche Diagnostics GmbH.

A pesar de las importantes ventajas que se han descrito, existe también un problema importante intrínseco de s-GDH. s-GDH tiene más bien un espectro de sustrato amplio en comparación con m-GDH. Es decir, s-GDH oxida, no solamente glucosa, sino también otros varios azúcares, incluyendo maltosa, galactosa, lactosa, manosa, xilosa y ribosa (Dokter y otros, 1986a). La reactividad hacia azúcares distintos de la glucosa puede dificultar en algunos casos la exactitud de la determinación de los niveles de glucosa en sangre en algunos pacientes diabéticos. En pacientes específicos, sometidos a diálisis peritoneal tratados con icodextrina (un polímero de glucosa) pueden contener en sus fluidos corporales, por ejemplo en la sangre, elevados niveles de otros azúcares, especialmente maltosa (Wens, R., y otros, Perit Dial Int 18 (1998) 603-9).

Por lo tanto, muestras clínicas, por ejemplo las obtenidas de pacientes diabéticos, especialmente pacientes con complicaciones renales y especialmente de pacientes sometidos a diálisis, pueden contener niveles significativos de otros azúcares, especialmente maltosa. Las determinaciones de la glucosa en muestras obtenidas a partir de dichos pacientes críticos se pueden ver dificultadas por la maltosa.

Hay pocos informes en la literatura científica sobre intentos de producir s-GDH dependientes de PQQ modificada que muestren especificidad de sustrato alterada. Debido a un resultado negativo, la mayor parte de estos esfuerzos no han sido publicados. Igarashi, S., y otros, (1999) indica que la introducción de una mutación de punto en la posición Glu277 conduce a mutantes con perfil de especificidad de sustrato alterado. No obstante, ninguno de estos mutantes conduce a una especificidad mejorada, por lo menos dos veces, para la glucosa, por ejemplo en comparación con xilosa, galactosa o maltosa.

El documento EP 1 176 202 es técnica anterior de acuerdo con Art 54(3) EPC. Da a conocer los mutantes Asn452Thr, Asn457lle, Asp 457Asn que tienen especificidad mejorada para la glucosa en comparación con lactosa o maltosa.

Se puede resumir en que los intentos conocidos en la técnica destinados a mejorar las características de s-GDH, especialmente su especificidad hacia la glucosa, no han tenido éxito para ampliar de manera requerida para un control preciso de los niveles de glucosa en pacientes que tienen también elevados niveles de azúcares distintos a la glucosa.

Por lo tanto, existe una elevada demanda y necesidad clínica de formas mutantes de s-GDH caracterizadas por una especificidad mejorada para la glucosa como sustrato.

Ha sido el objetivo de la presente invención dar a conocer nuevos mutantes o variantes de s-GDH con especificidad de sustrato significativamente mejorada para la glucosa, en comparación con otras moléculas de azúcares seleccionados, tales como, por ejemplo, galactosa o maltosa.

De manera sorprendente se ha descubierto que es posible mejorar significativamente la especificidad de sustrato de s-GDH para la glucosa en comparación con otros azúcares y superar, por lo menos parcialmente, los problemas anteriormente conocidos en esta técnica.

La especificidad de sustrato para la glucosa en comparación con otras moléculas de azúcar seleccionadas ha sido mejorada significativamente al prever s-GDH mutante, de acuerdo con la presente invención, tal como se describe a continuación y en las reivindicaciones adjuntas. Debido a la especificidad mejorada de sustrato de las nuevas formas de s-GDH es posible un avance técnico significativo para las determinaciones de glucosa en diferentes campos de aplicación.

Resumen de la invención

Se ha descubierto de manera sorprendente que es posible conseguir mutantes de s-GDH con especificidad de sustrato mejorada hacia la glucosa como sustrato en comparación con otros azúcares seleccionados. Se dan a conocer nuevas variantes de s-GDH que muestran una especificidad de sustrato significativamente más elevada para la glucosa, en especial en comparación con la maltosa.

También se dan a conocer moléculas mutantes de s-GDH que en comparación con la enzima de tipo natural muestran actividad específica esencialmente igual para la glucosa como sustrato pero actividad marcadamente reducida para otras moléculas de azúcar seleccionadas.

Esta comparación de actividad específica de un mutante para una de las otras moléculas de sustrato se basa en relación con las actividades enzimáticas originales de una encima de tipo natural y se calcula con respecto a la misma, por ejemplo, aislada de Acinetobacter calcoaceticus.

También se prevén proteínas s-GDH mutadas así como secuencias de polinucleótidos que codifican para dichas proteínas, que muestran características mejoradas, especialmente especificidad incrementada para la glucosa.

Se ha descubierto que los mutantes de s-GDH que comprenden, como mínimo, una sustitución de aminoácido en una posición de aminoácido que corresponde a una posición de la secuencia de tipo natural de s-GDH conocidos por A. calcoaceticus (SEQ ID NO: 24) seleccionados entre el grupo que consiste en las posiciones 348 y 428 proporcionan enzimas s-GDH con características mejoradas, especialmente especificidad mejorada para la glucosa. Las variantes que comprenden una sustitución en la posición 348 muestran un notable efecto positivo sobre la especificidad de la glucosa.

Los mutantes de s-GDH mejorados pueden ser utilizados de manera muy ventajosa para la detección específica o medición de glucosa en muestras biológicas, especialmente en dispositivos formados por tiras de prueba o biosensores.

Los siguientes ejemplos, referencias, listado de secuencias y figuras se facilitan para ayudar a la comprensión de la presente invención, cuyo ámbito real es indicado en las reivindicaciones adjuntas. Se comprenderá que se pueden introducir modificaciones en los procedimientos indicados sin alejarse del espíritu de la invención.

Descripción de las figuras

Figura 1: Secuencia de nucleótico (ADN) del gen dehidrogenasa de glucosa soluble dependiente de PQQ de Acinetobacter calcoaceticus y la correspondiente secuencia de aminoácido (SEQ ID NO: 23).

Figura 2: Secuencias de proteína de s-GDH (superior) dependiente de PQQ de A. calcoaceticus y s-GDH (inferior) de A. baumannii, alineadas de acuerdo con homología de secuencia.

Figura 3: Ilustración del vector pACSGDH referido al ejemplo 1, conteniendo el tipo natural de las secuencias de ADN mutado de glucosa dehidrogenasa soluble dependiente de PQQ.

Figura 4: Secuencia de nucleótido (ADN) del vector pACSGDH referido al ejemplo 1 conteniendo la secuencia de ADN de tipo natural de glucosa dehidrogenasa (SEQ ID NO: 25) soluble dependiente de PQQ.

Descripción detallada de la invención

En una primera realización, la invención se refiere a un mutante de la forma soluble de EC 1.1.99.17, también conocida como glucosa dehidrogenasa (s-GDH) soluble dependiente de PQQ, estando caracterizado dicho mutante porque con respecto a la correspondiente enzima de tipo natural y en referencia, como mínimo, a otros sustratos de azúcar seleccionado, tiene, como mínimo, una especificidad de sustrato mejorada de tipo doble para glucosa, en el que dicha mejora de especificidad es calculada de acuerdo con la siguiente fórmula:

en el que dicho mutante comprende una sustitución de residuo de aminoácido en la posición de aminoácido que corresponde a la posición 348 de la secuencia de tipo natural de s-GDH conocida a partir de A. calcoaceticus (SEQ 5 ID NO: 24).

Las directrices indicadas en la presente invención son aplicadas fácilmente para cualquier aislado de s-GDH conocido o incluso desconocido. Estos aislados de tipo natural pueden ser utilizados para evaluar las mejoras relativas de la especificidad para las variantes generadas a partir de las mismas.

10 La enzima de tipo natural de la cepa LMD 79.41 de tipo Acinetobacter calcoaceticus que corresponde a SEQ ID NO: 24 es bien conocida y está bien caracterizada. En caso de que una enzima distinta de tipo natural sometida a investigación no esté bien caracterizada, es ventajoso utilizar la s-GDH procedente de la cepa LMD 79.41 de tipo Acinetobacter calcoaceticus como referencia. En otra realización preferente, se comparan las características de una

15 variante mejorada de s-GDH a esta enzima de tipo natural. La presente invención se refiere, por lo tanto, a un mutante de s-GDH cuyo mutante está caracterizado porque con respecto a la enzima de tipo natural de SEQ ID NO: 24 y con respecto, como mínimo, a otro sustrato de azúcar seleccionado tiene como mínimo especificidad de sustrato incrementada al doble para la glucosa.

20 Tal como se ha explicado anteriormente, se han caracterizado hasta la fecha dos familias de enzimas completamente diferentes con actividad de glucosa dehidrogenasa, agrupadas conjuntamente con la sigla EC1.1.99.17. No obstante, estas dos familias de enzimas no parecen estar relacionadas entre si.

A los efectos de la invención, solamente la forma soluble de GDH (s-GDH) es relevante y se explican variantes 25 mejoradas de la misma más adelante.

Es conocido en esta técnica que la secuencia de ADN de tipo natural de una glucosa dehidrogenasa soluble dependiente de PQQ puede ser aislada de cepas de Acinetobacter. Es más preferente el aislamiento de la cepa LMD 79.41 de tipo Acinetobacter calcoaceticus. La secuencia de esta s-GDH de tipo natural (proteína madura) se 30 facilita en la figura: 1 y SEQ ID NO: 24. Otras cepas LMD de Acinetobacter pueden ser utilizadas también como fuente de s-GDH de tipo natural. Estas secuencias se pueden alinear a la secuencia obtenida de A. calcoaceticus y se pueden hacer comparaciones de secuencias (ver figura: 2). También parece factible rastrear las bibliotecas de ADN de otras cepas bacterianas, tal como se describen, por ejemplo, para E.coli K-12 (Oubrie, A., y otros, J Mol Biol 289 (1999) 319-33) en lo anterior e identificar secuencias relacionadas con s-GDH en dichos genomas. Estas

35 secuencias y secuencias homólogas todavía no identificadas pueden ser utilizadas para generar mutantes de s-GDH con mejor especificidad del sustrato para la glucosa.

