CN101421396B

CN101421396B - 吡咯并喹啉醌依赖性可溶性葡萄糖脱氢酶的改良突变体

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Publication number: CN101421396B
Application number: CN200780013259.8A
Authority: CN
Inventors: M·博尼茨-多莱特; D·贝克; P·克拉茨什; R·施穆克; H·冯德埃尔茨
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2006-04-13
Filing date: 2007-04-11
Publication date: 2016-01-20
Anticipated expiration: 2027-04-11
Also published as: JP2016119904A; PL3246402T3; KR20080106349A; PL2010649T3; BRPI0710131B1; JP5937547B2; US20090148874A1; JP6185617B2; CA2649135C; ES2807530T3; AU2007237478B2; CN101421396A; JP5683809B2; BRPI0710131A2; EP2010649A1; JP2009533033A; JP2013198497A; AU2007237478A1; HK1131633A1; PT2010649T

Abstract

本发明公开了与麦芽糖相比对葡萄糖具有提高的特异性的PQQ依赖性可溶性葡萄糖脱氢酶(s-GDH；EC1.1.5.2)突变体，其在位置348具有由甘氨酸、丙氨酸或丝氨酸置换苏氨酸，其中所述突变体另外包括至少一个用于提高突变体稳定性的突变，一个或多个用于提高突变体对葡萄糖的亲和性的突变和/或一个或多个用于与麦芽糖相比进一步提高突变体对葡萄糖的特异性的突变，并且其中位置348对应于从醋酸钙不动杆菌(A.calcoaceticus)s-GDH野生型序列(SEQ？ID？NO：2)已知的氨基酸位置。还公开了编码该突变体s-GDH的基因，以及这些s-GDH的不同应用，特别是用于测定样品中的葡萄糖浓度。

Description

吡咯并喹啉醌依赖性可溶性葡萄糖脱氢酶的改良突变体

本发明涉及对葡萄糖(与麦芽糖相比较)具有提高特异性的PQQ-依赖性可溶性葡萄糖脱氢酶(s-GDH；EC1.1.5.2)的突变体，在位置348由甘氨酸、丙氨酸或丝氨酸替代了苏氨酸，并且其中所述突变体另外包括至少一个用于提高突变体稳定性的突变和一个或多个用于提高突变体对己糖例如优选葡萄糖的亲和性的突变，和/或一个或多个用于进一步提高突变体对葡萄糖(与麦芽糖相比较)的特异性的突变，并且其中这些位置对应于从醋酸钙不动杆菌(A.calcoaceticus)s-GDH野生型序列已知的氨基酸位置。还公开了编码该突变体s-GDH的基因，和这些s-GDH突变体的不同应用，特别是用于测定样品中葡萄糖的浓度。

发明背景

血糖浓度的测定在糖尿病的临床诊断和监控中是非常重要的。全世界大约150百万人患有慢性疾病糖尿病，根据WHO，到2025年，该数字将加倍。尽管糖尿病能容易地得到诊断和治疗，成功的长期监控需要快速而精确地报道血糖浓度的低成本诊断工具。PQQ-依赖性葡萄糖脱氢酶(EC1.1.5.2)催化将葡萄糖氧化成葡糖酸内酯的反应。因此，将这种类型的酶用于测量血糖中。这些工具之一是基于可溶性葡萄糖脱氢酶(s-GlucDOR，EC1.1.5.2)的诊断试条，可溶性葡萄糖脱氢酶是最初源自醋酸钙不动杆菌(Acinetobactercalcoaceticus)的含吡咯并喹啉醌的酶。

醌蛋白使用醌作为辅因子，将醇、胺和醛糖氧化成其相应的内酯、醛和醛糖酸(Duine，J.A.，EnergygenerationandtheglucosedehydrogenasepathwayinAcinetobacter(不动杆菌中的能量产生和葡萄糖脱氢酶途径)，在″TheBiologyofAcinetobacter″(不动杆菌的生物学)NewYork，PlenumPress(1991)，pp.295-312；Duine，J.A.，Eur.J.Biochem.200(1991)271-284；Davidson，V.L.，在″Principlesandapplicationsofquinoproteins″(醌蛋白的原理和应用)，整本书，NewYork，MarcelDekker(1993)；Anthony，C.，Biochem.J.320(1996)697-711；Anthony，C.和Ghosh，M.，CurrentScience72(1997)716-727；Anthony，C.，Biochem.Soc.Trans.26(1998)413-417；Anthony，C.和Ghosh，M.，Prog.Biophys.Mol.Biol.69(1998)1-22)。在醌蛋白中，含有非共价结合辅因子2，7，9-三羧基-1H-吡咯[2，3-f]喹啉-4，5-二酮(PQQ)的那些构成最大的亚群(Duine1991，上文)。迄今为止已知的所有细菌性醌葡萄糖脱氢酶属于该亚群，使用PQQ作为辅因子(Anthony和Ghosh1997上文；Goodwin，PM.和Anthony，C.，Adv.Microbiol.Physiol.40(1998)1-80；Anthony，C.，Adv.inPhot.andResp.15(2004)203-225)。

在细菌中已经表征了两种类型的PQQ依赖性葡萄糖脱氢酶(EC1.1.5.2)：一种是膜结合的(m-GDH)；另一种是可溶性的(s-GDH)。两种类型没有共享任何显著的序列同源性(Cleton-Jansen，A.M.，等，Mol.Gen.Genet.217(1989)430-436；Cleton-Jansen，A.M.，等，AntonieVanLeeuwenhoek56(1989)73-79；Oubrie，A.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96(1999)11787-11791)。关于它们的动力学以及免疫特性也是不同的(Matsushita，K.，等，BioscienceBiotechnol.&Biochem.59(1995)1548-1555)。m-GDH在革兰氏阴性细菌中广泛分布，然而，只在不动杆菌菌株如醋酸钙不动杆菌(Duine，J.A.，1991a；Cleton-Jansen，A.M.等，J.Bacteriol.170(1988)2121-2125；Matsushita和Adachi，1993)和鲍氏不动杆菌(A.baumannii)(JP11243949)的周质间隙中发现了s-GDH。

通过搜索序列数据库，已经在大肠杆菌K-12和集胞藻属(Synechocystis)中鉴定了两个与全长醋酸钙不动杆菌s-GDH同源的序列。此外，还分别在绿脓杆菌(P.aeruginosa)和百日咳杆菌(Bordetellapertussis)(Oubrie等.1999a，b，c)以及中间肠杆菌(Enterobacterintermedium)(Kim，C.H.等，CurrentMicrobiol.47(2003)457-461)的基因组中发现了与醋酸钙不动杆菌s-GDH同源的两个不完整序列。这四个未表征蛋白质的推论氨基酸序列与醋酸钙不动杆菌s-GDH密切相关，在推定的绝对保守的活性位点具有许多残基。这些同源蛋白可能具有相似的结构并催化相似的PQQ依赖性反应(Oubrie等，1999a，b，c；OubrieA.，Biochim.Biophys.Acta1647(2003)143-151；Reddy，S.，和Bruice，T.C.，J.Am.Chem.Soc.126(2004)2431-2438；Yamada，M.等，Biochim.Biophys.Acta1647(2003)185-192)。

已经发现细菌性s-GDH和m-GDH具有非常不同的序列和不同的底物特异性。例如，醋酸钙不动杆菌含有两种不同的PQQ依赖性葡萄糖脱氢酶，一种称为m-GDH，其在体内是活性的，而另一种称为s-GDH，因为其只在体外可以显示出活性。Cleton-Jansen等，1988；1989a，b克隆了编码两种GDH酶的基因并测定这两种GDH基因的DNA序列。在m-GDH和s-GDH之间不存在明显的同源性，确证了m-GDH和s-GDH表示两种完全不同的分子的事实(Laurinavicius，V.，等，Biologija(2003)31-34)。

已经在大肠杆菌中克隆了来自醋酸钙不动杆菌的s-GDH的基因。在细胞中产生后，s-GDH通过细胞质膜转移至周质间隙(Duine，J.A.，(不动杆菌中的能量产生和葡萄糖脱氢酶途径)，在″TheBiologyofAcinetobacter″(不动杆菌的生物学)NewYork，PlenumPress(1991)，pp.295-312；Matsushita，K.和Adachi，O.，Bacterialquinoproteinsglucosedehydrogenaseandalcoholdehydrogenase(细菌性醌蛋白葡萄糖脱氢酶和醇脱氢酶)，在″PrinciplesandapplicationsofQuinoproteins″(醌蛋白的原理和应用)，NewYork，MarcelDekker(1993)pp.47-63)。和来自醋酸钙不动杆菌的天然s-GDH一样，在大肠杆菌中表达的重组s-GDH是同型二聚体，每个单体具有一个PQQ分子和三个钙离子(Dokter，P.等，Biochem.J.239(1986)163-167；Dokter，P.等，FEMSMicrobiol.Lett.43(1987)195-200；Dokter，P.等，Biochem.J.254(1988)131-138；Olsthoorn，A.J.和Duine，J.A.，Arch.Biochem.Biophys.336(1996)42-48；Oubrie，A.，等，J.Mol.Biol.289(1999)319-333；Oubrie，A.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A96(1999)11787-11791；Oubrie，A.，等，EmboJ.18(1999)5187-5194)。s-GDH将多种单糖和二糖氧化成相应的酮，其进一步水解成醛糖酸，它还能够给PMS(吩嗪硫酸甲酯)、DCPIP(2，6-二氯-酚靛酚)、WB(Wurster’s蓝)和短链泛醌如泛醌Q1和泛醌Q2(Matsushita，K.，等，Biochem.28(1989)6276-6280；Matsushita，K.，等，AntonieVanLeeuwenhoek56(1989)63-72)，几种人工电子受体如N-甲基phenazonium硫酸二甲酯(Olsthoorn，A.J.和Duine，J.A.，Arch.Biochem.Biophys.336(1996)42-48；Olsthoorn，A.J.和Duine，J.A.，Biochem.37(1998)13854-13861)和导电聚合物(Ye，L.，等，Anal.Chem.65(1993)238-241)提供电子。鉴于s-GDH对葡萄糖的高比活性(Olsthoorn，A.J.andDuine，J.A.，(1996)上文)及其宽泛的人工电子受体特异性，这种酶非常适于分析应用，特别是用于诊断应用中葡萄糖测定的(生物)传感器或试条中(Kaufmann，N.等，Developmentandevaluationofanewsystemfordeterminingglucosefromfreshcapillarybloodandheparinizedbloodin“Glucotrend”(1997)1-16(用于在“Glucotrend”中测定来自新鲜毛细管血液和肝素化血液的葡萄糖的新系统的研发和评价)，BoehringerMannheimGmbH；Woosuck，S.等，SensorsandActuatorsB100(2004)395-402)。

