KR101168623B1 - 피롤로퀴놀린 퀴논 의존 가용성 글루코오스 탈수소효소의 개선된 돌연변이체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 348 위치의 트레오닌이 글리신, 알라닌 또는 세린 중 하나로 치환된 것으로서 말토오스와 비교하여 글루코오스에 대한 특이성이 향상된 PQQ-의존 가용성 글루코오스 탈수소효소 (s-GDH; EC 1.1.5.2) 의 돌연변이체를 개시하는데, 이 때 상기 돌연변이체는 부가적으로, 상기 돌연변이체의 안정성을 향상시키는 적어도 하나의 돌연변이 및 상기 돌연변이체의 글루코오스에 대한 친화력을 향상시키는 하나 이상의 돌연변이(들), 및/또는 말토오스와 비교하여 글루코오스에 대한 상기 돌연변이체의 특이성을 추가로 향상시키는 하나 이상의 돌연변이(들)을 포함하고, 348 위치는 A. 칼코아세티쿠스 s-GDH 야생형 서열로부터 공지된 아미노산 위치들에 대응한다. 또한 이러한 돌연변이체 s-GDH 를 인코딩하는 유전자, 및 이들 s-GDH 돌연변이체들의 상이한 용도, 특히 시료 중의 글루코오스의 농도를 결정하기 위한 용도가 개시된다.

PQQ, s-GDH, 돌연변이체, 글루코오스, A. 칼코아세티쿠스

Description

피롤로퀴놀린 퀴논 의존 가용성 글루코오스 탈수소효소의 개선된 돌연변이체 {IMPROVED MUTANTS OF PYRROLOQUINOLINE QUINONE DEPENDENT SOLUBLE GLUCOSE DEHYDROGENASE}

본 발명은, 348 위치의 트레오닌이 글리신, 알라닌 또는 세린 중 하나로 치환된 것으로 말토오스와 비교하여 글루코오스에 대한 특이성이 향상된 PQQ-의존 가용성 글루코오스 탈수소효소 (s-GDH; EC 1.1.5.2) 의 돌연변이체로서, 부가적으로 상기 돌연변이체의 안정성을 향상시키는 적어도 하나의 돌연변이 및 6탄당, 예컨대 바람직하게는 글루코오스에 대한 상기 돌연변이체의 친화력을 향상시키는 하나 이상의 돌연변이(들), 및/또는 말토오스와 비교하여 글루코오스에 대한 상기 돌연변이체의 특이성을 추가로 향상시키는 하나 이상의 돌연변이(들)를 포함하고, 이들 위치가 A. 칼코아세티쿠스 (A. calcoaceticus) s-GDH 야생형 서열로부터 공지된 아미노산 위치에 해당하는 돌연변이체에 관한 것이다. 또한 이와 같은 돌연변이체 s-GDH 를 인코딩하는 유전자, 및 이들 s-GDH 돌연변이체들의, 특히 시료 중의 글루코오스의 농도를 결정함에 있어서의, 상이한 용도들이 개시된다.

혈중 글루코오스 농도의 결정은 당뇨병의 임상 진단 및 관리에 있어서 극히 중요하다. 전세계적으로 대략 1억5천만명이 만성 질환인 당뇨병을 앓고 있는 데, WHO 에 따르면 그 수치는 2025 년에 2배가 될 수 있다. 당뇨병은 용이하게 진단 및 치료되지만, 성공적인 장기적인 관리를 위해서는 혈중 글루코오스 농도를 신속하고 정확하게 알려주는 저비용의 진단 도구가 필요하다. PQQ-의존성 글루코오스 탈수소효소 (EC 1.1.5.2) 는 글루코오스가 글루코노락톤으로 산화되는 반응을 촉매한다. 그 결과로, 상기 유형의 효소는 혈당을 측정하는데 사용된다. 이러한 도구 중 하나는 본래 아시네토박터 칼코아세티쿠스 (Acinetobacter calcoaceticus) 에서 유래한 피롤로퀴놀린 퀴논-포함 효소인 가용성 글루코오스 탈수소효소 (s-GlucDOR, EC 1.1.5.2) 에 기초한 진단 스트립 (diagnostic strip) 이다.

퀴노단백질 (quinoprotein) 은 퀴논을 보조인자로 사용하여 알콜, 아민 및 알도스 (aldose) 를 이들의 대응 락톤, 알데히드 및 알돌산 (aldolic acid) 으로 산화시킨다(Duine, J.A., Energy generation and the glucose dehydrogenase pathway in Acinetobacter, "The Biology of Acinetobacter" New York, Plenum Press (1991), pp. 295-312; Duine, J.A., Eur. J. Biochem. 200 (1991) 271-284; Davidson, V.L., in "Principles and applications of quinoproteins", the whole book, New York, Marcel Dekker (1993); Anthony, C., Biochem. J. 320 (1996) 697-711; Anthony, C. 및 Ghosh, M., Current Science 72 (1997) 716-727; Anthony, C., Biochem. Soc. Trans. 26 (1998) 413-417; Anthony, C. 및 Ghosh, M., Prog. Biophys. Mol. Biol. 69 (1998) 1-22). 퀴노단백질 중에서, 비공유적으로 결합된 보조인자 2,7,9-트리카르복시-1H-피롤로 [2,3-f]퀴놀린-4,5-디온 (PQQ) 을 가진 것은 가장 큰 하위군을 구성한다(Duine 1991, 상기 참조). 지금까지 알려진 모든 세균성 퀴논 글루코오스 탈수소효소는 PQQ 를 보조인자로 가진 상기 하위군에 속한다(Anthony 및 Ghosh 1997, 상기 참조; Goodwin, P.M. 및 Anthony, C., Adv. Microbiol. Physiol. 40 (1998) 1-80; Anthony, C., Adv. in Phot. and Resp. 15 (2004) 203-225).

2가지 유형의 PQQ-의존성 글루코오스 탈수소효소 (EC 1.1.5.2) 가 세균에서 특징분석되었다: 하나는 막-결합성이고(m-GDH); 다른 하나는 가용성이다(s-GDH). 두 유형 모두 어떠한 유의미한 서열 상동성을 공유하지 않는다(Cleton-Jansen, A.M., 등, Mol. Gen. Genet. 217 (1989) 430-436; Cleton-Jansen, A.M., 등, Antonie Van Leeuwenhoek 56 (1989) 73-79; Oubrie, A., 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (1999) 11787-11791). 이들은 또한 이들의 반응속도 및 면역학적 특성 모두에 있어서 상이하다(Matsushita, K., 등, Bioscience Biotechnol. & Biochem. 59 (1995) 1548-1555). 상기 m-GDH 는 그람-음성 세균에 광범위하게 존재하나, s-GDH 는, A. 칼코아세티쿠스(Duine, J.A., 1991a; Cleton-Jansen, A.M. 등, J. Bacteriol. 170 (1988) 2121-2125; Matsushita 및 Adachi, 1993) 및 A. 바우마니 (A. baumannii) (JP 11243949)와 같은 아시네토박터 계통의 주변세포질 공간에서만 유일하게 발견되었다.

