BRPI0710131A2 - mutantes aperfeiçoados de glicose desidrogenase solúvel dependente de pirrolquinilina quinona - Google Patents

Abstract

<B>MUTANTES APERFEIçOADOS DE GLICOSE DESIDROGENASE SOLúVEL DEPENDENTE DE PIRROLQUINOLINA QUINONA<D>A presente invenção descreve um mutante de glicose desidrogenase solúvel dependente de PQQ (s-GDH; EC 1.1.5.2) com especificidadeaperfeiçoada a glicose em comparação com maltose, apresentando uma substituição de treonina na posição 348 por glicina, alanina ou serina, na qual esse mutante adicionalmente compreende pelo menos uma mutação para aperfeiçoar a estabilidade do mutante e uma ou mais mutações para aperfeiçoar a afinidade do mutante por glicose, e/ou uma ou mais mutaçõespara aperfeiçoar adicionalmente a especificidade do mutante a glicose em comparação com maltose, e na qual a posição 348 corresponde às posições de aminoácidos conhecidas seqüência do tipo selvagem de s-GDH de A.calcoaceticus. Também descritos são genes que codificam esse mutante de s-GDH e diferentes aplicações desses mutantes de s-GDH, particularmente para determinar a concentração de glicose em uma amostra.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MUTANTESAPERFEIÇOADOS DE GLICOSE DESIDROGENASE SOLÚVEL DEPEN-DENTE DE PIRROLQUINOLINA QUINONA"

A presente invenção refere-se a um mutante de glicose desidro-genase solúvel dependente de PQQ (s-GDH; EC 1.1.5.2) com especificidadeaperfeiçoada em relação a glicose em comparação com maltose, apresen-tando uma substituição de treonina na posição 348 por glicina, alanina ouserina, e na qual esse mutante adicionalmente compreende pelo menos umamutação para aperfeiçoar a estabilidade do mutante e uma ou mais muta-ções para aperfeiçoar a afinidade do mutante por hexoses, por exemplo, pre-ferencialmente glicose, e/ou uma ou mais mutações para aperfeiçoar adicio-nalmente a especificidade do mutante a glicose em comparação com malto-se, e em que essas posições correspondem às posições dos aminoácidosconhecidas da seqüência do tipo selvagem s-GDH de A. calcoaceticus.Também descritos são genes que codificam essa s-GDH mutante e diferen-tes aplicações desses mutantes de s-GDH, particularmente para determinara concentração de glicose em uma amostra.

Fundamento da Invenção

A determinação de concentração de glicose no sangue é extre-mamente importante em diagnose clínica e no controle de diabetes. Aproxi-madamente 150 milhões de pessoas no mundo sofrem da doença crônicadiabetes melito, um número que poderá dobrar por volta de 2025 de acordocom a OMS (WHO). Embora diabetes seja imediatamente diagnosticada etratada, controle bem-sucedido a longo prazo exige ferramentas de diagnós-tico de baixo custo que registrem rápida e precisamente concentrações deglicose no sangue. Glicose desidrogenases dependentes de PQQ (EC1.1.5.2) catalisam uma reação em que glicose é oxidada a gliconolactona.Conseqüentemente, esse tipo de enzima é usado na medição de açúcar nosangue. Uma dessas ferramentas é uma fita de diagnóstico baseada na en-zima solúvel glicose desidrogenase (s-GlucDOR, EC 1.1.5.2), uma enzimaque contém pirrolquinolina quinona originalmente derivada de Acinetobactercalcoaceticus.Quinoproteínas usam quinona como co-fator para oxidar álcoois,aminas e aldoses às suas lactonas, aldeídos e ácidos aldólicos correspon-dentes (Duine, J.A., Energy generation and the glicose desidrogenase path-way in Acinetobacter (Geração de energia e o caminho da glicose desidro-genase em vAc/netobacfeí), in "The Biology of Acinetobactei" ("A Biologia deAcinetobactet1), Nova Iorque, Plenum Press (1991), pp. 295-312; Duine,J.A., Eur. J. Biochem. 200 (1991) 271-284; Davidson, V.L., in "Principies andapplications of quinoproteins" ("Princípios e aplicações de quinoproteínas"),todo o livro, Nova Iorque, Mareei Dekker (1993); Anthony, C., Biochem. J.320 (1996) 697-711; Anthony, C. e Ghosh, M., Current Science 72 (1997)716-727; Anthony, C., Biochem. Soe. Trans. 26 (1998) 413-417; Anthony, C.e Ghosh, M., Prog. Biophys. MoL Biol. 69 (1998) 1-22. Entre as quinoproteí-nas, aquelas que contêm o co-fator 2,7,9-tricarbóxi-1 H-pirrol[2,3-f]quinolino-4,5-diona (PQQ) não-covalentemente ligado constituem o maior sub-grupo(Duine 1991, supra). Todas as glicose desidrogenases de quinona bacteria-na há muito conhecidas pertencem a esse subgrupo com PQQ como co-fator (Anthony e Ghosh 1997, supra-, Goodwin, P.M. e Anthony, C., Adv. Mi-crobiol. Physiol. 40 (1998) 1-80; Anthony, C., Adv. in Phot. and Resp. 15(2004) 203-225).

Dois tipos de glicose desidrogenase dependente de PQQ (EC1.1.5.2) foram caracterizados em bactérias: uma é ligada a membrana (m-GDH); a outra é (s-GDH) solúvel. Ambos os tipos não compartilham qualquerhomologia significativa de seqüências (Cleton-Jansen, A.M. e outros, MoLGen. Genet. 217 (1989) 430-436; Cleton-Jansen, A.M. e outros, Antonie VanLeeuwenhoek 56 (1989) 73-79; Oubrie, A. e outros, Proc. Natl. Acad. Sei.U.S.A. 96 (1999) 11787-11791. Eles são também diferentes em relação tan-to às suas propriedades cinéticas quanto às suas propriedades imunológicas(Matsushita, K. e outros, Bioscience Biotechnol. & Biochem. 59 (1995) 1548-1555). As m-GDHs são comuns em bactérias gram-negativas, s-GDHs, en-tretanto, têm sido encontradas apenas no espaço periplasmático de cepasde Acinetobacter, tal como A. calcoaceticus (Duine, J.A., 1991a; Cleton-Jansen, A.M. e outros, J. Bacteriol. 170 (1988) 2121-2125; Matsushita e A-dachi, 1993) e A. baumannii(JP 11243949).

Por meio de busca em banco de dados de seqüências, duas se-qüências homólogas à s-GDH de comprimento completo de A. calcoaceticusforam identificadas in E.coli K-12 e Synechocystis sp.. Adicionalmente, duasseqüências incompletas homólogas à s-GDH de A. calcoaceticus foram tam-bém encontradas no genoma de P. aeruginosa e Bordetella pertussis (Ou-brie e outros, 1999 a, b, c) e Enterobacter intermedium (Kim, C.H. e outros.,Current Microbioi 47 (2003) 457-461), respectivamente. As seqüências deaminoácidos deduzidas dessas quatro proteínas não-caracterizadas são es-treitamente relacionadas com s-GDH de A. calcoaceticus com muitos resí-duos no sítio ativo putativo absolutamente conservados. Essas proteínashomólogas provavelmente apresentam uma estrutura similar e catalisamreações dependentes de PQQ similares (Oubrie e outros, 1999 a, b, c; Ou-brie A., Biochim. Biophys. Acta 1647 (2003) 143-151; Reddy, S., e Bruice,T.C., J. Am. Chem. Soe. 126 (2004) 2431-2438; Yamada, M. e outros, Bio-chim. Biophys. Acta 1647 (2003) 185-192).

Verificou-se que s-GDHs e m-GDHs bacterianas possuem se-qüências bastante diferentes e diferente especificidade a substratos. Porexemplo, A. calcoaceticus contém duas glicose desidrogenases dependen-tes de PQQ diferentes, um designada m-GDH, que é ativa in vivo, e outradesignada s-GDH, em relação à qual apenas atividade in ν/'/ro pode ser mos-trada. Cleton-Jansen e outros, 1988; 1989 a, b, clonaram os genes que codi-ficam as duas enzimas GDH e determinaram as seqüências de DNA dessesambos os genes para GDH. Não há homologia óbvia entre m-GDH e s-GDH,corroborando o fato de que m-GDH e s-GDH representam duas moléculascompletamente diferentes (Laurinavicius, V. e outros, Biologija (2003) 31-34).

O gene para s-GDH de A. calcoaceticus foi clonado em E. coli.Após ser produzida na célula, a s-GDH translocaliza-se através da membra-na citoplasmática para o espaço periplasmático (Duine, J.A., Energy genera-tion and the glicose desidrogenase pathway in Acinetobacter (Geração deenergia e o caminho da glicose desidrogenase em Αοίηθ^βοΐβή, in "TheBiology of Acinetobactet". Nova Iorque, Plenum Press (1991), pp. 295-312;Matsushita, K. e Adachi, O., Bacterial quinoproteins glucose dehydrogenaseand alcohol dehydrogenase (Glicose desidrogenase de quinoproteínas bac-terianas e desidrogenase alcoólica), in "Principies and applications ofquino-proteins" ("Princípios e aplicações de quinoproteínas"), Nova Iorque, MareeiDekker (1993) pp. 47-63). Como a s-GDH nativa de A. calcoaceticus, s-GDHrecombinante expressa em E.coli é um homodímero, com uma molécula dePQQ e três íons cálcio por monômero (Dokter, P. e outros, Biochem. J. 239(1986) 163-167; Dokter, P. e outros, FEMS Microbiol. Lett. 43 (1987) 195-200; Dokter, P. e outros, Biochem. J. 254 (1988) 131-138; Olsthoorn, A.J. eDuine, J.A., Arch. Biochem. Biophys. 336 (1996) 42-48; Oubrie, A. e outros,J. Mol. Biol. 289 (1999) 319-333; Oubrie, A. e outros, Proc. NatL Acad. Sei.U.S. A. 96(1999) 11787-11791; Oubrie, A. e outros, Embo J. 18(1999)5187-5194). s-GDH oxida uma ampla faixa de mono e dissacarídeos às corres-pondendentes cetonas que adicionalmente hidrolisam-se aos ácidos aldôni-cos, e é também capaz de doar elétrons a PMS (metossulfato de fenazina),DCPIP (2,6-diclorofenolino dofenol), WB (azul de Wurster) e ubiquinonas decadeias curtas tais como ubiquinona Q1 e ubiquinona Q2 (Matsushita, K. eoutros, Biochem. 28 (1989) 6276-6280; Matsushita, K. e outros, Antonie VanLeeuwenhoek 56 (1989) 63-72), diversos receptores artificiais de elétrons talcomo metil sulfato de N-metilfenazônio (Olsthoorn, A.J. e Duine, J.A., Arch.Biochem. Biophys. 336 (1996) 42-48; Olsthoorn, A.J. e Duine, J.A., Biochem.37 (1998) 13854-13861) e polímeros eletrocondutores (Ye, L. e outros, Anal.Chem. 65 (1993) 238-241). Em vista da alta atividade específica de s-GDH aglicose (Olsthoorn, A.J. e Duine, J.A., (1996), supra) e sua ampla especifici-dade a receptores artificiais de elétrons, a enzima é bem adequada a aplica-ções analíticas, particularmente para ser usada em (bio)sensores ou fitas deteste para determinação de glicose em aplicações diagnosticas (Kaufmann,N. e outros, Development and evaluation of a new system for determiningglucose from fresh capillary blood and heparinized blood in "Glucotrend"(Desenvolvimento e avaliação de um novo sistema para determinação deglicose a partir de sangue capilar novo e sangue heparinizado em "Glicoten-dência") (1997) 1-16, Boehringer Mannheim GmbH·, Woosuck, S. e outros,Sensors and Actuators B 100 (2004) 395-402).

Oxidação de glicose pode ser catalisada por pelo menos trêsgrupos de enzimas bastante distintos, isto é, por glicose desidrogenases de-pendentes de NAD/P, por flavoproteína glicose oxidases ou por quinoproteí-na GDHs (Duine, J.A., Biosens. Bioelectronics 10 (1995) 17-23). Uma auto-oxidação bastante lenta de s-GDH reduzida foi observada, demonstrandoque oxigênio é um receptor de elétrons muito pobre para s-GDH (Olsthoome Duine, 1996). s-GDH pode doar eficientemente elétrons da quinona redu-zida a mediadores tais como PMS, DCPIP, WB e ubiquinonas de cadeiascurtas tais como Q1 e Q2, mas não pode doar eficientemente elétrons dire-tamente a oxigênio.

Fitas de teste e sensores tradicionais para monitorar nível deglicose no sangue, soro e urina, por exemplo, de pacientes diabéticos, usamglicose oxidase. A eficácia da enzima é dependente da concentração de oxi-gênio. Medições de glicose a diferentes altitudes com diferentes concentra-ções de oxigênio no ar poderão levar a resultados falsos. A maior vantagemde glicose desidrogenases dependentes de PQQ é sua independência deoxigênio. Essa importante característica é, por exemplo, discutida in US6.103.509, em que algumas características de GDH ligada a membrana fo-ram investigadas.