葡萄糖氧化可以通过至少三种非常不同的酶组来催化，即，通过NAD/P-依赖性葡萄糖脱氢酶、通过黄素蛋白葡萄糖脱氢酶或通过醌蛋白GDH(Duine，J.A.，Biosens.Bioelectronics10(1995)17-23)。已经观察到还原的s-GDH相当慢的自体氧化，证明了氧对于s-GDH是非常差的电子受体(OlsthoornandDuine，1996)。s-GDH可以有效地将来自还原的醌的电子提供给介质如PMS、DCPIP、WB和短链泛醌如Q1和Q2，但是没有有效地将电子直接提供给氧。

用于监控例如来自糖尿病患者的血液、血清和尿液中的葡萄糖水平的传统试条和传感器使用葡萄糖氧化酶。这种酶的性能依赖于氧浓度。在空气中具有不同氧浓度的不同高度的葡萄糖测量可能导致假结果。PQQ-依赖性葡萄糖脱氢酶的主要优势是它们不依赖于氧。这种重要的特征例如描述于US6,103,509中，其中研究了膜结合GDH的一些特征。

对该领域的重要贡献是一起使用了s-GDH和合适的介质。基于s-GDH的测试方法和试条装置详细公开于US5,484,708中。该专利还含有关于测试的设定和用于测量葡萄糖的基于s-GDH的试条的生产的详细信息。其中以及所引用的文献中所述的方法在此引入作为参考。

关于该领域和包括关于具有葡萄糖脱氢酶活性的酶的各种应用模式的信息的其他专利或申请是US5,997,817；US6，057,120；EP0620283；和JP11-243949-A。

利用s-GDH和反应发生时产生颜色变化的指示剂的商业系统(Kaufmann等，1997，上文)是由RocheDiagnosticsGmbH配售的系统。

尽管以上讨论了使用PQQ依赖性s-GDH的优势，但认为在葡萄糖的测定中还是有缺陷的。该酶与m-GDH相比，具有相当宽的底物谱。即，s-GDH不仅氧化葡萄糖，而且还氧化几种其他的糖，包括麦芽糖、半乳糖、乳糖、甘露糖、木糖和核糖(Dokter等，1986a；OubrieA.，Biochim.Biophys.Acta1647(2003)143-151)。在特定情况中，针对葡萄糖以外的糖的反应性可能削弱测定血糖水平的精确性。特别在进行腹膜渗析的患者中，使用淀粉类多糖(葡萄糖聚合物)的治疗可能在他们的体液例如血液中含有高水平的其他糖，尤其是麦芽糖(Wens，R.，等，Perit.Dial.Int.18(1998)603-609)。

因此，临床样品，如从糖尿病患者获得的，尤其是从肾并发症患者获得的，尤其是从渗析下的患者获得的，可以含有显著水平的其他糖，尤其是麦芽糖。从这样的临床患者获得的样品中的葡萄糖测定受到了麦芽糖的削弱(Frampton，J.E.和Plosker，G.L.，Drugs63(2003)2079-2105)。

关于产生具有改变的底物特异性的改良PQQ依赖性s-GDH的尝试，在文献中有一些报道。Igarashi，S.，等，Biochem.Biophys.Res.Commun.264(1999)820-824报道了在位置Glu277引入点突变形成了具有改变的底物特异性特征的突变体。

Sode，EP1176202，报道了s-GDH内的特定氨基酸取代形成了对葡萄糖具有提高的亲和性的突变体s-GDH。在EP1167519中，同一作者报道了具有提高稳定性的突变体s-GDH。此外，同一作者在JP2004173538中报道了对葡萄糖具有提高的亲和性的其他s-GDH突变体。

Kratzsch，P.等，WO02/34919报道了可以通过s-GDH的特定位置中的氨基酸置换来提高s-GDH对葡萄糖的特异性，与其他糖底物相比较，尤其是与麦芽糖相比较。重要且决定性的是氨基酸位置348的置换。例如在位置348含有替代野生型s-GDH中存在的苏氨酸的甘氨酸的突变体s-GDH对底物葡萄糖具有显著提高的选择性，例如，与底物麦芽糖相比较。它们还公开了在位置348和428具有置换的双突变体对葡萄糖具有更加提高的特异性。

在WO2006/008132中，显示了s-GDH的氨基酸428和429之间的氨基酸插入，尤其是结合位置348的合适氨基酸置换，对底物特异性具有非常有利的作用。含有该插入的突变体例如对底物葡萄糖具有更高的特异性，与底物麦芽糖相比较。

然而，已经报道了对葡萄糖特异性的一些改进，显示出这些改进经常和不幸地结合一些缺陷，例如这样突变的s-GDH降低的稳定性、降低的活性和/或降低的对葡萄糖的亲和性。例如，已经清楚的是在位置348包括氨基酸置换的s-GDH突变体花费于所述突变体的稳定性、亲和性和活性，与野生型酶相比较。

因此对于进一步改进的突变形式的s-GDH存在着很大的需求和临床需要，该突变形式的s-GDH对葡萄糖具有高特异性，并且同时其特征在于合适的热稳定性，以及比活性或对葡萄糖的亲和性的提高，或特征在于比活性和对葡萄糖的亲和性同时提高。

本发明的任务是提供新的s-GDH突变体或变体，其与在位置348包括置换的具有提高的特异性的突变体相比较，具有显著提高的热稳定性、比活性和对葡萄糖的亲和性。

已经发现了通过从所附权利要求中给出的位置选择突变，可以显著提高在位置348具有置换的s-GDH突变体的热稳定性、比活性和对葡萄糖的亲和性。

由于新形式的s-GDH的改良特性，用于各种应用领域中葡萄糖测定的有意义的技术方法是可能的。例如可以根据本发明的改良s-GDH突变体，对于生物样品中葡萄糖的特异性检测或测量具有很大的优势。

发明概述

本发明涉及s-GDH的突变体。公开了PQQ-依赖性可溶性葡萄糖脱氢酶(s-GDH；EC1.1.5.2)的突变体，其对于葡萄糖(与麦芽糖相比)具有提高的特异性，在位置348由甘氨酸、丙氨酸或丝氨酸置换了苏氨酸，并且其中所述突变体另外包括至少一个用于提高突变体稳定性的突变，至少一个用于提高突变体对葡萄糖的亲和性的突变，和任选一个或多个用于进一步提高突变体对葡萄糖(与麦芽糖相比)的特异性的突变，并且其中给出的位置对应于从醋酸钙不动杆菌s-GDH野生型序列(SEQIDNO：2)已知的氨基酸位置。

还公开了分离的编码s-GDH突变蛋白的多核苷酸，含有可操作连接启动子序列的所述分离多核苷酸的表达载体，该启动子序列能够促进所述多核苷酸再宿主细胞中的表达，以及含有所述表达载体的宿主细胞。

此外，描述了生产s-GDH突变体的方法，包括在适于产生s-GDH突变体的条件下培养用合适的表达载体转染的宿主细胞。

还公开了使用根据本发明的改良s-GDH突变体检测、测定或测量样品中葡萄糖的方法，所述改进包括将样品接触所述突变体。

还描述了用于检测或测量样品中葡萄糖的装置，包括根据本发明的改良s-GDH和所述测量需要的其他试剂。

发明详述

在第一个实施方案中，本发明涉及PQQ-依赖性可溶性葡萄糖脱氢酶(s-GDH；EC1.1.5.2)的突变体，其对于葡萄糖(与麦芽糖相比)具有提高的特异性，在位置348由甘氨酸、丙氨酸或丝氨酸置换了苏氨酸，并且其中所述突变体包括至少一个用于提高突变体稳定性的突变，另外包括至少一个用于提高突变体对葡萄糖的亲和性的突变，和任选一个或多个用于进一步提高突变体对葡萄糖(与麦芽糖相比)的特异性的突变，并且其中给出的位置对应于从醋酸钙不动杆菌s-GDH野生型序列(SEQIDNO：2)已知的氨基酸位置。

如WO02/34919中所述的，对应于从醋酸钙不动杆菌分离的野生型序列的s-GDH序列的位置348中的氨基酸置换可以用来显著提高s-GDH的葡萄糖特异性。这是为什么本发明的框架中所述的改进得到了全部描述，并且是基于在位置348含有氨基酸置换的s-GDH突变体。优选，位置348的残基苏氨酸是由选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸的氨基酸残基置换的。在更优选的实施方案中，甘氨酸或丝氨酸用来替代位置348的苏氨酸。术语T348G是本领域技术人员已知的，并且表示位置348的苏氨酸由甘氨酸替代。

如上所讨论的，将具有葡萄糖脱氢酶活性的两种完全不同的醌蛋白酶类型(膜结合的和可溶性的)一起分组在EC1.1.5.2下。这两种类型显示出彼此不相关。

对于本发明的目的，只有可溶性形式的GDH(s-GDH)是相关的，并且以下讨论其改良的突变体。

本领域已知可以从不动杆菌的菌株分离出可溶性PQQ依赖性葡萄糖脱氢酶的野生型DNA-序列。最优选的是从醋酸钙不动杆菌型菌株LMD79.41分离s-GDH。这种野生型s-GDH的多肽序列(成熟蛋白)和DNA序列各自在SEQIDNO：2和SEQIDNO：1中给出。其他不动杆菌的LMD菌株也可以用作野生型s-GDH的来源。可以将这样的序列与从醋酸钙不动杆菌获得序列进行比对并进行序列比较。还可行的是筛选其他细菌菌株的DNA文库，如例如所述的大肠杆菌K-12(Oubrie，A.，等，J.Mol.Biol.289(1999)319-333)，并用来鉴定这样的基因组中与s-GDH相关的序列。这样的序列以及尚未鉴定的同源序列可以用来产生具有提高的热稳定性的s-GDH突变体。

通过参考从SEQIDNO：2已知的氨基酸位置，更详细地描述本发明的成就，SEQIDNO：2是从醋酸钙不动杆菌型菌株LMD79.41分离的野生型s-GDH序列。通过合适的序列比较容易地鉴定出不同的s-GDH分离物中对应于SEQIDNO：2的氨基酸位置。

优选使用GCGPackageVersion10.2(GeneticsComputerGroup，Inc.)的PileUp程序进行s-GDH序列与野生型SEQIDNO：2序列的多重比对和比较。PileUp形成了多个序列比对，使用Feng，D.F.和Doolittle，R.F.，J.Mol.Evol.25(1987)351-360的渐进性比对方法的简化，并且因此限定用于相同、相似或不同氨基酸残基的记分矩阵。这种方法开始于两个最相似序列的成对比对，产生了两个受比对序列的簇。然后，可以将该簇与下一个最相关的序列或受比对序列的簇进行比对。可以通过两个单独序列的成对比对的简单延伸来比对两个簇的序列。通过一系列渐进性的成对比对来完成最终的比对，该渐进性的成对比对包括递增的不同序列和簇，直至所有序列包括在最终的成对比对中。可以容易地将另一个同源s-GDH分子中这样的氨基酸位置鉴定为对应于SEQIDNO：2中的醋酸钙不动杆菌s-GDH给出的位置。这是为什么在此给出的氨基酸位置应当理解为SEQIDNO：2的氨基酸位置或作为另一个同源s-GDH分子中与其对映的位置。