서열 데이터베이스 검색을 통해, 전장 (full-length) A. 칼코아세티쿠스 s-GDH 에 상동인 2 개의 서열이 대장균 (E.coli) K-12 및 시네코시스티스 (Synechocystis) 종에서 동정되었다. 부가적으로, A. 칼코아세티쿠스 s-GDH 에 상동인 2 개의 불완전한 서열이 각각 P. 아에루기노사 (P. aeruginosa) 및 보르데텔라 페르투시스 (Bordetella pertussis) (Oubrie 등 1999 a, b, c) 및 엔테로박터 인테르메디움 (Enterobacter intermedium) (Kim, C.H. 등, Current Microbiol. 47 (2003) 457-461) 의 게놈에서 또한 발견되었다. 이들 4 개의 비(非)특징화 단백질들의 연역된 아미노산 서열은 A. 칼코아세티쿠스 s-GDH 와 밀접하게 관련되어 있으며, 추정상의 활성 부위의 다수의 잔기들은 완전히 보존되어 있다. 이들 상동 단백질들은 유사한 구조를 가지며 유사한 PQQ-의존성 반응들을 촉매할 가능성이 있다(Oubrie 등, 1999 a, b, c; Oubrie A., Biochim. Biophys. Acta 1647 (2003) 143-151; Reddy, S., 및 Bruice, T.C., J. Am. Chem. Soc. 126 (2004) 2431-2438; Yamada, M. 등, Biochim. Biophys. Acta 1647 (2003) 185-192).

세균의 s-GDH 및 m-GDH 는 전적으로 상이한 서열 및 상이한 기질 특이성을 갖는 것으로 나타났다. 예를 들어, A. 칼코아세티쿠스는 2 개의 상이한 PQQ-의존성 글루코오스 탈수소효소를 갖고 있는데, 하나는 m-GDH 로서 생체내에서 활성이며, 다른 하나는 s-GDH 로서 시험관내에서만 활성을 나타낼 수 있다. Cleton-Jansen 등 (1988; 1989 a, b) 은 상기 두 GDH 효소들을 코딩하는 유전자를 클로닝하고, 이들 GDH 유전자 둘 다의 DNA 서열을 결정하였다. m-GDH 및 s-GDH 간에 명백한 상동성은 존재하지 않는데, 이는 m-GDH 및 s-GDH 가 2 개의 완전히 상이한 분자를 나타낸다는 사실을 확증한다(Laurinavicius, V., 등, Biologija (2003) 31-34).

A. 칼코아세티쿠스로부터의 s-GDH 의 유전자가 대장균에서 클로닝되었다. s-GDH 는 세포에서 생성된 후, 세포막을 통해 주변세포질 공간으로 이동한다(Duine, J.A., Energy generation and the glucose dehydrogenase pathway in Acinetobacter, in "The Biology of Acinetobacter", New York, Plenum Press (1991), pp. 295-312; Matsushita, K. 및 Adachi, O., Bacterial quinoproteins glucose dehydrogenase and alcohol dehydrogenase, in "Principles and applications of Quinoproteins", New York, Marcel Dekker (1993) pp. 47-63). A. 칼코아세티쿠스로부터의 본래적 s-GDH 와 같이, 대장균에서 발현된 재조합 s-GDH 는 동종이량체로서, 단량체당 1 개의 PQQ 분자 및 3 개의 칼슘 이온을 갖는다(Dokter, P. 등, Biochem. J. 239 (1986) 163-167; Dokter, P. 등, FEMS Microbiol. Lett. 43 (1987) 195-200; Dokter, P. 등, Biochem. J. 254 (1988) 131-138; Olsthoorn, A.J. 및 Duine, J.A., Arch. Biochem. Biophys. 336 (1996) 42-48; Oubrie, A., 등, J. Mol. Biol. 289 (1999) 319-333; Oubrie, A., 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 96 (1999) 11787-11791; Oubrie, A., 등, Embo J. 18 (1999) 5187-5194). s-GDH 는 광범위한 단당류 및 이당류를 대응 케톤으로 산화시키는데, 이들은 추가로 가수분해하여 알돈산 (aldonic acid) 으로 되며, 상기 s-GDH 는 또한 PMS (페나진 메토술페이트), DCPIP (2,6-디클로로페놀인도페놀), WB (Wurster's blue) 및 단쇄 유비퀴논, 예컨대 유비퀴논 Q1 및 유비퀴논 Q2 (Matsushita, K., 등, Biochem. 28 (1989) 6276-6280; Matsushita, K., 등, Antonie Van Leeuwenhoek 56 (1989) 63-72), 여러 인공 전자 수용체들, 예컨대 N-메틸페나조늄 메틸 술페이트 (Olsthoorn, A.J. 및 Duine, J.A., Arch. Biochem. Biophys. 336 (1996) 42-48; Olsthoorn, A.J. 및 Duine, J.A., Biochem. 37 (1998) 13854-13861) 및 전자전도성 중합체들 (Ye, L., 등, Anal. Chem. 65 (1993) 238-241) 에 전자를 제공할 수 있다. 글루코오스에 대한 s-GDH 의 고 특이적 활성(Olsthoorn, A.J. 및 Duine, J.A., (1996) 상기 참조) 및 이의 넓은 인공 전자 수용체 특이성의 관점에서, 상기 효소는 분석 용도, 특히 (바이오-)센서에서 사용하기에 또는 진단 용도에서의 글루코오스 측정을 위한 테스트 스트립에 알맞다(Kaufmann, N. 등, Development and evaluation of a new system for determining glucose from fresh capillary blood and heparinized blood in "Glucotrend" (1997) 1-16, Boehringer Mannheim GmbH; Woosuck, S. 등, Sensors and Actuators B 100 (2004) 395-402).

글루코오스 산화는 적어도 3 개의 전혀 다른 효소군에 의해, 즉, NAD/P-의존성 글루코오스 탈수소효소에 의해, 플라보단백질 (flavoprotein) 글루코오스 산화효소에 의해 또는 퀴노단백질 GDH 에 의해 촉매될 수 있다(Duine, J.A., Biosens. Bioelectronics 10 (1995) 17-23). 환원된 s-GDH 의 다소 느린 자가산화가 관찰되었는데, 이는 산소가 s-GDH 에 대한 매우 좋지 않은 전자 수용체임을 증명한다(Olsthoorn 및 Duine, 1996). s-GDH 는 환원된 퀴논으로부터의 전자를 PMS, DCPIP, WB 및 단쇄 유비퀴논, 예컨대 Q1 및 Q2 와 같은 매개체들에 효율적으로 전해줄 수 있지만, 산소에 직접 전자를 효율적으로 전해줄 수는 없다.

혈액, 혈청 및 소변 (예컨대, 당뇨병 환자로부터의 것) 중의 글루코오스 수준을 모니터하기 위한 종래의 테스트 스트립 및 센서는 글루코오스 산화효소를 이 용한다. 상기 효소의 성능은 산소 농도 의존성이다. 공기 중의 산소 농도가 상이한, 상이한 고도에서 글루코오스를 측정하면 그릇된 결과가 나올 수 있다. PQQ-의존성 글루코오스 탈수소효소의 주요한 이점은 이들의 산소 비(非)의존성이다. 이 중요한 특징은 예컨대, US 6,103,509 에서 논의되었는데, 여기서는 막-결합 GDH 의 일부 특징이 조사되었다.

당해 분야에 대한 중요한 공헌은 s-GDH 를 적절한 매개체와 함께 사용한 것이었다. s-GDH 에 기초한 검정 방법 및 테스트 스트립 장치는 US 5,484,708 에 상세히 개시되어 있다. 상기 특허에는 또한 글루코오스의 측정을 위한 검정의 구성 및 s-GDH-기반 테스트 스트립의 제조에 대한 상세한 정보가 담겨 있다. 상기 특허 및 인용된 문헌들에 기술된 방법은 본원에 참조 병합된다.