El término “mutante” o “variante” en el sentido de la presente invención, se refiere a una proteína de s-GDH que comparada a una secuencia de tipo natural correspondiente muestra, como mínimo, una sustitución de aminoácido.

40 Los expertos en el sector apreciarán que hay varias posibilidades para producir polinucleótidos que codifican para una secuencia de polipéptido de dicha s-GDH mutada. Desde luego, también es posible generar mutantes que comprenden una o varias adiciones o delecciones de aminoácidos.

Un mutante, de acuerdo con la presente invención, se caracteriza porque con respecto a la enzima correspondiente 45 de tipo natural tiene, como mínimo, una especificidad de sustrato mejorada en un valor doble para la glucosa en comparación, como mínimo, con otro sustrato de azúcar seleccionado.

A efectos de calcular la especificidad del sustrato o reactividad cruzada, una forma sencilla consiste en disponer la actividad medida con glucosa como sustrato a 100% y comparar la actividad medida con el otro azúcar seleccionado

50 al valor de la glucosa. En algunos casos, a efectos de no ser redundante, se utiliza simplemente el término especificidad sin hacer especial referencia a la glucosa por una parte, y a otro sustrato de azúcar seleccionado por otra.

Los expertos en la materia observarán que la comparación de las (re-) actividades se hace mejor a concentraciones 55 equimolares de las moléculas del sustrato investigado utilizando condiciones bien definidas de ensayo. De otro modo, se tienen que hacer correcciones para diferencias en las concentraciones.

Se han escogido condiciones de ensayo normalizadas y bien definidas a efectos de evaluar especificidad (mejoras en). La actividad enzimática de s-GDH para la glucosa como sustrato y también para otros sustratos de azúcar seleccionados se mide tal como se describe en el ejemplo 6.

5 Basándose en estas mediciones, se evalúa la reactividad cruzada y la especificidad (mejoras en).

La reactividad (cruzada) de s-GDH para un azúcar seleccionado en porcentaje es calculado como reactividad cruzada [(%)] = (actividad azúcar seleccionado / actividad glucosa) x 100%.

10 La reactividad (cruzada) para la s-GDH de la maltosa de tipo natural, de acuerdo con la siguiente fórmula, ha sido determinada aproximadamente en 105%. Se ha medido la reactividad (cruzada) de s-GDH de tipo natural para galactosa en un valor aproximado de 50% (ver tabla 1). La especificidad (mejorada) se calcula de acuerdo con la siguiente fórmula:

En comparación con la enzima de tipo natural, una forma s-GDH que tiene, como mínimo, una mejora por un factor doble en la especificidad para la glucosa, con respecto a la maltosa (maltosa/glucosa) de acuerdo con la maltosa como sustrato, tiene como máximo 52,5% de la actividad medida con la glucosa como sustrato. Sin embargo, si, por

20 ejemplo, un s-GDH mutante tiene una reactividad cruzada para la maltosa de 20% (determinada y calculada tal como se ha descrito anteriormente), este mutante, en comparación con s-GDH de tipo natural, tiene, por lo tanto, una mejora según un factor 5,25 en la especificidad del sustrato (maltosa/glucosa).

El término “actividad específica” para un sustrato es bien conocido en este técnica, siendo preferentemente utilizado

25 para describir la actividad enzimática por cantidad de proteína. Se conocen varios métodos en la técnica para determinar la actividad específica de las moléculas de GDH, utilizando glucosa u otros azúcares como sustratos (Igarashi, S.,y otros, Biochem Biophys Res Commun 264 (1999) 820). Uno de los métodos disponibles para dicha medición se describe en detalle en la sección de ejemplos.

30 Si bien es posible seleccionar muchas moléculas de azúcar distintas e investigar la especificidad de la glucosa de s-GDH en comparación con cualquier molécula de azúcar seleccionado, se prefiere seleccionar una molécula de azúcar clínicamente relevante para esta comparación. Se seleccionan azúcares seleccionados preferentemente del grupo que consiste en manosa, alosa, galactosa, xilosa y maltosa. Más preferentemente, la maltosa o galactosa son seleccionadas y el s-GDH mutante se prueba para especificidad mejorada del sustrato para la glucosa en

35 comparación con galactosa o maltosa. En una realización preferente adicional, el azúcar seleccionado es maltosa.

Se ha descubierto de manera sorprendente que las mejoras en la especificidad de la glucosa de la s-GDH mutada, por ejemplo maltosa con respecto a glucosa, son muy considerables. Por lo tanto, es preferible que dicha especificidad del sustrato para la glucosa en comparación con la especificidad del sustrato para, como mínimo, otro

40 de los sustratos de azúcar seleccionados, se mejore en un factor mínimo de tres. Otras realizaciones preferentes comprenden mutantes de s-GDH caracterizados por una especificidad de sustrato mejorada para la glucosa que es, por lo menos, 5 veces superior o también de modo preferente, como mínimo, 10 veces superior en comparación con la otra molécula de azúcar seleccionada.

45 Las mutaciones en s-GDH conducen en muchos casos a variantes de enzimas con actividad específica drásticamente reducida para la glucosa como sustrato. Esta disminución en actividad específica (absoluta o global) para el sustrato de glucosa, no obstante, puede ser crítica para aplicaciones rutinarias. De modo sorprendente, se ha descubierto que la especificidad mejorada para la glucosa no debe tener lugar a expensas de una reducción notable de la actividad específica general. Por lo tanto, es preferente que la s-GDH con especificidad mejorada con

50 respecto al sustrato de glucosa muestre, como mínimo, 10% de la actividad específica para glucosa, según medición con la enzima de tipo natural. Desde luego, es más preferible que dichas enzimas mutadas muestren, como mínimo, 20% o de modo más preferente, como mínimo 50%, de la actividad de glucosa respectiva de la s-GDH de tipo natural.

55 En otra realización adicional preferente, la invención se refiere a un mutante de forma soluble de EC1.1.99.17 también conocido como glucosa dehidrogenasa (s-GDH) soluble dependiente de PQQ, cuyo mutante se caracteriza porque:

a) la reactividad específica del sustrato hacia la glucosa es esencialmente igual a la de la enzima de tipo natural, y b) la reactividad específica del sustrato hacia la maltosa es 30% o menos en comparación con la enzima de tipo natural.

La reactividad específica del sustrato (también llamada actividad específica) hacia la glucosa, se considera que es esencialmente igual a la de la enzima de tipo natural, si como mínimo, 50% de la actividad enzimática original para la glucosa de la enzima de tipo natural se mantiene. También son preferentes los mutantes que muestran, como mínimo, 80% o preferentemente más, como mínimo 90% de la actividad específica para la glucosa medida para la enzima de tipo natural.

De manera muy sorprendente se ha descubierto que es posible obtener estos mutantes o variantes de s-GDH, que en comparación con s-GDH de tipo natural muestran esencialmente igual actividad enzimática para la glucosa, pero, no obstante, reactividad específica del sustrato significativamente reducida hacia otros azúcares seleccionados, especialmente hacia la maltosa. Los mutantes caracterizados porque la reactividad específica del sustrato hacia la glucosa es esencialmente igual a la de la enzima de tipo natural y porque la reactividad específica del sustrato hacia la maltosa es 20% o menos en comparación con la enzima de tipo natural, son preferibles. Son preferibles adicionalmente los mutantes para los que la actividad específica de la maltosa es de 15% o incluso solamente 10%

o menos de la actividad específica de la maltosa medida para la enzima correspondiente de tipo natural, mientras que la reactividad específica para la glucosa es esencialmente igual a la actividad específica para la glucosa de la enzima de tipo natural correspondiente.

En el caso en que la enzima de tipo natural no está bien caracterizada, es preferible utilizar la s-GDH de la cepa LMD 79.41 de tipo Acinetobacter calcoaceticus como referencia. En otra realización preferente, las características de una variante mejorada de s-GDH se comparan a la enzima de tipo natural y la presente invención se refiere, por lo tanto, a un mutante de s-GDH, estando caracterizado dicho mutante en que con respecto a la enzima de tipo natural de SEQ ID NO: 24 muestra esencialmente igual actividad enzimática para la glucosa pero reactividad específica del sustrato significativamente reducida (como mínimo, 70% menos) hacia, como mínimo, otro sustrato de azúcar seleccionado.

De manera inesperada, se ha descubierto que es posible generar mutantes de s-GDH con especificidad substitutiva mejorada y de manera incluso más inesperada se ha descubierto que son solamente unas pocas posiciones de aminoácidos bien definidas las que son de mayor relevancia a este respecto.

Los logros de la presente invención se describen en mayor detalle haciendo referencia a posiciones de aminoácidos conocidas a partir de SEQ ID NO: 24, secuencia de tipo natural de s-GDH aislada a partir de la cepa LMD 79.41 de tipo Acinetobacter calcoaceticus. Las posiciones de aminoácidos en diferentes aislados de s-GDH correspondientes a posiciones de SEQ ID NO: 24 son identificadas fácilmente por comparación apropiada de secuencias. Preferentemente, el programa PileUp es utilizado para evaluar la homología o identidad entre estas secuencias. Las posiciones de aminoácidos que se indican a continuación se comprenderán como posiciones de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 o de posiciones correspondientes a las mismas en otras moléculas de s-GDH, excepto que se haga referencia específica a una SEQ ID NO distinta o a un aislado distinto de s-GDH. Para evitar redundancias solamente en unos pocos casos, se indica el hecho de que se pueden modificar posiciones correspondientes en diferentes aislados de la misma manera, mientras que a efectos de conveniencia, en la mayor parte de casos, y se utiliza se utiliza simplemente la posición correspondiente de SEQ ID NO: 24.