Uma importante contribuição ao campo tem sido o uso de s-GDH juntamente com mediadores apropriados. Métodos de ensaio e disposi-tivos de fitas de teste baseados em s-GDH são descritos em detalhes in US5.484.708. Essa patente também contém informação detalhada sobre a con-figuração de ensaios e a produção de fitas de teste baseadas em s-GDHpara medição de glicose. Os métodos descritos na patente, bem como nosdocumentos citados nela, são incluídos aqui como referência.

Outras patentes ou pedidos relativos ao campo e que compre-endem informação específica sobre várias modalidades de aplicação de en-zimas com atividade de glicose desidrogenase são US 5.997.817, US6.057.120, EP 0 620 283 e JP 11-243949-A.Um sistema comercial que utiliza s-GDH e um indicador queproduz uma mudança de cor quando a reação ocorre (Kaufmann e outros,1997, supra) é o sistema Glucotrend® distribuído por Roche DiagnosticsGmbH.

Apesar das vantagens discutidas acima no uso de uma s-GDHdependente de PQQ, na determinação de glicose, também uma desvanta-gem tem de ser considerada. A enzima tem particularmente um amplo es-pectro de substratos em comparação com m-GDH. Isto é, s-GDH oxida nãosó glicose, mas também diversos outros açúcares, incluindo maltose, galac-tose, lactose, manose, xilose e ribose (Dokter e outros, 1986 a; Oubrie A.,Biochim. Biophys. Acta 1647 (2003) 143-151). A reatividade a açúcares dife-rentes de glicose poderá em certos casos prejudicar a precisão de determi-nação de níveis de glicose no sangue. Em particular, pacientes sob diáliseperitoneal, tratados com icodextrina (um polímero de glicose), poderão con-ter em seus fluidos sangüíneos, por exemplo, no sangue, altos níveis de ou-tros açúcares, especialmente de maltose (Wens, R. e outros, Perit. Diai Int.18(1998)603-609).

Portanto, amostras clínicas como, por exemplo, aquelas obtidasde pacientes diabéticos, especialmente de pacientes com complicações re-nais e especialmente de pacientes sob diálise, poderão conter significativosníveis de outros açúcares, especialmente maltose. Determinações de glicoseem amostras obtidas desses pacientes críticos poderão ser prejudicadas pormaltose (Frampton, J.E. e Plosker, G.L., Drugs 63 (2003) 2079-2105).

Há poucos relatos na literatura sobre tentativas para produzir s-GDHs modificadas dependentes de PQQ com especificidade a substratosalterada. Igarashi, S. e outros, Biochem. Biophys. fíes. Commun. 264 (1999)820-824, relatam que introdução de uma mutação pontual na posiçãoGlu277 conduz a mutantes com perfil de especificidade a substratos altera-da.

Sode, EP 1 176 202, relata que certas substituições de aminoá-cidos em s-GDH leva a s-GDH mutante com afinidade aperfeiçoada por gli-cose. In EP 1 167 519, o mesmo autor relata s-GDH mutante com estabili-dade aperfeiçoada. Adicionalmente, o mesmo autor relata /n JP2004173538outros mutantes de s-GDH com afinidade aperfeiçoada por glicose.

Kratzsch, P. e outros, WO 02/34919, relatam que a especificida-de de s-GDH a glicose em comparação com outros substratos de açúcar,especialmente em comparação com maltose, pode ser aperfeiçoada porsubstituições de aminoácidos em certas posições de s-GDH. Central e cruci-al é uma substituição na posição de aminoácidos 348. Uma s-GDH mutantecompreendendo, por exemplo, uma glicina na posição 348 em vez de umatreonina como presente na s-GDH do tipo selvagem apresenta uma seletivi-dade tremendamente aperfeiçoada pelo substrato glicose quando, por e-xemplo, em comparação com o substrato maltose. Eles também revelamque um mutante duplo que possui substituições nas posições 348 e 428 a-presenta uma especificidade ainda mais aperfeiçoiada a glicose.

In WO 2006/008132 mostra-se que uma inserção de aminoácidoentre os aminoácidos 428 e 429 de s-GDH, especialmente em combinaçãocom uma substituição apropriada de aminoácidos na posição 348, apresentaefeitos bastante favoráveis sobre a especificidade a substratos. Mutantesque compreendem essa inserção são, por exemplo, mais específicos aosubstrato glicose em comparação com o substrato maltose.

Contudo, considerando que na verdade alguns aperfeiçoamen-tos na especificidade a glicose encontram-se relatados, parece que tais a-perfeiçoamentos freqüente e infelizmente se fazem acompanhar de desvan-tagens tais como, por exemplo, uma reduzida estabilidade, uma reduzidaatividade e/ou uma reduzida afinidade por glicose dessa s-GDH mutada, porexemplo, tornou-se evidente que a especificidade aperfeiçoada de um mu-tante de s-GDH que compreende uma substituição de aminoácido na posi-ção 348 ocorre à custa de estabilidade, afinidade e atividade desse mutanteem comparação com a enzima do tipo selvagem.

Uma grande demanda e necessidade clínica existem, portanto,por formas mutantes de s-GDH adicionalmente aperfeiçoadas que apresen-tam uma alta especificidade a glicose e que caracterizam ao mesmo umarazoável termoestabilidade, bem como aperfeiçoamentos em atividade es-pecífica ou afinidade por glicose, ou que caracterizam aperfeiçoamentostanto em atividade específica quanto em afinidade por glicose.

Tratou-se de tarefa da presente invenção proporcionar novosmutantes ou variantes de s-GDH com termoestabilidade significativamenteaperfeiçoada, atividade específica e afinidade por glicose em comparaçãocom um mutante com especificidade aperfeiçoada compreendendo umasubstituição na posição 348.

Verificou-se que é possível aperfeiçoar significativamente a ter-moestabilidade, a atividade específica e a afinidade por glicose de um mu-tante de s-GDH que apresenta uma substituição na posição 348 medianteseleção de mutações das posições conforme dado nas reivindicações anexas.

Devido às propriedades aperfeiçoadas das novas formas de s-GDH, progresso técnico significativo para determinações de glicose em vá-rios campos de aplicação é possível. Os mutantes de s-GDH aperfeiçoadosde acordo com esta invenção podem, por exemplo, ser usados com grandevantagem para a detecção específica ou medição de glicose em amostrasbiológicas.

Sumário da Invenção

A presente invenção refere-se a mutantes de s-GDH. Um mu-tante de glicose desidrogenase solúvel dependente de PQQ (s-GDH; EC1.1.5.2) é descrito com especificidade aperfeiçoada a glicose em compara-ção com maltose, apresentando uma substituição de treonina na posição348 por glicina, alanina ou serina, mutante este que compreende adicional-mente pelo menos uma mutação para aperfeiçoar a estabilidade do mutante,pelo menos uma mutação para aperfeiçoar a afinidade do mutante por glico-se, e opcionalmente uma ou mais mutações para aperfeiçoar adicionalmentea especificidade do mutante a glicose em comparação com maltose, e emque as posições dadas correspondem às posições de aminoácidos conheci-das da seqüência do tipo selvagem (ID SEQ NO: 2) de s-GDH de A. calcoa-ceticus.

Também descritos são um polinucleotídeo isolado que codificauma proteína mutante de s-GDH, um vetor de expressão que compreendeesse polinucleotídeo isolado operavelmente ligado a uma seqüência promo-tora capaz de promover a expressão desse polinucleotídeo em uma célulahospedeira e uma célula hospedeira que compreende esse vetor de expres-são.

Adicionalmente, é descrito um processo para produzir mutantesde s-GDH, compreendendo esse processo cultivar a célula hospedeira trans-fectada com um vetor de expressão apropriado sob condições adequadaspara produção de um mutante de s-GDH.

Adicionalmente, é descrito um método de detecção, determina-ção ou medição de glicose em uma amostra, usando um mutante de s-GDHaperfeiçoado de acordo com a presente invenção, compreendendo esse a-perfeiçoamento contatar com esse mutante a amostra.

Também é descrito um dispositivo para a detecção ou mediçãode glicose em uma amostra que compreende um mutante de s-GDH aperfei-çoado de acordo com a presente invenção e outros reagentes exigidos paraessa medição.

Descrição Detalhada da Invenção

Em uma primeira modalidade, a invenção refere-se a um mutan-te de glicose desidrogenase solúvel dependente de PQQ (s-GDH; EC1.1.5.2) com especificidade aperfeiçoada a glicose em comparação commaltose, apresentando uma substituição de treonina na posição 348 por gli-cina, alanina ou serina e em que esse mutante compreende pelo menos umamutação para aperfeiçoar a estabilidade do mutante e adicionalmente com-preende pelo menos uma mutação para aperfeiçoar a afinidade do mutantea glicose, e opcionalmente uma ou mais mutações para aperfeiçoar adicio-nalmente a especificidade do mutante a glicose em comparação com malto-se, e em que as posições dadas correspondem às posições de aminoácidosconhecidas da seqüência do tipo selvagem (ID SEQ NO: 2) de s-GDH de A.calcoaceticus.

Conforme descrito in WO 02/34919, uma substituição do amino-ácido na posição 348 da seqüência de s-GDH que corresponde à seqüênciado tipo selvagem isolada de A. calcoaceticus pode ser usada para aperfei-çoar significativamente a especificidade de s-GDH a glicose. Isso se dá por-que os aperfeiçoamentos descritos no contexto da presente invenção sãotodos descritos e baseados em um mutante de s-GDH que compreende umasubstituição de aminoácido na posição 348. Preferencialmente, o resíduo detreonina na posição 348 é substituído por um resíduo de aminoácido sele-cionado do grupo que consiste de alanina, glicina e serina. Em uma modali-dade adicionalmente preferida, glicina ou serina é usada para substituir treo-nina na posição 348. A terminologia T348G é conhecida daquele habilitado no estado da técnica e indica que treonina na posição 348 é substituída porglicina.

Como discutido neste relatório, acima, dois tipos de enzima dequinoproteína completamente diferentes com atividade de glicose desidro-genase (ligada a membrana e solúvel) são agrupadas sob EC 1.1.5.2. Essesdois tipos parecem não ser relacionados um com o outro.

Para o fim deste invenção, somente a forma solúvel de GDH (s-GDH) é relevante e mutantes aperfeiçoados da mesma são discutidos aqui,abaixo.

Sabe-se no estado da técnica que a seqüência de DNA do tiposelvagem de uma glicose desidrogenase solúvel dependente de PQQ podeser isolada de cepas de Acinetobacter. Mais preferido é o isolamento de s-GDH da cepa LMD 79.41 do tipo Acinetobacter calcoaceticus. A seqüênciapolipeptídica dessa s-GDH do tipo selvagem (a proteína madura) é dada emID SEQ NO: 2 e a seqüência de DNA é dada em ID SEQ NO: 1, respectiva- mente. Outras cepas LMD de Acinetobacter poderão também ser usadascomo fonte de s-GDH do tipo selvagem. Essas seqüências podem ser ali-nhadas com a seqüência obtida de A. calcoaceticus e comparações de se-qüências podem ser feitas. Parece também exeqüível classificar bibliotecasde DNA de outras cepas bacterianas, como, por exemplo, descrito para K-12de E.coli (Oubrie, A. e outros, J. Moi Biol. 289 (1999) 319-333) e para identi-ficar seqüências relacionadas com s-GDH em tais genomas. Essas seqüên-cias e seqüências homólogas ainda não-identificadas poderão ser usadaspara gerar s-GDH mutantes com termoestabilidade aperfeiçoada.

As realizações da presente invenção são descritas em grandesdetalhes fazendo referência a posições de aminoácidos conhecidas de IDSEQ NO: 2, a seqüência do tipo selvagem de s-GDH como isolada da cepaLMD 79.41 do tipo Acinetobacter calcoaceticus. Posições de aminoácidosem diferentes isolados de s-GDH que correspondem a posições de ID SEQNO: 2 são facilmente identificadas por meio de comparação apropriada deseqüências.

O alinhamento múltiplo e comparação de uma seqüência de s-GDH com a seqüência do tipo selvagem de ID SEQ NO: 2 preferencialmenteé realizada com o programa PiIeUp de GCG Package Versão 10.2 (GeneticsComputer Group, Inc.). PiIeUp cria um alinhamento múltiplo de seqüênciasusando uma simplificação do método de alinhamento progressivo de Feng,D. F. e Doolittie, R. F., J. Moi EvoL 25 (1987) 351-360, e as matrizes classi-ficadas em relação a resíduos de aminoácidos idênticos, similares ou dife-rentes são definidas conseqüentemente. Esse processo começa com o ali-nhamento aos pares das duas seqüências mais similares, produzindo umagrupamento de duas seqüências alinhadas. Esse agrupamento pode entãoser alinhado com a próxima seqüência mais relacionada ou agrupamento deseqüências alinhadas. Dois agrupamentos de seqüências podem ser alinha-dos por meio de uma extensão simples do alinhamento aos pares de duasseqüências individuais. O alinhamento final é obtido por uma série de ali-nhamentos aos pares progressivos que incluem seqüências e agruapamen-tos crescentemente dissimilares, até todas as seqüências terem sido incluí-das no alinhamento aos pares final. Dessa maneira, posições de aminoáci-dos noutras moléculas homólogas de s-GDH podem ser facilmente identifi-cadas como correspondendo às posições dadas para s-GDH de A. calcoace-ticus em ID SEQ NO: 2. Isso se dá porque as posições de aminoácidos da-das aqui devem ser entendidas como posições de aminoácidos de ID SEQNO: 2 ou como posições que correspondem a elas em outra molécula homó-loga de s-GDH.