글루코오스 탈수소효소 활성을 가진 효소들에 대한 다양한 응용 방식에 대한 구체적인 정보를 가진 당해 분야에 관련된 기타 특허 또는 출원은 US 5,997,817; US 6,057,120; EP 0 620 283; 및 JP 11-243949-A 이다.

s-GDH 및 반응이 일어날 때 색 변화를 생성하는 지시자를 이용하는 시판 중인 시스템 (Kaufmann, 등, 1997, 상기 참조) 은 Roche Diagnostics GmbH 에 의해 배급되는 Glucotrend^® 시스템이다.

글루코오스 측정에서 PQQ 의존성 s-GDH 의 사용에 대한 상기 논의된 이점에도 불구하고, 단점이 또한 고려되어야 한다. 상기 효소는 m-GDH 와 비교하여 다소 넓은 기질 스펙트럼을 갖는다. 즉, s-GDH 는 글루코오스뿐 아니라 말토오 스, 갈락토오스, 락토오스, 만노오스, 자일로오스 및 리보오스를 포함하는 여러 다른 당들도 산화시킨다(Dokter 등 1986 a; Oubrie A., Biochim. Biophys. Acta 1647 (2003) 143-151). 글루코오스 이외의 당에 대한 반응성은 일부 경우 혈중 글루코오스 수치 측정의 정확성을 손상시킬 수 있다. 특히, 이코덱스트린 (글루코오스 중합체) 이 처치된 복막 투석 중의 환자들은, 고수준의 다른 당, 특별히 말토오스가 이들의 체액 중에, 예컨대, 혈액 중에 함유되어 있을 수 있다(Wens, R., 등, Perit. Dial. Int. 18 (1998) 603-609).

따라서, 예컨대 당뇨병 환자들, 특별히 신장 합병증이 있는 환자들 및 특별히 투석 중인 환자들로부터 수득한, 임상 시료들은 유의미한 수준의 다른 당, 특별히 말토오스를 함유할 수 있다. 이러한 중환자들로부터 수득한 시료 내의 글루코오스 측정은 말토오스에 의해 손상될 수 있다(Frampton, J.E. 및 Plosker, G.L., Drugs 63 (2003) 2079-2105).

변경된 기질 특이성을 가진 변형 PQQ-의존성 s-GDH 를 제조하려는 시도가 문헌에 몇몇 보고되어 있다. Igarashi, S., 등 (Biochem. Biophys. Res. Commun. 264 (1999) 820-824) 은, Glu277 위치에 점돌연변이를 도입함으로써 변경된 기질 특이성 프로필을 가진 돌연변이체가 생성된다고 보고한다.

Sode (EP 1 176 202) 는 s-GDH 내의 특정 아미노산 치환에 의해 글루코오스에 대해 향상된 친화력을 가진 돌연변이 s-GDH 가 생성된다고 보고한다. EP 1 167 519 에서는, 동일 저자가 안정성이 향상된 돌연변이 s-GDH 에 대해 보고한다. 또한, 동일 저자는 JP2004173538 에서 글루코오스에 대한 친화력이 향상된 다른 s-GDH 돌연변이체에 대해 보고한다.

Kratzsch, P. 등 (WO 02/34919) 은, s-GDH 의 특정 위치에서의 아미노산 치환에 의해 다른 당 기질과 비교하여, 특별히 말토오스와 비교하여 글루코오스에 대한 s-GDH 의 특이성이 향상될 수 있다는 것을 보고한다. 중심적이고도 결정적인 것은 아미노산 348 위치에서의 치환이다. 돌연변이 s-GDH, 예를 들어 348 위치에서 야생형 s-GDH 에서 존재하는 트레오닌 대신 글리신을 가진 것은, 예컨대 기질 말토오스와 비교하여, 기질 글루코오스에 대해 대단히 향상된 선택성을 갖는다. 이들은 또한 348 및 428 위치에서 치환을 갖는 이중 돌연변이체가 글루코오스에 대해 더욱 더 향상된 특이성을 갖는다는 것을 개시한다.

WO 2006/008132 에서는, s-GDH 의 428 및 429 아미노산들 사이의 아미노산 삽입은, 특별히 348 위치에서의 적절한 아미노산 치환과 조합시, 기질 특이성에 상당히 유리한 효과를 갖는 것이 제시되어 있다. 상기 삽입을 가진 돌연변이체는 예를 들어 기질인 말토오스와 비교하여 기질 글루코오스에 대해 더욱 특이적이다.

그러나, 글루코오스 특이성에 대해 상당한 일부의 향상이 보고되었지만, 그러한 향상은 빈번하게 및 불행히도 예컨대 그러한 변이된 s-GDH 의 안정성 감소, 활성 감소 및/또는 글루코오스에 대한 친화력 감소와 같은 단점들이 따르는 것으로 보인다. 예를 들어, 348 위치에 아미노산 치환을 가진 s-GDH 돌연변이체의 향상된 특이성은 야생형 효소와 비교하여 상기 돌연변이체의 안정성, 친화력 및 활성의 손실을 요한다는 것이 명백해졌다.

따라서 글루코오스에 대한 높은 특이성을 가지며 동시에 합당한 열 안정성, 및 글루코오스에 대한 특이 활성 또는 친화력의 향상을 특징으로 하는, 또는 글루코오스에 대한 특이 활성 및 친화력 모두의 향상을 특징으로 하는 s-GDH 의 더욱 개선된 돌연변이체에 대한 요구 및 임상적 필요성이 크게 존재한다.

본 발명의 과제는 348 위치에서의 치환을 가진 향상된 특이성을 가진 돌연변이체와 비교하여 글루코오스에 대한 친화력, 특이 활성 및 열 안정성이 유의미하게 향상된 새로운 s-GDH 의 돌연변이체 또는 변형체 (variant) 를 제공하는 것이었다.

첨부된 청구항에 제시된 바의 위치들에서의 돌연변이들을 선별함으로써 348 위치에서의 치환을 가진 s-GDH 돌연변이체의 열 안정성, 글루코오스에 대한 특이 활성 및 친화력을 유의미하게 향상시키는 것이 가능하다는 것을 발견하였다.

새로운 형태의 s-GDH 의 향상된 특성들로 인해, 다양한 응용 분야에서 글루코오스 측정에 있어서의 유의미한 기술적 진보가 가능하다. 본 발명에 따른 향상된 s-GDH 돌연변이체는, 예를 들어 생물학적 시료 중에서의 글루코오스의 특이적 검출 또는 측정에 있어서 크게 이롭게 사용될 수 있다.

본 발명은 s-GDH 의 돌연변이체에 관한 것이다. 348 위치의 트레오닌이 글리신, 알라닌 또는 세린 중 하나로 치환된 것으로 말토오스와 비교하여 글루코오스에 대해 향상된 특이성을 갖는 PQQ-의존 가용성 글루코오스 탈수소효소 (s-GDH; EC 1.1.5.2) 의 돌연변이체로서, 부가적으로 상기 돌연변이체의 안정성을 향상시키는 적어도 하나의 돌연변이, 상기 돌연변이체의 글루코오스에 대한 친화력을 향상시키는 적어도 하나의 돌연변이, 및 임의로는 말토오스와 비교하여 글루코오스에 대한 상기 돌연변이체의 특이성을 추가로 향상시키는 하나 이상의 돌연변이(들)를 포함하고, 제시된 위치들은 A. 칼코아세티쿠스 s-GDH 야생형 서열 (서열번호: 2) 로부터 공지된 아미노산 위치에 해당하는 돌연변이체가 개시된다.