Los mutantes que comprenden una sustitución de aminoácido en la posición correspondiente a la posición 348 de s-GDH se ha observado que muestran un notable efecto en la especificidad para la glucosa. Tal como se ha demostrado en la tabla 1, se pueden identificar y generar múltiples variantes de s-GDH con especificidad mejorada para la glucosa, siempre que, como mínimo, el aminoácido en posición treonina 348 correspondiente a la posición de secuencia s-GDH de tipo natural de A. calcoaceticus sea sustituido por otro aminoácido apropiado.

También se ha descubierto que sustituciones combinadas de aminoácidos en posiciones de aminoácidos correspondientes a las posiciones 348 y 428 de SEQ ID NO: 24 son ventajosas para generar mutantes o variantes de s-GDH con especificidad significativamente mejorada para la glucosa.

Los residuos 348 o 428 de s-GDH aislados de la cepa LMD 79.41 de tipo Acinetobacter calcoaceticus no son conocidos en la técnica que ayude a la unión de un sustrato de s-GDH (Oubrie, A., y otros, Embo J 18 (1999) 5187-94,;Oubrie, A. y Dijkstra, B. W., Protein Sci 9 (2000) 1265-73). No hay explicación química o física disponible de por qué las sustituciones de estos residuos de aminoácidos altera la especificidad del sustrato de s-GDH para la glucosa, en comparación con otras moléculas de azúcar de interés.

Además, se ha descubierto además que la sustitución del aminoácido 76 también tiene un efecto positivo en la especificidad de la glucosa de s-GDH.

En otra realización adicional preferente, la s-GDH mutada se caracteriza porque el residuo de aminoácido treonina en la posición 348, es sustituido por un residuo de aminoácido, seleccionado entre el grupo que consiste en alanina, glicina, y serina. En una realización más preferente, se utiliza glicina para sustituir por treonina, en la posición 348.

Un grupo de variantes preferentes de s-GDH, de acuerdo con la presente invención, comprende la sustitución del residuo de aminoácido en la posición 348 y, como mínimo, una de las posiciones siguientes 76, 143, 168,169 y

428.

En otra realización adicional, una proteína mutante de s-GDH dependiente de PQQ comprende la sustitución de un residuo de aminoácido en la posición 428 de la correspondiente secuencia de tipo natural de Acinetobacter calcoaceticus, en el que el residuo de asparagina, en la secuencia de tipo natural, es sustituido por otros residuos apropiados de aminoácidos. Preferentemente, dicho residuo de aminoácido es seleccionado del grupo que consiste en leucina, prolina, y valina. Es preferible sustituir la asparagina por prolina en la posición 428.

Además, se ha demostrado además que el aminoácido de glutamina, en la posición 76, puede ser sustituido para mejorar los problemas impuestos por la reactividad cruzada de s-GDH con otras moléculas de azúcar. Se identifican fácilmente posiciones de secuencia de otros aislados de s-GDH, correspondiente a esa posición de secuencia por una búsqueda de homología basada en SEQ ID NO: 3. En otra realización preferente, el mutante, de acuerdo con la presente invención, comprende por lo tanto la sustitución de glutamina en la posición 76 de la correspondiente secuencia de tipo natural de Acinetobacter calcoaceticus.

Es preferible seleccionar el aminoácido utilizado en dicha sustitución en una posición que corresponde a la posición 76 en SEQ ID NO: 24 del grupo que consiste en alanina, ácido aspártico, ácido glutámico, glicina, metionina, prolina, y serina.

Tal como se ha descrito en lo anterior, la sustitución del aminoácido en posición 348 de la secuencia de s-GDH correspondiente a la secuencia de tipo natural aislada de A. calcoaceticus, se puede utilizar para mejorar significativamente la especificidad de la glucosa de s-GDH. Se obtienen más mutantes mejorados mediante una proteína mutante de s-GDH que comprende, al menos, dos sustituciones de aminoácidos, en el que el aminoácido que corresponde a la posición de aminoácido 348 de SEQ ID NO: 24 es sustituido.

Otra realización de la presente invención es, por lo tanto, un s-GDH mutante que comprende, como mínimo, dos sustituciones de residuos de aminoácidos en una posición de aminoácidos que corresponde a una posición de la secuencia de tipo natural de s-GDH conocida de A. calcoaceticus (SEQ ID NO: 24), siendo seleccionadas dichas posiciones de aminoácidos sustituidos entre el grupo que consiste en las posiciones 16, 22, 76, 116, 120, 127, 143, 168, 169, 171, 177, 227, 230, 231, 245, 255, 277, 295, 299, 308, 317, 341, 348, 349, 355, 422, 428 y 438, en la que el residuo de aminoácido T348 se sustituye. Es preferible, además, que una variante de s-GDH que tiene, como mínimo, dos residuos de aminoácidos sustituidos, comprenda una sustitución en la posición 348 y, como mínimo, una sustitución adicional seleccionada entre el grupo de posiciones que comprenda las posiciones 76, 143, 168, 169, y 428.

En otra realización adicional preferente, las, como mínimo, dos posiciones de aminoácidos sustituidas en una s-GDH mutante, se seleccionan del grupo que formado por las posiciones de aminoácidos 76, 348, y/o 428.

Mutantes que comprenden sustituciones de residuos de aminoácidos correspondientes a las posiciones 348 y 428, se han mostrado muy ventajosas para mejorar la especificidad de s-GDH para la glucosa, en comparación con otros sustratos de azúcar. Es especialmente preferente, diseñar y seleccionar mutantes de s-GDH que comprendan una sustitución en ambas posiciones 348 y 428. Son más preferentes los mutantes que comprenden, en estas dos posiciones, las sustituciones preferentes que se han descrito en lo anterior. Una variante de s-GDH que comprende T348G y N428P es la más preferente.

La terminología T348G y N428P es conocida en esta técnica como indicativa de que la treonina en la posición 348, es sustituida por glicina, y la glutamina en la posición 428, es sustituida por prolina.

Las proteínas mutantes de s-GDH que comprenden, además de las sustituciones en las posiciones 348 y 428, sustituciones en las posiciones 76, 127 y 143, que representan también realizaciones preferentes de la presente invención.

Además de ejemplos preferentes de proteínas mutadas de s-GDH, de acuerdo con la presente invención, comprenden sustituciones de aminoácidos en las posiciones 76 y 348 y, también, dichos mutantes comprenden sustituciones en las posiciones 76 y 428. En otra realización preferente, la proteína mutada de s-GDH, de acuerdo con la presente invención, comprende sustituciones de los residuos de aminoácidos en las posiciones 76, 348 y

428.

En otra realización adicional preferente, la variante de s-GDH, de acuerdo con la presente invención, comprende, como mínimo, tres sustituciones de aminoácidos, correspondiendo a los, como mínimo, tres residuos de aminoácidos sustituidos en posiciones de aminoácidos de las secuencia de s-GDH de tipo natural conocido de A. calcoaceticus (SEQ ID NO: 24), siendo seleccionadas dichas posiciones de aminoácidos sustituidas del grupo que consiste en las posiciones 171, 227, 230, 245, 341, 348, 349 y 428, de manera que ambos residuos de aminoácidos T348 y N428 son sustituidos. Preferentemente, dichos mutantes “trible” comprenden, como mínimo, una de las siguientes sustituciones: Y171G, H227F, P230H, E245D o M341V.

Las variantes preferentes de s-GDH con especificidad muy mejorada para la glucosa comprenden sustituciones en las posiciones 348 y 428 en combinación con sustituciones en las posiciones 245 o 341, o ambas.

El análisis de secuencias de aminoácidos reveló que los motivos de secuencias hallados en s-GDH de tipo natural de A. calcoaceticus por una parte y A. baumannii por otra, parecen ser muy conservadores alrededor de las posiciones de mayor relevancia para mejorar la especificidad para la glucosa, tal como se ha identificado en la presente invención, es decir, en las posiciones 76, 348, y 428, correspondientes a s-GDH de tipo natural de A. calcoaceticus (ver figura 2).

Una realización preferente, según la presente invención, es, por lo tanto, una proteína mutante de s-GDH dependiente de PQQ que comprende la secuencia de aminoácido de WPXaaVAPS (SEQ ID NO: 1), en la que dicho residuo Xaa es un residuo de aminoácido distinto de la treonina. La SEQ ID NO:1 corresponde a la posición 346-352 de s-GDH fr tipo natural de A. calcoaceticus o posiciones 347-353 de s-GDH de tipo natural de A. baumannii.

Más preferente, es un mutante de s-GDH en el que dicho Xaa en SEQ ID NO: 1 representa alanina, glicina o serina, con mayor preferencia Xaa representa glicina.

Un mutante de s-GDH dependiente de PQQ, que comprende la secuencia de aminoácido de TAGXaaVQK (SEQ ID NO: 2), en el que dicho residuo Xaa es un residuo de aminoácidos distinto de asparagina, es otra realización preferente de la invención. La SEQ ID NO:2 corresponde a las posiciones 425-431 de s-GDH de tipo natural de A. calcoaceticus o a las posiciones 426-432 de s-GDH de tipo natural A. baumannii.