O termo "mutante" ou "variante" no sentido da presente inven-ção refere-se a uma proteína s-GDH que comparada à seqüência de amino-ácidos do tipo selvagem em ID SEQ NO: 2 exibe pelo menos uma substitui-ção, supressão ou inserção de aminoácidos.

O mutante de s-GDH poderá compreender outras substituiçõese/ou supressões e/ou inserções, contanto que um mutante s-GDH da inven-ção não difira em mais de 45 aminoácidos da s-GDH de ID SEQ NO: 2, porexemplo, que exibe no máximo 45 substituições, inserções ou supressõesde aminoácidos no total.

O termo "uma mutação para aperfeiçoamento da estabilidade"refere-se a quaisquer substituições e/ou supressões e/ou inserções aminoque aperfeiçoam a termoestabilidade de um mutante de s-GDH em um mo-delo de tensão por temperatura a curto prazo.

Como mencionado acima, aperfeiçoamentos na especificidade aglicose parecem ser possíveis apenas e grandemente à custa de uma esta-bilidade reduzida, uma afinidade reduzida a glicose ou uma atividade especí-fica reduzida ou de quaisquer combinações dessas propriedades desvanta-josas.

Estabilidade de acordo com a presente invenção é avaliadanesse modelo de tensão a curto prazo e a estabilidade de s-GDH como de-terminado nesse modelo é referida como termoestabilidade. Termoestabili-dade é determinada medindo a atividade enzimática de s-GDH não-estressada e estressada de uma amostra. Ajustando a atividade não-estressada da amostra em 100%, a atividade restante após tratamento detensão pode ser calculada em porcentagem. Para mutantes de s-GDH comespecificidade aperfeiçoada a substrato, foram escolhidas condições de es-tressamento de 64°C por 30 minutos. Usando essas condições, a enzima dotipo selvagem apresenta cerca de 80% de sua atividade original, conside-rando que a maioria dos mutantes com especificidade aperfeiçoada a glicoseapresenta somente 10% ou menos de sua atividade enzimática inicial apósterem sido submetidos a esse modelo de tensão a curto prazo.

Preferencialmente, a mutação para aperfeiçoamento da estabili-dade de uma variante de s-GDH que apresenta uma substituição de treoninana posição 348 por glicina, alanina ou serina é uma substituição. Preferenci-almente, essa substituição é selecionada do grupo que consiste de D87R;N122K; S124K; S146A ou G; L187F ou Μ; N267Y; V298L; T313D e L386F.

Também preferido, essa substituição para aperfeiçoamento daestabilidade de uma variante de s-GDH é selecionada do grupo que consistede D87R; N122K; S124K; S146G; V298L e L386F. Em modalidades adicio-nalmente preferidas, combinações de duas, três ou quatro dessas substitui-ções ou também preferencialmente de todas essas cinco substituições sãousadas em uma s-GDH mutada para aperfeiçoar a estabilidade desse mutante.

Em uma modalidade preferida, o mutante de s-GDH de acordocom a presente invenção compreende uma arginina na posição 87 como sesabe de s-GDH do tipo selvagem (ID SEQ NO: 2) de A. calcoaceticus, ou emuma posição que corresponde a essa posição 87 em uma enzima homóloga.

Em uma modalidade adicionalmente preferida, o mutante de s-GDH de acordo com a presente invenção compreende uma Iisina na posição122 como se sabe de s-GDH do tipo selvagem (ID SEQ NO: 2) de A. calcoa-ceticus, ou em uma posição que corresponde a essa posição 122 em umaenzima homóloga.

Em uma modalidade adicionalmente preferida, o mutante de s-GDH de acordo com a presente invenção compreende uma Iisina na posição124 como se sabe de s-GDH do tipo selvagem (ID SEQ NO: 2) de A. calcoa-ceticus, ou em uma posição que corresponde a essa posição 124 em umaenzima homóloga.

Em uma modalidade adicionalmente preferida, o mutante de s-GDH de acordo com a presente invenção compreende glicina na posição146 como se sabe de s-GDH do tipo selvagem (ID SEQ NO: 2) de A. calcoa-ceticus, ou em uma posição que corresponde a essa posição 146 em umaenzima homóloga.

Em uma modalidade adicionalmente preferida, o mutante de s-GDH de acordo com a presente invenção compreende Ieucina na posição298 como se sabe de s-GDH do tipo selvagem (ID SEQ NO: 2) de A. calcoa-ceticus, ou em uma posição que corresponde a essa posição 298 em umaenzima homóloga.

Em uma modalidade adicionalmente preferida, o mutante de s-GDH de acordo com a presente invenção compreende fenilalanina na posi-ção 386 como se sabe de s-GDH do tipo selvagem (ID SEQ NO: 2) de A.calcoaceticus, ou em uma posição que corresponde a essa posição 386 emuma enzima homóloga.

Verifica-se que seis posições de s-GDH parecem ser particular-mente importantes para obter aperfeiçoamentos significativos em termos determoestabilidade, isto é, as posições 87, 122, 124, 146, 298 e 386. O que éde significativa relevância aqui é o fato de que se verifica que essas substitu-ições apresentam um pronunciado efeito sobre a termoestabilidade de mu-tantes que anteriormente tinham sido gerados a fim de paerfeiçoar especifi-cidade a glicose, mas à custa de uma termoestabilidade reduzida. Em umamodalidade preferida, o mutante de s-GDH de acordo com a presente inven-ção compreende uma arginina na posição 87, uma Iisina na posição 122 e124, uma glicina na posição 146, uma Ieucina na posição 298 e uma fenila-lanina na posição 386 de ID SEQ NO:2, ou em uma posição que correspon-de a essas posições se é usada uma s-GDH homóloga.

Em uma modalidade adicionalmente preferida, a presente in-venção refere-se a um mutante de glicose desidrogenase solúvel dependen-te de PQQ (s-GDH; EC 1.1.5.2) com especificidade aperfeiçoada a glicoseem comparação com maltose, apresentando uma substituição de treonina naposição 348 por glicina ou por alanina ou por serina, em que esse mutanteadicionalmente compreende pelo menos uma mutação para aperfeiçoar aestabilidade do mutante e pelo menos uma mutação para aperfeiçoar a afi-nidade do mutante por glicose.

O termo "afinidade" por um substrato é bem conhecido no esta-do da técnica. Ele é dado em mM como chamado valor Km. Vários métodossão conhecidos no estado da técnica para determinar a afinidade de s-GDH,usando glicose ou outros açúcares como substratos, cf. Igarashi, S. e outros,Biochem Biophys Res Commun 264 (1999) 820.Na classificação de novas variantes com extrato bruto de E. coli,um cálculo de porcentagem do valor Km foi realizado para avaliação maisrápida de clones gerados. A afinidade por glicose de mutantes de s-GDHcandidatos foi calculada de acordo com a bem conhecida cinética de Mi-chaelis-Menten.

O mutante de s-GDH de acordo com a presente invenção apre-senta uma afinidade aperfeiçoada por glicose em comparação com um mu-tante que compreende uma substituição de treonina na posição 348 por gli-cina, alanina ou serina. Preferencialmente, a afinidade pelo substrato glicoseé determinada conforme descrito em detalhes na seção de exemplos.

Preferencialmente, o que é referido como uma ou mais muta-ções para aperfeiçoamento da afinidade por glicose de um mutante de s-GDH que já compreende uma substituição de treonina na posição 348 porglicina, alanina ou serina é uma substituição de aminoácido selecionada dogrupo que consiste de L110H ou Υ; N229A, G ou S; Q246H, M ou Ν; Y333A;G339T; M341V; V349A ou G e V436P.

No caso de o aminoácido que corresponde à posição 110 daseqüência do tipo selvagem (ID SEQ NO: 2) de s-GDH conhecida de A. cal-coaceticus ser substituído em uma variante da presente invenção, prefere-seque o aminoácido Ieucina que ocorre naturalmente seja substituído por umaminoácido selecionado do grupo que consiste de histidina e tirosina. Maispreferencialmente, a substituição na posição 110 é por histidina.

No caso de o aminoácido que corresponde à posição 229 daseqüência do tipo selvagem (ID SEQ NO: 2) de s-GDH conhecida de A. cal-coaceticus ser substituído em uma variante da presente invenção, prefere-seque o aminoácido asparagina que ocorre naturalmente seja substituído porum aminoácido selecionado do grupo que consiste de alanina, glicina e seri-na. Mais preferencialmente, a substituição na posição 229 é por alanina.

No caso de o aminoácido que corresponde à posição 349 daseqüência do tipo selvagem (ID SEQ NO: 2) de s-GDH conhecida de A. cal-coaceticus ser substituído em uma variante da presente invenção, prefere-seque o aminoácido valina que ocorre naturalmente seja substituído por umaminoácido selecionado do grupo que consiste de alanina e glicina. Maispreferencialmente, a substituição na posição 349 é por glicina.

Também preferencialmente, a mutação para aperfeiçoamentoda afinidade por glicose é selecionada do grupo que consiste de L110H,Q246H; G339T; M341V, V349G e V436P.

Também preferencialmente essa substituição para aperfeiçoa-mento da afinidade por glicose é selecionada de Q246H; G339T; M341V eV349G. Uma s-GDH preferida de acordo com a presente invenção compre-ende duas ou três dessas substituições ou todas essas quatro substituições.

Em uma modalidade adicionalmente preferida, o mutante de s-GDH acima descrito com especificidade aperfeiçoada a glicose em compa-ração com maltose, apresentando uma substituição de treonina na posição348 por glicina, alanina ou serina e compreendendo pelo menos uma muta-ção para aperfeiçoar a estabilidade, adicionalmente compreende uma oumais mutações para aperfeiçoar a especificidade do substrato do mutante aglicose em comparação com maltose.

Para certas aplicações, a especificidade do substrato de um mu-tante de s-GDH com especificidade aperfeiçoada a glicose em comparaçãocom maltose, apresentando uma substituição de treonina na posição 348 porglicina, alanina ou serina, poderá, todavia, não ser suficiente para certas a-plicações de rotina.

Em certas modalidades, poderá ser exigido gerar um mutante des-GDH que além da mutação na posição 348 discutida acima compreendeuma ou mais mutações mutações adicionais para aperfeiçoar adicionalmentea especificidade do mutante a glicose em comparação com maltose.

O termo "especificidade do substrato" ou "especificidade" é bemconhecido daquele habilitado no estado da técnica.

A fim de calcular a especificidade do substrato ou reatividadecruzada, uma maneira fácil é ajustar a atividade medida com glicose comosubstrato em 100 % e comparar com o valor da glicose a atividade medidacom outro açúcar selecionado. Algumas vezes, a fim de não ser redundante,simplesmente o termo especificidade é usado sem fazer referência especiala glicose, por um lado, e a outro substrato de açúcar selecionado, por outro.

O especialista no campo, entenderá que comparação de ativi-dades enzimáticas é realizada melhor sob concentrações equimolares dasmoléculas do substrato investigadas usando condições de ensaio bem defi-nidas. De outro modo, correções de diferenças nas concentrações têm deser efetuadas.

Condições de ensaio padronizadas e bem definidas têm de serescolhidas a fim de avaliar (aperfeiçoamentos na) especificidade do substra-to. A atividade enzimática de s-GDH a glicose como substrato, bem como aoutros substratos de açúcar selecionados, é medida como descrito na seçãoExemplos.

Com base nas medições de atividade enzimática a glicose ou amaltose, respectivamente, reatividade cruzada (e seu aperfeiçoamento) éavaliada.

A reatividade (cruzada) de s-GDH a maltose em porcentagem écalculada como

Reatividade cruzada [%] = (atividade de maltose/atividade deglicose) χ 100%.

Reatividade (cruzada) a maltose de s-GDH do tipo selvagem deacordo com a fórmula acima foi determinada como cerca de 105% (ver WO02/34919).

Especificidade é calculada de acordo a seguinte fórmula:

<formula>formula see original document page 18</formula>

Aperfeiçoamentos na especificidade de um novo mutante de s-GDH são reconhecidos como valores menores no cálculo acima, em compa-ração com um mutante de s-GDH com especificidade aperfeiçoada para gli-cose em comparação com maltose, apresentando uma substituição de treo-nina na posição 348 por glicina, alanina ou serina.

Como entenderá aquele habilitado no estado da técnica, os nú-meros absolutos dependerão do número e espécie de mutações já presen-tes em um mutante. O número e espécie de mutações já presentes em ummutante poderá ser denominado base do mutante. Qualquer nova mutação émelhor comparada diretamente com a base do mutante.

Preferencialmente, a mutação para aperfeiçoar adicionalmente aespecificidade do substrato a glicose em comparação com maltose é umasubstituição de aminoácido selecionada do grupo que consiste de Q145P;D163G ou N; Q164F; L169F; Y171G; I208L ou V; T224I; E245D; G276S;A294D ou E; V300A, S1 Ν, Y ou I; T307G; T323V; A354Y, E ou L; R378I, M1A ou D; N428P e inserção 429 Ρ. O termo "inserção 429" é usado para indi-car que entre a posição 428 e a posição 429 de ID SEQ N0:2 é introduzidauma prolina.