또한 s-GDH 돌연변이체 단백질을 인코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드, 숙주 세포에서 상기 폴리뉴클레오티드의 발현을 촉진할 수 있는 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된 상기 분리된 폴리뉴클레오티드를 포함한 발현 벡터 및 상기 발현 벡터를 포함한 숙주 세포가 개시된다.

또한, s-GDH 돌연변이체의 제조에 적합한 조건 하에서 적절한 발현 벡터로 트랜스펙션된 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는 s-GDH 돌연변이체의 제조 방법이 기술된다.

또한, 본 발명에 따른 개선된 s-GDH 돌연변이체를 사용하여 시료 중의 글루코오스를 검출, 결정 또는 측정하는 방법으로서, 상기 향상이 상기 시료를 상기 돌연변이체에 접촉시키는 것을 포함하는 방법이 개시된다.

또한 시료 중의 글루코오스의 검출 또는 측정을 위한 장치로서 본 발명에 따른 개선된 s-GDH 돌연변이체 및 상기 측정에 필요한 기타 시약들을 포함한 장치가 기술된다.

발명의 상세한 설명

제 1 구현예에서, 본 발명은, 348 위치의 트레오닌이 글리신, 알라닌 또는 세린 중 하나로 치환되어 말토오스와 비교하여 글루코오스에 대한 특이성이 향상된 PQQ-의존 가용성 글루코오스 탈수소효소 (s-GDH; EC 1.1.5.2) 의 돌연변이체로서, 그의 안정성을 향상시키는 적어도 하나의 돌연변이를 포함하고, 부가적으로 그의 글루코오스에 대한 친화력을 향상시키는 적어도 하나의 돌연변이, 및 임의로는 말토오스와 비교하여 글루코오스에 대한 그의 특이성을 추가로 향상시키는 하나 이상의 돌연변이(들)를 포함하고, 제시된 위치들은 A. 칼코아세티쿠스 s-GDH 야생형 서열 (서열번호: 2) 로부터 공지된 아미노산 위치에 대응하는 돌연변이체에 관한 것이다.

WO 02/34919 에 기재된 바와 같이, A. 칼코아세티쿠스로부터 분리한 야생형 서열에 대응하는 s-GDH 서열의 348 위치의 아미노산의 치환은 s-GDH 의 글루코오스 특이성을 유의미하게 향상시키는데 사용될 수 있다. 이는 본 발명의 테두리에서 기술된 향상이 모두 348 위치에서의 아미노산 치환을 가진 s-GDH 돌연변이체를 기술하고 그에 기초하는 이유이다. 바람직하게는 348 위치의 트레오닌 잔기는 알라닌, 글리신, 및 세린으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 잔기로 치환된다. 더욱 바람직한 구현예에서는 348 위치에서 트레오닌을 대신하는 데에 글리신 또는 세린이 사용된다. 용어 T348G 는 당업자에게 공지되어 있는 것으로, 348 위치의 트레오닌이 글리신으로 대체된 것을 나타낸다.

본원에서 상기 논의한 바와 같이, 글루코오스 탈수소효소 활성을 가진 2 개의 완전히 상이한 퀴노단백질 효소 유형 (막 결합성 및 가용성) 은 EC 1.1.5.2 하에 함께 분류된다. 이들 두 유형은 서로 관련되지 않은 것으로 보인다.

본 발명의 목적을 위해서는, 가용성 형태의 GDH (s-GDH) 만이 관련성 있으며, 이의 개선된 돌연변이체가 본원의 이하에서 논의된다.

가용성 PQQ-의존성 글루코오스 탈수소효소의 야생형 DNA-서열이 아시네토박터 계통으로부터 분리될 수 있다는 것은 당업계에 공지되어 있다. 가장 바람직한 것은 아시네토박터 칼코아세티쿠스-유형 계통 LMD 79.41 로부터 s-GDH 를 분리하는 것이다. 상기 야생형 s-GDH 의 폴리펩티드 서열 (성숙 단백질) 은 서열번호: 2 에 제시되어 있으며, 그의 DNA 서열은 서열번호: 1 에 각각 제시되어 있다. 아시네토박터의 다른 LMD 계통은 또한 야생형 s-GDH 의 원천으로서 사용될 수 있다. 이러한 서열은 A. 칼코아세티쿠스로부터 수득한 서열에 정렬시켜, 서열 비교를 행할 수 있다. 예를 들어 대장균 K-12 에 대해 기술된 바와 같이, 다른 세균 계통의 DNA-라이브러리들을 스크리닝하는 것(Oubrie, A., 등, J. Mol. Biol. 289 (1999) 319-333) 및 그러한 게놈 내에서 s-GDH 와 관련된 서열을 동정하는 것 또한 실현가능성 있는 것으로 보인다. 이러한 서열 및 아직 동정되지 않은 상동 서열은 열 안정성이 향상된 s-GDH 돌연변이체를 생성하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 성과는 아시네토박터 칼코아세티쿠스-유형 계통 LMD 79.41 에서 분리한 s-GDH 의 야생형 서열인 서열번호: 2 로부터 공지된 아미노산 위치를 언급하여 매우 상세히 기술된다. 서열번호: 2 의 위치들에 대응하는 상이한 s-GDH 분리체들의 아미노산 위치는 적절한 서열 비교에 의해 용이하게 확인된다.

서열번호: 2 의 야생형 서열과 s-GDH 서열의 다중 정렬 및 비교는 바람직하게는 GCG 패키지 버전 10.2 의 PileUp 프로그램 (Genetics Computer Group, Inc.) 으로 수행된다. PileUp 는 문헌 [Feng, D. F. 및 Doolittle, R. F., J. Mol. Evol. 25 (1987) 351-360] 의 점진 정렬 방법을 단순화한 것을 사용하여 다중 서열 정렬을 생성하며, 그에 따라 동일, 유사 또는 상이한 아미노산 잔기들에 대한 점수 행렬이 정의된다. 이 방법은 2 개의 정렬된 서열들의 집단 (cluster) 을 생성하는 2 개의 가장 유사한 서열들의 쌍 (pair wise) 정렬로 시작한다. 상기 집단은 그 후 정렬된 서열들 중 다음으로 가장 관련된 서열 또는 집단과 정렬될 수 있다. 2 개의 서열 집단들은 2 개의 개별 서열들의 쌍 정렬의 단순한 확장으로써 정렬될 수 있다. 마지막 정렬은 점점 더 유사하지 않은 서열 및 집단들을 포함하는 일련의 점진적인 쌍 정렬에 의해 수행되는데, 이는 모든 서열이 마지막 쌍 정렬에 포함될 때까지 수행된다. 이러한 방식으로, 서열번호: 2 에서 A. 칼코아세티쿠스 s-GDH 에 대해 제시된 위치들에 대응하는, 다른 상동인 s-GDH 분자들 내의 아미노산 위치들이 용이하게 밝혀질 수 있다. 이는 본원에 제시된 아미노산 위치들이 서열번호: 2 의 아미노산 위치들로서 또는 또 다른 상동인 s-GDH 분자에서의 그것에 대응하는 위치들로서 이해되어야 하는 이유이다.

본 발명의 맥락에서 용어 "돌연변이체" 또는 "변형체"는 서열번호: 2 에 제시된 야생형 아미노산 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 나타내는 s-GDH 단백질에 관련된 것이다.

본 발명의 s-GDH 돌연변이체가 서열번호: 2 의 s-GDH 로부터 45 개 이상의 아미노산이 상이하지 않다는 조건 하에서, 예컨대 총 45 개 이하의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 나타내는 조건 하에서, 상기 s-GDH 돌연변이체는 다른 치환 및/또는 결실 및/또는 삽입을 포함할 수 있다.