在本发明的意义伤，术语“突变体”或“变体”涉及s-GDH蛋白，其与SEQIDNO：2给出的野生型氨基酸序列相比较，呈现出至少一个氨基酸置换、删除或插入。

s-GDH突变体可以包括其他置换和/或删除和/或插入，只要本发明的s-GDH突变体与SEQIDNO：2的s-GDH的不同不超过45个氨基酸，例如，总共呈现出最多45个氨基酸置换、插入或删除。

术语“用于提高稳定性的突变”指的是在短期温度应力模型中提高s-GDH突变体的热稳定性的任何氨基置换和/或删除和/或插入。

如上所述，只有并且很大程度地以降低的稳定性、对葡萄糖降低的亲和性或降低的比活性或这些不利特征的任何组合的代价，才可能出现葡萄糖特异性的提高。

在这样的短期应力模型中测定根据本发明的稳定性，并将该模型中测定的s-GDH稳定性称为热稳定性。通过测量样品无应力的和受应力的s-GDH酶活性来测定热稳定性。通过将无应力样品活性设定为100％，可以以百分比计算应力处理后的剩余活性。对于具有提高的底物特异性的s-GDH的突变体，选择了64℃持续30分钟的应力条件。使用这些条件，野生型酶具有约80％剩下的最初活性，而大部分对葡萄糖具有提高的特异性的突变体，将它们接受这种短期应力模型后，只具有10％或更低剩下的最初活性。

优选，用于提高在位置348由甘氨酸、丙氨酸或丝氨酸置换苏氨酸的s-GDH变体的稳定性的突变是置换。优选，所述置换选自D87R；N122K；S124K；S146A或G；L187F或M；N267Y；V298L；T313D和L368F。

还优选用于提高s-GDH变体的稳定性的所述置换选自D87R；N122K；S124K；S146G；V298L和L386F。在进一步优选的实施方案中，在突变的s-GDH中使用两个、三个或四个这些置换的组合，或者还优选的是，使用所有这些五个置换。

在优选的实施方案中，根据本发明的s-GDH突变体在位置87含有精氨酸，如从醋酸钙不动杆菌野生型s-GDH(SEQIDNO：2)已知的或在对应于同源酶中的所述位置87的位置中。

在进一步优选的实施方案中，根据本发明的s-GDH突变体在位置122含有赖氨酸，如从醋酸钙不动杆菌野生型s-GDH(SEQIDNO：2)已知的或在对应于同源酶中的所述位置122的位置中。

在进一步优选的实施方案中，根据本发明的s-GDH突变体在位置124含有赖氨酸，如从醋酸钙不动杆菌野生型s-GDH(SEQIDNO：2)已知的或在对应于同源酶中的所述位置124的位置中。

在进一步优选的实施方案中，根据本发明的s-GDH突变体在位置146含有甘氨酸，如从醋酸钙不动杆菌野生型s-GDH(SEQIDNO：2)已知的或在对应于同源酶中的所述位置146的位置中。

在进一步优选的实施方案中，根据本发明的s-GDH突变体在位置298含有亮氨酸，如从醋酸钙不动杆菌野生型s-GDH(SEQIDNO：2)已知的或在对应于同源酶中的所述位置298的位置中。

在进一步优选的实施方案中，根据本发明的s-GDH突变体在位置386含有苯丙氨酸，如从醋酸钙不动杆菌野生型s-GDH(SEQIDNO：2)已知的或在对应于同源酶中的所述位置386的位置中。

就热稳定性而言，已经发现六个s-GDH的位置对于获得显著提高似乎是相当重要的，即，位置87、122、124、146、298和386。在此显著相关的是已经发现这些置换对突变体的热稳定性具有显著作用的事实，该突变体是之前为了提高葡萄糖特异性而产生的，但是是以降低的热稳定性为代价的。在优选的实施方案中，根据本发明的s-GDH突变体在SEQIDNO：2的位置87含有精氨酸，在位置122和124含有赖氨酸，在位置146含有甘氨酸，在位置298含有亮氨酸，而在位置386含有苯丙氨酸，或者如果使用了同源s-GDH，在对应于所述位置的位置中。

在进一步优选的实施方案中，本发明涉及PQQ依赖性可溶性葡萄糖脱氢酶(s-GDH；EC1.1.5.2)的突变体，其对葡萄糖(与麦芽糖相比较)具有提高的特异性，在位置348由甘氨酸或由丙氨酸或由丝氨酸置换了苏氨酸，其中所述突变体另外包括至少一个用于提高突变体稳定性的突变和至少一个用于提高突变体对葡萄糖的亲和性的突变。

术语对底物的“亲和性”是本领域公知的。以mM给出，称为Km-值。本领域已知各种方法来测定s-GDH的亲和性，使用葡萄糖或其他糖作为底物，参考，Igarashi，S.，等，BiochemBiophysResCommun264(1999)820。

在使用粗制大肠杆菌提取物筛选新变体中，进行Km-值的百分比计算，用于对所产生的克隆进行较快的评价。对于候选的s-GDH突变体，根据公知的Michaelis-Menten-动力学计算对葡萄糖的亲和性。

与在位置348包括由甘氨酸、丙氨酸或丝氨酸置换了苏氨酸的突变体相比较，根据本发明的s-GDH突变体对葡萄糖具有提高的亲和性。优选，如实施例部分中详细所述的来测定对底物葡萄糖的亲和性。

优选，用于提高已经在位置348包括由甘氨酸、丙氨酸或丝氨酸置换了苏氨酸的s-GDH突变体对葡萄糖的亲和性的一个或多个突变选自L110H或Y；N229A、G或S；Q246H、M或N；Y333A；G339T；M341V；V349A或G和V436P。

在本发明的变体中对应于从醋酸钙不动杆菌已知的s-GDH野生型序列(SEQIDNO：2)的位置110的氨基酸被置换的情况中，优选天然产生的氨基酸亮氨酸由选自组氨酸和酪氨酸的氨基酸置换。更优选，位置110的置换是由组氨酸置换的。

在本发明的变体中对应于从醋酸钙不动杆菌已知的s-GDH野生型序列(SEQIDNO：2)的位置229的氨基酸被置换的情况中，优选天然产生的氨基酸天冬酰胺由选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸的氨基酸置换。更优选，位置229的置换是由丙氨酸置换的。

在本发明的变体中对应于从醋酸钙不动杆菌已知的s-GDH野生型序列(SEQIDNO：2)的位置349的氨基酸被置换的情况中，优选天然产生的氨基酸缬氨酸由选自丙氨酸和甘氨酸的氨基酸置换。更优选，位置349的置换是由甘氨酸置换的。

还优选的是，用于提高对葡萄糖的亲和性的突变选自L110H、Q246H；G339T；M341V、V349G和V436P。

还优选的是，用于提高对葡萄糖的亲和性的所述置换选自Q246H；G339T；M341V和V349G。根据本发明优选的s-GDH包括这些置换中的两个或三个或所有这些四个置换。

在进一步优选的实施方案中，上述对葡萄糖(与麦芽糖相比较)具有提高的特异性，在位置348具有由甘氨酸、丙氨酸或丝氨酸置换了苏氨酸并且包括至少一个用于提高稳定性的突变的s-GDH突变体另外包括一个或多个用于提高突变体对葡萄糖(与麦芽糖相比较)的底物特异性的突变。

对于特定的应用，对葡萄糖(与麦芽糖相比较)具有提高的特异性，在位置348具有由甘氨酸、丙氨酸或丝氨酸置换了苏氨酸的s-GDH突变体的底物特异性还不足以用于特定的常规应用。

在特定的实施方案中，需要产生除了上述在位置348的突变外还包括一个或多个其他用于进一步提高突变体对葡萄糖(与麦芽糖相比较)的特异性的突变的s-GDH突变体。

术语“底物特异性”或“特异性”是本领域技术人员公知的。

为了计算底物特异性或交叉反应性，一种容易的方法是将用葡萄糖作为底物测量的活性设定为100％并将使用其他选定的糖测量的活性与葡萄糖值进行比较。有时候，为了不多余，简单使用术语特异性，一方面没有特意参照葡萄糖，而另一方面没有特意参照选定的其他糖。

本领域的专家清楚使用公认的条件以等摩尔浓度的所研究底物分子进行酶活性比较是最好的。另外必须进行浓度差异的校正。

为了测试底物特异性(的提高)，必须选择标准化和公认的测试条件。如实施例部分中所述的来测量s-GDH对作为底物的葡萄糖以及对其他选定的糖底物的酶活性。

基于各自对葡萄糖或对麦芽糖的酶活性的测量，测定交叉反应性(及其提高)。

按照交叉反应性[％]＝(麦芽糖活性/葡萄糖活性)×100％计算以百分比计的s-GDH对麦芽糖的(交叉)反应性。

根据上述等式已经将野生型s-GDH对麦芽糖的(交叉)反应性测定为约105％(参见WO02/34919)。

根据以下等式计算特异性：

与对葡萄糖(与麦芽糖相比较)具有提高的特异性，在位置348具有由甘氨酸、丙氨酸或丝氨酸置换了苏氨酸的s-GDH突变体相比较，认为新的s-GDH突变体特异性的提高在上述计算中为较小的值。

本领域技术人员将认识到绝对数取决于突变体中已经存在的突变的数量和种类。将突变体中已经存在的突变的数量和种类称为突变背景。任何新的突变最好与突变背景直接比较。

优选，用于进一步提高对葡萄糖(与麦芽糖相比较)的底物特异性的突变是选自Q145P；D163G或N；Q164F；L169F；Y171G；I208L或V；T224I；E245D；G276S；A294D或E；V300A、S、N、Y或I；T307G；T323V；A354Y、E或L；R378I、M、A或D；N428P的氨基酸置换和插入429P。术语“插入429”用来表示SEQIDNO：2的位置428和位置429之间插入脯氨酸。

在本发明的变体中对应于从醋酸钙不动杆菌已知的s-GDH野生型序列(SEQIDNO：2)的位置169的氨基酸被置换的情况中，优选天然产生的氨基酸亮氨酸由选自苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的氨基酸置换。更优选，位置169的置换是由苯丙氨酸置换的。

在本发明的变体中对应于从醋酸钙不动杆菌已知的s-GDH野生型序列(SEQIDNO：2)的位置171的氨基酸被置换的情况中，优选天然产生的氨基酸酪氨酸由选自丙氨酸、甲硫氨酸和甘氨酸的氨基酸置换。更优选，位置171的置换是由甘氨酸置换的。

在本发明的变体中对应于从醋酸钙不动杆菌已知的s-GDH野生型序列(SEQIDNO：2)的位置245的氨基酸被置换的情况中，优选天然产生的氨基酸谷氨酸由选自天冬氨酸、天冬酰胺或谷酰胺的氨基酸置换。更优选，位置245的置换是由天冬氨酸置换的。

在本发明的变体中对应于从醋酸钙不动杆菌已知的s-GDH野生型序列(SEQIDNO：2)的位置341的氨基酸被置换的情况中，优选天然产生的氨基酸甲硫氨酸由选自缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸的氨基酸置换。更优选，位置341的置换是由缬氨酸置换的。