No caso de o aminoácido que corresponde à posição 169 da se-qüência do tipo selvagem de s-GDH conhecida de A. calcoaceticus (ID SEQNO: 2) ser substituído em uma variante da presente invenção, prefere-seque o aminoácido Ieucina que ocorre naturalmente seja substituído por feni-lalanina, tirosina ou triptofano. Mais preferencialmente, a substituição na po-sição 169 é por fenilalanina.

No caso de o aminoácido que corresponde à posição 171 da se-qüência do tipo selvagem de s-GDH conhecida de A. calcoaceticus (ID SEQNO: 2) ser substituído em uma variante da presente invenção, prefere-seque o aminoácido tirosina que ocorre naturalmente seja substituído por umaminoácido selecionado do grupo que consiste de alanina, metionina, glici-na. Mais preferencialmente, a substituição na posição 171 é por glicina.

No caso de o aminoácido que corresponde à posição 245 da se-qüência do tipo selvagem de s-GDH conhecida de A. calcoaceticus (ID SEQNO: 2) ser substituído em uma variante da presente invenção, prefere-seque o aminoácido ácido glutâmico que ocorre naturalmente seja substituídopor ácido aspártico, asparagina ou glutamina. Mais preferencialmente, asubstituição na posição 245 é por ácido aspártico.

No caso de o aminoácido que corresponde à posição 341 da se-qüência do tipo selvagem de s-GDH conhecida de A. calcoaceticus (ID SEQNO: 2) ser substituído em uma variante da presente invenção, prefere-seque o aminoácido metionina que ocorre naturalmente seja substituído porvalina, alanina, Ieucina ou isoleucina. Mais preferencialmente, a substituiçãona posição 341 é por valina.

Verifica-se também que é possível aperfeiçoar adicionalmenteespecificidade do substrato de uma variante de s-GDH que já compreendeuma substituição na posição 348 por meio de inserção de um aminoácido,preferencialmente uma prolina, entre as posições 428 e 429.

Também preferida, a mutação adicional para aperfeiçoar a es-pecificidade do substrato a glicose em comparação com maltose é selecio-nada do grupo que consiste de L169F; Y171G; E245D; N428P e inserção429P.

Preferencialmente, a mutação adicional para aperfeiçoar a es-pecificidade do substrato a glicose em comparação com maltose é selecio-nada do grupo que consiste de L169F; Y171G; E245D; e N428P. Em moda-lidades adicionalmente preferidas, combinações de duas, três ou todas es-sas quatro substituições são usadas para aperfeiçoar a especificidade dosubstrato desse mutante a glicose em comparação com maltose. Tambémpreferida, a mutação adicional para aperfeiçoar a especificidade do substratoa glicose em comparação com maltose é selecionada do grupo que consistede L169F; Y171G; E245D; e inserção 429P. Em modalidades adicionalmen-te preferidas, combinações de duas ou todas essas três substituições sãousadas juntamente com a inserção 429 P em uma s-GDH mutada para aper-feiçoar a especificidade do substrato desse mutante a glicose em compara-ção com maltose.

Como descrito in WO 02/34919 e WO 2006/008132, respectiva-mente, uma substituição na posição 428, por meio da qual asparagina ésubstituída por prolina ou uma inserção do aminoácido prolina entre as posi-ções 428 e 429, respectivamente, aperfeiçoa adicionalmente a especificida-de de um mutante de s-GDH que já compreende uma substituição na posi-ção 348. Em uma modalidade adicionalmente preferida, a presente inven-ção, portanto, refere-se a um mutante de glicose desidrogenase solúvel de-pendente de PQQ (s-GDH; EC 1.1.5.2) com especificidade aperfeiçoada aglicose em comparação com maltose, apresentando uma substituição detreonina na posição 348 por glicina, por alanina ou por serina, e uma substi-tuição na posição 428, por meio da qual asparagina é substituída por prolinaou uma inserção do aminoácido prolina entre as posições 428 e 429, em queesse mutante adicionalmente compreende pelo menos uma mutação paraaperfeiçoar a estabilidade do mutante, pelo menos uma mutação para aper-feiçoar a atividade específica do mutante e opcionalmente uma ou mais mu-tações para aperfeiçoar a afinidade do mutante por glicose, e/ou uma oumais mutações para aperfeiçoar adicionalmente a especificidade do mutantea glicose em comparação com maltose, e em que as posições dadas corres-pondem às posições de aminoácidos conhecidas da seqüência do tipo sel-vagem (ID SEQ NO: 2) de s-GDH de A. calcoaceticus.

Em outra modalidade, a presente invenção refere-se a um mu-tante de glicose desidrogenase solúvel dependente de PQQ (s-GDH; EC1.1.5.2) com especificidade aperfeiçoada a glicose em comparação commaltose, apresentando uma substituição de treonina na posição 348 por gli-cina, alanina ou serina, em que esse mutante adicionalmente compreendepelo menos uma mutação para aperfeiçoar a estabilidade do mutante e pelomenos uma mutação para aperfeiçoar a atividade específica do mutante.

O termo "atividade específica" é bem conhecido do estado datécnica. É usado para descrever a atividade enzimática por quantidade deproteína. Vários métodos são conhecidos no estado da técnica para deter-minar atividade específica de uma s-GDH, usando glicose ou outros açúca-res como substratos; ver, por exemplo, lgarashi, S. e outros, Biochem Bio-phys Res Commun 264 (1999) 820. O mutante de s-GDH de acordo com apresente invenção apresenta uma atividade específica aperfeiçoada em re-lação ao substrato glicose em comparação com um mutante que compreen-de uma substituição de treonina na posição 348 por glicina, alanina ou serina.

Preferencialmente, a mutação para aperfeiçoar a atividade es-pecífica a glicose é uma substituição de aminoácido selecionada do grupoque consiste de H30F ou R; A301G ou S e A302S ou T.

Como aquele habilitado no estado da técnica entenderá, é pos-sível realizar substituições de aminoácidos, por exemplo, mutações silencio-sas, que não influenciam as propriedades de s-GDH em um grau significati-vo. A variante de acordo com a presente invenção não terá, no entanto, maisde 45 trocas de aminoácidos em comparação com ID SEQ NO:2. Preferen-cialmente, a variante compreenderá 20 ou menos substituições de aminoá-cidos, mais preferencialmente, apenas 15 substituições de aminoácidos, ousubstituições menores estarão presentes.

Algumas variantes específicas de s-GDH de acordo com a pre-sente invenção são dadas na seção Exemplos. Variantes preferidas de s-GDH com baixa interferência em glicose e características aperfeiçoadas emrelação a termoestabilidade e afinidade de substrato por glicose compreen-dem os mutantes com as seguintes substituições:N122K+L169F+Y171G+E245D+M341 V+T348G+ins429P;N122K+S124K+L169F+Y171G+E245D+M341 V+T348G+ins429P;N122K+S124K+L169F+Y171G+E245D+M341 V+T348G+L386F+ins429P;N122K+S124K+L169F+Y171G+E245D+Q246H+M341V+T348G+L386F +ins429P;D87R+N122K+S124K+S146G+L169F+Y171G+E245D+Q246H+V298L+M341 V+T348S+L386F+ins429P;

D87R+N122K+S124K+S146G+L169F+Y171G+E245D+Q246H+V298L++G339T+M341 V+T348G+L386F+ins429P;

D87R+N122K+S124K+S146G+L169F+Y171G+E245D+Q246H+V298L+M341V+T348S+L386F+ins429P+V436P;

D87R+N122K+S124K+S146G+L169F+Y171G+E245D+Q246H+V298L+M341 V+T348S+V349G+A354T+L386F+ins429P;

D87R+L110H+N122K+S124K+S146G+L169F+Y171G+E245D+Q246H+V298L+M341 V+T348S+L386F+ins429P.

Numerosas possibilidades são conhecidas no estado da técnicapara produzir proteínas mutantes. Com base nas importantes verificações dapresente invenção que descrevem a importância crfitica de certos resíduospara aperfeiçoar a termoestabilidade, a afinidade por glicose e a especifici-dade do substrato de um mutante s-GDH, aquele habilitado no estado datécnica pode agora facilmente produzir adicionalmente variantes apropriadasde s-GDH que abrigam essas e outras modificações favoráveis. Essas vari-antes, por exemplo, podem ser obtidas pelos métodos conhecidos como mu-tagenêse aleatória (Leung, D. W. e outros, Technique 1 (1989) 11-15) e/oumutagenêse orientada a sítios (Hill, D. E. e outros, Methods EnzymoL 155(1987) 558-568). Um método alternativo para produzir uma proteína com aspropriedades desejada é proporcionar constructos quiméricos, que contêmelementos de seqüências de pelo menos duas diferentes fontes, ou sintetizarcompletamente um gene apropriado para s-GDH. Esses procedimentos co-nhecidos no estado da técnica poderão ser usados em combinação com ainformação descrita na presente invenção para proporcionar mutantes ouvariantes de s-GDH que compreendem, por exemplo, substituições adicio-nais de aminoácidos em combinação com com importância crítica conhecidade uma substituição na posição 348 de ID SEQ NO: 2.

Uma variante de s-GDH de acordo com a presente invenção po-de, por exemplo, ser produzida iniciando de um gene para s-GDH conformeisolado de cepa LMD 79.41 do tipo Acinetobacter calcoaceticus, bem comocomeçando de uma seqüência homóloga. No contexto deste pedido, o termo"homólogo" significa compreender uma seqüência de aminoácidos de s-GDHcom pelo menos 90% de identidade em comparação com ID SEQ NO: 2. Emoutras palavras, após alinhamento apropriado usando o programa PileUp,pelo menos 90% dos aminoácidos dessa s-GDH homóloga são idênticos aosaminoácidos descritos em ID SEQ NO: 2.

Entender-se-á que variações de DNA e de seqüências de ami-noácidos existem naturalmente, ou poderão ser intencionalmente introduzi-das usando métodos conhecidos no estado da técnica. Essas variações po-derão resultar em até 10% de diferenças em aminoácidos na seqüência ge-ral, devido a supressões, substituições, inserções, inversões ou adições deum ou mais resíduos de aminoácidos nessa seqüência em comparação comID SEQ NO: 2. Essas substituições de aminoácidos poderão ser realizadas,por exemplo, com base em similaridade em polaridade, carga, solubilidade,hidrofobicidade, hidrofilicidade e/ou a natureza antipática dos resíduos en-volvidos., por exemplo, aminoácidos negativamente carregados incluem áci-do aspártico e ácido glutâmico; aminoácidos carregados positivamente in-cluem Iisina e arginina; aminoácidos com grupos cabeça polares não-carregados ou grupos cabeça não-polares não-carregados que apresentamvalores de hidrofilicidade similares incluem o seguinte: leucina, isoleucina,valina, glicina, alanina, asparagina, glutamina, serina, treonina, fenilalanina etirosina. Outras variações contempladas incluem sais e ésteres dos polipep-tídeos acima mencionados, bem como precursores dos polipeptídeos acimamencionados, por exemplo, precursores que apresentam uma substituiçãono término N tais como metionina, N-formilmetionina, usadas como seqüên-cias condutoras. Essas variações poderão ser efetuadas sem necessaria-mente se afastar do escopo e do espírito da presente invenção.

De acordo com procedimentos conhecidos no estado da técnicaou de acordo com os procedimentos fornecidos na seção de exemplos, épossível obter seqüências de polinucleotídeos que codificam qualquer dosmutantes de s-GDH como discutido acima. A invenção, portanto, compreen-de também seqüências isoladas de polinucleotídeos que codificam proteínasmutantes de s-GDH de acordo com a presente invenção como descrito aci-ma.

A presente invenção adicionalmente inclui um vetor de expres-são que compreende uma seqüência de ácidos nucléicos de acordo com apresente invenção ligada operavelmente a uma seqüência promotora capazde dirigir sua expressão em uma célula hospedeira.

A presente invenção adicionalmente inclui um vetor de expres-são que compreende uma seqüência de ácidos nucléicos de acordo com apresente invenção ligada operavelmente a uma seqüência promotora capazde dirigir sua expressão em uma célula hospedeira. Vetores preferidos sãoplasmídeos tal como pACSGDH mostrado nas Figuras 2 e 3.

Vetores de expressão úteis na presente invenção tipicamentecontêm uma origem de replicação, uma resistência a antibióticos para sele-ção, um promotor para expressão e toda ou parte da variante genética de s-GDH. Os vetores de expressão poderão também incluir outras seqüênciasde DNA conhecidas no estado da técnica, tais como seqüências sinalizado-ras (para melhor enovelamento, transporte para o periplasma ou secreção),indutores para melhor modulação da expressão ou sítios de clivagem paraclonagem.

As características do vetor de expressão selecionado têm de sercompatíveis com a célula hospedeira, que será empregada, por exemplo,quando se realiza clonagem em um sistema de células de E. coli, o vetor deexpressão deve conter promotores isolados do genoma de células de E. coli(por exemplo, Iac ou trp). Origens de replicação adequadas tal como a ori-gem de replicação plasmídeo CoIEI podem ser usadas. Promotores ade-quados incluem, por exemplo, Iac e trp. Prefere-se também que o vetor deexpressão inclua a seqüência que codifica um marcador de seleção tal comoum gene de resistência a antibióticos. Como marcadores selecionáveis, re-sistência a ampicilina ou resistência a canamicina poderão ser conveniente-mente empregadas. Todos esses materiais são conhecidos no estado datécnica e são comercialmente disponíveis.