용어 "안정성을 향상시키는 돌연변이"란 단기 온도 스트레스 모델에서 s-GDH 돌연변이체의 열 안정성을 향상시키는 임의의 아미노 치환 및/또는 결실 및/또는 삽입을 지칭한다.

상기 언급한 바와 같이, 글루코오스 특이성의 향상은 단지 및 주로 안정성 감소, 글루코오스에 대한 친화력 감소 또는 특이 활성 감소 또는 이들 불리한 특성들의 임의의 조합을 대가로 할 가능성이 있는 것으로 보인다.

본 발명에 따른 안정성은 상기와 같은 단기 스트레스 모델로 평가하고, 상기 모델에서 결정된 s-GDH 안정성을 열 안정성으로 언급한다. 열 안정성은 스트레스가 가해지지 않은 및 가해진 시료의 s-GDH 효소 활성을 측정함으로써 결정된다. 스트레스가 가해지지 않은 시료 활성을 100% 로 설정하여 스트레스 처리 후 잔존 활성을 백분율로 산출할 수 있다. 기질 특이성이 향상된 s-GDH 의 돌연변이체에 대해, 30 분간 64℃ 의 스트레스 조건을 선택하였다. 이 조건을 이용하면, 야생형 효소는 그의 본래의 활성의 약 80 % 가 남는 반면, 글루코오스에 대한 특이성이 향상된 대부분의 돌연변이체는 상기 단기 스트레스 모델에 적용된 후 그들의 초기 효소 활성의 10 % 이하만이 남는다.

바람직하게는 348 위치의 트레오닌이 글리신, 알라닌 또는 세린 중 하나로 치환된 s-GDH 변형체의 안정성을 향상시키는 돌연변이는 치환이다. 바람직하게는 상기 치환은 D87R; N122K; S124K; S146A 또는 G; L187F 또는 M; N267Y; V298L; T313D 및 L386F 로 이루어진 군에서 선택된다.

또한 바람직하게는 s-GDH 변형체의 안정성을 향상시키는 상기 치환은 D87R; N122K; S124K; S146G; V298L 및 L386F 로 이루어진 군에서 선택된다. 더욱 바람직한 구현예에서는 돌연변이된 s-GDH 에서 상기 돌연변이체의 안정성을 향상시키기 위해 2 개, 3 개 또는 4 개의 이들 치환들의 조합 또는 또한 바람직한 것으로서 이들 5 개 치환 모두의 조합이 사용된다.

바람직한 구현예에서 본 발명에 따른 s-GDH 돌연변이체는 A. 칼코아세티쿠스 야생형 s-GDH (서열번호: 2) 로부터 공지된 87 위치에 또는 상동 효소에서 상기 87 위치에 대응하는 위치에 아르기닌을 포함한다.

추가로 바람직한 구현예에서 본 발명에 따른 s-GDH 돌연변이체는 A. 칼코아세티쿠스 야생형 s-GDH (서열번호: 2) 로부터 공지된 122 위치에 또는 상동 효소에서 상기 위치 122 에 대응하는 위치에 리신을 포함한다.

추가로 바람직한 구현예에서 본 발명에 따른 s-GDH 돌연변이체는 A. 칼코아세티쿠스 야생형 s-GDH (서열번호: 2) 로부터 공지된 124 위치에 또는 상동 효소에서 상기 위치 124 에 대응하는 위치에 리신을 포함한다.

추가로 바람직한 구현예에서 본 발명에 따른 s-GDH 돌연변이체는 A. 칼코아세티쿠스 야생형 s-GDH (서열번호: 2) 로부터 공지된 146 위치에 또는 상동 효소에서 상기 146 위치에 대응하는 위치에 글리신을 포함한다.

추가로 바람직한 구현예에서 본 발명에 따른 s-GDH 돌연변이체는 A. 칼코아세티쿠스 야생형 s-GDH (서열번호: 2) 로부터 공지된 298 위치에 또는 상동 효소에서 상기 위치 298 에 대응하는 위치에 류신을 포함한다.

추가로 바람직한 구현예에서 본 발명에 따른 s-GDH 돌연변이체는 A. 칼코아세티쿠스 야생형 s-GDH (서열번호: 2) 로부터 공지된 386 위치에 또는 상동 효소에서 상기 386 위치에 대응하는 위치에 페닐알라닌을 포함한다.

s-GDH 의 6 개 위치, 즉, 87, 122, 124, 146, 298 및 386 위치는 열 안정성 측면에서 유의미한 향상을 이룩함에 있어 다소 중요하게 보이는 것으로 나타났다. 여기서 유의미하게 관련성 있는 것은 이들 치환이 이전에 글루코오스 특이성을 향상시키기 위해, 그러나 열 안정성 감소라는 대가를 치루면서 생성한 돌연변이체들의 열 안정성에 현저한 영향을 미치는 것으로 나타났다는 사실이다. 바람직한 구현예에서 본 발명에 따른 s-GDH 돌연변이체는 서열번호:2 의 87 위치에 아르기닌을, 122 및 124 위치에 리신을, 146 위치에 글리신을, 298 위치에 류신을, 및 386 위치에 페닐알라닌을, 또는 상동 s-GDH 가 사용된 경우 상기 위치들에 대응하는 위치에 상기 각각을 포함한다.

추가로 바람직한 구현예에서 본 발명은, 348 위치의 트레오닌이 글리신, 또는 알라닌 또는 세린으로 치환된 것으로서 말토오스와 비교하여 글루코오스에 대한 특이성이 향상된 PQQ-의존 가용성 글루코오스 탈수소효소 (s-GDH; EC 1.1.5.2) 의 돌연변이체로서, 부가적으로 상기 돌연변이체의 안정성을 향상시키는 적어도 하나의 돌연변이 및 상기 돌연변이체의 글루코오스에 대한 친화력을 향상시키는 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 돌연변이체에 관한 것이다.

기질에 대한 "친화력"이라는 용어는 당업계에 익히 알려져 있다. 이는 소위 Km-값으로서 mM 로 제시된다. 기질로서 글루코오스 또는 다른 당을 사용하여 s-GDH 의 친화력을 결정하는 다양한 방법은 당업계에 공지되어 있다(참조: Igarashi, S., 등, Biochem Biophys Res Commun 264 (1999) 820).

미정제 대장균 추출물을 이용하여 새로운 변형체들을 스크리닝함에 있어서, 생성되는 클론들에 대한 더욱 빠른 평가를 위해 Km-값에 대한 백분율 산출이 수행되었다. 후보 s-GDH 돌연변이체들의 글루코오스에 대한 친화력은 주지의 Michaelis-Menten-속도론에 따라 산출되었다.

본 발명에 따른 s-GDH 돌연변이체는 348 위치의 트레오닌이 글리신, 알라닌 또는 세린으로 치환된 돌연변이체와 비교하여 글루코오스에 대한 향상된 친화력을 갖는다. 바람직하게는 기질 글루코오스에 대한 친화력은 실시예 부분에서 상세히 기술된 바와 같이 결정된다.

바람직하게는 이미 348 위치의 트레오닌이 글리신, 알라닌 또는 세린으로 치환된 s-GDH 돌연변이체의 글루코오스에 대한 친화력 향상을 위한 하나 이상의 돌연변이는 L110H 또는 Y; N229A, G 또는 S; Q246H, M 또는 N; Y333A; G339T; M341V; V349A 또는 G 및 V436P 로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 치환이다.