还发现了可以在位置428和429之间插入氨基酸优选脯氨酸来进一步提高已经在位置348包括置换的s-GDH突变体的底物特异性。

还优选的是，用于提高对葡萄糖(与麦芽糖相比较)的底物特异性的其他突变选自L169F；Y171G；E245D；N428P和插入429P。

优选，用于提高对葡萄糖(与麦芽糖相比较)的底物特异性的其他突变选自L169F；Y171G；E245D；和N428P。在进一步优选的实施方案中，使用两个、三个或所有这四个置换的组合来提高该突变体对葡萄糖(与麦芽糖相比较)的底物特异性。还优选的是，用于提高对葡萄糖(与麦芽糖相比较)的底物特异性的其他突变选自L169F；Y171G；E245D；和插入429P。在进一步优选的实施方案中，在突变的s-GDH中和插入429P一起使用两个或全部三个置换的组合来提高该突变体对葡萄糖(与麦芽糖相比较)的底物特异性。

如WO02/34919和WO2006/008132中分别所述的，位置428的置换，由此天冬酰胺由脯氨酸替代的，或位置428和429之间的氨基酸脯氨酸的插入，分别进一步提高了已经在位置348包括置换的s-GDH突变体的特异性。在进一步优选的实施方案中，本发明因此涉及PQQ依赖性可溶性葡萄糖脱氢酶(s-GDH；EC1.1.5.2)的突变体，其对葡萄糖(与麦芽糖相比较)具有提高的特异性，在位置348具有由甘氨酸或由丙氨酸或由丝氨酸置换了苏氨酸，由此天冬酰胺由脯氨酸替代或位置428和429之间插入氨基酸脯氨酸，其中所述突变体另外包括至少一个用于提高突变体稳定性的突变，至少一个用于提高突变体的比活性的突变，和任选一个或多个用于提高突变体对葡萄糖的亲和性的突变，和/或一个或多个用于进一步提高突变体对葡萄糖(与麦芽糖相比较)的特异性的突变，并且其中给出的位置对应于从醋酸钙不动杆菌s-GDH野生型序列(SEQIDNO：2)已知的氨基酸位置。

在另一个实施方案中，本发明涉及PQQ依赖性可溶性葡萄糖脱氢酶(s-GDH；EC1.1.5.2)的突变体，其对葡萄糖(与麦芽糖相比较)具有提高的特异性，在位置348具有由甘氨酸或由丙氨酸或由丝氨酸置换了苏氨酸，其中所述突变体另外包括至少一个用于提高突变体稳定性的突变和至少一个用于提高突变体的比活性的突变。

术语“比活性”是本领域公知的。它用来描述每含量蛋白质的酶活性。本领域已知用各种方法来测定s-GDH的比活性，使用葡萄糖或其他糖作为底物，参见，例如，Igarashi，S.，等，BiochemBiophysResCommun264(1999)820。与在位置348包括由甘氨酸、丙氨酸或丝氨酸置换苏氨酸的突变体相比较，根据本发明的s-GDH突变体对底物葡萄糖具有提高的比活性。

优选，用于提高对葡萄糖的比活性的突变是选自H30F或R；A301G或S和A302S或T的氨基酸置换。

如本领域技术人员所知的，可以采取氨基酸置换，例如，沉默突变，其没有将s-GDH的特性影响至显著扩大。然而，根据本发明的变体与SEQIDNO：2相比较，具有不超过45个氨基酸变化。优选，变体将包括20个或更少的氨基酸置换，更优选，只有15个氨基酸置换或更少的置换存在。

在实施例部分给出了根据本发明的一些特异性s-GDH变体。优选，具有低葡萄糖干扰而关于热稳定性和对葡萄糖的底物亲和性具有提高的特征的s-GDH变体包括具有以下置换的突变体：

N122K+L169F+Y171G+E245D+M341V+T348G+ins429P；

N122K+S124K+L169F+Y171G+E245D+M341V+T348G+ins429P；

N122K+S124K+L169F+Y171G+E245D+M341V+T348G+L386F+ins429P；

N122K+S124K+L169F+Y171G+E245D+Q246H+M341V+T348G+L386F+ins429P；

D87R+N122K+S124K+S146G+L169F+Y171G+E245D+Q246H+V298L+M341V+T348S+L386F+ins429P；

D87R+N122K+S124K+S146G+L169F+Y171G+E245D+Q246H+V298L+G339T+M341V+T348G+L386F+ins429P；

D87R+N122K+S124K+S146G+L169F+Y171G+E245D+Q246H+V298L+M341V+T348S+L386F+ins429P+V436P；

D87R+N122K+S124K+S146G+L169F+Y171G+E245D+Q246H+V298L+M341V+T348S+V349G+A354T+L386F+ins429P；

D87R+L110H+N122K+S124K+S146G+L169F+Y171G+E245D+Q246H+V298L+M341V+T348S+L386F+ins429P。

本领域中已知产生突变蛋白的各种可能性。基于本发明公开了特定残基对提高突变体s-GDH的热稳定性、对葡萄糖的亲和性和底物特异性的关键重要性的重要发现，本领域技术人员现在可以容易地产生更多合适的带有这些和其他有利改进的s-GDH变体。例如，可以通过已知的方法如随机诱变(Leung，D.W.，等，Technique1(1989)11-15)和/或定点诱变(Hill，D.E.，等，MethodsEnzymol.155(1987)558-568)来获得这样的变体。生产具有所需特性的蛋白的可替换方法是提供嵌合构建体，其含有来自至少两个不同来源的序列要素，或完全合成合适的s-GDH基因。这样本领域已知的方法可以结合本发明公开的信息使用来提供s-GDH的突变体或变体，其包括，例如，其他的氨基酸置换结合SEQIDNO：2的位置348置换的已知关键重要性。

例如，可以通过从醋酸钙不动杆菌型菌株LMD79.41分离的s-GDH基因以及通过从同源序列开始来产生根据本发明的s-GDH变体。在本申请的范围中，术语“同源”意思是与SEQIDNO：2相比较，包括具有至少90％同一性的s-GDH氨基酸序列。换句话说，使用PileUp程序进行合适的比对后，该同源s-GDH至少90％的氨基酸与SEQIDNO：2中所述的氨基酸相同。

将理解DNA和氨基酸序列的变化天然存在，或可以是使用本领域已知的方法有意引入的。这些变化可以导致整个序列与SEQIDNO：2相比较高达10％的氨基酸差异，这些差异是由于所述序列中一个或多个氨基酸残基的删除、置换、插入、颠倒或添加引起的。例如，可以基于所涉及残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两性性质，进行这样的氨基酸置换。例如，负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；具有不带电的极性头部基团或非极性头部基团并具有相似亲水性值的氨基酸包括以下的：亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。其他考虑的变化包括上述多肽的盐和酯，以及上述多肽的前体，例如，具有N-端置换的前体，如用作前导序列的甲硫氨酸、N-甲酰甲硫氨酸。可以进行这样的变化，而没有必然地脱离本发明的范围和精神。

根据本领域现有技术中已知的方法或根据实施例部分中给出的方法，可以获得编码上述任一种s-GDH突变体的多核苷酸序列。本发明因此还包括分离的多核苷酸序列，其编码如上所述的根据本发明的s-GDH突变蛋白。

本发明进一步包括表达载体，其含有可操作连接能够在宿主细胞中指导其表达的启动子序列的根据本发明的核酸序列。

本发明进一步包括表达载体，其含有可操作连接能够在宿主细胞中指导其表达的启动子序列的根据本发明的核酸序列。优选的载体是质粒，如图2和3中所示的pACSGDH。

本发明中有用的表达载体通常含有复制起点、用于选择的抗生素抗性、用于表达的启动子和完整的或一部分s-GDH基因变体。表达载体还可以包括本领域已知的其他DNA序列，如信号序列(用于更好的折叠、转运至胞间质中或分泌)、用于更好地调节表达的诱导剂，或用于克隆的分裂位点。

选定的表达载体的特征必须与待使用的宿主细胞相容。例如，在大肠杆菌细胞系统中克隆时，表达载体应当含有从大肠杆菌的基因组分离的启动子(例如，lac或trp)。可以使用合适的复制起点，如ColEl质粒复制起点。合适的启动子包括，例如，lac和trp。还优选的是表达载体包括编码选择标记如抗生素抗性基因的序列。作为可选择的标记，通常氨基苄青霉素抗性或卡那霉素抗性。所有这些材料是本领域已知的并可购得。

可以使用本领域已知的标准重组DNA技术构建含有所需编码和控制序列的合适表达载体，其中许多技术描述于Sambrook等的“MolecularCloning：ALaboratoryManual”(分子克隆：实验室手册)中，(1989)ColdSpringHarbor，NY，ColdSpringHarborLaboratoryPress。

本发明另外涉及含有表达载体的宿主细胞，该载体包括编码全部或部分突变体s-GDH的DNA序列。宿主细胞优选含有如下的表达载体，该表达载体包括编码具有实施例2-8中所示的一个或多个突变的突变体s-GDH的DNA序列之一的全部或部分。合适的宿主细胞包括，例如，从Promega(2800WoodsHollowRoad，Madison，WI，USA)可获得的大肠杆菌HB101(ATCC33694)、从Stratagene(11011NorthTorreyPineRoad，LaJolla，CA，USA)可获得的XL1-BlueMRF’等。

可以通过本领域已知的各种方法将表达载体引入宿主细胞中。例如，可以通过聚乙二醇介导的原生质体转化方法(Sambrook等，1989，上文)进行用表达载体转化宿主细胞。然而，也可以使用其他将表达载体引入宿主细胞中的方法，例如，电穿孔、弹道注射或原生质体融合。

一旦将含有s-GDH变体的表达载体引入合适的宿主细胞，可以在允许所需s-GDH变体表达的条件下培养宿主细胞。可以通过即抗生素选择来容易地鉴定含有所需表达载体的宿主细胞，该表达载体具有编码突变体s-GDH的全部或部分的DNA序列。可以通过不同的方法如测量-GDHmRNA转录产物的产生、免疫检测基因产物或检测基因产物的酶活性来鉴定s-GDH变体的表达。优选，使用酶测试。

本发明还教导了s-GDH突变体的产生和筛选。按照本领域中所知的进行随机诱变和饱和诱变。筛选变体的热稳定性(将没有热应力处理的活性与热应力处理后的剩余活性相比较)。调整所选择的测试条件，以确保可以测量例如由单个氨基酸置换引起的预期少量提高。实施例3中给出了一种合适突变体的选择或筛选的优选模式。可以清楚地检测与起始酶(突变体或野生型)相比较的任何变化或提高。

当然，应当理解不是所有的表达载体和DNA调控序列将同样地起很好的作用来表达本发明的DNA序列。也不是所有的宿主细胞将同样地与相同的表达系统一起起到很好的作用。然而，本领域技术人员将清楚使用在此提供的指导在表达载体、DNA调控序列和宿主细胞中进行选择，而不需要过度的实验。