Vetores de expressão adequados que contêm as seqüênciasdesejadas de codificação e controle poderão ser construídos utilizando téc-nicas padrões de DNA recombinante conhecidas no estado da técnica, mui-tas das quais são descritas in Sambrook e outros, in "Molecular Cloning: ALaboratory Manual" ("Clonagem Molecular: Manual de Laboratório") (1989)Cold Spring Harbor, Nova Iorque, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

A presente invenção adicionalmente refere-se a células hospe-deiras que contêm um vetor de expressão que compreende uma seqüênciade DNA que codifica todo ou parte da s-GDH mutante. As células hospedei-ras preferencialmente contêm um vetor de expressão que compreende todaou parte de uma das seqüências de DNA que codificam uma s-GDH mutanteque apresenta uma ou mais mutações mostradas nos Exemplos 2-8. Célulashospedeiras adequadas incluem, por exemplo, HB101 de E. coli (ATCC33694) disponível pela Promega (2800 Woods Hollow Road, Madison, Wl,EUA), XLI-BIue MRP disponível pela Stratagene (11011 North Torrey PineRoad, La Joila, CA, EUA) e similares.

Vetores de expressão poderão ser introduzidos em células hos-pedeiras por meio de vários métodos conhecidos no estado da técnica. Porexemplo, transformação de células hospedeiras com vetores de expressãopode ser realizada por meio de método de transformação com protoplastosmediada por polietilenoglicol (Sambrook e outros, 1989, supra). Entretanto,outros métodos para introduzir vetores de expressão em células hospedei-ras, por exemplo, eletroporação, injeção bolística ou fusão de protoplastos,podem também ser empregados.

Uma vez que um vetor de expressão contendo uma variante des-GDH tenha sido introduzido em uma célula hospedeira apropriada, a célulahospedeira poderá ser cultivada sob condições que permitem expressão dasvariantes desejadas de s-GDH. Células hospedeiras que contêm o vetor deexpressão desejado com a seqüência de DNA que codifica toda ou parte das-GDH mutante podem ser facilmente identificadas por, isto é, seleção anti-biótica. A expressão das variantes de s-GDH pode ser identificada por dife-rentes métodos tais como medição de produção de transcriptos de mRNA des-GDH, detecção do produto genético imunologicamente ou detecção daatividade enzimática do produto genético. Preferencialmente, é aplicado umensaio enzimático.

A presente invenção também ensina a geração e classificaçãode mutantes de s-GDH. Mutagênese aleatória e mutagênese por saturaçãosão realizadas como se sabe no estado da técnica. Variantes são classifica-das em relação a termoestabilidade (atividade sem tratamento de tensãotérmica comparada com atividade remanescente após tratamento de tensãotérmica). As condições de ensaio escolhidas são adaptadas de modo a as-segurar que as esperadas pequenas acentuações realizadas, por exemplo,por uma única substituição de aminoácido, possam ser medidas. Uma moda-lidade preferida de seleção ou classificação de mutantes apropriados é dadano Exemplo 3. Qualquer mudança ou aperfeiçoamento em comparação coma enzima de partida (mutante ou do tipo selvagem) pode ser claramente de-tectada.

Deve-se, naturalmente, entender que nem todos os vetores deexpressão e seqüências reguladoras de DNA funcionariam igualmente bempara expressar as seqüências de DNA da presente invenção. Nem todas ascélulas hospedeiras funcionariam igualmente bem com o mesmo sistema deexpressão. No entanto, aquele habilitado no estado da técnica faria uma se-leção apropriada entre os vetores de expressão, seqüências reguladoras deDNA e células hospedeiras usando a orientação proporcionada aqui semexperimentação indevida.

A invenção também se refere a um processo para produzir vari-antes de s-GDH da presente invenção, o qual compreende cultivar uma célu-la hospedeira da invenção sob condições adequadas para produção da s-GDH mutante da invenção. Para células hospedeiras bacterianas, condiçõesde cultura típicas são meio líquido contendo fontes de carbono e de nitrogê-nio, o agente antibiótico e o agente de indução apropriados (dependendo dovetor de expressão usado). Antibióticos apropriados típicos incluem ampicil-lina, canamicina, cloranfenicol, tetraciclina e similares. Agentes de induçãotípicos incluem IPTG, glicose, Iactose e similares.

Prefere-se que os polipeptídeos da presente invenção sejam ob-tidos por produção em células hospedeiras que expressam uma seqüênciade DNA que codifica a s-GDH mutante. Os polipeptídeos da presente inven-ção poderão também ser obtidos por tradução in vitro do mRNA codificadopor uma seqüência de DNA que codifica a s-GDH mutante. Por exemplo, asseqüências de DNA poderão ser sintetizadas conforme descrito acima e in-troduzidas em um vetor de expressão adequado, que, por sua vez, poderáser usado em um sistema transcrição/tradução in vitro.

Um vetor de expressão que compreende um polinucleotídeo iso-lado como definido e descrito acima operavelmente ligado a uma seqüênciapromotora capaz de promover sua expressão em um sistema de síntese depeptídeos sem células representa outra modalidade preferida da presenteinvenção.

Os polipeptídeos produzidos, por exemplo, por procedimentoscomo descrito acima poderão então ser isolados e purificados usando váriastécnicas de purificação de proteína de rotina. Por exemplo, procedimentoscromatográficos tais como cromatografia de troca iônica, cromatogrâfia defiltração em gel e cromatografia de afinidade poderão ser empregados.

Uma vez que as maiores aplicações das variantes aperfeiçoadasde s-GDH desta invenção é para uso em fitas de teste para monitorar o nívelde glicose no sangue em pacientes diabéticos. A insensibilidade de glicosedesidrogenase dependente de PQQ a oxigênio é, como discutido acima,uma grande vantagem sobre glicose oxidase. A interferência devido a, porexemplo, maltose, galactose e/ou outros açúcares relacionados que poderãoestar presentes em uma amostra a ser analisada pode agora ser significati-vamente reduzida usando as novas variantes de s-GDH que apresentamtanto termoestabilidade aperfeiçoada quanto especificidade aperfeiçoada aglicose. Naturalmente, muitas espécies de amostras poderão ser investiga-das. Fluidos corporais tais como soro, plasma, fluido intestinal ou urina sãofontes preferidas para tais amostras.

A invenção também compreende um método de detecção, de-terminação ou medição de glicose em uma amostra usando um mutante des-GDH de acordo com a presente invenção. É especialmente preferido que ométodo aperfeiçoado para detecção de glicose em uma amostra seja carac-terizado pelo fato de que essa detecção, determinação ou medição de glico-se seja realizada utilizando um sensor ou dispositivo de fita de teste.

Também dentro do escopo da presente invenção está um dispo-sitivo para a detecção ou medição de glicose em uma amostra que compre-ende um mutante de s-GDH de acordo com esta invenção, bem como oou-tros reagentes exigidos para essa medição.

As variantes de s-GDH com termoestabilidade aperfeiçoada des-ta invenção podem também ser usadas com grande vantagem em biossen-sores (D1Costa, E.J. e outros, Biosensors 2 (1986) 71-87; Laurinavicius, V. eoutros, Analytical Letters 32 (1999) 299-316; Laurinavicius, V. e outros, Mo-natshefte fuer Chemie 130 (1999) 1269-1281; Woosuck, S. e outros, Sen-sors e Actuators B 100 (2004) 395-402) para monitoramento online de glico-se em uma amostra ou um reator. Com essa finalidade, as variantes de s-GDH podem, por exemplo, ser usadas para revestir um eletrodo de vidroinsensível a oxigênio com um complexo de ósmio contendo uma rede deepóxi condutora redox (Ye e outros, 1993, supra) para determinação maisprecisa da concentração de glicose.

Nos exemplos seguintes, todos os reagentes, enzimas de restri-ção e outros materiais foram obtidos de Roche Diagnostics Germany, a me-nos que outras fontes comerciais sejam especificadas, e usados de acordocom as instruções dadas pelos fornecedores. Operações e métodos empre-gados para a purificação, caracterização e clonagem de DNA são bem co-nhecidos no estado da técnica (Ausubel, F. e outros, in"Current protocols inmolecular biology*' ("Protocolos correntes em biologia molecular") (1994) Wi-ley Verlag) e podem ser adaptados, conforme exigido, por aquele habilitadono estado da técnica.

Os exemplos seguintes ilustram adicionalmente a presente in-venção. Esses exemplos não pretendem limitar o escopo da presente inven-ção, mas proporcionam adicionalmente compreensão da invenção.

Os exemplos seguintes, listagem de seqüências e figuras sãoproporcionados para ajudar na compreensão da presente invenção, cujoverdadeiro escope é apresentado nas reivindicações anexas. Entende-seque modificações podem ser efetuadas nos procedimentos apresentadossem se afastar do espírito da invenção.

Descrição das Figuras

Figura 1: Seqüências protéicas de S-GDH de A. calcoaceticus dependentede PQQ (alto) e s-GDH de A. baumannii (fundo) alinhadas deacordo com homologia de seqüências.

Figura 2: Ilustração de vetor pACSGDH referido no Exemplo 1 contendoas seqüências do tipo selvagem ou mutadas de DNA, respecti-

vamente, de glicose desidrogenase solúvel dependente dePQQ.

Figura 3: Seqüências de nucleotídeos (DNA) do vetor pACSGDH referidono Exemplo 1 contendo a seqüência do tipo selvagem de DNAde glicose desidrogenase solúvel dependente de PQQ.

Exemplo 1

Clonagem e expressão da glicose desidrogenase solúvel do tipo selva-gem dependente de PQQ de A. calcoaceticus em E. coli

O gene para s-GDH foi isolado de cepa LMD 79.41 de Acineto-bacter calcoaceticus de acordo com procedimentos padrões. O gene do tiposelvagem para s-GDH foi subclonado em um plasmídeo contendo o promo-tor mgl para expressão ajustável (cf. Pedido de Patent WO 88/09373). O no-vo constructo foi chamado pACSGDH (ver Figuras 2 e 3, bem como ID SEQNO: 3). Os plasmídeos recombinantes foram introduzidos em um organismohospedeiro selecionado do grupo de E.coli. Esses organismos foram entãocultivados sob condições apropriadas e colônias mostrando atividade sele-cionada a s-GDH.

O plasmídeo pACSGDH foi isolado de uma cultura de 200 ml danoite para o dia do clone mencionado acima usando QIAGEN Plasmid MaxiKit (Qiagen) de acordo com o protocolo do fabricante. O plasmídeo foi res-suspenso em 1 ml de água bidestilada. A concentração do plasmídeo foi de-terminada usando um fotômetro Beckman DU 7400.

O rendimento foi de 600 pg. Em seguida, a qualidade do plasmí-deo foi determinada por eletroforese em gel de agarose.

Exemplo 2

Generação de T348G mutante e T348S mutante

Como padrões de partida para a geração de variantes adicio-nalmente aperfeiçoadas, foi produzida s-GDH mutada com as mutaçõesT348G ou T348S, respectivamente. Esses mutantes de s-GDH foram esco-lhidos porque se sabe que eles apresentam especificidade aperfeiçoada dosubstrato a glicose em comparação com o substrato maltose (ver WO02/34919).

O Kit de Mutagênese Orientada a Sítios QuickChange (Strata-gene, Cat. 200518) foi usado para substituir a treonina na posição 348 poruma glicina ou uma serina. Os primers apropriados foram projetados.

O primer 5'- e o primer 3' usados para mutagenêse eram com-plementares um ao outro e continham o códon modificado pela troca de tre-onina por glicina (ACA por GGG) ou de treonina por serina (ACA to TCA) emuma posição central. Esses nucleotídeos foram flanqueados por 12 a 16 nu-cleotídeos em cada extremidade. As seqüências dos nucleotídeos eram i-dênticas à fita de DNA sentido e anti-sentido que flanqueiam o códon pelatroca de aminoácidos. Em vez dos códons ACA = treonina pela fita sentido eTGT pela fita anti-sentido, respectivamente, os primers continham GGG =glicina ou TCA = serina, respectivamente, pela fita sentido, e CCC = glicinaou AGT = serina, respectivamente, pela fita anti-sentido. A fita sentido e afita anti-sentido pela troca T348G são dadas como IDs SEQs NOs: 3 e 4,respectivamente.

CATTTGCTGG CCAGGGGTTG CACCGTCAT (=ID SEQ NO: 4)ATGACGGTGC AACCCCTGGC CAGCAAATG (=ID SEQ NO: 5)

A reação RCP e a digestão de Dpnl foram realizadas de acordocom o manual. Após isso, 1 pl de amostra foi usado para a eletroporação decélulas XL-MRF. Electroporação foi obtida com 2,5 KV em cuvettes de 0,2cm utilizando um pulsador de E. coli BioRad (BioRad). Após crescimento em1 ml de LB a 37°C por uma hora, bactérias foram plaqueadas sobre meio "4χ lêvedo" (20 g de extrato de lêvedo + 5 g de NaCI, pH 7,0 a 1 I, água dest.)-placas de ampicilina ágar (100 pg / ml ampicilina) e crescidas da noite para odia a 37°C. Os clones de s-GDH mutada foram examinados usando o méto-do de classificação seguinte.