Preferentemente, el mutante de s-GDH que comprende la SEQ ID NO: 2 se caracteriza porque dicho residuo Xaa es seleccionado del grupo que consiste en leucina, prolina y valina, de modo más preferentemente Xaa es un residuo de prolina.

Se conocen numerosas posibilidades en la técnica para producir proteínas mutantes. En base a los importantes descubrimientos de la presente invención que dan a conocer la importancia crítica de las posiciones de aminoácidos 348 y 428 y también la utilidad de la posición 76, actualmente los técnicos en la materia pueden producir otras variantes apropiadas de s-GDH. Estas variantes, por ejemplo, pueden ser obtenidas por los métodos conocidos como mutagénesis al azar (Leung, D. W., y otros, Technique 1 (1989) II-15) y/o mutagénesis dirigida (Hill, D. E., y otros, Methods Enzymol 155 (1987) 558-68). Un método alternativo para producir una proteína con las propiedades deseadas consiste en proporcionar constructos quiméricos, que contienen elementos de secuencia de, como mínimo, dos fuentes distintas para sintetizar completamente un gen s-GDH apropiado. Estos procedimientos conocidos en la técnica pueden ser utilizados en combinación con la información que se da a conocer en la presente invención para proporcionar mutantes o variantes de s-GDH que comprenden, como mínimo, una sustitución de aminoácidos en una posición de la secuencia que corresponde a las posiciones 348 y/o 428 de la SEQ ID NO: 24.

Una variante de s-GDH de acuerdo con la presente invención puede ser producida, por ejemplo, a partir de un gen s-GDH aislado de la cepa LMD 79.41 de tipo Acinetobacter calcoaceticus, así como partiendo de una secuencia homóloga. De acuerdo con esta solicitud, el término “homólogo” está destinado a comprender s-GHD de tipo natural aislado de otros organismos a condición de que la homología de secuencia comparada con SEQ ID NO: 24 sea, como mínimo, del 90%. En otras palabras, después de la alineación apropiada utilizando el programa “PileUp”, como mínimo, el 90% de los aminoácidos de dicha s-GDH son idénticos a los aminoácidos descritos en SEQ ID NO: 24.

Se comprenderá que existen naturalmente variaciones de ADN y secuencias de aminoácidos, o que éstas pueden ser introducidas intencionadamente utilizando métodos conocidos en la técnica. Estas variaciones pueden tener como resultado diferencias en hasta un 10% de aminoácidos en la secuencia global debido a delecciones, sustituciones, inserciones, inversiones o adiciones de uno o varios residuos de aminoácidos en dicha secuencia en comparación con la SEQ ID NO: 24. Estas sustituciones de aminoácidos pueden ser realizadas, por ejemplo, en base a la similitud en la polaridad, carga la solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o la naturaleza anfipática de los residuos involucrados. Por ejemplo, los aminoácidos con carga negativa son el ácido aspártico y ácido glutámico; aminoácidos cargados positivamente incluyen lisina y arginina; los aminoácidos con grupos de cabeza polar o no polar no cargados que tienen valores de hidrofilicidad similares incluyen los siguientes: leucina, isoleucina, valina, glicina, alanina, asparagina, glutamina, serina, treonina, fenilalanina, tirosina. Otras variantes previstas incluyen sales y ésteres de los polipéptidos antes mencionados, así como los precursores de los polipéptidos antes mencionados, por ejemplo, los precursores que tienen sustitución del terminal N, tal como metionina, Nformilmetionina utilizadas como secuencias principales. Estas variaciones se pueden realizar sin salir necesariamente del ámbito y espíritu de la presente invención.

De acuerdo con el estado de la técnica o de acuerdo con procedimientos facilitados en la sección de ejemplos, es posible obtener secuencias de polinucleótidos que codifican para cualquiera de los mutantes de s-GDH, tal como se ha indicado anteriormente. La invención comprende, por lo tanto, asimismo secuencias de polinucleótidos aislados que codifican proteínas mutantes de s-GDH, tal como se ha descrito en lo anterior.

La presente invención comprende además un vector de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico, de acuerdo con la presente invención enlazada operativamente a una secuencia promotora capaz de dirigir su expresión en una célula huésped.

La presente invención incluye además un vector de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico, de acuerdo con la presente invención, enlazada operativamente a una secuencia promotora capaz de dirigir la expresión en una célula huésped. Los vectores preferentes son plásmidos, tales como pACSGDH mostrados en las figuras 3 y 4.

Los vectores de expresión, útiles para la presente invención, contienen de manera típica un origen de replicación, un promotor situado más arriba de la secuencia de ADN, y van seguidos de la secuencia de ADN que codifica para la totalidad o una parte de las variantes de s-GDH. La secuencia de ADN que codifica para la totalidad de una parte de las variantes de s-GDH es seguida por secuencias de terminación de la transcripción y el vector restante. Los vectores de expresión también pueden incluir otras secuencias de ADN conocidas en la técnica, por ejemplo, las secuencias principales de estabilidad, que proporcionan estabilidad del producto de expresión, las secuencias principales de secreción que proporciona la secreción del producto de expresión, las secuencias que permiten la expresión del gen estructural a modular (por ejemplo, por la presencia o ausencia de nutrientes u otros inductores en el medio de crecimiento), las secuencias de marcado que son capaces de proporcionar selección fenotípica en células huésped transformadas, y las secuencias que proporcionan lugares de fraccionamiento por endonucleasas de restricción.

Las características del vector de expresión real utilizado deben ser compatible con la célula huésped que se debe utilizar. Por ejemplo, cuando se efectúa clonado en un sistema de células E.Coli, el vector de expresión debe contener promotores aislados del genoma de células de E.Coli (por ejemplo, lac, o trp). Se incluyen entre los orígenes apropiados de replicación en diferentes huéspedes de E.Coli, por ejemplo, un origen de replicación de plásmido ColE1. Se incluyen entre los promotores adecuados, por ejemplo, lac y trp. También es preferible que el vector de expresión incluya una secuencia que codifique para un marcador seleccionable. El marcador seleccionable es preferentemente un gen de resistencia a los antibióticos. Como marcadores seleccionables se pueden utilizar convenientemente el de resistencia a la ampicilina, o de resistencia a la kanamicina. Todos estos materiales son conocidos en la técnica y se encuentran a disposición comercialmente.

Se pueden construir vectores de expresión adecuados que contienen las secuencias deseadas de codificación y de control utilizando técnicas de ADN recombinante estándar conocidas en la técnica, muchas de las cuales se describen por Sambrook, y otros (1989).

La presente invención se refiere además a células huésped que contienen un vector de expresión que comprende una secuencia de ADN que codifica para la totalidad o una parte de los mutantes de s-GDH. Las células huésped contienen preferentemente un vector de expresión que comprende la totalidad o parte de una de las secuencias de ADN que tienen una o varias mutaciones, mostradas en la tabla 1. Son adicionalmente preferentes, las células huésped que contienen un vector de expresión que comprende una o varias secuencias reguladoras de ADN capaces de dirigir la replicación y/o expresión de una secuencia de ADN y que está operativamente enlazada a la misma, para la totalidad o una parte de mutantes de s-GDH. Se incluyen, entre las células huésped adecuadas, por ejemplo, E.Coli HB101 (ATCC 33694) disponible de la firma Pomega (2800 Woods Hollow Road, Madison, WI, USA), XL1-Blue MRF disponible de Stratagene (11011 North Torrey Pine Road, La Jolla, CA, USA) y similares.

Los vectores de expresión pueden ser introducidos en células huésped por varios métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la transformación de células huésped con vectores de expresión puede ser llevada a cabo por un método de transformación de protoplástos mediado por polietilenglicol (Sambrook, y otros 1989). No obstante, se pueden utilizar otros métodos para la introducción de vectores de expresión en células huésped, por ejemplo, electroporación, inyección biolística, o fusión de protoplástos.

Una vez se ha introducido un vector de expresión, que contiene una variante de s-GDH en una célula huésped apropiada, la célula huésped puede ser cultivada en condiciones que permitan la expresión de las variantes deseadas de s-GDH. Las células huésped que contienen un vector de expresión que contiene una secuencia de ADN que codifica para la totalidad o parte de los mutantes de s-GDH son identificadas, por ejemplo, por uno o varios de los sistemas generales siguientes: hibridación de ADN, presencia o ausencia de funciones de genes marcadores, la evaluación del nivel de transcripción, medida por la producción de transcriptores de s-GDH mRNA en la célula huésped, y detección inmunológicamente del producto de gen. Las células huésped preferentemente transformadas son identificadas por ensayo de enzimas, por ejemplo, detección colorimétrica.

La presente invención da a conocer también la generación y cribado de variantes de s-GDH. Se lleva a cabo, tal como se conocer en la técnica, mutagénesis al azar y mutagénesis de saturación. Las variantes son analizadas por la especificidad del sustrato de la glucosa, maltosa y otros azúcares. Las condiciones de ensayo escogidas están adaptadas para asegurar que los pequeños incrementos esperados producidos, por ejemplo, por una única sustitución de un aminoácido único, puedan ser medidos. Esto se ha conseguido ajustando las condiciones e ensayo, de manera que la actividad de la enzima de tipo natural (o parental) se encuentra próxima al límite inferior de detección. Una modalidad de selección o cribado de mutantes apropiados se indica en el ejemplo 3. Cualquier cambio o mejora, en comparación con la enzima de tipo natural, pueden ser claramente detectados de ésta manera.