本发明还涉及用于产生本发明的s-GDH变体的方法，包括在适于产生本发明的突变体s-GDH的条件下培养本发明的宿主细胞。对于细菌宿主细胞，典型的培养条件是含有碳源和氮源、合适的抗生素和诱导剂(取决于所用的表达载体)的液体培养基。典型的合适抗生素包括氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素等。典型的诱导剂包括IPTG、葡萄糖、乳糖等。

优选的是通过在宿主细胞中表达编码突变体s-GDH的DNA序列的产生来获得本发明的多肽。还可以通过由编码突变体s-GDH的DNA序列编码的mRNA的体外翻译来获得本发明的多肽。例如，可以如上所述的合成DNA序列并插入合适的表达载体中，随后将其用于体外转录/翻译系统中。

含有可操作地连接能够在无细胞肽合成系统中促进表达的启动子序列的如所限定的和上述的分离多核苷酸的表达载体表示本发明的另一个优选实施方案。

例如，通过如上所述的方法产生的多肽，然后使用各种常规蛋白纯化技术来分离和纯化。例如，可以使用色谱方法，如离子交换色谱、凝胶过滤色谱和亲和性色谱。

本发明改良的s-GDH变体的一个主要应用是用于试条中，用来监控糖尿病患者的血糖水平。如上所讨论的，PQQ-依赖性葡萄糖脱氢酶对氧的不敏感性是优于葡萄糖氧化酶的一个大优势。现在使用具有提高的热稳定性以及对葡萄糖提高的特异性的新s-GDH变体可以显著降低由于待分析样品中可能存在的例如麦芽糖、半乳糖和/或其他相关糖引起的干扰。当然，可以研究许多种类的样品。体液，如血清、血浆、小肠液或尿液是这些样品的优选来源。

本发明还包括使用根据本发明的s-GDH突变体检测、测定或测量样品中的葡萄糖的方法。特别优选的是用于检测样品中的葡萄糖的改良方法的特征在于使用传感器或试条装置进行葡萄糖的所述检测、测定或测量。

也在本发明范围内的是用于检测或测量样品中的葡萄糖的装置，其包括根据本发明的s-GDH突变体以及所述测量需要的其他试剂。

本发明具有提高的热稳定性的s-GDH变体也可以很有利地用于生物传感器中(D′Costa，E.J.，等，Biosensors2(1986)71-87；Laurinavicius，V.，等，AnalyticalLetters32(1999)299-316；Laurinavicius，V.，等，MonatsheftefuerChemie130(1999)1269-1281；Woosuck，S.等，SensorsandActuatorsB100(2004)395-402)，用于在线监控样品或反应器中的葡萄糖。出于该目的，例如，s-GDH变体可以用于覆盖氧不敏感玻璃质电极，该电极具有含有氧化还原传导环氧网络的锇复合物(Ye等，1993，上文)，用于更精确的测定葡萄糖浓度。

在以下的实施例中，所有试剂、限制酶和其他材料都获自RocheDiagnosticsGermany，除非特意指出其他商业来源，并根据供应商给出的说明来使用。用于DNA的纯化、表征和克隆的操作和方法是本领域公知的(Ausubel，F.，等，在″Currentprotocolsinmolecularbiology″(分子生物学的通用方案)中，(1994)WileyVerlag)，并可以按照需要由本领域技术人员来调整。

以下的实施例进一步说明了本发明。不打算将这些实施例用来限制本发明的范围，但提供了更多的本发明的理解。

提供了以下的实施例、序列表和附图来帮助理解本发明，其真实范围列于所附权利要求中。理解可以对所示方法进行改动，但没有脱离本发明的精神。

附图描述

图1：根据序列同源性比对的醋酸钙不动杆菌PQQ-依赖性s-GDH(上图)和鲍氏不动杆菌s-GDH(下图)的蛋白序列。

图2：实施例1中提及的pACSGDH载体的说明，其各自含有可溶性PQQ依赖性葡萄糖脱氢酶的野生型或突变的DNA序列。

图3：实施例1中提及的pACSGDH载体的核苷酸(DNA)序列，其含有可溶性PQQ依赖性葡萄糖脱氢酶的野生型DNA序列。

实施例1

大肠杆菌中野生型醋酸钙不动杆菌可溶性PQQ依赖性葡萄糖脱氢酶的克隆和表达

根据标准方法从醋酸钙不动杆菌菌株LMD79.41分离s-GDH基因。将野生型s-GDH基因亚克隆至含有用于可调节表达的mgl启动子的质粒中(参考专利申请WO88/09373)。将新的构建体称为pACSGDH(参见图2和3以及SEQIDNO：3)。将重组质粒引入选自大肠杆菌组的宿主生物体中。然后将这些生物体在合适的条件下培养并选择显示出s-GDH活性的菌落。

使用QIAGENPlasmidMaxi试剂盒(Qiagen)根据制造商的方案从200ml上述克隆的过夜培养物中分离出质粒pACSGDH。将质粒重悬浮于1ml重蒸水中。使用BeckmanDU7400光度计测定质粒的浓度。

产量为600μg。然后，通过琼脂糖凝胶电泳测定质粒的质量。

实施例2

产生突变体T348G和突变体T348S

制造了各自用于产生具有突变T348G或T348S的改良变体突变体s-GDH的起始模板。选择这些s-GDH的突变体，是因为已知它们对葡萄糖具有提高的底物特异性，与底物麦芽糖相比较(参见WO02/34919)。

使用QuickChange定点诱变试剂盒(Stratagene，Cat.200518)，以在位置348由甘氨酸或丝氨酸替代苏氨酸。设计合适的引物。

用于诱变的5’-和3’-引物彼此互补，并在特定的位置含有改变的密码子，用于将苏氨酸变成甘氨酸(ACA至GGG)或从苏氨酸变成丝氨酸(ACA至TCA)。这些核苷酸的两侧在每一端为12至16个核苷酸。核苷酸的序列与用于氨基酸变换的密码子两侧的正义和反义DNA-链相同。替代密码子ACA＝苏氨酸用于正义链，TGT用于反义链，含有GGG＝甘氨酸或TCA＝丝氨酸的引物给自用于正义链，CCC＝甘氨酸或AGT＝丝氨酸各自用于反义链。用于变换T348G的正义和反义链各自如SEQIDNO：3和4中所示。

CATTTGCTGGCCAGGGGTTGCACCGTCAT(＝SEQIDNO：4)

ATGACGGTGCAACCCCTGGCCAGCAAATG(＝SEQIDNO：5)

根据手册进行PCR反应和DpnI消化。此后，将1μl的样品用于XL-MRF’-细胞的电穿孔。在0.2cm的比色皿中使用BioRad大肠杆菌脉冲仪(BioRad)用2.5KV来实现电穿孔。在1mlLB中37℃生长一小时后，将细菌涂布于“4×酵母”培养基(20g酵母提取物+5gNaCl，pH7.0至11Aquadest.)-氨苄青霉素琼脂平板(100μg/ml氨苄青霉素)，并在37℃生长过夜。使用以下的筛选方法检测突变的s-GDH克隆。

实施例3

筛选

将上述琼脂平板上的突变体克隆挑选至微量滴定平板(MTP)中，每孔含有200μl“4×酵母”-氨苄青霉素培养基，并在37℃孵育过夜。将这些平板称为主(master)平板。

从每个主平板，将5μl样品/孔转移至含有5μl/孔B(B＝细菌蛋白提取试剂；PierceNo.78248)的MTP中，用于细胞破裂，并加入240μl0.0556mM吡咯并喹啉醌(PQQ)；50mMHepes；15mMCaCl₂pH7.0/孔，用于s-GDH的激活。为了完成全酶的形成，将MTP在25℃孵育2小时并在10℃孵育过夜。将该平板称为工作平板。

从工作平板，将4×10μl样品/孔转移至四个空的MTP中。此后，用标准浓度(即，30mM)的葡萄糖测试第一个等份，用降低的葡萄糖浓度(1.9mM替代30mM)测试第二个等份，用麦芽糖作为底物测试第三个等份，而在和第一个等份一样测试第四个等份之前，将其在64℃接受应力30分钟。以等摩尔标准浓度即30mM使用所有选择的其他糖分子。对于所有的测试，使用90μl已经含有待分析糖的介质溶液(参见实施例8)。

计算dE/min，并将使用30mM葡萄糖作为底物的值设定为100％活性。将用其他糖获得的值与葡萄糖值相比较并以百分比活性来计算((例如，对于麦芽糖为：dE/min麦芽糖/dE葡萄糖)*100)。这等于(变体)酶的交叉反应性。在以下的表中，给出了“M/G”，即，使用麦芽糖(M)作为底物与葡萄糖(G)作为底物的s-GDH的交叉反应性。

将用1.9mM葡萄糖获得的值与30mM葡萄糖值相比较，并以百分比相对活性来计算((dE/min1.9mM葡萄糖/30mM葡萄糖)*100)。这给出了％-值，这是所分析变体的Km-值的直接表示。根据该计算，越高的％-值表示越低(＝越好)的Km-值。

表1：突变体T348G和T348S与野生型(WT)s-GDH相比较的基础特征

酶	30mM糖以％计的M/G	％相对活性1.9mM/30mM葡萄糖	稳定性，30min，64℃	氨基酸(AA)变化
					WT	105％	70％	80％	-
突变体A	22％	25％	40％	T348G
					突变体A’	50％	35％	50％	T348S

实施例4

突变体s-GDH的测序

对s-GDHT348G举例说明该方法。以下详述的测序也可以用于其他s-GDH突变体的测序。

将一些的引物用于s-GDH突变体的测序：

正义链：5′-TTAACGTGCTGAACAGCCGG-3′(＝SEQIDNO：6)

反义链：5`-ATATGGGTAAAGTACTACGC-3′(＝SEQIDNO：7)

各自分离含有突变体s-GDHT348G和s-GDHT348S基因的质粒，s-GDHT348G突变体具有约22％的麦芽糖/葡萄糖交叉反应性，而s-GDHT348S突变体具有50％麦芽糖/葡萄糖交叉反应性(高纯质粒分离试剂盒，RocheDiagnosticsGmbH，No.1754785)，并使用ABIPrismDyeTerminatorSequencing试剂盒以及ABI3/73和3/77测序仪(AmershamPharmaciaBiotech)来测序。

测序证实了对于两个突变体已经获得了DNA和氨基酸水平上的定点诱变。这导致了位置348从T分别变成G或变成S。在两个基因上没有发现其他突变。

实施例5

以T348G(突变体A)和T348S(突变体A’)为基础通过饱和诱变获得更多的s-GDH突变体。

发明人从之前自己进行的研究中知道了候选的氨基酸位置。怀疑或已知这些候选氨基酸位置能影响s-GDH的相关特征，如热稳定性、对葡萄糖的底物特异性或亲和性，基于T348G(突变体A)或基于T348S(突变体A’)单独分析这些特征。