A. 칼코아세티쿠스로부터 공지된 s-GDH 야생형 서열 (서열번호: 2) 의 110 위치에 대응하는 아미노산이 본 발명의 변형체에서 치환되는 경우, 천연적으로 존재하는 아미노산 류신을 히스티딘 및 티로신으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산으로 치환하는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는, 상기 110 위치에서의 치환을 히스티딘으로 한다.

A. 칼코아세티쿠스로부터 공지된 s-GDH 야생형 서열 (서열번호: 2) 의 229 위치에 대응하는 아미노산이 본 발명의 변형체에서 치환되는 경우, 천연적으로 존재하는 아미노산 아스파라긴을 알라닌, 글리신 및 세린으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산으로 치환하는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는, 상기 229 위치에서의 치환을 알라닌으로 한다.

A. 칼코아세티쿠스로부터 공지된 s-GDH 야생형 서열 (서열번호: 2) 의 349 위치에 대응하는 아미노산이 본 발명의 변형체에서 치환되는 경우, 천연적으로 존재하는 아미노산 발린을 알라닌 및 글리신으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산으로 치환하는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는, 상기 349 위치에서의 치환을 글리신으로 한다.

또한 바람직하게는, 글루코오스에 대한 친화력을 향상시키는 변이는 L110H, Q246H; G339T; M341V, V349G 및 V436P 로 이루어진 군에서 선택된다.

또한 바람직하게는, 글루코오스에 대한 친화력을 향상시키는 상기 치환이 Q246H; G339T; M341V 및 V349G 로부터 선택된다. 본 발명에 따른 바람직한 s-GDH 는 이들 치환 중 2 또는 3 개 또는 이들 4 개의 치환 모두를 포함한다.

추가로 바람직한 구현예에서, 348 위치의 트레오닌이 글리신, 알라닌 또는 세린 중 하나로 치환되고 안정성을 향상시키는 적어도 하나의 돌연변이를 갖는 것으로서 말토오스와 비교하여 글루코오스에 대한 특이성이 향상된 상기 기술한 s-GDH 돌연변이체는 부가적으로 말토오스와 비교하여 글루코오스에 대한 상기 돌연변이체의 기질 특이성을 향상시키는 하나 이상의 돌연변이(들)를 포함한다.

특정 용도에 있어서, 348 위치의 트레오닌이 글리신, 알라닌 또는 세린 중 하나로 치환된 것으로서 말토오스와 비교하여 글루코오스에 대한 특이성이 향상된 s-GDH 돌연변이체의 기질 특이성은 특정의 일상적인 용도에 있어서 충분하지 않을 수 있다.

특정 구현예에서는 348 위치에서의 상기 논의한 돌연변이에 더하여, 말토오스와 비교하여 글루코오스에 대한 상기 돌연변이체의 특이성을 추가로 향상시키는 하나 이상의 부가적인 돌연변이(들)를 포함하는 s-GDH 돌연변이체를 생성하는 것이 필요할 수 있다.

용어 "기질 특이성" 또는 "특이성"은 당업자에게 익히 알려져 있다.

기질 특이성 또는 교차-반응성을 산출하기 위해 한가지 용이한 방법은 기질로서 글루코오스를 이용하여 측정한 활성을 100 % 으로 하고 다른 선택된 당으로 측정한 활성을 상기 글루코오스 값과 비교하는 것이다. 간혹, 장황함을 피하기 위해, 한편으로 글루코오스를 및 다른 한편으로 선택된 다른 당 기질을 특별히 언급하지 않고 단순히 특이성이라는 용어를 사용한다.

당 분야의 전문가는 효소 활성의 비교는 명확한 검정 조건들을 사용하여 조사된 등몰 농도의 기질 분자들에서 가장 잘 이루어진다는 것을 인식할 것이다. 그렇지 않으면, 농도 차에 대한 보정이 이루어져야 한다.

기질 특이성(의 향상)을 평가하기 위해서는 표준화된 명확한 검정 조건들이 선택되어야 한다. 기질로서의 글루코오스 및 다른 선택된 당 기질들에 대한 s-GDH 의 효소 활성은 실시예 부분에서 기술된 바와 같이 측정한다.

글루코오스 또는 말토오스 각각에 대한 효소 활성 측정에 기초하여, 교차-반응성 (및 이의 향상) 을 평가한다.

말토오스에 대한 s-GDH (교차-) 반응성 (%) 은 하기와 같이 계산한다:

교차-반응성 [%] = (활성 말토오스/활성 글루코오스) x 100%.

상기 식에 따른 야생형 s-GDH 의 말토오스에 대한 (교차-) 반응성은 약 105% 로 결정되었다(WO 02/34919 참조).

특이성은 하기 식에 따라 계산된다:

신규한 s-GDH 돌연변이체의 특이성의 향상은, 348 위치의 트레오닌이 글리신, 알라닌 또는 세린 중 하나로 치환된 것으로서 말토오스와 비교하여 글루코오스에 대한 특이성이 향상된 s-GDH 돌연변이체와 비교할 때, 상기 계산에서 더 작은 값으로 인지된다.

당업자는 인식할 것이지만, 해당 무명수 (absolute number) 는 돌연변이체 내에 이미 존재하는 돌연변이의 수 및 종류에 의존할 것이다. 돌연변이체 내에 이미 존재하는 돌연변이의 수 및 종류는 돌연변이체 배경 (mutant back-ground) 으로 칭해질 수 있다. 임의의 신규한 돌연변이는 상기 돌연변이체 배경에 직접 비교하는 것이 최선이다.

바람직하게는 말토오스와 비교하여 글루코오스에 대한 기질 특이성을 추가로 향상시키는 변이는 Q145P; D163G 또는 N; Q164F; L169F; Y171G; I208L 또는 V; T224I; E245D; G276S; A294D 또는 E; V300A, S, N, Y 또는 I; T307G; T323V; A354Y, E 또는 L; R378I, M, A 또는 D; N428P 및 삽입 429 P 로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 치환이다. 용어 "삽입 429"는 서열번호:2 의 428 위치 및 429 위치 사이에 프롤린이 삽입되는 것을 나타내기 위해 사용된다.

A. 칼코아세티쿠스로부터 공지된 s-GDH 야생형 서열 (서열번호: 2) 의 169 위치에 대응하는 아미노산이 본 발명의 변형체에서 치환되는 경우, 천연적으로 존재하는 아미노산 류신을 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판으로 치환하는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 상기 169 위치에서의 치환을 페닐알라닌으로 한다.

A. 칼코아세티쿠스로부터 공지된 s-GDH 야생형 서열 (서열번호: 2) 의 171 위치에 대응하는 아미노산이 본 발명의 변형체에서 치환되는 경우, 천연적으로 존재하는 아미노산 티로신을 알라닌, 메티오닌, 글리신으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산으로 치환하는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 상기 171 위치에서의 치환을 글리신으로 한다.

A. 칼코아세티쿠스로부터 공지된 s-GDH 야생형 서열 (서열번호: 2) 의 245 위치에 대응하는 아미노산이 본 발명의 변형체에서 치환되는 경우, 천연적으로 존재하는 아미노산 글루탐산을 아스파르트산, 아스파라긴 또는 글루타민으로 치환하는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 상기 245 위치에서의 치환을 아스파르트산으로 한다.

A. 칼코아세티쿠스로부터 공지된 s-GDH 야생형 서열 (서열번호: 2) 의 341 위치에 대응하는 아미노산이 본 발명의 변형체에서 치환되는 경우, 천연적으로 존재하는 아미노산 메티오닌을 발린, 알라닌, 류신 또는 이소류신으로 치환하는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 상기 341 위치에서의 치환을 발린으로 한다.