Exemplo 3

Classificação

As colônias mutantes na placa de ágar descrita acima foram re-colhidas em placas de microtitulação (MTPs) contendo 200 μl de meio "4 χlêvedo"-ampicilina por poço e incubadas da noite para o dia a 37°C. Essasplacas são chamadas placas-mestras.

De cada placa-mestra, 5 μΙ de amostra/poço foram transferidospara uma MTP contendo 5 μΙ por poço de B (B = Reagente de Extração deProteína Bacteriana; Pierce No. 78248), para ruptura celular, e 240 μΙ de0,0556 mM de pirrolquinolina quinona (PQQ); 50 mM de Hepes; 15 mM deCaCb pH 7,0/poço para ativação de s-GDH, foram adicionados. Para com-pletar a formação da holoenzima, a MTP foi incubada a 25°C por 2 horas e a10°C da noite para o dia. Essa placa é chamada placa de trabalho.Da placa de trabalho, 4 χ 10 μΙ de amostra por poço foram trans-feridos para quatro MTPs vazias. Em seguida, a primeira alíquota foi testadacom glicose sob concentração padrão (isto é, 30 mM), a segunda, com umaconcentração reduzida de glicose (1,9 mM em vez de 30 mM), a terceira,com maltose como substrato, e a quarta, submetida a tensão por 30 min a64°C antes de testar essa alíquota similarmente à primeira alíquota. Tudoselecionado, outras moléculas de açúcar foram usadas em concentraçãopadrão equimolar, isto é, a 30 mM. Em todos os ensaios, foram aplicados 90μl de solução mediadora (ver Exemplo 8) já contendo o açúcar a ser anali-sado.

O dE/min foi calculado e o valor usando 30 mM de glicose comosubstrato foi ajustado em 100% de atividade. O valor obtido com o outro a-çúcar foi comparado com o valor da glicose e calculado em porcentagem deatividade (por exemplo, para maltose como: (dE/min de maltose/dE de glico-se)*100). Essa atividade é equivalent à reatividade cruzada da enzima (vari-ante). Nas Tabelas "M/G" seguintes, é dada a reatividade cruzada de s-GDHcom maltose (M) como substrato em comparação com glicose (G) comosubstrato.

O valor obtido com 1,9 mM de glicose foi comparado com o valorde 30 mM de glicose e calculado em porcentagem relativa de atividade((dE/min de 1,9 mM de glicose/30 mM de glicose)*100). Isso fornece um va-lor em % que é um indicador indireto do valor de Km para a variante analiza-da. De acordo com esse cálculo, um valor percentual maior indica um valorde Km menor (= melhor).Tabela 1: Características básicas dos mutantes T348G e T348S emcomparação com s-GDH do tipo selvagem (WT)__

<table>table see original document page 33</column></row><table>

Exemplo 4

Seqüenciamento de uma s-GDH mutante

O método é exemplificado por T348G de s-GDH. O seqüencia-mento detalhado abaixo pode também ser usado para seqüenciamento deoutros mutantes de s-GDH.

Os seguintes prímers foram usados para seqüenciamento de ummutante de s-GDH:

Fita sentido: 5 '-TTA ACG TGC TGA ACA GCC GG-3' (= ID SEQ N0:6)Fita anti-sentido: 5-ATA TGG GTA AAG TAC TAC GC -3' (= ID SEQ NO: 7)

Os plasmídeos contendo o gene para s-GDH mutante T348G,mutante este que apresenta cerca de 22% de reatividade cruzada malto-se/glicose, e T348S de s-GDH, mutante este que apresenta 50% de reativi-dade cruzada maltose/glicose, respectivamente, foram isolados (Kit de Iso-lamento de Plasmídeos Altamente Puros, Roche Diagnostics GmbH,No. 1754785) e seqüenciados usando um Kit de Seqüenciamento Termina-dor com Corante ABI Prism e os seqüenciadores ABI 3/73 e 3/77 (Amer-sham Pharmacia Biotech).

O seqüenciamento confirmou que as mutações desejadas emDNA e no nível de aminoácidos foram obtidas em ambos os mutantes. Issoresultou em uma troca de T por G ou por S, respectivamente, na posição348. Nenhuma mutação adicional nos dois genes foi verificada.

Exemplo 5

Mutantes adicionais de s-GDH obtidos por mutagênse por saturaçãocom base em T348G (mutante A) e T348S (mutante A')

Posições de aminoácidos candidatos eram conhecidos dos in-ventores a partir de estudos anteriores conduzidos por eles. Aquelas posi-ções de aminoácidos candidatos suspeitas ou sabidas influenciar characte-rísticas relevantes de s-GDH tais como termoestabilidade, especificidade asubstrato ou afinidade por glicose foram analisadas individualmente combase em T348G (mutante A) ou com base em T348S (mutante A').

Mutagênese por saturação foi realizada em relação a posiçõesúnicas de aminoácidos a fim de avaliar que efeito essa única substituição deaminoácidos poderia apresentar sobre o mutante T348G ou T348S, respec-tivamente.

O Kit de Mutagênse Orientada a Sítios QuickChange (Stratage-ne, Cat. 200518) foi usado para substituir sucessivamente aminoácidos dotipo selvagem nas posições 87, 110, 122, 124, 145, 146, 169, 171, 187, 246,294, 298, 300, 313, 323, 333, 339, 341, 349, 378, 428 e 436 da proteína s-GDH do tipo selvagem, respectivamente.

O primer 5' e o primer3' usados para mutagênese foram esco-lhidos para serem complementares um ao outro e continham NNN (N = A, C,G ou T) em uma posição central. Os três nucleotídeos N aleatoriamente in-corporados, que estão na posição desejada e codificam a posição dos ami-noácidos sob investigação foram flanqueados por 12 a 16 nucleotídeos emcada extremidade que eram idênticos à fita de DNA sentido e anti-sentido dopadrão. Em lugar do códon do tipo selvagem, os primers continham NNN,portanto os oligonucleotídeos codificados para cada códon possível.

Para cada uma das posições sob investigação, foi realizada umareação RCP.

As reações de RCP e as digestões de endonuclease de restriçãopor Dpnl foram realizadas de acordo com o manual fornecido com o Kit deMutagênese Orientada a Sítios QuickChange (Stratagene, Cat. 200518).

De cada reação RCP, 1 μΙ foi usado para a eletroporação de cé-lulas XL1F. As células foram crescidas e as atividades de s-GDH dos clonesforam determinadas como descrito acima.

Para aumentar a probabilidade estatística de que todas as 20substituições possíveis de aminoácidos são cobertas nessa avaliação, 200clones de cada posição foram classificadas como descrito no Exemplo 3.Clones de interesse foram seqüenciados de acordo com o método dado noExemplo 4.

Tabela 2: Efeito de substituições adicionais de aminoácidos sobre ca-racterísticas básicas de mutante A (=T348G)

<table>table see original document page 35</column></row><table>Tabela 3: Efeito de substituições adicionais de aminoácidos sobre ca·racterísticas básicas de mutante A' (=T348S)

<table>table see original document page 36</column></row><table>

Trocas de aminoácidos com um efeito positivo sobre especifici-dade a substrato, afinidade por glicose e/ou termoestabilidade de mutante Aou mutante A', respectivamente, podem ser derivadas das Tabelas 2 e 3.

Exemplo 6

Identificação de mutantes com termoestabilidade aperfeiçoada

Os experimentos foram estendidos a mutantes apresentandoespecificidade muito boa de substrato a glicose em comparação com malto-se, mas à custa de desvantagens tal como termoestabilidade baixa demaisou afinidade por glicose baixa demais.

O chamado mutante 6 apresenta uma baixa reatividade cruzadaa maltose bastante favorável que é somente cerca de 1,5% da reatividadeconforme medido para glicose. O mutante 6 caracteriza-se pelas substitui-ções de aminoácidos Y171G, E245D, M341V e T348G e apresenta uma in-serção de uma prolina (ins429P) entre as posições 428 e 429.

Os seguintes prímers foram usados para introduzir essas substi-tuições desejadas de aminoácidos:

Fita sentido 5'-CCTATAAGAAAAAGACAGATACGCTCG -3' (ID SEQ NO: 8)Fita anti-sentido 5'-CGAGCGTATCTGTC I 11 I ICTTATAGG-3' (ID SEQ: NO: 9)D87R:

Fita sentido 5 '-TTCCATCCTCGAGAGATTGTCAAT-3'(ID SEQ NO: 10)

Fita anti-sentido 5'-ATTGACAATCTCTCTGAGGATGGAA-3' (ID SEQ: NO: 11)N122K e S124K:

Fita sentido 5'-CGTTATACCTATAAGAAAAAGACAGATACGCTCG-3' (ID SEQNO: 12)

Fita anti-sentido 5'- CGAGCGTATCTGTCI I I I ICTTATAGGTATAACG-3' (IDSEQ NO: 13)S146G:

Fita sentido 5 -AAAAGACCATCAGGGTGGTCTCGAGAAG -3' (ID SEQ NO: 14)Fita anti-sentido 5'-CTTCTCGAGACCACCCTGATGGTCTTTT -3' (ID SEQ: NO:15)V298L:

Fita sentido 5'-GCTCAAAATGGATTAAAAGTAGCCGCA -3' (ID SEQ NO: 16)Fita anti-sentido 5 '-TGCGGCTACTTTATTTCCATTTTGAGC -3' (ID SEQ: NO:17)

L386F:

Fita sentido 5'- CCGTATTAAGTTCGATCCAACTTATAGC -3' (ID SEQ NO: 18)Fita anti-sentido 5'- GCTATAAGTTGGATCGAACTTAATACGG -3' (ID SEQ:NO: 19)Tabela 4: Mutações com impacto positivo sobre a termoestabilidade demutantes de s-GDH que já compreendem outros mutantes para, por e-xemplo, aperfeiçoar especificidade a glicose

<table>table see original document page 38</column></row><table>

Os resultados acima mostram que as trocas de aminoácidosD87R, N122K, S124K, S146A ou G, preferencialmente G, S146G, L187F ouΜ; N267Y, V298L, T313D e L386F aperfeiçoam a termoestabilidade do mu-tante básico 6.

As substituições D87R; N122K; S124K; S146G; V298L e L386Fapresentam efeitos bastante fortes sobre aperfeiçoamentos na termoestabi-lidade.

Exemplo 7Geração de mutantes com alta especificade de substratos a glicose emcomparação com maltose e aperfeiçoamento de afinidade por glicose

In WO 02/34919 diversas trocas de aminoácidos em diferentesposições de s-GDH foram identificadas e mostradas acentuar a especificida-de de substratos a glicose em comparação com, por exermplo, maltose.Combinações da troca de aminoácido T348G com substituições de aminoá-cidos em outras posições, por exemplo, nas posições 169, 171, 245, 341e/ou 349, aumentou a especificidade de substratos adicionalmente. Diversosmutantes de s-GDH diferentes com especificidade aperfeiçoada a glicose,mas em comparação com maltose, porém com particularmente uma baixaafinidade pelo substrato glicose, foram selecionados e tentativas foram feitaspara aperfeiçoar sua afinidade por glicose.

Como se sabe dos experimentos resumidos nas Tabelas 2 e 3,as substituições de aminoácidos L110H ou Υ; N229A, G ou S; Q246H, M ouΝ; Y333A; G339T; M341V; V349A ou G e V436P parecem apropriadas paraaumentar a afinidade de um mutante de s-GDH por glicose. Efeitos mais in-tensos sobre afinidade são observados com os mutantes L110H, Q246H;G339T; M341V; V349G e V436P. Aperfeiçoamentos de afinidade adicional-mente fortes foram verificados com as trocas de aminoácidos Q246H,M341V; V349G e V436P. Mutações pontuais são introduzidas em mutantesjá existentes pela mesma estratégia como já exemplificado no Example 6,portanto, aqui apenas os primers específicos às substituições Q246H sãodados.

Fita sentido 5'- GGTAAATTATTGCAGTCTGATCATGGCCC -3' (ID SEQ NO: 20)

Fita anti-sentido 5'- GGGCCATGATCAGACTGCAATAATTTACC -3' (ID SEQ: NO: 21)

A determinação de afinidade por glicose via classificação damedição dos valores de Km como descrito no Exemplo foi realizada. O valorde Km aparente foi calculado dos gráficos de diferentes concentrações desubstrato versus atividade da enzima.

A atividade específica foi aprimorada como descrito no ExempleCombinações de trocas identificadas como apropriadas para a -perfeiçoar especificidade, afinidade e/ou estabilidade de substratos foramintroduzidads em s-GDH mutada com especificidade totalmente aperfeiçoa-da a glicose em comparação a maltose.