为了评价单个氨基酸置换中哪个分别对突变体T348G或T348S有作用，对于单个氨基酸位置进行了饱和诱变。

使用QuickChangeSite-DirectedMutagenesisKit(Stratagene，Cat.200518)来依次分别置换野生型s-GDH-蛋白的位置87、110、122、124、145、146、169、171、187、246、294、298、300、313、323、333、339、341、349、378、428和436上的野生型氨基酸。

选择用于诱变的5’-和3’-引物是彼此互补的，并在重要位置中含有NNN(N＝A、C、G或T)。三个随机引入的核苷酸N，其在所需的位置并编码所研究的氨基酸位置，这些N两侧每端为12至16个核苷酸，其与模板的正义和反义DNA-链相同。替代野生型密码子，因此引物含有的NNN寡核苷酸编码每个可能的密码子。

对于所研究的每个位置，进行一个PCR反应。

根据QuickChange定点诱变试剂盒(Stratagene，Cat.200518)提供的手册进行PCR反应和DpnI-限制内切酶消化。

对于每个PCR反应，使用1μl用于XL1F-细胞的电穿孔。使细胞生长并如上所述的测定克隆的s-GDH活性。

为了提高统计可能性，本发明中涵盖所有20个可能的氨基酸置换，按照实施例3中所述的对每个位置的200个克隆进行筛选。根据实施例4中给出的方法对感兴趣的克隆进行测序。

表2：其他氨基酸置换对突变体A(＝T348G)的基础特征的作用

酶	在30mM糖以％计的M/G	％相对活性1.9mM/30mM葡萄糖	稳定性，30min，64℃	氨基酸(AA)变换
					Wt-GlucDOR	105％	70％	80％	-
突变体A	22％	25％	40％	T348G
					突变体A/1	-	30％	-	+L110H
突变体A/2	-	28％	-	+L110Y
					突变体A/3	40％	50％	-	+Q246H
突变体A/4	33％	30％	-	+Q246M

酶	在30mM糖以％计的M/G	％相对活性1.9mM/30mM葡萄糖	稳定性，30min，64℃	氨基酸(AA)变换
					突变体A/5	35％	33％	-	+Q246N
突变体A/6	-	30％	-	+Y333A
					突变体A/7	55％	40％	-	+G339T
突变体A/8	30％	45％	-	+V436P
					突变体A/9	28％	30％	-	+M341V
突变体A/10	25％	28％	40％	+V349A
					突变体A/11	26％	28％	40％	+V349G
突变体A/12	20％	27％	-	+Q145P
					突变体A/13	17％	30％	-	+A294D
突变体A/14	15％	30％	-	+A294E
					突变体A/15	20％	28％	-	+V300A
突变体A/16	20％	28％	-	+V300S
					突变体A/17	20％	28％	-	+V300N
突变体A/18	20％	28％	-	+V300Y
					突变体A/19	20％	28％	-	+V300I
突变体A/20	17％	25％	-	+T323V
					突变体A/21	18％	26％	-	+R378I
突变体A/22	19％	26％	-	+R378M
					突变体A/23	17％	26％	-	+R378A
突变体A/24	17％	28％	-	+R378D
					突变体A/25	15％	22％	-	+E245D
突变体A/26	18％	32％	30％	+L169F
					突变体A/27	18％	31％	28％	+Y171G
突变体A/28	12％	20％	20％	+Ins429P
					突变体A/29	-	-	50％	+D87R
突变体A/30	-	-	70％	+S146A
					突变体A/31	-	-	75％	+S146G
突变体A/32	-	-	45％	+L187F
					突变体A/33	-	-	50％	+N122K

酶	在30mM糖以％计的M/G	％相对活性1.9mM/30mM葡萄糖	稳定性，30min，64℃	氨基酸(AA)变换
					突变体A/34	-	-	45％	+S124K
突变体B	10％	35％	50％	T348G+N428P

表3：其他氨基酸置换对突变体A’(＝T348s)的基础特征的作用

酶	在30mM糖以％计的M/G	％相对活性1.9mM/30mM葡萄糖	稳定性，30min，64℃	氨基酸(AA)变换
					Wt-GlucDOR	105％	70％	80％	-
突变体A’	50％	35％	50％	T348S
					突变体A’/1	55％	47％	-	+L110H
突变体A’/2	65％	70％	-	+Q246H
					突变体A’/3	58％	50％	-	+Q246M
突变体A’/4	60％	55％	-	+Q246N
					突变体A’/5	59％	50％	-	+G339T
突变体A’/6	60％	60％	-	+V436P
					突变体A’/7	40％	35％	-	+A294D
突变体A’/8	38％	32％	-	+A294E
					突变体A’/9	41％	45％	-	+T323V
突变体A’/10	43％	47％	-	+R378I
					突变体A’/11	44％	47％	-	+R378M
突变体A’/12	40％	50％	-	+R378A
					突变体A’/13	40％	50％	-	+R378D
突变体A’/14	-	-	60％	+D87R
					突变体A’/15	-	-	80％	+S146A
突变体A’/16	-	-	85％	+S146G
					突变体A’/17	-	-	65％	+V298L
突变体A’/18	-	-	60％	+T313D
					突变体A’/19	-	-	75％	+L386F

从表2和3可以得到各自对突变体A或突变体A’的底物特异性、对葡萄糖的亲和性和/或热稳定性具有积极作用的氨基酸变换。

实施例6

具有提高的热稳定性的突变体的鉴定

已经将实验扩展至对葡萄糖(与麦芽糖相比较)具有相当好的底物特异性的突变体，但是是以如太低的热稳定性或太低的对葡萄糖的亲和性这样的缺陷为代价的。

所谓的突变体6对麦芽糖具有非常有利的低交叉反应性，只是对葡萄糖测量的活性的约1.5％。突变体6的特征在于氨基酸置换Y171G、E245D、M341V和T348G，并且在位置428和429之间具有脯氨酸插入(ins429P)。

使用以下引物来引入这些所需的氨基酸置换：

正义链5′-CCTATAAGAAAAAGACAGATACGCTCG-3′(SEQIDNO：8)

反义链5′-CGAGCGTATCTGTCTTTTTCTTATAGG-3′(SEQID：NO：9)

D87R：

正义链5′-TTCCATCCTCGAGAGATTGTCAAT-3′(SEQIDNO：10)

反义链5′-ATTGACAATCTCTCTGAGGATGGAA-3′(SEQID：NO：11)

N122K和S124K：

正义链5′-CGTTATACCTATAAGAAAAAGACAGATACGCTCG-3′(SEQIDNO：12)

反义链5′-CGAGCGTATCTGTCTTTTTCTTATAGGTATAACG-3′(SEQIDNO：13)

S146G：

正义链5′-AAAAGACCATCAGGGTGGTCTCGAGAAG-3′(SEQIDNO：14)

反义链5′-CTTCTCGAGACCACCCTGATGGTCTTTT-3′(SEQID：NO：15)

V298L：

正义链5′-GCTCAAAATGGATTAAAAGTAGCCGCA-3′(SEQIDNO：16)

反义链5′-TGCGGCTACTTTATTTCCATTTTGAGC-3′(SEQID：NO：17)

L386F：

正义链5′-CCGTATTAAGTTCGATCCAACTTATAGC-3′(SEQIDNO：18)

反义链5′-GCTATAAGTTGGATCGAACTTAATACGG-3′(SEQID：NO：19)

表4：对已经包括其他例如用于提高葡萄糖特异性的突变的s-GDH突变体的热稳定性具有正面影响的突变

酶	在30mM糖以％计的M/G	稳定性，30min，64℃	氨基酸变换
				WT	105％	80％	-
突变体A	25％	40％	T348G
				突变体V	25％	50％	T348G+T313D
突变体VI	25％	45％	T348G+N267Y
				突变体6	1.5％	5％	N122K+L169F+Y171G+E245D+M341V+T348G+ins429P
突变体19	2％	10％	N122K+S124K+L169F+Y171G+E245D+M341V+T348G+ins429P
				突变体21	2％	15％	N122K+S124K+L169F+Y171G+E245D+M341V+T348G+L386F+ins429P
突变体24	2％	25％	N122K+S124K+L169F+Y171G+E245D+M341V+T348G+L386F+ins429P
				突变体22	2.5％	20％	N122K+S124K+L169F+Y171G+E245D+Q246H+M341V+T348G+L386F+ins429P
Mutant25	2.5％	55％	N122K+S124K+L169F+Y171G+E245D+Q246H+M341V+T348G+L386F+ins429P

酶	在30mM糖以％计的M/G	稳定性，30min，64℃	氨基酸变换
				Mutant29	2.5％	75％	D87R+N122K+S124K+S146G+L169F+Y171G+E245D+Q246H+V298L+M341V+T348S+L386F+ins429P
Mutant30	2.5％	60％	D87R+N122K+S124K+S146G+L169F+Y171G+E245D+Q246H+V298L++G339T+M341V+T348G+L386F+ins429P
				Mutant31	3％	80％	D87R+N122K+S124K+S146G+L169F+Y171G+E245D+Q246H+V298L+M341V+T348S+L386F+ins429P+V436P
Mutant32	3.3％	67％	D87R+N122K+S124K+S146G+L169F+Y171G+E245D+Q246H+V298L+M341V+T348S+V349G+A354T+L386F+ins429P
				Mutant33	4.3％	80％	D87R+L110H+N122K+S124K+S146G+L169F+Y171G+E245D+Q246H+V298L+M341V+T348S+L386F+ins429P

以上的结果显示了氨基酸变换D87R、N122K、S124K、S146A或G，优选G，S146G、L187F或M；N267Y、V298L、T313D和L386F提高了基础突变体6的热稳定性。

置换D87R；N122K；S124K；S146G；V298L和L386F对热稳定性的提高具有非常强烈的作用。

实施例7

产生与麦芽糖相比对葡萄糖具有高底物特异性和对葡萄糖提高的亲和性的突变体

在WO02/34919中，已经鉴定了在s-GDH不同位置的七个氨基酸变换，并显示出提高了对葡萄糖的底物特异性，与例如麦芽糖相比较。此外，氨基酸变换T348G与其他位置的氨基酸置换例如位置169、171、245、341和/或349的结合提高了底物特异性。选择了七个对葡萄糖(与麦芽糖相比较)具有提高的特异性但对底物葡萄糖具有相当低的亲和性的不同s-GDH突变体，进行尝试来提高它们对葡萄糖的亲和性。

如从表2和3中概括的实验中可知的，氨基酸置换L110H或Y；N229A、G或S；Q246H、M或N；Y333A；G339T；M341V；V349A或G和V436P显示出能合适地提高s-GDH突变体对葡萄糖的亲和性。使用突变体L110H、Q246H；G339T；M341V；V349G和V436P看到对亲和性最强烈的作用。使用氨基酸变换A246H、M341V；V349G和V436P发现更强烈的亲和性提高。按照实施例6中举例说明的通过相同的策略将点突变引入现有的突变体中，因此在此只给出了用于置换Q246H的特异性引物。

正义链5′-GGTAAATTATTGCAGTCTGATCATGGCCC-3′(SEQIDNO：20)

反义链5′-GGGCCATGATCAGACTGCAATAATTTACC-3′(SEQID：NO：21)