348 위치에서의 치환을 이미 가진 s-GDH 변형체에 대해, 428 및 429 위치 사이에 아미노산, 바람직하게는 프롤린을 삽입하여 그의 기질 특이성을 추가로 향상시키는 것이 가능하다는 것이 또한 발견되었다.

또한 바람직하게는, 말토오스와 비교하여 글루코오스에 대한 기질 특이성을 향상시키는 부가적인 돌연변이는 L169F; Y171G; E245D; N428P 및 삽입 429P 로 이루어진 군에서 선택된다.

바람직하게는, 말토오스와 비교하여 글루코오스에 대한 기질 특이성을 향상시키는 부가적인 돌연변이는 L169F; Y171G; E245D; 및 N428P 로 이루어진 군에서 선택된다. 더욱 바람직한 구현예에서는 이러한 돌연변이체에 있어서 말토오스와 비교하여 글루코오스에 대한 이의 기질 특이성을 향상시키기 위해 2, 3 또는 4 개의 이들 치환 모두의 조합을 사용한다. 또한 바람직하게는, 말토오스와 비교하여 글루코오스에 대한 기질 특이성을 향상시키는 부가적인 돌연변이는 L169F; Y171G; E245D; 및 삽입 429P 로 이루어진 군에서 선택된다. 더욱 바람직한 구현예에서 말토오스와 비교하여 상기 돌연변이체의 글루코오스에 대한 기질 특이성을 향상시키기 위해, 돌연변이된 s-GDH 에서 2 또는 3 개의 모든 치환들의 조합을 상기 삽입 429 P 와 함께 사용한다.

WO 02/34919 및 WO 2006/008132 에 각각 기재된 바와 같이, 아스파라긴이 프롤린으로 대체된 428 위치에서의 치환 또는 428 및 429 위치 사이의 아미노산 프롤린의 삽입은 각각 348 위치에서의 치환을 이미 포함한 s-GDH 돌연변이체의 특이성을 추가로 향상시킨다. 추가로 바람직한 구현예에서 본 발명은 따라서 348 위치의 트레오닌이 글리신, 알라닌 또는 세린으로 치환되고, 또한 428 위치에서 아스파라긴이 프롤린으로 대체된 치환 또는 428 및 429 위치 사이에 아미노산 프롤린의 삽입을 갖는 것으로서 말토오스와 비교하여 글루코오스에 대한 특이성이 향상된 PQQ-의존 가용성 글루코오스 탈수소효소 (s-GDH; EC 1.1.5.2) 의 돌연변이체로서, 부가적으로 상기 돌연변이체의 안정성을 향상시키는 적어도 하나의 돌연변이, 상기 돌연변이체의 특이 활성을 향상시키는 적어도 하나의 돌연변이, 및 임의로는 상기 돌연변이체의 글루코오스에 대한 친화력을 향상시키는 하나 이상의 돌연변이(들), 및/또는 말토오스와 비교하여 글루코오스에 대한 상기 돌연변이체의 특이성을 추가로 향상시키는 하나 이상의 돌연변이(들)을 포함하고, 상기 제시된 위치들은 A. 칼코아세티쿠스 s-GDH 야생형 서열 (서열번호: 2) 로부터 공지된 아미노산 위치들에 대응하는 돌연변이체에 관한 것이다.

또 다른 구현예에서 본 발명은, 348 위치의 트레오닌이 글리신, 알라닌 또는 세린 중 하나로 치환된 것으로서 말토오스와 비교하여 글루코오스에 대한 특이성이 향상된 PQQ-의존 가용성 글루코오스 탈수소효소 (s-GDH; EC 1.1.5.2) 의 돌연변이체로서, 부가적으로 상기 돌연변이체의 안정성을 향상시키는 적어도 하나의 돌연변이 및 상기 돌연변이체의 특이 활성을 향상시키는 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 돌연변이체에 관한 것이다.

용어 "특이 활성"은 당업계에 익히 알려져 있다. 이는 단백질의 양에 대한 효소 활성을 기술하는데 사용된다. 기질로서 글루코오스 또는 다른 당을 사용하여 s-GDH 의 특이 활성을 결정하는 다양한 방법들이 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, Igarashi, S., 등, Biochem Biophys Res Commun 264 (1999) 820 참조). 본 발명에 따른 s-GDH 돌연변이체는 348 위치의 트레오닌이 글리신, 알라닌 또는 세린 중 하나로 치환된 돌연변이체와 비교하여 기질 글루코오스에 대한 향상된 특이 활성을 갖는다.

바람직하게는 글루코오스에 대한 특이 활성을 향상시키는 돌연변이는 H30F 또는 R; A301G 또는 S 및 A302S 또는 T 로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 치환이다.

당업자는 인식할 것이지만, s-GDH 의 특성에 유의미한 정도로 영향을 미치지 않는 아미노산 치환, 예컨대 침묵 돌연변이를 수행하는 것이 가능하다. 본 발명에 따른 변형체는, 그러나, 서열번호:2 와 비교하여 45 개 이하의 아미노산이 교체될 것이다. 바람직하게는, 상기 변형체는 20 개 이하 아미노산 치환을 포함하고, 더욱 바람직하게는, 단 15 개의 아미노산 치환 또는 보다 적은 치환이 존재할 것이다.

본 발명에 따른 일부 특정 s-GDH 변형체가 하기 실시예 부분에서 제시된다. 글루코오스 간섭이 낮고 열 안정성 및 글루코오스에 대한 기질 친화력에 있어서 향상된 특징을 갖는 바람직한 s-GDH 변형체는 하기 치환들을 갖는 돌연변이체를 포함한다:

당업계에는 돌연변이체 단백질을 제조하는 수많은 가능성들이 알려져 있다. 돌연변이 s-GDH 의 열 안정성, 글루코오스에 대한 친화력 및 기질 특이성을 향상시키는 특정 잔기들의 결정적인 중요성을 개시하는 본 발명의 중요한 발견들에 기초하여, 당업자는 이제 이들 및 기타 유리한 변형을 가진 더욱 적절한 변형체들을 용이하게 제조할 수 있다. 이러한 변형체들은 예를 들어 무작위 돌연변이유발 (Leung, D. W., 등, Technique 1 (1989) 11-15) 및/또는 부위 지정 돌연변이유발 (Hill, D. E., 등, Methods Enzymol. 155 (1987) 558-568) 로 알려진 방법들에 의해 수득할 수 있다. 상기 목적하는 특성들을 가진 단백질을 제조하는 대안적인 방법은 적어도 2 개의 상이한 원천들로부터의 서열 요소들을 포함하는 키메라 구조체를 제공하는 것, 또는 적절한 s-GDH 유전자를 순전히 합성하는 것이다. 당업계에 공지된 이러한 방법들은, 예컨대 상기 공지된 결정적으로 중요한 서열번호: 2 의 348 위치에서의 치환과 병행하여 부가적인 아미노산 치환을 포함한 s-GDH 의 돌연변이체 또는 변형체를 제공하는 본 발명에 개시된 정보와 조합하여 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 s-GDH 변형체는 예컨대, 아시네토박터 칼코아세티쿠스-유형 계통 LMD 79.41 로부터 분리한 s-GDH 유전자로부터 출발함으로써뿐 아니라 상동 서열로부터 출발함으로써도 제조할 수 있다. 본 출원의 맥락에서 용어 "상동"은 서열번호: 2 와 비교하여 적어도 90 % 동일성을 가진 s-GDH 아미노산 서열을 포함하는 것을 의미한다. 즉, PileUp 프로그램을 이용한 적절한 정렬 후, 이러한 상동 s-GDH 의 아미노산 중 적어도 90 % 가 서열번호: 2 에 기재된 아미노산들과 동일하다.