Tabela 5: Combinação de várias substituições de aminoácidos em mu-tantes de s-GDH com especificidade de substratos aperfeiçoada a gli-

<table>table see original document page 40</column></row><table>

Pode-se ver claramente que em todos os tipos de mutantes atroca de aminoácido adicional Q246H produziu um aumento de afinidade porglicose e um aperfeiçoamento em relação a atividade específica. O mutante6 apresenta as trocas de aminoácidos nas posições T348G, N122K, L169F,Y171G, E245D, M341V e uma inserção de prolina na posição 429 como omutante 13 e Q246H adicional. O mutante J apresenta as trocas de aminoá-cidos nas posições T348G, Y171G, E245D, M341V, N428P como o mutanteG e Q246H adicional.O mutante 22 apresenta as trocas de aminoácidos nas posiçõesT348G, N122K, S124K, L169F, Y171G, E245D, Q246H, M341V, L386F euma inserção de prolina na posição 429. O mutante 29 apresenta todas astrocas do mutante 22, exceto T348G, que é trocado por T348S, e resultouem um aperfeiçoamento de velocidade. Os mutantes 30 e 31 atingiram valo-res de Km ainda maiores para glicose trocando adicionalmente G339T eV436P.

Exemplo 8

Purificação de s-GDH do tipo selvagem ou variante e análise de ativi-dade enzimática e atividade específica, respectivamente

Células de E. coli compreendendo um vetor de expressão de s-GDH apropriado são crescidos (4 χ lêvedo-amp., 37°C), colhidos e ressus-pensos em tampão de fosfato de potássio, pH 7,0. Ruptura de células foirealizada por passagem em Prensa Francesa 70-90 MPa (700-900 bars).Após centrifugação, o sobrenadante foi aplicado em uma coluna de S-Sepharose (Amersham Pharmacia Biotec) equilibrada com 10 mM de tam-pão de fosfato de potássio, pH 7,0. Após lavagem, a s-GDH foi eluída usan-do um gradient salino de NaCI 0-1 M. As frações mostrando atividade de s-GDH foram reunidas, dialisadas contra tampão de fosfato de potássio, pH7,0, e re-cromatografadas em coluna de S-sepharose reequilibrada. As fra-ções ativas foram reunidas e submetidas a filtração em gel usando uma co-luna St/perdei® 200 (Amersham). As frações ativas foram reunidas e após,adição de CaCI2 (concentração final de 3 mM), armazenadas a -20°C.

Determinação de proteína foi realizada usando o Reagente deEnsaio Protéico No. 23225 da Pierce (curva de calibração com BSA, 30 min,37°C).

Para medição da atividade enzimática, as amostras de s-GDHforam diluídas em 1 mg de proteína/ml com pirrolquinolina quinona (PQQ)0,0556 mM; Hepes 50 mM; CaCI2 15 mM, pH 7,0, e incubadas a 25°C por 30minutos para reconstituição ou ativação.

Após ativação, amostras foram diluídas com Hepes 50 mM; Ca-Cl2 15 mM, pH 7,0, até aproximadamente 0,02 U/ml, e 50 μΙ de cada amostradiluída foram adicionados a 1.000 μΙ de uma solução tampão de citrato 0,2 M(pH 5,8; a 25°C) contendo 0,315 mg de (4-(dimetilfospinilmetil)-2-metil-pirazol-[1.5a]-imidazol-3-il)-(4-nitrossofenil)-amina (ver patente norte-ameri-cana US 5.484.708)/ml como mediador e 30 mM de açúcar.

Extinção a 620 nm é monitorada durante os primeiros 5 minutosa 25°C.

Uma unidade de atividade enzimática corresponde à conversãode 1 mMol de mediador/min sob as condições de ensaio acima.Cálculo:

Atividade volumétrica (U/ml) = (volume total * dE/min [U/ml]) : (ε * amostravolume * 1)

(ε = coeficiente de extinção; εβ2ο nm = 30[1 * mmol'1 * cm ~1]).Atividade específica (U/mg) = Atividade volumétrica, U/ml, dividida por con-centração de proteína, mg/ml, resulta em U/mg.

Os ensaios foram realizados com glicose e maltose (Merck, A-lemanha), respectivamente.

Resultados referentes a atividade enzimática, bem como a ativi-dade específica, foram incluídos nas Tabelas dadas nos Exemplos anterio-res.LISTAGEM DE SEQÜENCIAS

<110> Roche Diagnostics GmbHF. Hoffmarm La Roche AG

<120> Mutantes aperfeiçoados de glicose desidrogenase solúvel dependente depirrolquinolina quinona

<130> 23713 WO

<150> EP06007779

<151> 2006-04-13

<160> 21

<170> PatentIn versão 3.2

<210> 1

<211> 1362

<212> DNA

<213> Acinetobacter calcoaceticus

<220><221><222>

CDS

(1)..(1362)

<400> 1

gat gtt cct cta act cca tct caa ttt gct aaa gcg aaa tca gag aac

Asp Val Pro Leu Thr Pro Ser Gln Phe Ala Lys Ala Lys Ser Glu Asn

1 5 10 15

48

ttt gac aag aaa gtt att cta tct aat cta aat aag ccg cac gcg ttgPhe Asp Lys Lys Val Ile Leu Ser Asn Leu Asn Lys Pro His Ala Leu20 25 30

96

tta tgg gga cca gat aat caa att tgg tta act gag cga gca aca ggtLeu Trp Gly Pro Asp Asn Gln Ile Trp Leu Thr Glu Arg Ala Thr Gly35 40 45

144

aag att cta aga gtt aat cca gag tcg ggt agt gta aaa aca gtt tttLys Ile Leu Arg Val Asn Pro Glu Ser Gly Ser Val Lys Thr Val Phe50 55 60

192

cag gta cca gag att gtc aat gat gct gat ggg cag aat ggt tta ttaGln Val Pro Glu Ile Val Asn Asp Ala Asp Gly Gln Asn Gly Leu Leu65 70 75 80

240

ggt ttt gcc ttc cat cct gat ttt aaa aat aat cct tat ate tat attGly Phe Ala Phe His Pro Asp Phe Lys Asn Asn Pro Tyr Ile Tyr Ile85 90 95

288

tca ggt aca ttt aaa aat ccg aaa tct aca gat aaa gaa tta ccg aacSer Gly Thr Phe Lys Asn Pro Lys Ser Thr Asp Lys Glu-Leu Pro Asn100 105 110

336

caa acg att att cgt cgt tat acc tat aat aaa tca aca gat acg ctcGln Thr Ile Ile Arg Arg Tyr Thr Tyr Asn Lys Ser Thr Asp Thr Leu115 120 125

384

gag aag cca gtc gat tta tta gca gga tta cct tca tca aaa gac catGlu Lys Pro Val Asp Leu Leu Ala Gly Leu Pro Ser Ser Lys Asp His130 135 140

432cag tca ggt cgt ctt gtc att ggg cca gat caa aag att tat tat acg 480

Gln Ser Gly Arg Leu Val Ile Gly Pro Asp Gln Lys Ile Tyr Tyr Thr145 150 155 160

att ggt gac caa ggg cgt aac cag ctt gct tat ttg ttc ttg cca aat 528

Ile Gly Asp Gln Gly Arg Asn Gln Leu Ala Tyr Leu Phe Leu Pro Asn165 170 175

caa gca caa cat acg cca act caa caa gaa ctg aat ggt aaa gac tat 576

Gln Ala Gln His Thr Pro Thr Gln Gln Glu Leu Asn Gly Lys Asp Tyr180 185 190

cac acc tat atg ggt aaa gta cta cgc tta aat ctt gat gga agt att 624

His Thr Tyr Met Gly Lys Val Leu Arg Leu Asn Leu Asp Gly Ser Ile195 200 205

cca aag gat aat cca agt ttt aac ggg gtg gtt age cat att tat aca 672

Pro Lys Asp Asn Pro Ser Phe Asn Gly Val Val Ser His Ile Tyr Thr210 215 220

ctt gga cat cgt aat ccg cag ggc tta gca ttc act cca aat ggt aaa 720

Leu Gly His Arg Asn Pro Gln Gly Leu Ala Phe Thr Pro Asn Gly Lys225 230 235 240

tta ttg cag tet gaa caa ggc cca aac tet gac gat gaa att aac ctc 768

Leu Leu Gln Ser Glu Gln Gly Pro Asn Ser Asp Asp Glu Ile Asn Leu245 250 255

att gtc aaa ggt ggc aat tat ggt tgg ccg aat gta gca ggt tat aaa 816

Ile Val Lys Gly Gly Asn Tyr Gly Trp Pro Asn Val Ala Gly Tyr Lys260 265 270

gat gat agt ggc tat gct tat gca aat tat tca gca gca gcc aat aag 864

Asp Asp Ser Gly Tyr Ala Tyr Ala Asn Tyr Ser Ala Ala Ala Asn Lys275 280 285

tca att aag gat tta gct caa aat gga gta aaa gta gcc gca ggg gtc 912

Ser Ile Lys Asp Leu Ala Gln Asn Gly Val Lys Val Ala Ala Gly Val290 295 300

cct gtg acg aaa gaa tet gaa tgg act ggt aaa aac ttt gtc cca cca 960

Pro Val Thr Lys Glu Ser Glu Trp Thr Gly Lys Asn Phe Val Pro Pro305 310 315 320

tta aaa act tta tat acc gtt caa gat acc tac aac tat aac gat cca 1008Leu Lys Thr Leu Tyr Thr Val Gln Asp Thr Tyr Asn Tyr Asn Asp Pro325 330 335

act tgt gga gag atg acc tac att tgc tgg cca aca gtt gca ccg tca 1056Thr Cys Gly Glu Met Thr Tyr Ile Cys Trp Pro Thr Val Ala Pro Ser340 345 350

tet gcc tat gtc tat aag ggc ggt aaa aaa gca att act ggt tgg gaa 1104Ser Ala Tyr Val Tyr Lys Gly Gly Lys Lys Ala Ile Thr Gly Trp Glu355 360 365

aat aca tta ttg gtt cca tet tta aaa cgt ggt gtc att ttc cgt att 1152Asn Thr Leu Leu Val Pro Ser Leu Lys Arg Gly Val Ile Phe Arg Ile370 375 380

aag tta gat cca act tat age act act tat gat gac gct gta ccg atg 1200Lys Leu Asp Pro Thr Tyr Ser Thr Thr Tyr Asp Asp Ala Val Pro Met385 390 395 400

ttt aag age aac aac cgt tat cgt gat gtg att gca agt cca gat ggg 1248Phe Lys Ser Asn Asn Arg Tyr Arg Asp Val Ile Ala Ser Pro Asp Gly405 410 415

aat gtc tta tat gta tta act gat act gcc gga aat gtc caa aaa gat 1296Asn Val Leu Tyr Val Leu Thr Asp Thr Ala Gly Asn Val Gln Lys Asp420 425 430

gat ggc tca gta aca aat aca tta gaa aac cca gga tct ctc att aag 1344Asp Gly Ser Val Thr Asn Thr Leu Glu Asn Pro Gly Ser Leu Ile Lys435 440 445

ttc acc tat aag gct aag 1362

Phe Thr Tyr Lys Ala Lys450

<210> 2<211> 454<212> PRT

<213> Acinetobacter calcoaceticus<400> 2

Asp Val Pro Leu Thr Pro Ser Gln Phe Ala Lys Ala Lys Ser Glu Asn1 5 10 15

Phe Asp Lys Lys Val Ile Leu Ser Asn Leu Asn Lys Pro His Ala Leu20 25 30

Leu Trp Gly Pro Asp Asn Gln Ile Trp Leu Thr Glu Arg Ala Thr Gly35 40 45

Lys Ile Leu Arg Val Asn Pro Glu Ser Gly Ser Val Lys Thr Val Phe50 55 60

Gln Val Pro Glu Ile Val Asn Asp Ala Asp Gly Gln Asn Gly Leu Leu65 70 75 80

Gly Phe Ala Phe His Pro Asp Phe Lys Asn Asn Pro Tyr Ile Tyr Ile85 90 95

Ser Gly Thr Phe Dys Asn Pro Lys Ser* Thx Asp Lys Glu Leu Pro Asn100 105 110

Gln Thr Ile Ile Arg Arg Tyr Thr Tyr Asn Lys Ser Thr Asp Thr Leu115 120 125

Glu Lys Pro Val Asp Leu Leu Ala Gly Leu Pro Ser Ser Lys Asp His130 135 140

Gln Ser Gly Arg Leu Val Ile Gly Pro Asp Gln Lys Ile Tyr Tyr Thr145 150 155 160

Ile Gly Asp Gln Gly Arg Asn Gln Leu Ala Tyr Leu Phe Leu Pro Asn165 170 175Gln Ala Gln His Thr Pro Thr Gln Gln Glu Leu Asn Gly Lys Asp Tyr180 185 190