进行了如实施例3中所述的通过筛选Km-值测量来测定对葡萄糖的亲和性。从不同底物浓度对酶活性的曲线计算明显的Km-值。

按照实施例8中所述的计算出比活性。

已经将鉴定为适于提高底物特异性、亲和性和/或稳定性的变换组合引入对葡萄糖(与麦芽糖相比较)具有显著提高的特异性的突变体s-GDH中。

表5：与麦芽糖相比对葡萄糖具有提高的底物特异性的s-GDH突变体中各种氨基酸置换的组合

酶	以％计的筛选Km-值	app.Km-值mM葡萄糖	app.Km-值mM麦芽糖	以％计的M/G	比活性U/mg
						WT	70	0，7	1，4	105	800
突变体6	8	64，7	714	1.5	268
						Mut.13(＝突变体6+Q246H)	20	17，1	208	3	430
突变体G	12	11	110	2	351
						Mut.J(＝突变体G+Q246H)	18	8	143	3	489
突变体22	18	11	n.d.	2.5	400
						突变体23(＝突变体22，+Q246N)	15	13	n.d.	2	350
突变体29(象突变体22，而是T348S)	21	11	n.d.	2.5	400
						突变体30(＝突变体22+G339T	26	9	n.d.	2.5	350
突变体31(＝突变体29+V436P)	33	6	n.d.	3	380
						突变体32(＝突变体29+V349G+A354T)	32	n.d.	n.d.	3.3	220.
突变体33(＝突变体29+L110H)	28	n.d.	n.d.	4.3	350

可以清楚地看到对所有突变类型，附加的氨基酸变换Q246H产生了对葡萄糖提高的亲和性并提高了比活性。突变体6与突变体13一样在位置T348G、N122K、L169F、Y171G、E245D、M341V具有氨基酸变换和在位置429具有脯氨酸插入，以及另外的Q246H。突变体J与突变体G一样在位置T348G、Y171G、E245D、M431V、N428P具有氨基酸变换，以及另外的Q246H。

突变体22在位置T348G、N122K、S124K、L169F、Y171G、E245D、Q246H、M341V、L386F具有氨基酸变换和位置429的脯氨酸插入。突变体29具有突变体22的所有变换，除了T348G，其变换成T348S，并且导致速度的提高。通过另外变换G339T和V436P，突变体30和31对于葡萄糖获得更高的Km-值。

实施例8

野生型或变体s-GDH的纯化以及各自的酶活性和比活性的分析

使包括合适的s-GDH表达载体的大肠杆菌生长(4×酵母-Amp.37℃)，收集并重悬浮于pH7.0的磷酸钾缓冲液中。通过FrenchPresspassage(700-900巴)进行细胞破裂。离心后，将上清液施加于用pH7.0的10mM磷酸钾缓冲液平衡的S-Sepharose(AmershamPharmaciaBiotec)柱上。洗涤后，使用0-1MNaCl盐梯度洗脱s-GDH。集合显示出s-GDH活性的级分，对pH7.0的磷酸钾缓冲液进行渗析并且在再次平衡的S-sepharose柱上再次进行色谱分离。集合活性级分并接受凝胶过滤，使用200柱(Amersham)。集合活性级分，并在加入CaCl₂(3mM终浓度)后，存储于-20℃。

使用来自Pierce的蛋白质测试试剂no.23225进行蛋白测定(用BSA校准曲线，30min，37℃)。

为了测量酶活性，用0.0556mM吡咯并喹啉醌(PQQ)；50mMHepes；15mMCaCl₂pH7.0将s-GDH样品稀释至1mg蛋白/ml，并在25℃孵育30分钟，用于重建或激活。

激活后，用50mMHepes；15mMCaCl₂pH7.0将样品稀释至大约0.02U/ml，并将50μl每个稀释的样品加入1000μl0.2M柠檬酸缓冲溶液中(pH5.8；25℃)，该缓冲溶液含有0.315mg(4-(二甲基磷酰基甲基)-2-甲基-吡唑并-[1.5a]-咪唑-3-基)-(4-亚硝基苯基)-胺(参见，专利US5,484,708)/ml作为介质，和30mM糖。

在25℃头5分钟的过程中监控620nm处的消光。

一单位酶活性对应于上述条件下1mMol介质/min的转化。

计算：

体积活性(U/ml)＝(总体积*dE/min[U/ml])：(ε*样品体积*1)

(ε＝消光系数；ε620nm＝30[1*mmol^-1*cm^-1])。

比活性(U/mg)＝体积活性U/ml除以蛋白浓度mg/ml得到U/mg。

分别使用葡萄糖和麦芽糖(Merck，德国)进行测试。

已经将关于酶活性以及比活性的结果包括于之前实施例中给出的表中。

序列表

<110>RocheDiagnosticsGmbH

F.HoffmannLaRocheAG

<120>吡咯并喹啉醌依赖性可溶性葡萄糖脱氢酶的改良突变体

<130>23713WO

<150>EP06007779

<151>2006-04-13

<160>21

<170>PatentInversion3.2

<210>1

<211>1362

<212>DNA

<213>醋酸钙不动杆菌

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1362)