Se debe comprender, desde luego, que no todos los vectores de expresión y secuencias reguladoras de ADN funcionarían igualmente bien para expresar las secuencias de ADN de la presente invención. Tampoco funcionarían igualmente bien todas las células huésped con el mismo sistema de expresión. No obstante, un técnico ordinario en la materia puede llevar a cabo una selección entre los vectores de expresión, las secuencias reguladoras de ADN y las células huésped utilizando las instrucciones que se facilitan en esta descripción sin necesidad de una experimentación indebida y sin alejarse del ámbito de la presente invención.

La invención se refiere también a un procedimiento para la producción de variantes de s-GDH de la presente invención que comprende el cultivo de una célula huésped de la invención en las condiciones apropiadas para la producción de mutantes de s-GDH de la invención. Para células huésped bacterianas, las condiciones de cultivo típicas son un medio líquido que contiene el antibiótico apropiado y el agente de inducción. Se incluyen entre los antibióticos típicos apropiados, la ampicilina, kanamicina, cloramfenicol, tetraciclina, y similares. Entre los agentes de inducción típicos se incluyen IPTG, glucosa, lactosa y similares.

Es preferible que los polipéptidos de la presente invención se obtengan por producción en las células huésped que expresan una secuencia de ADN que codifica el mutante de s-GDH. Los polipéptidos de la presente invención pueden ser obtenidos también por traducción in vitro del mARN, codificado por una secuencia de ADN que codifica para el mutante de s-GDH. Por ejemplo, las secuencias de ADN pueden ser sintetizadas, tal como se ha descrito anteriormente, e insertadas en un vector de expresión adecuado, que a su vez puede ser utilizado en un sistema de transcripción/traducción in vitro.

Un vector de expresión, que comprende un polinucleótido aislado, según se ha definido y descrito anteriormente, enlazado operativamente a una secuencia promotora capaz de promover su expresión en un sistema de síntesis de péptido libre de células, representa otra realización preferente de la presente invención.

Los polipéptidos producidos, por ejemplo, por procedimientos, tal como se ha descrito en lo anterior, pueden ser, a continuación, aislados y purificados utilizando diferentes técnicas de purificación de proteínas de rutina. Por ejemplo, se pueden utilizar procedimientos cromatográficos, tales como cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de filtrado de gel, y cromatografía de afinidad.

Una de las aplicaciones más importantes de las variantes de s-GDH mejoradas de la presente invención es para su utilización en tiras de pruebas para controlar el nivel de glucosa en sangre en pacientes diabéticos. Debido a la insensibilidad de la dehidrogenasa de glucosa dependiente de PQQ frente al oxígeno, un sistema que utilice variantes mejoradas de s-GDH tiene menor tendencia a la interferencia del oxígeno que los sistemas basados en oxidasa de glucosa. De modo más importante, dado que las variantes de s-GDH tienen especificidad mejorada frente a la glucosa y actividad enzimática relativa significativamente reducida con respecto a otros azúcares, la interferencia debida a maltosa, galactosa, y/o otros azúcares relacionados, que pueden encontrarse presentes en una muestra a analizar, se reduce significativamente. Desde luego, se pueden investigar muchos tipos de muestras. Los fluidos corporales, tales como suero, plasma, fluidos intestinales u orina, son fuentes preferentes para dichas muestras.

La invención comprende también un procedimiento para detectar, determinar o medir glucosa en una muestra utilizando un mutante de s-GDH de acuerdo con la presente invención. Es especialmente preferente que el procedimiento mejorado para la detección de glucosa en una muestra se caracterice porque dicha detección, determinación o medición de glucosa se lleve a cabo utilizando un sensor o dispositivo de tira de pruebas.

Asimismo, dentro del ámbito de la presente invención, se encuentra un dispositivo para la detección o medición de glucosa en una muestra que comprende un mutante de s-GDH de acuerdo con esta invención, así como otros reactivos requeridos para dicha medición.

Estas variantes de s-GDH, con especificidad del sustrato mejorada, según la presente invención, pueden ser también utilizadas de manera muy ventajosa en biosensores (D’Costa, E. J., y otros, Biosensors 2 (1986) 71-87; Laurinavicius, V., y otros, Analytical Letters 32 (1999) 299-316; Laurinavicius, V., y otros, Monatshefte fuer Chemie 130 (1999) 1269-1281) para el control en línea de la glucosa en una muestra o en un reactor. Para ello, las variantes de s-GDH pueden ser utilizadas, por ejemplo, para el recubrimiento de un electrodo vítreo insensible al oxígeno, con un complejo de osmio, que contiene una red conductora de epoxi redox (Ye y otros, 1993, supra) para

una determinación más exacta de la concentración de glucosa.

Existen también otras aplicaciones posibles para las variantes de s-GDH con la especificidad mejorada del sustrato de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, estas variantes de s-GDH pueden ser utilizadas en un proceso de producción de ácido aldónico. S-GDH de tipo natural tiene un elevado rendimiento a la oxidación del sustrato, produciendo ácidos glucónico y otros ácidos aldónicos. Mediante la utilización de variantes de s-GDH que son más específicas para la glucosa, la producción de ácido glucónico tendría como resultado una proporción mucho menor de subproductos. Con otras variantes de s-GDH de diferente especificidad del sustrato, es posible producir diferentes ácidos aldónicos, según las necesidades.

En los siguientes ejemplos, todos los reactivos, enzimas de restricción, y otros materiales, fueron obtenidos de la firma Roche Diagnostics de Alemania, si no se indican específicamente otras fuentes de origen, y se utilizaron de acuerdo con las instrucciones facilitadas por los suministradores. Las operaciones y métodos utilizados para la purificación, caracterización, y clonado de ADN son bien conocidos en esta técnica (Ausubel, F., y otros, in "Current protocols in molecular biology" (1994), Wiley Verlag) y se pueden adaptar según sea necesario por técnicos expertos.

Los siguientes ejemplos muestran adicionalmente la presente invención. Estos ejemplos no están destinados a limitar el alcance de la invención, sino a facilitar una mejor comprensión de la misma.

Ejemplo 1

Clonado y expresión de dehidrogenasa de glucosa dependiente de PQQ soluble de A. calcoaceticus de tipo natural en E.Coli.

El gen de s-GDH fue aislado de la cepa LMD 79.41 de Acinetobacter Calcoaceticus de acuerdo con procesos estándar. El gen de s-GDH de tipo natural fue subclonado en un plásmido, conteniendo el promotor mgl para la expresión ajustable (ver solicitud de patente WO 88/09373). El nuevo constructo fue designado pACSGDH (ver figuras 3 y 4). Los plásmidos recombinantes fueron introducidos en un organismo huésped seleccionado del grupo E.Coli. Estos organismos fueron cultivados a continuación bajo condiciones apropiadas y se seleccionaron colonias que mostraban la actividad de s-GDH.

El plásmido pACSGDH fue aislado de un cultivo de 200 ml durante una noche del clon mencionado anteriormente, utilizando el Maxi Kit QIAGEN Plasmid (Qiagen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El plásmido fue resuspendido en 1 ml de agua bidestilada. La concentración del plásmido fue determinada utilizando un fotómetro Beckman DU 7400. El rendimiento fue de 600!g. A continuación, se determinó la calidad del plásmido por electroforesis de gel de agarosa.

Ejemplo 2

PCR Mutagénico

Para generar mutaciones al azar en el gen s-GDH, se llevó a cabo PCR Mutagénico (reacción en cadena de polimerasa). El plásmido pACSGDH y la secuencia de ADN que codifica las enzimas mutadas (producto PCR de PCR Mutagénico) fueron digeridos con enzimas de restricción Sphl y EcoRl. Los productos fueron purificados. Las secuencias de ADN digeridas fueron ligadas y se utilizó una parte alícuota de la mezcla de reacción de ligado para transformar las células competentes E.Coli. Los transformantes fueron seleccionados a continuación en placas LB que contenían ampicilina.

Para el ensayo, se escogieron colonias individuales, se cultivaron durante una noche en LB medio conteniendo ampicilina, y se sometieron a rastreo (ver ejemplo 3).

Mezcla de reacción de PCR Mutagénico:

40 ng pACSGDH

1 x buffer without MgCl2 (Roche Diagnostics GmbH, Cat. 1699 105)

dCTP, dTTP 1mM

dATP, dGTP 0,2 mM (Roche Diagnostics GmbH, Cat. 1969 064)

40 pmol GF23-Cebador (5’-CGC GCA CGC GCA TGC CGC CGA TGT TC) (= SEQ ID NO: 4)

40 pmol GR23 (5’-GAC GGC CAG TGA ATT CTT TTC TA) (= SEQ ID NO: 5) 7 mM MgCl2

0.6 mM MnCl2 5 U Taq ADN polimerasa (Roche Diagnostics GmbH, Cat. 1146165) Gen Amp PCR Sistema 2400 (Perkin Elmer), 30 ciclos: 95 °C 1 min, 45 °C 2 min, 72 °C 2 min.

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Purificación de los productos de PCR utilizando el equipo de purificación de producto High Pure PCR, de Roche Diagnostics GmbH (Cat. 1732676) de acuerdo con su protocolo de fabricación.

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Digestión de los fragmentos de PCR con 25 U SphI (Roche Diagnostics GmbH, Cat. 606 120) en 1 x tampón H (Roche Diagnostics GmbH, Cat. 1 417 991) a 37 °C durante una noche; adición de 25 U EcoRI (Roche Diagnostics GmbH, Cat. 703 737) y digestión adicional durante 3,5 horas.

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Digestión de 50 !g pACSGDH con 180 U SphI y 180 U EcoRI en 1 x tampón H durante 4 horas a 37 °C.

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Electroforesis de gel del pACSGDH digerido y los fragmentos digeridos utilizando geles de agarosa (0,8 %).