His Thr Tyr Met Gly Lys Val Leu Arg Leu Asn Leu Asp Gly Ser Ile195 200 205

Pro Lys Asp Asn Pro Ser Phe Asn Gly Val Val Ser His Ile Tyr Thr210 215 220

Leu Gly His Arg Asn Pro Gln Gly Leu Ala Phe Thr Pro Asn Gly Lys225 230 235 240

Leu Leu Gln Ser Glu Gln Gly Pro Asn Ser Asp Asp Glu Ile Asn Leu245 250 255

Ile Val Lys Gly Gly Asn Tyr Gly Trp Pro Asn Val Ala Gly Tyr Lys260 265 270

Asp Asp Ser Gly Tyr Ala Tyr Ala Asn Tyr Ser Ala Ala Ala Asn Lys275 280 285

Ser Ile Lys Asp Leu Ala Gln Asn Gly Val Lys Val Ala Ala Gly Val290 295 300

Pro Val Thr Lys Glu Ser Glu Trp Thr Gly Lys Asn Phe Val Pro Pro305 310 315 320

Leu Lys Thr Leu Tyr Thr Val Gln Asp Thr Tyr Asn Tyr Asn Asp Pro325 330 335

Thr Cys Gly Glu Met Thr Tyr Ile Cys Trp Pro Thr Val Ala Pro Ser340 345 350

Ser Ala Tyr Val Tyr Lys Gly Gly Lys Lys Ala Ile Thr Gly Trp Glu355 360 365

Asn Thr Leu Leu Val Pro Ser Leu Lys Arg Gly Val Ile Phe Arg Ile370 375 380

Lys Leu Asp Pro Thr Tyr Ser Thr Thr Tyr Asp Asp Ala Val Pro Met385 390 395 400

Phe Lys Ser Asn Asn Arg Tyr Arg Asp Val Ile Ala Ser Pro Asp Gly405 410 415

Asn Val Leu Tyr Val Leu Thr Asp Thr Ala Gly Asn Val Gln Lys Asp420 425 430

Asp Gly Ser Val Thr Asn Thr Leu Glu Asn Pro Gly Ser Leu435 440 445Phe Thr Tyr Lys Ala Lys450

<210> 3<211> 4373<212> DNA<213> Artificial

<220>

<223> Vetor de seqüência pACSGDH<400> 3

cactaactga ttacgcaccg catgtaaccg ttttcaatct gtgagtaaat tcacagttta 60

ttaacattgt gatagctatg atgacaacgt ttgtcgcact gtaactaacg tgtaacagtt 120

agttgtcagt tttgctgggg tatttcgctt ataaaaaccg ttatcacaat atcccgcgac 180

taccggacaa aaataaagag ttgaataaga gcttatccca ttagggctat tttacttgcc 240

attttggacc tgggcagtgc tcgccaaaac gcgttagcgt tttgaacgcg ctagcggcgg 300

cccgaagggc gagcgtagcg agtcaaacct cacgtactac gtgtacgctc cggtttttgc 360

gcgctgtccg tgtccaaact gctgcgccaa taacgcctgg tgggataggc tctaaatacg 420

cttcggcgtt cagtaacacg cgttaacgtg ctgaacagcc gggcattttt ttacgctata 480

ccctacataa taaaaccgga gctaccatga ataagaaggt actgaccctt tctgccgtga 540

tggcaagtct gttattcggc gcgcacgcgc atgccgccga tgttcctcta actccatctc 600

aatttgctaa agcgaaatca gagaactttg acaagaaagt tattctatct aatctaaata 660

agccgcacgc gttgttatgg ggaccagata atcaaatttg gttaactgag cgagcaacag 720

gtaagattct aagagttaat ccagagtcgg gtagtgtaaa aacagttttt caggtaccag 780

agattgtcaa tgatgctgat gggcagaatg gtttattagg ttttgccttc catcctgatt 840

ttaaaaataa tccttatatc tatatttcag gtacatttaa aaatccgaaa tctacagata 900

aagaattacc gaaccaaacg attattcgtc gttataccta taataaatca acagatacgc 960

tcgagaagcc agtcgattta ttagcaggat taccttcatc aaaagaccat cagtcaggtc 1020

gtcttgtcat tgggccagat caaaagattt attatacgat tggtgaccaa gggcgtaacc 1080

agcttgctta tttgttcttg ccaaatcaag cacaacatac gccaactcaa caagaactga 1140

atggtaaaga ctatcacacc tatatgggta aagtactacg cttaaatctt gatggaagta 1200

ttccaaagga taatccaagt tttaacgggg tggttagcca tatttataca cttggacatc 1260

gtaatccgca gggcttagca ttcactccaa atggtaaatt attgcagtct gaacaaggcc 1320

caaactctga cgatgaaatt aacctcattg tcaaaggtgg caattatggt tggccgaatg 1380

tagcaggtta taaagatgat agtggctatg cttatgcaaa ttattcagca gcagccaata 1440

agtcaattaa ggatttagct caaaatggag taaaagtagc cgcaggggtc cctgtgacga 1500

aagaatctga atggactggt aaaaactttg tcccaccatt aaaaacttta tataccgttc 1560aagataccta caactataac gatccaactt gtggagagat gacctacatt tgctggccaa 1620

cagttgcacc gtcatctgcc tatgtctata agggcggtaa aaaagcaatt actggttggg 1680

aaaatacatt attggttcca tctttaaaac gtggtgtcat tttccgtatt aagttagatc 1740

caacttatag cactacttat gatgacgctg taccgatgtt taagagcaac aaccgttatc 1800

gtgatgtgat tgcaagtcca gatgggaatg tcttatatgt attaactgat actgccggaa 1860

atgtccaaaa agatgatggc tcagtaacaa atacattaga aaacccagga tctctcatta 1920

agttcaccta taaggctaag taatacagtc gcattaaaaa accgatctat aaagatcggt 1980

ttttttagtt ttagaaaaga attcactggc cgtcgtttta caacgtcgtg actgggaaaa 2040

ccctggcgtt acccaactta atcgccttgc agcacatccc cctttcgcca gctggcgtaa 2100

tagcgaagag gcccgcaccg atcgcccttc ccaacagttg cgcagcctga atggcgaatg 2160

gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc gcatatggtg 2220

cactctcagt acaatctgct ctgatgccgc atagttaagc cagccccgac acccgccaac 2280

acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt 2340

gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag 2400

acgaaagggc ctcgtgatac gcctattttt ataggttaat gtcatgataa taatggtttc 2460

ttagacgtca ggtggcactt ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt gtttattttt 2520

ctaaatacat tcaaatatgt atccgctcat gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata 2580

atattgaaaa aggaagagta tgagtattca acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt 2640

tgcggcattt tgccttcctg tttttgctca cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc 2700

tgaagatcag ttgggtgcac gagtgggtta catcgaactg gatctcaaca gcggtaagat 2760

ccttgagagt tttcgccccg aagaacgttt tccaatgatg agcactttta aagttctgct 2820

atgtggcgcg gtattatccc gtattgacgc cgggcaagag caactcggtc gccgcataca 2880

ctattctcag aatgacttgg ttgagtactc accagtcaca gaaaagcatc ttacggatgg 2940

catgacagta agagaattat gcagtgctgc cataaccatg agtgataaca ctgcggccaa 3000

cttacttctg acaacgátcg gaggaccgaa ggagctaacc gcttttttgc acaacatggg 3060

ggatcatgta actcgccttg atcgttggga accggagctg aatgaagcca taccaaacga 3120

cgagcgtgac accacgatgc ctgtagcaat ggcaacaacg ttgcgcaaac tattaactgg 3180

cgaactactt actctagctt cccggcaaca attaatagac tggatggagg cggataaagt 3240

tgcaggacca cttctgcgct cggcccttcc ggctggctgg tttattgctg ataaatctgg 3300

agccggtgag cgtgggtctc gcggtatcat tgcagcactg gggccagatg gtaagccctc 3360

ccgtatcgta gttatctaca cgacggggag tcaggcaact atggatgaac gaaatagaca 3420

gatcgctgag ataggtgcct cactgattaa gcattggtaa ctgtcagacc aagtttactc 3480

atatatactt tagattgatt taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat 3540cctttttgat aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtcagaccccgta gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg

ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagctaccaactctt tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgtcct

tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct

cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg

gttggactca agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc

gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga

gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg

cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta

tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg

ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg

ctggcctttt gctcacatgt tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat

taccgccttt gagtgagctg ataccgctcg ccgcagccga acgacggggc ccg

<210> 4<211> 29<212> DNA<213> Artificial

<220>

<223> primer<400> 4

catttgctgg ccaggggttg caccgtcat 29

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 5

atgacggtgc aacccctggc cagcaaatg 29

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<22 3> primer

36003660372037803840390039604020408041404200426043204373

<400> 6

ttaacgtgct gaacagccgg

20<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 7

atatgggtaa agtactacgc

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 8

cctataagaa aaagacagat acgctcg

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 9

cgagcgtatc tgtctttttc ttatagg

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 10

ttccatcctc gagagattgt caat

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 11

attgacaatc tctctgagga tggaa

<210> 12

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial

<220><223> primer

<400> 12

cgttatacct ataagaaaaa gacagatacg ctcg

34

<210> 13

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<22 3 > primer

<400> 13

cgagcgtatc tgtctttttc ttataggtat aacg 34

<210> 14

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<210> 15

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 15

cttctcgaga ccaccctgat ggtctttt 28

<210> 16

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<22 3 > primer

<210> 17

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 14

aaaagaccat cagggtggtc tcgagaag

28

<400> 16

gctcaaaatg gattaaaagt agccgca

27

<400> 17

tgcggctact ttatttccat tttgagc

27<210> 18

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223 > primer

<400> 18

ccgtattaag ttcgatccaa cttatagc

<210> 19

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer<400> 19

gctataagtt ggatcgaact taatacgg

<210> 20

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer<400> 20

ggtaaattat tgcagtctga tcatggccc

<210> 21

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223 > primer

<400> 21

gggccatgat cagactgcaa taatttacc

Claims (16)

1. Mutante de glicose desidrogenase solúvel dependente dePQQ (s-GDH; EC 1.1.5.2) com especificidade aperfeiçoada a glicose emcomparação com maltose, apresentando uma substituição de treonina naposição 348 por glicina, alanina ou serina, em que esse mutante adicional-mente compreende:a) pelo menos uma mutação para aperfeiçoar a estabilidadedo mutante,b) pelo menos uma mutação para aperfeiçoar a afinidade domutante a glicose, e, opcionalmente,c) uma ou mais mutações para aperfeiçoar adicionalmente aespecificidade do mutante a glicose em comparação commaltose, eem que essas posições correspondem às posições dos aminoácidos conhe-cidas da seqüência do tipo selvagem de s-GDH de A. calcoaceticus (ID SEQNO: 2).

2. Mutante de s-GDH, de acordo com a reivindicação 1, no quala mutação para aperfeiçoar a estabilidade é uma substituição de aminoáci-dos selecionada do grupo que consiste de L110H, Q246H; G339T; M341V;V349G e V436P.

3. Mutante de s-GDH, de acordo com a reivindicação 1, no quala mutação para aperfeiçoar a afinidade por glicose é selecionada do grupoque consiste de L110H ou Υ; N229A, G ou S; Q246H, M ou Ν; Y333A;G339T; M341V; V349A ou G e V436P.

4. Mutante de s-GDH, de acordo com a reivindicação 1, no quala mutação para aperfeiçoar a especificidade do mutante a glicose em com-paração com maltose é uma substituição de aminoácidos selecionada dogrupo que consiste de Q145P; D163G ou N; Q164F; L169F; Y171G; I208Lou V; T224I; E245D; G276S; A294D ou E; V300A, S, Ν, Y ou I; T307G;T323V; A354Y, E ou L; R378I, Μ, A ou D; N428P e inserção 429 P.

5. Mutante de s-GDH, de acordo com a reivindicação 2, no qualessa substituição para aperfeiçoamento da estabilidade é selecionada dogrupo que consiste de D87R; N122K; S124K; S146G; V298L e L386F.

6. Mutante de s-GDH, de acordo com a reivindicação 3, no qualessa substituição para aperfeiçoamento da afinidade a glicose é selecionadado grupo que consiste de L110H, Q246H; G339T; M341V; V349G e V436P.

7. Mutante de s-GDH, de acordo com a reivindicação 4, no qualessa substituição para aperfeiçoamento da especificidade do mutante a gli-cose em comparação com maltose é selecionada do grupo que consiste deL169F; Y171G; E245D; N428P e inserção 429P.

8. Polinucleotídeo isolado que codidica um mutante da proteínas-GDH de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 7.

9. Vetor de expressão que compreende um polinucleotídeo iso-lado como definido na reivindicação 8, operavelmente ligado a uma seqüên-cia promotora capaz de promover a expressão desse polinucleotídeo emuma célula hospedeira.

10. Célula hospedeira que compreende o vetor de expressão dareivindicação 9.

11. Processo para produzir mutantes de s-GDH, o qual compre-ende cultivar a célula hospedeira da reivindicação 10 sob condições ade-quadas para produção dos mutantes de enzima.

12. Vetor de expressão que compreende um polinucleotídeo iso-lado como definido na reivindicação 11, operavelmente ligado a uma se-qüência promotora capaz de promover sua expressão em um sistema desíntese peptídica sem células.

13. Processo para produzir mutantes de s-GDH com o construc-to da reivindicação 12 em um sistema de síntese peptídica sem células sobcondições adequadas para produção desses mutantes de enzima.

14. Método de detecção, determinação ou medição de glicoseem uma amostra usando um mutante de s-GDH de acordo com qualquerdas reivindicações 1 a 7, esse aperfeiçoamento compreendendo contatar aamostra com esse mutante.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizadoadicionalmente pelo fato de essa detecção, determinação ou medição deglicose é realizada usando um sensor ou dispositivo de fita de teste.

16. Dispositivo para a detecção ou medição de glicose em umaamostra que compreende um mutante de s-GDH de acordo com qualquerdas reivindicações 1 a 7 e outros reagentes exigidos para essa medição.