<400>1

gatgttcctctaactccatctcaatttgctaaagcgaaatcagagaac48

AspValProLeuThrProSerGlnPheAlaLysAlaLysSerGluAsn

151015

tttgacaagaaagttattctatctaatctaaataagccgcacgcgttg96

PheAspLysLysValIleLeuSerAsnLeuAsnLysProHisAlaLeu

202530

ttatggggaccagataatcaaatttggttaactgagcgagcaacaggt144

LeuTrpGlyProAspAsnGlnIleTrpLeuThrGluArgAlaThrGly

354045

aagattctaagagttaatccagagtcgggtagtgtaaaaacagttttt192

LysIleLeuArgValAsnProGluSerGlySerValLysThrValPhe

505560

caggtaccagagattgtcaatgatgctgatgggcagaatggtttatta240

GlnValProGluIleValAsnAspAlaAspGlyGlnAsnGlyLeuLeu

65707580

ggttttgccttccatcctgattttaaaaataatccttatatctatatt288

GlyPheAlaPheHisProAspPheLysAsnAsnProTyrIleTyrIle

859095

tcaggtacatttaaaaatccgaaatctacagataaagaattaccgaac336

SerGlyThrPheLysAsnProLysSerThrAspLysGluLeuProAsn

100105110

caaacgattattcgtcgttatacctataataaatcaacagatacgctc384

GlnThrIleIleArgArgTyrThrTyrAsnLysSerThrAspThrLeu

115120125

gagaagccagtcgatttattagcaggattaccttcatcaaaagaccat432

GluLysProValAspLeuLeuAlaGlyLeuProSerSerLysAspHis

130135140

cagtcaggtcgtcttgtcattgggccagatcaaaagatttattatacg480

GlnSerGlyArgLeuValIleGlyProAspGlnLysIleTyrTyrThr

145150155160

attggtgaccaagggcgtaaccagcttgcttatttgttcttgccaaat528

IleGlyAspGlnGlyArgAsnGlnLeuAlaTyrLeuPheLeuProAsn

165170175

caagcacaacatacgccaactcaacaagaactgaatggtaaagactat576

GlnAlaGlnHisThrProThrGlnGlnGluLeuAsnGlyLysAspTyr

180185190

cacacctatatgggtaaagtactacgcttaaatcttgatggaagtatt624

HisThrTyrMetGlyLysValLeuArgLeuAsnLeuAspGlySerIle

195200205

ccaaaggataatccaagttttaacggggtggttagccatatttataca672

ProLysAspAsnProSerPheAsnGlyValValSerHisIleTyrThr

210215220

cttggacatcgtaatccgcagggcttagcattcactccaaatggtaaa720

LeuGlyHisArgAsnProGlnGlyLeuAlaPheThrProAsnGlyLys

225230235240

ttattgcagtctgaacaaggcccaaactctgacgatgaaattaacctc768

LeuLeuGlnSerGluGlnGlyProAsnSerAspAspGluIleAsnLeu

245250255

attgtcaaaggtggcaattatggttggccgaatgtagcaggttataaa816

IleValLysGlyGlyAsnTyrGlyTrpProAsnValAlaGlyTyrLys

260265270

gatgatagtggctatgcttatgcaaattattcagcagcagccaataag864

AspAspSerGlyTyrAlaTyrAlaAsnTyrSerAlaAlaAlaAsnLys

275280285

tcaattaaggatttagctcaaaatggagtaaaagtagccgcaggggtc912

SerIleLysAspLeuAlaGlnAsnGlyValLysValAlaAlaGlyVal

290295300

cctgtgacgaaagaatctgaatggactggtaaaaactttgtcccacca960

ProValThrLysGluSerGluTrpThrGlyLysAsnPheValProPro

305310315320

ttaaaaactttatataccgttcaagatacctacaactataacgatcca1008

LeuLysThrLeuTyrThrValGlnAspThrTyrAsnTyrAsnAspPro

325330335

acttgtggagagatgacctacatttgctggccaacagttgcaccgtca1056

ThrCysGlyGluMetThrTyrIleCysTrpProThrValAlaProSer

340345350

tctgcctatgtctataagggcggtaaaaaagcaattactggttgggaa1104

SerAlaTyrValTyrLysGlyGlyLysLysAlaIleThrGlyTrpGlu

355360365

aatacattattggttccatctttaaaacgtggtgtcattttccgtatt1152

AsnThrLeuLeuValProSerLeuLysArgGlyValIlePheArgIle

370375380

aagttagatccaacttatagcactacttatgatgacgctgtaccgatg1200

LysLeuAspProThrTyrSerThrThrTyrAspAspAlaValProMet

385390395400

tttaagagcaacaaccgttatcgtgatgtgattgcaagtccagatggg1248

PheLysSerAsnAsnArgTyrArgAspValIleAlaSerProAspGly

405410415

aatgtcttatatgtattaactgatactgccggaaatgtccaaaaagat1296

AsnValLeuTyrValLeuThrAspThrAlaGlyAsnValGlnLysAsp

420425430

gatggctcagtaacaaatacattagaaaacccaggatctctcattaag1344

AspGlySerValThrAsnThrLeuGluAsnProGlySerLeuIleLys

435440445

ttcacctataaggctaag1362

PheThrTyrLysAlaLys

450

<210>2

<211>454

<212>PRT

<213>醋酸钙不动杆菌

<400>2

AspValProLeuThrProSerGlnPheAlaLysAlaLysSerGluAsn

151015

PheAspLysLysValIleLeuSerAsnLeuAsnLysProHisAlaLeu

202530

LeuTrpGlyProAspAsnGlnIleTrpLeuThrGluArgAlaThrGly

354045

LysIleLeuArgValAsnProGluSerGlySerValLysThrValPhe

505560

GlnValProGluIleValAsnAspAlaAspGlyGlnAsnGlyLeuLeu

65707580

GlyPheAlaPheHisProAspPheLysAsnAsnProTyrIleTyrIle

859095

SerGlyThrPheLysAsnProLysSerThrAspLysGluLeuProAsn

100105110

GlnThrIleIleArgArgTyrThrTyrAsnLysSerThrAspThrLeu

115120125

GluLysProValAspLeuLeuAlaGlyLeuProSerSerLysAspHis

130135140

GlnSerGlyArgLeuValIleGlyProAspGlnLysIleTyrTyrThr

145150155160

IleGlyAspGlnGlyArgAsnGlnLeuAlaTyrLeuPheLeuProAsn

165170175

GlnAlaGlnHisThrProThrGlnGlnGluLeuAsnGlyLysAspTyr

180185190

HisThrTyrMetGlyLysValLeuArgLeuAsnLeuAspGlySerIle

195200205

ProLysAspAsnProSerPheAsnGlyValValSerHisIleTyrThr

210215220

LeuGlyHisArgAsnProGlnGlyLeuAlaPheThrProAsnGlyLys

225230235240

LeuLeuGlnSerGluGlnGlyProAsnSerAspAspGluIleAsnLeu

245250255

IleValLysGlyGlyAsnTyrGlyTrpProAsnValAlaGlyTyrLys

260265270

AspAspSerGlyTyrAlaTyrAlaAsnTyrSerAlaAlaAlaAsnLys

275280285

SerIleLysAspLeuAlaGlnAsnGlyValLysValAlaAlaGlyVal

290295300

ProValThrLysGluSerGluTrpThrGlyLysAsnPheValProPro

305310315320

LeuLysThrLeuTyrThrValGlnAspThrTyrAsnTyrAsnAspPro

325330335

ThrCysGlyGluMetThrTyrIleCysTrpProThrValAlaProSer

340345350

SerAlaTyrValTyrLysGlyGlyLysLysAlaIleThrGlyTrpGlu

355360365

AsnThrLeuLeuValProSerLeuLysArgGlyValIlePheArgIle

370375380

LysLeuAspProThrTyrSerThrThrTyrAspAspAlaValProMet

385390395400

PheLysSerAsnAsnArgTyrArgAspValIleAlaSerProAspGly

405410415

AsnValLeuTyrValLeuThrAspThrAlaGlyAsnValGlnLysAsp

420425430

AspGlySerValThrAsnThrLeuGluAsnProGlySerLeuIleLys

435440445

PheThrTyrLysAlaLys

450

<210>3

<211>4373

<212>DNA

<213>人造

<220>

<223>载体pACSGDH序列

<400>3

cactaactgattacgcaccgcatgtaaccgttttcaatctgtgagtaaattcacagttta60

ttaacattgtgatagctatgatgacaacgtttgtcgcactgtaactaacgtgtaacagtt120

agttgtcagttttgctggggtatttcgcttataaaaaccgttatcacaatatcccgcgac180

taccggacaaaaataaagagttgaataagagcttatcccattagggctattttacttgcc240

attttggacctgggcagtgctcgccaaaacgcgttagcgttttgaacgcgctagcggcgg300

cccgaagggcgagcgtagcgagtcaaacctcacgtactacgtgtacgctccggtttttgc360

gcgctgtccgtgtccaaactgctgcgccaataacgcctggtgggataggctctaaatacg420

cttcggcgttcagtaacacgcgttaacgtgctgaacagccgggcatttttttacgctata480

ccctacataataaaaccggagctaccatgaataagaaggtactgaccctttctgccgtga540

tggcaagtctgttattcggcgcgcacgcgcatgccgccgatgttcctctaactccatctc600

aatttgctaaagcgaaatcagagaactttgacaagaaagttattctatctaatctaaata660

agccgcacgcgttgttatggggaccagataatcaaatttggttaactgagcgagcaacag720

gtaagattctaagagttaatccagagtcgggtagtgtaaaaacagtttttcaggtaccag780

agattgtcaatgatgctgatgggcagaatggtttattaggttttgccttccatcctgatt840

ttaaaaataatccttatatctatatttcaggtacatttaaaaatccgaaatctacagata900

aagaattaccgaaccaaacgattattcgtcgttatacctataataaatcaacagatacgc960

tcgagaagccagtcgatttattagcaggattaccttcatcaaaagaccatcagtcaggtc1020

gtcttgtcattgggccagatcaaaagatttattatacgattggtgaccaagggcgtaacc1080

agcttgcttatttgttcttgccaaatcaagcacaacatacgccaactcaacaagaactga1140

atggtaaagactatcacacctatatgggtaaagtactacgcttaaatcttgatggaagta1200

ttccaaaggataatccaagttttaacggggtggttagccatatttatacacttggacatc1260

gtaatccgcagggcttagcattcactccaaatggtaaattattgcagtctgaacaaggcc1320

caaactctgacgatgaaattaacctcattgtcaaaggtggcaattatggttggccgaatg1380

tagcaggttataaagatgatagtggctatgcttatgcaaattattcagcagcagccaata1440

agtcaattaaggatttagctcaaaatggagtaaaagtagccgcaggggtccctgtgacga1500

aagaatctgaatggactggtaaaaactttgtcccaccattaaaaactttatataccgttc1560

aagatacctacaactataacgatccaacttgtggagagatgacctacatttgctggccaa1620

cagttgcaccgtcatctgcctatgtctataagggcggtaaaaaagcaattactggttggg1680

aaaatacattattggttccatctttaaaacgtggtgtcattttccgtattaagttagatc1740

caacttatagcactacttatgatgacgctgtaccgatgtttaagagcaacaaccgttatc1800

gtgatgtgattgcaagtccagatgggaatgtcttatatgtattaactgatactgccggaa1860

atgtccaaaaagatgatggctcagtaacaaatacattagaaaacccaggatctctcatta1920

agttcacctataaggctaagtaatacagtcgcattaaaaaaccgatctataaagatcggt1980

ttttttagttttagaaaagaattcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaa2040

ccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaa2100

tagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatg2160

gcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatatggtg2220

cactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagccccgacacccgccaac2280

acccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgt2340

gaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgag2400

acgaaagggcctcgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataatggtttc2460

ttagacgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttattttt2520

ctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaata2580

atattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttt2640

tgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgc2700

tgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagat2760

ccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgct2820

atgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcataca2880

ctattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatgg2940

catgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaa3000

cttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatggg3060

ggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacga3120

cgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactgg3180

cgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagt3240

tgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctgg3300

agccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctc3360

ccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagaca3420

gatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactc3480

atatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagat3540

cctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtc3600

agaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctg3660

ctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagct3720

accaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtcct3780

tctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacct3840

cgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgg3900

gttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttc3960

gtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtga4020

gctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcgg4080

cagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatcttta4140

tagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcagg4200

ggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttg4260

ctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtat4320

taccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgacggggcccg4373

<210>4

<211>29

<212>DNA

<213>人造

<220>

<223>引物

<400>4

catttgctggccaggggttgcaccgtcat29

<210>5

<211>29

<212>DNA

<213>人造

<220>

<223>引物

<400>5

atgacggtgcaacccctggccagcaaatg29

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>人造

<220>

<223>引物

<400>6

ttaacgtgctgaacagccgg20

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>人造

<220>

<223>引物

<400>7

atatgggtaaagtactacgc20

<210>8

<211>27

<212>DNA

<213>人造

<220>

<223>引物

<400>8

cctataagaaaaagacagatacgctcg27

<210>9

<211>27

<212>DNA

<213>人造

<220>

<223>引物

<400>9

cgagcgtatctgtctttttcttatagg27

<210>10

<211>24

<212>DNA

<213>人造

<220>

<223>引物

<400>10

ttccatcctcgagagattgtcaat24

<210>11

<211>25

<212>DNA

<213>人造

<220>

<223>引物

<400>11

attgacaatctctctgaggatggaa25

<210>12

<211>34

<212>DNA

<213>人造

<220>

<223>引物

<400>12

cgttatacctataagaaaaagacagatacgctcg34

<210>13

<211>34

<212>DNA

<213>人造

<220>

<223>引物

<400>13

cgagcgtatctgtctttttcttataggtataacg34

<210>14

<211>28

<212>DNA

<213>人造

<220>

<223>引物

<400>14

aaaagaccatcagggtggtctcgagaag28

<210>15

<211>28

<212>DNA

<213>人造

<220>

<223>引物

<400>15

cttctcgagaccaccctgatggtctttt28

<210>16

<211>27

<212>DNA

<213>人造

<220>

<223>引物

<400>16

gctcaaaatggattaaaagtagccgca27

<210>17

<211>27

<212>DNA

<213>人造

<220>

<223>引物

<400>17

tgcggctactttatttccattttgagc27

<210>18

<211>28

<212>DNA

<213>人造

<220>

<223>引物

<400>18

ccgtattaagttcgatccaacttatagc28

<210>19

<211>28

<212>DNA

<213>人造

<220>

<223>引物

<400>19

gctataagttggatcgaacttaatacgg28

<210>20

<211>29

<212>DNA

<213>人造

<220>

<223>引物

<400>20

ggtaaattattgcagtctgatcatggccc29

<210>21

<211>29

<212>DNA

<213>人造

<220>

<223>引物

<400>21

gggccatgatcagactgcaataatttacc29

Claims

1.与麦芽糖相比对葡萄糖具有提高的特异性的PQQ依赖性可溶性葡萄糖脱氢酶的突变体，其中所述突变体基于SEQIDNO：2所示的醋酸钙不动杆菌(Acinetobactercalcoaceticus)s-GDH野生型序列进行突变，且其中所述突变体为

D87R+N122K+S124K+S146G+L169F+Y171G+E24SD+Q246H+V298L+M341V+T348S+L386F+ins429P+V436P；

D87R+N122K+S124K+S146G+L169F+Y171G+E245D+Q246H+V298L+M341V+T348S+V349G+A354T+L386F+ins429P；或

2.编码根据权利要求1的可溶性葡萄糖脱氢酶突变体的分离多核苷酸。

3.表达载体，其包括权利要求2中限定的分离多核苷酸，该分离多核苷酸可操作连接能够促进所述多核苷酸在宿主细胞中表达的启动子序列。

4.包括权利要求3的表达载体的宿主细胞。

5.用于产生可溶性葡萄糖脱氢酶突变体的方法，所述方法包括在适于可溶性葡萄糖脱氢酶突变体产生的条件下培养权利要求4的宿主细胞。

6.表达载体，其包括权利要求2中限定的分离多核苷酸，该分离多核苷酸可操作连接能够促进其在无细胞肽合成系统中表达的启动子序列。

7.在适于产生所述可溶性葡萄糖脱氢酶突变体的条件下在无细胞肽合成系统中使用权利要求6的构建体产生可溶性葡萄糖脱氢酶突变体的方法。

8.根据权利要求1的可溶性葡萄糖脱氢酶突变体在制备用于检测、测定或测量样品中葡萄糖的装置中的用途。

9.权利要求8的用途，进一步的特征在于使用传感器或试条装置进行所述葡萄糖的检测、测定或测量。

10.用于检测或测量样品中葡萄糖的装置，其包括根据权利要求1的可溶性葡萄糖脱氢酶突变体和所述测量需要的其它试剂。