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Extracción de moléculas de ADN utilizando Kit de extracción QUIAquick Gel (Qiagen, Cat. 28706), de acuerdo con el protocolo de los fabricantes.

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Determinación de la concentración de los fragmentos y vector digerido utilizando un fotómetro Beckman DU 7400.

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Determinación de la calidad de los productos purificados por electroforesis de gel de agarosa.

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Ligado del vector de 100ng digerido con fragmentos de 140ng mPCR utilizando 1 U T4-DNA-Ligase (Roche Diagnostics GmbH, Cat. 481 220) en un volumen de 20!l a 16 °C durante una noche.

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Electroporación de células ZL 1F electro-competentes (Stratagene) con 1!l de la reacción de ligado con cubetas de 2,5 KV in 0,2 cm utilizando un dispositivo BioRad E. coli Pulser (BioRad).

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Después de crecimiento en un ml LB a 37ºC durante una hora, se aplicaron las bacterias en forma de placas sobre placas de LB Ampicilina Agar (100!g/ml de Ampicilina) y se cultivaron durante una noche a 37ºC.

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50% de estos clones expresando s-GDH mutada se activaron utilizando el siguiente método de rastreo.

Ejemplo 3

Rastreo

Las colonias mutantes sobre placas de Agar, descritas en lo anterior, fueron recogidas en placas de micro-titulación (mtp) conteniendo 200!l de LB-Ampicilina-Medio/pocillo, y se incubaron durante una noche a 37ºC. Estas placas se llaman placas maestras.

De cada placa maestra se traspasaron 5!l muestra/pocillo a un mtp conteniendo 5!l por cada pocillo de B (B=reactivo de extracción de Proteínas Bacterianas; Pierce Nº. 78248) para disrupción de células y se añadieron 240!l de 0,0556 mM pyrollo-quinolina quinona (PQQ); 50 mM Hepes; 15 mM CaCl2 pH 7,0/ pocillo, para activación de s-GDH. Para completar la formación del holoenzima, el mtp fue incubado a 25º C durante 2 horas y 10ºC a lo largo de una noche. Esta placa es llamada placa de trabajo.

De la placa de trabajo se trasladaron 20x10!l muestra/orificio a 2 mtp vacías. Después de ello, una fue sometida a una prueba con glucosa, y la otra con maltosa u otras moléculas de azúcar seleccionadas como sustrato. Todas la moléculas de azúcar fueron utilizadas en concentraciones equimolares.

Se calculó dE/min y se ajustó el valor utilizando glucosa como sustrato a 100% de actividad. El valor obtenido con el otro azúcar fue comparado con la glucosa y calculado en actividad porcentual ((dE/min Maltosa/dE Glucosa)*100). Esto es equivalente a la reactividad cruzada de la enzima (mutante).

Ejemplo 4

Secuenciado de gen de s-GDH mutante a partir de PCR Mutagénica

El plásmido que contiene el gen de s-GDH mutante, que conduce un 50% de actividad maltosa/glucosa fue aislado (High Pure Plasmid Isolation Kit, Roche Diagnostics GmbH, No. 1754785) y secuenciado utilizando un Kit de Secuenciado ABI Prism y un secuenciador ABI 3/73 y 3/77 (Amersham Pharmacia Biotech).

Se utilizaron los cebadores siguientes:

Cadena sentido: GDH F2 : 5’-TTA ACG TGC TGA ACA GCC GG-3’ (= SEQ ID NO: 6) GDH F3: 5’-GAT G CT GAT GGG CAG AAT GG-3’ (= SEQ ID NO: 7) GDH F4: 5’-ATA TGG GTA AAG TAC TAC GC -3’ (= SEQ ID NO: 8)

5 GDH F5: 5’-ACG ATC CAA CTT GTG GAG AG-3’ (= SEQ ID NO: 9)

Cadena antisentido: GDH R1: 5’-CGA TTA AGT TGG GTA ACG CC-3’ (= SEQ ID NO: 10) GDH R2: 5’-ATA CGG AAA ATG ACA CCA CG-3’ (= SEQ ID NO: 11) GDH R3: 5’-GGG CCT TGT TCA GAC TGC AA-3’ (= SEQ ID NO: 12) GDH R4: 5’-CAA GAC GAC CTG ACT GAT GG-3’ (= SEQ ID NO: 13) GDH R5: 5’-CAT AAC AAC GCG TGC GGC TT-3’ (= SEQ ID NO: 14)

Resultados:

15 => 6 mutaciones en nivel de secuencia de ADN => 4 mutaciones en nivel de aminoácido: en posición 340 (enzima madura) cambio de E a G en posición 348 (enzima madura) cambio de T a S en posición 369 (enzima madura) cambio de N a H en posición 413 (enzima madura) cambio de S a N

Ejemplo 5

25 Mutantes de s-GDH obtenidos por Mutagénesis de saturación

Se utilizó el Kit de Mutagénesis dirigido al lugar QuickChange (Stratagene, Cat. 200518) para sustituir satisfactoriamente aminoácidos de tipo natural en posiciones definidas de la proteína s-GDH o de los mutantes de s-GDH (purificación de plásmido, tal como se ha descrito en lo anterior) con otros aminoácidos al azar.

Los cebadores 5’ y 3’, utilizados para mutagénesis, eran complementarios entre sí, y contenían NNN en posición central. Estos nucleótidos estaban flanqueados por 12 a 16 nucleótidos en cada extremo. Las secuencias de los nucleótidos eran idénticas a la cadena cADN o a la cadena complementaria cADN flanqueando el codón para el aminoácido que tenía que ser sustituido. En vez del condón, el cebador contenía NNN, por lo que los

35 oligonucleótidos codifican para cada codón.

Para cada posición definida, se llevó a cabo una reacción PCR.

Las reacciones PCR y las digestiones Dpnl fueron llevadas a cabo, de acuerdo con el manual.

Después de ello, se utilizó 1 !l de cada reacción para la electroporación de células XL 1F. Las células fueron cultivadas y se determinó, tal como se ha descrito anteriormente, la actividad de s-GDH de los clones.

Para asegurar estadísticamente que los 20 aminoácidos variantes habían sido rastreados, se comprobaron 200 45 clones para cada posición.

Se utilizaron los siguientes cebadores:

para posición 340, cadena Sentido EGF 5’-TCC AAC TTG TGG ANN N AT GAC CTA CAT TT-3’ (= SEQ ID NO: 15)

Cadena Antisentido EGR 5’-AAA TGT AGG TCA TNN NTC CAC AAG TTG GA-3’ (= SEQ ID NO: 16)

55 para posición 348, cadena Sentido TSF 5’-CAT TTG CTG GCC ANN NGT TG C ACC GTC AT-3’(= SEQ ID NO: 17)

cadena Antisentido TSR 5’-ATG ACG GTG CAA CNN NTG GCC AGC AAA TG-3’ (= SEQ ID NO: 18) para posición 369, cadena sentido NHF 5’-TAC TGG TTG GGA ANN NAC ATT ATT GGT TC -3’ (= SEQ ID NO: 19)

cadena Antisentido NHR 5’-GAA CCA ATA ATG TNN NTT CCC AAC CAG TA-3’(= SEQ ID NO: 20)

para posición 413 cadena Sentido SNF 5’-TGA TGT GAT TGC ANN NCC AGA TGG GAA TG -3’ (= SEQ ID NO: 21) 5 cadena Antisentido SNR 5’-CAT TCC CAT CTG GNN NTG CAA TCA CAT CA-3’ (= SEQ ID NO: 22)

Resultados:

10 Los cambios de aminoácidos en las posiciones 340, 369 y 413 no cambiaron la especificidad del sustrato. Solamente la oscilación en la posición 348 facilitó la producción de clones con especificidad de sustrato de 25100% (maltosa/glucosa).

Numerosas rondas de PCR mutagénico y de saturación de mutagénesis fueron llevadas a cabo. Se descubrió y

15 confirmó que las posiciones 348 y 428 son de mayor importancia y que el intercambio de otros aminoácidos puede mejorar adicionalmente la especificidad para glucosa mutada de s-GDH. En la tabla 1, se indican datos representativos y posiciones.

Tabla 1: Ejemplos de variantes s-GDH con especificidad mejorada a la glucosa

Abreviaciones:

n.p. = no probado AE = actividad específica (U/mg proteína) con glucosa como sustrato

Aminoácido cambiado a secuencia de tipo natural

Conversión de la glucosa Conversión de la maltosa Conversión de la galactosa AE

Tipo natural

100% 105% 50% 1000

340 E a G 348 T a S 369 N a H 413 S a N

100% 50% 25% 700

22 I a L 295 Q a L 422 L a l

100% 123% 14% 178

348 T a D

100% 80% n.p. n.p.

348 T a A

100% 67% n.p. n.p.

348 T a G

100% 22% 20% 910

428 N a P

100% 8% 25% n.p.

348 T a G

100%

428 N a V 348 T a G

100% 22% 22% n.p.

127 T a M 143 D a Q 348 T a G 428 N a P

100% 1% 32% n.p.

76 Q a A 348 T a G

100% 17% n.p. n.p.

76 Q a M 348 T a G

100% 18% n.p. n.p.

76 Q a D 348 T a G

100% 17% n.p. n.p.

76 Q a P 348 T a G

100% 17% n.p. n.p.

76 Q a S 348 T a G

100% 17% n.p. n.p.

76 Q a G 348 T a G

100% 20% n.p. n.p.

76 Q a E 348 T a G

100% 17% n.p. n.p.

143 D a E 348 T a G

100% 17% n.p. n.p.

171 Y a H 348 T a G 308 K a N

100% 19% n.p. n.p.

171 Y a D 348 T a G 317 F a V

100% 18% n.p. n.p.

127 T a S 169 L a H 348 T a G 355 Y a H

100% 11% n.p. n.p.

16 N a D 120 T a S 177 Q a R 277 Y a H 348 T a G

100% 22% n.p. n.p.

116 I a T 255 N a T 299 K a R 348 T a G

100% 20% n.p. n.p.

227 H a Y

100% 18% n.p. n.p.

348 T a G 438 N a S

341 M a V 348 T a G

100% 20% n.p. n.p.

348 T a G 349 V a G 428 N a P

100% 10% n.p. n.p.

171 Y a G 230 P a H 348 T a G 428 N a P

100% 3% n.p. n.p.

230 P a H 348 T a G 428 N a P

100% 10% n.p. 200

227 H a F 230 P a H 348 T a G 428 N a P

100% 6% n.p. n.p.

143 D a E 348 T a G

100% 17% n.p. n.p.

143 D a E 348 T a G 428 N a P

100% 1% n.p. n.p.

169 G a X 230 P a H 348 T a G 428 N a P

100% 2% n.p. n.p.

Ejemplo 6:

Purificación de mutante s-GDH T348G

5 Las células cultivadas (LB-Amp. 37ºC) fueron recogidas y resuspendidas en un tampón de fosfato potásico pH 7,0. Se llevó a cabo disrupción celular por paso por una French Press (700-900 bar). Después de la centrifugación, el sobrenadante fue aplicado a una columna de S-Sefarosa (Amersham Pharmacia Biotec) equilibrada con 10mM de tampón de fosfato potásico pH 7,0. Después de un lavado, la S-GDH fue eludida utilizando un gradiente de sal de 0

10 1 M NaCl. Las fracciones que mostraban actividad s-GDH fueron agrupadas, dializadas contra tampón de fosfato potásico pH 7,0, y recromatografiadas en una columna de S-Sefarosa reequilibrada. Las fracciones activas fueron reunidas y sometidas a una filtración de gel utilizando una columna de Superdex® 200 (Amersham Pharmacia Biotec). Las fracciones activas fueron agrupadas y almacenadas a -20 °C.

Ensayo de enzima y determinación de Proteína del mutante T348G y tipo natural de s-GDH. Se llevó a cabo una determinación de proteínas utilizando el reactivo de ensayo de proteínas nº. 23225 de la firma Pierce (curva de calibrado con BSA, 30 Min. 37ºC).

20 Las muestras de s-GDH fueron diluidas en 1mg de proteína/ml con 0,0556 mM pirollo-quinolina quinona (PQQ); 50 mM Hepes; 15 mM CaCl2 pH 7,0 incubadas a 25°C durante 30 minutos para la reconstitución o activación.

Después de la activación se añadieron 50 !l de la muestra a 1000 !l de una solución de tampón de citrato 0,2 M (pH 5,8; a 25°C), conteniendo 0,315 mg (4-(dimetil fosfinil metil)--2-metil-pirazolo-[1,5a]-imidazolil-3-)-(4nitrosofenilamina) (ver patente US 5.484.708) /ml como mediador y 33 mM de azúcar).

5 Se controló la extinción a 620 nm durante los primeros 5 minutos a 25ºC.

Una unidad de actividad de enzima corresponde a la conversión de 1mMol de mediador/min bajo las condiciones de ensayo indicadas.

Cálculo: Actividad = (volumen total * dE/min [U/ml]) : ( * volumen de la muestra * 1)

(e = coeficiente de extinción; en este ejemplo e620 nm = 30 [1* mmol-1 * cm-1])

15 El ensayo fue llevado a cabo con glucosa, maltosa y galactosa (Merck, Alemania).

Resultados:

Muestra

Actividad específica U/mg Proteína (glucosa como sustrato) % de conversión de maltosa/glucosa % de conversión de galactosa/glucosa

Tipo natural

1000 105% 50%

Mutante T348G

910 22% 20%

Ejemplo 7: Determinación de glucosa en presencia o ausencia de Maltosa

T348G de s-GDH de tipo natural y mutante fueron aplicados para la determinación de la glucosa. Las muestras de

25 referencia contenían 65mg de glucosa/dl. La muestra de la “prueba” contenía 65mg de glucosa/dl y 130mg/dl de maltosa. Se utilizaron las mismas cantidades de actividad de s-GDH para cada ensayo (U/ml; ver ensayo de enzima).

Se mezcló en una cubeta:

1ml 0,315mg (4-(dimetil fosfinil metil)-2-metil-pirazolo-[1,5a]-imidazolil-3-)-(4-nitrosofenil)-amina ml/0,2 M citrato pH 5,8.

0,015 ml de muestra (glucosa, o glucosa + maltosa).

35 El ensayo fue iniciado añadiendo 0,050 ml 90 U/ml de s-GDH. El cambio de absorción a 620 nm fue controlado. Pasados 5 minutos, se observaron valores constantes y se calcularon dE/5 min. El valor obtenido midiendo la muestra de referencia con s-GDH de tipo natural se ajustó al 100%. Los otros valores fueron comparados a este valor de referencia y calculados en %.

Resultados:

65 mg/dl de glucosa

65 mg/dl de glucosa y 130 mg/ml de maltosa

Tipo natural s-GDH

100% 190%

s-GDH T348G mutante

100% 130%

45 Se puede ver claramente que el “valor de la glucosa” medido es notablemente menos alterado cuando se utiliza s-GDH mutada en esta determinación.

Listado de referencias

Anthony C., 1996. Quinoprotein-catalysed reactions. Biochem. J. 320(3):697-711 Anthony C., Ghosh M., 1997. The structure and function of PQQ-co ntaining quinoproteins. Curr. Sci. 72(10):716727 Anthony, C., Biochem J 320 (1996) 697-711 Anthony, C. and Ghosh, M., Current Science 72 (1997) 716-727

55 Anthony, C. and Ghosh, M., Prog Biophys Mol Biol 69 (1998) 1-21 Anthony, C., Biochem Soc Trans 26 (1998) 413-7 Ausubel, F., y otros, in "Current protocols in molcular biology" (1994), Wiley Verlag Cleton-Jansen, A. M., y otros, Antonie Van Leeuwenhoek 56 (1989) 73-9 Cleton-Jansen, A. M., y otros, J Bacteriol 170 (1988) 2121-5 Cleton-Jansen, A. M., y otros, Mol Gen Genet 217 (1989) 430-6 Davidson, V. L. in "Principles and applications of quinoproteins" (1993) the whole book, New York, Marcel Dekker D’Costa, E. J., y otros, Biosensors 2 (1986) 71-87 Dokter, P., y otros, FEMS Microbiology Letters 43 (1987) 195-200 Dokter, P., y otros, Biochem J 239 (1986) 163-7 Dokter, P., y otros, Biochem J 254 (1988) 131-8 Duine, J. A. Energy generation and the glucose dehydrogenase pathway in Acinetobacter in "The Biology of Acinetobacter" (1991) 295-312, New York, Plenum Press Duine, J. A., Biosens. Bioelectronics 10 (1995) 17-23 Duine, J. A., y otros, Arch Microbiol 131 (1982) 27-31 Duine, J. A., Eur J Biochem 200 (1991) 271-84 Goodwin, P. M. and Anthony, C., Adv Microb Physiol 40 (1998) 1-80 Hill, D. E., y otros, Methods Enzymol 155 (1987) 558-68 Igarashi, S., y otros, Biochem Biophys Res Commun 264 (1999) 820-4 Kaufmann, N., y otros Development and evaluation of a new system for determining glucose from fresh capillary blood and heparinised venous blood in "Glucotrend" (1997) 1-16, Mannheim, Boehringer Mannheim GmbH Laurinavicius, V., y otros, Analytical Letters 32 (1999) 299-316 Laurinavicius, V., y otros, Monatshefte fuer Chemie 130 (1999) 1269-1281 Leung, D. W., y otros, Technique 1 (1989) 11-15 Matsushita, K. and Adachi, O. Bacterial quinoproteins glucose dehydrogenase and alcohol dehydrogenase in "Principles and applications of Quinoproteins" (1993) 47-63, New York, Marcel Dekker Matsushita, K., y otros, Antonie Van Leeuwenhoek 56 (1989) 63-72 Matsushita, K., y otros, Biochemistry 28 (1989) 6276-80 Matsushita, K., y otros, Bioscience Biotechnology & Biochemistry 59 (1995) 1548-1555 Oliphant, A. R., y otros, Gene 44 (1986) 177-83 Olsthoorn, A. J. and Duine, J. A., Arch Biochem Biophys 336 (1996) 42-8 Olsthoorn, A. J. and Duine, J. A., Biochemistry 37 (1998) 13854-61 Oubrie, A. and Dijkstra, B. W., Protein Sci 9 (2000) 1265-73 Oubrie, A., y otros, Embo J 18 (1999) 5187-94 Oubrie, A., y otros, J Mol Biol 289 (1999) 319-33 Oubrie, A., y otros, Proc Natl Acad Sci U S A 96 (1999) 11787-91 Sambrook, J., y otros -in "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (1989) -, Cold Spring Harbour, NY, Cold Spring Harbour Laboratory Press Wens, R., y otros, Perit Dial Int 18 (1998) 603-9 Ye, L., y otros, Anal. Chem. 65 (1993) 238-41

EP 0 620 283 JP 11243949 US 5.484.708 US 5.997.817 US 6.057.120 US 6.103.509 WO 92/07953 WO 99/30152 WO 88/09373

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> F. Hoffmann-La Roche AG Roche Diagnostics GmbH

<120> Nuevas formas de Dhidrogenasa de glucosa soluble dependiente de Pirroloquinolina Quinona

<130> 19139 WO

<140>

<141>

<150> EP 00123512.6

<151> 2000-10-27

<150> EP 00127294.7

<151> 2000-12-19

<160> 25

<170> PatentIn Ver. 2.1

<210> 1

<211> 7

<212> PRT

<213> Acinetobacter calcoaceticus

<400> 1

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> Acinetobacter calcoaceticus

<400> 2

<210> 3

<211> 7

<212> PRT

<213> Acinetobacter calcoaceticus

<400> 3

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de sentido GF23

<400> 4 cgcgcacgcg catgccgccg atgttc 26

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia Artificial: cebador de antisentido GR23

<400> 5 gacggccagt gaattctttt cta 23

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de sentido GDH F2

<400> 6 ttaacgtgct gaacagccgg 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de sentido GDH F3

<400> 7 gatgctgatg ggcagaatgg 20 <210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de sentido GDH F4

<400> 8 atatgggtaa agtactacgc 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de sentido GDH F5

<400> 9 acgatccaac ttgtggagag 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de antisentido GDH R1

<400> 10 cgattaagtt gggtaacgcc 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de antisentido GDH R2

<400> 11 atacggaaaa tgacaccacg 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de antisentido GDH R3

<400> 12 gggccttgtt cagactgcaa 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de antisentido GDH R4

<400> 13 caagacgacc tgactgatgg 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de antisentido GDH R5

<400> 14 cataacaacg cgtgcggctt 20

<210> 15

<211> 29

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220> <223 Descripción de la secuencia artificial: cebador de sentido EGF

<400> 15 tccaacttgt ggannnatga cctacattt 29

<210> 16

<211> 29

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de antisentido EGR

<400> 16 aaatgtaggt catnnntcca caagttgga 29

<210> 17

<211> 29

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de sentido TSF

<400> 17 catttgctgg ccannngttg caccgtcat 29

<210> 18

<211> 29

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de antisentido TSR

<400> 18 atgacggtgc aacnnntggc cagcaaatg 29

<210> 19

<211> 29

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de sentido NHF

<400> 19 tactggttgg gaannnacat tattggttc 29

<210> 20

<211> 29

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de antisentido NHR

<400> 20 gaaccaataa tgtnnnttcc caaccagta 29

<210> 21

<211> 29

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de sentido SNF

<400> 21 tgatgtgatt gcannnccag atgggaatg 29

<210> 22

<211> 29

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de antisentido SNR

<400> 22 cattcccatc tggnnntgca atcacatca 29

<210> 23

<211> 1362

<212> DNA

<213> Acinetobacter calcoaceticus

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1362)

<400> 23

<210> 24

<211> 454

<212> PRT

<213> Acinetobacter calcoaceticus

<400> 24

5 <210> 25

<211> 4373

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220> 10 <223> Descripción de la secuencia artificial: vector pACSGDH

<400> 25

Claims (28)

1. REIVINDICACIONES

   1. Mutante de forma soluble de EC 1,199,17, también conocida como dehidrogenasa de glucosa soluble dependiente de PQQ (s-GDH) estando caracterizado dicho mutante porque, con respecto a la enzima de tipo natural correspondiente y con respecto, como mínimo, a otro sustrato de azúcar seleccionado, tiene, como mínimo dos veces, una mayor especificidad de sustrato incrementada, para la glucosa, de manera que dicha mejora de la especificidad se calcula de acuerdo con la fórmula:

   actividad mutante glucosa actividad azúcar seleccionado tipo natural especificidad (mejora) = -------------------------------------------X---------------------------------------------------- actividad glucosa tipo natural actividad mutante azúcar seleccionado,

   en la que dicho mutante comprende una sustitución de residuo de aminoácido en la posición de aminoácido correspondiente a la posición 348 de la secuencia de tipo natural de s-GDH conocida desde A. Calcoaceticus (SEQ ID NO: 24).

2. 2.

   Mutante, según la reivindicación 1, caracterizado además porque dicho azúcar seleccionado es seleccionado del grupo que consiste en maltosa y galactosa.

3. 3.

   Mutante, según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado además porque dicho azúcar seleccionado es maltosa.

4. 4.

   Mutante de s-GDH dependiente de PQQ, según la reivindicación 1, caracterizado además porque dicha especificidad del sustrato para la glucosa es mejorada, como mínimo, 3 veces.

5. 5.

   Mutante de s-GDH dependiente de PQQ, según la reivindicación 1, caracterizado además porque dicha especificidad del sustrato para la glucosa es mejorada, como mínimo, 5 veces.

6. 6.

   Mutante de s-GDH dependiente de PQQ, según la reivindicaciones 1 a 5, caracterizado además porque la s-GDH de tipo natural es aislada de una cepa del grupo de la especie Acinetobacter que consiste en A. calcoaceticus y A. baumannii.

7. 7.

   Proteína mutante de s-GDH dependiente de PQQ, según la reivindicaciones 1 a 6, cuyo mutante comprende, como mínimo, otra sustitución del residuo de aminoácido en las posiciones de aminoácido correspondiente con las posiciones de la secuencia de tipo natural del s-GDH conocida de A. calcoaceticus (SEQ ID NO: 24), siendo seleccionadas dichas posiciones de aminoácidos sustituidos del grupo que consiste en las posiciones 16, 22, 76, 116, 120, 127, 143, 168, 169, 171, 177, 227, 230, 231, 245, 255, 277, 295, 299, 308, 317, 341, 349, 355, 422, 428 y 438.

8. 8.

   Mutante, según la reivindicación 7, caracterizado además porque, como mínimo uno de los siguientes residuos de aminoácidos 16, 116, 120, 127, 169, 171, 177, 227, 255, 277, 299, 317, 355 y 438 está sustituido.

9. 9.

   Proteína mutante, según la reivindicación 7, que comprende sustituciones de los residuos de aminoácidos en las posiciones 348 y 428.

10. 10.

    Proteína mutante de s-GDH dependiente de PQQ, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, comprendiendo el mutante, como mínimo, 3 sustituciones de residuos de aminoácidos en las posiciones de aminoácidos correspondientes a las posiciones de la secuencia de tipo natural de s-GDH conocida de A. calcoaceticus (SEQ ID NO: 24) siendo seleccionadas dichas posiciones de aminoácidos sustituidos del grupo que consiste en las posiciones 171, 227, 230, 245, 341, 348, 349, y 428, en el que ambos residuos de aminoácido T348 y N428 están sustituidos.

11. 11.

    Mutante, según la reivindicación 9 ó 10, caracterizado además porque la asparagina en la posición 428 está sustituida por un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en ofleucina, prolina y valina.

12. 12.

    Mutante, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizada además porque la treonina en posición 348 está sustituida por un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en alanina, glicina, y serina.

13. 13.

    Proteína mutante de s-GDH dependiente de PQQ, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, comprendiendo el mutante la secuencia de aminoácido de WPXaaVAPS (SEQ ID NO: 1), en la que dicho residuo Xaa es un residuo de aminoácido distinto de treonina.

14. 14.

    Proteína mutante, según la reivindicación 13, caracterizada además porque dicho residuio Xaa es glicina.

15. 15.

    Proteína mutante de s-GDH dependiente de PQQ, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, comprendiendo el mutante la secuencia de aminoácido TAGXaaVQK (SEQ ID NO: 2), en el que dicho residuo Xaa es un residuo de aminoácido distinto de asparagina.

16. 16.

    Proteína mutante, según la reivindicación 15, caracterizada además porque dicho residuo Xaa es prolina.

17. 17.

    Proteína mutante de s-GDH dependiente de PQQ, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, comprendiendo el mutante la secuencia de aminoácido ADGXaaNGL (SEQ ID NO: 3), en el que dicho residuo Xaa es un residuo de aminoácido distinto de asparagina.

18. 18.

    Mutante, según la reivindicación 17, caracterizada además porque dicho residuo Xaa es seleccionado entre el grupo que consiste en ácido aspártico, ácido glutámico, metionina, prolina, serina, alanina, o glicina.

19. 19.

    Polinucleótido aislado que codifica al proteína mutante de s-GDH, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a

20. 16.

21. 20.

    Vector de expresión, que comprende un polinucleótido aislado, según la reivindicación 19 enlazado operativamente a una secuencia promotora capaz de promover la expresión de dicho polinucleótido en una célula huésped.

22. 21.

    Célula huésped que comprende el vector de expresión de la reivindicación 20.

23. 22.

    Procedimiento para la producción de variantes de s-GDH que comprende el cultivo de la célula huésped de la reivindicación 21, en condiciones apropiadas para la producción de las variantes de enzima.

24. 23.

    Vector de expresión que comprende un polinucleótido aislado, según la reivindicación 20, enlazado operativamente a una secuencia promotora capaz de promover suexpresión en un sistema de síntesis de péptido libre de células.

25. 24.

    Procedimiento para la producción de variantes de s-GDH con el constructo de la reivindicación 23, en un sistema de síntesis de péptido libre de células, en las condiciones adecuadas para la producción de dichas variantes de la enzima.

26. 25.

    Método de detección, determinación, o medición de glucosa en una muestra utilizando mutante de s-GDH, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, comprendiendo dicha mejora el contacto de la muestra con el mutante.

27. 26.

    Procedimiento, según la reivindicación 25, caracterizado además porque dicha detección, determinación, o medición de la glucosa es llevada a cabo utilizando un sensor o un dispositivo de banda de pruebas.

28. 27.

    Dispositivo para la detección o medición de glucosa en una muestra que comprende un mutante de s-GDH, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, y otros reactivos requeridos para dicha medición.