DNA 및 아미노산 서열들의 변이가 천연적으로 존재하거나, 또는 당업계에 공지된 방법들을 사용하여 의도적으로 도입될 수 있다는 것은 자명할 것이다. 이들 변이들은 상기 서열 내의 하나 이상의 아미노산 잔기들의 결실, 치환, 삽입, 역위 또는 부가로 인해 서열번호: 2 와 비교하여 전체 서열 중 10 % 이하의 아미노산 차이를 일으킬 수 있다. 이러한 아미노산 치환은, 예를 들어, 관련 잔기들의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성에 있어서의 유사성을 기초로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 음으로 하전된 아미노산으로는 아스파르트산 및 글루탐산이 있고; 양으로 하전된 아미노산에는 리신 및 아르기닌이 있고; 친수성 수치가 유사한 하전되지 않은 극성 헤드 (head) 기 또는 비극성 헤드 기를 가진 아미노산에는 하기가 있다: 류신, 이소류신, 발린, 글리신, 알라닌, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 페닐알라닌, 및 티로신. 기타 고려되는 변이에는 상기 언급한 폴리펩티드들의 염 및 에스테르, 및 상기 언급한 폴리펩티드들의 전구체, 예를 들어, 리더 서열로 사용된 메티오닌, N-포르밀메티오닌과 같은 N-말단 치환을 가진 전구체가 포함된다. 이러한 변이는 본 발명의 범위 및 정신을 필연적으로 벗어나지 않으면서 이루어질 수 있다.

당업계의 상황에서 공지된 절차에 따라 또는 하기 실시예 부분에서 제시된 절차에 따라, 상기 논의된 바의 s-GDH 돌연변이체 중 임의의 것을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 수득하는 것이 가능하다. 따라서 본 발명은 또한 상기 기술된 바의 본 발명에 따른 s-GDH 돌연변이체 단백질들을 인코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드 서열들을 포함한다.

본 발명에는 또한 숙주 세포 내에서 이의 발현을 지도할 수 있는 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된 본 발명에 따른 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터가 포함된다.

본 발명에는 또한 숙주 세포 내에서 이의 발현을 지도할 수 있는 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된 본 발명에 따른 핵산 서열을 포함한 발현 벡터가 포함된다. 바람직한 벡터는 도 2 및 3 에 나타난 pACSGDH 와 같은 플라스미드이다.

본 발명에서 유용한 발현 벡터는 전형적으로 복제원점, 선별을 위한 항생제 내성, 발현을 위한 프로모터 및 상기 s-GDH 유전자 변형체의 전체 또는 일부를 포함한다. 상기 발현 벡터는 또한 신호 서열과 같은 당업계에 공지된 다른 DNA 서열들 (더욱 양호한 접힘 (folding), 주변세포질로의 수송 또는 분비를 위한 것), 상기 발현에 대한 더욱 양호한 조절을 위한 유도물질, 또는 클로닝을 위한 절단 부위를 포함할 수 있다.

상기 선택된 발현 벡터의 특징들은 이용될 숙주 세포에 대해 융화될 수 있는 것이어야 한다. 예를 들어, 대장균 세포 시스템 내에서 클로닝시, 상기 발현 벡터는 대장균 세포의 게놈에서 분리한 프로모터 (예컨대, lac, 또는 trp) 를 포함하여야 한다. ColE1 플라스미드 복제원점과 같은 적당한 복제원점들을 사용할 수 있다. 적당한 프로모터에는, 예를 들어, lac 및 trp 이 있다. 또한 상기 발현 벡터가 항생제 내성 유전자와 같은 선별 마커를 코딩하는 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 선별가능 마커로는, 암피실린 저항성, 또는 카나마이신 저항성이 통상 이용될 수 있다. 이들 물질들은 모두 당업계에 공지되어 있으며, 시중에서 구입가능하다.

목적하는 코딩 및 조절 서열들을 가진 적당한 발현 벡터는 당업계에 공지된 표준 재조합 DNA 기법을 이용하여 구축할 수 있는데, 이 중 다수가 문헌 [Sambrook 등, in "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (1989) Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press] 에 기재되어 있다.

본 발명은 부가적으로 상기 돌연변이체 s-GDH 의 전부 또는 일부를 코딩하는 DNA 서열을 포함한 발현 벡터를 가진 숙주 세포에 관한 것이다. 상기 숙주 세포는 바람직하게는 실시예 2-8 에 나타난 하나 이상의 돌연변이를 가진 돌연변이체 s-GDH 를 코딩하는 DNA 서열 중 하나의 전부 또는 일부를 포함한 발현 벡터를 포함한다. 적당한 숙주 세포에는, 예를 들어, Promega (2800 Woods Hollow Road, Madison, WI, USA) 로부터 입수가능한 대장균 HB101 (ATCC 33694), Stratagene (11011 North Torrey Pine Road, La Jolla, CA, USA) 으로부터 입수가능한 XL1-Blue MRF' 등이 포함된다.

발현 벡터를 당업계에 공지된 다양한 방법으로 숙주 세포 내로 도입시킬 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터로의 숙주 세포의 형질전환은 폴리에틸렌 글리콜 매개 원형질체 형질전환 방법에 의해 실시할 수 있다(Sambrook 등 1989, 상기 참조). 그러나, 발현 벡터를 숙주 세포 내로 도입하는 기타 방법들, 예를 들어, 전기천공, 탄도 주입, 또는 원형질체 융합을 또한 이용할 수 있다.

s-GDH 변형체를 포함한 발현 벡터를 적절한 숙주 세포 내로 도입하면, 상기 숙주 세포를 목적하는 s-GDH 변형체의 발현을 허용하는 조건 하에서 배양시킬 수 있다. 돌연변이체 s-GDH 의 전부 또는 일부를 코딩하는 DNA 서열을 가진 목적 발현 벡터를 포함한 숙주 세포는 즉 항생제 선별에 의해 용이하게 밝혀낼 수 있다. s-GDH 변형체의 발현은 s-GDH mRNA 전사물의 제조 측정, 유전자 산물의 면역학적 검출 또는 상기 유전자 산물의 효소 활성의 검출과 같은 상이한 방법으로 확인할 수 있다. 바람직하게는 효소적 검정을 적용한다.

본 발명은 또한 s-GDH 돌연변이체의 생성 및 스크리닝을 교시한다. 당업계에 공지된 무작위 돌연변이유발 및 집중 돌연변이유발 (saturation mutagenesis) 을 수행한다. 변형체들을 열 안정성에 대해 스크리닝한다(열 스트레스 처리 부재시의 활성을 열 스트레스 처리 후 잔존 활성과 비교). 선택된 검정 조건들을, 예컨대, 단일 아미노산 치환에 의해서 야기된, 예상된 작은 향상들을 확실히 측정할 수 있도록 적합화한다. 적절한 돌연변이체에 대한 선별 또는 스크리닝의 한가지 바람직한 양식은 실시예 3 에 제시되어 있다. 상기 출발 효소 (돌연변이체 또는 야생형) 와 비교한 바 임의의 변화 또는 향상을 명확히 검출할 수 있다.

물론, 모든 발현 벡터 및 DNA 조절 서열이 본 발명의 DNA 서열을 발현함에 있어서 동등하게 만족스럽게 기능하는 것은 아님을 이해해야 한다. 또한 모든 숙주 세포가 상기 동일 발현 시스템과 함께 동등하게 만족스럽게 기능하지도 않을 것이다. 그러나, 당업계의 통상의 지식을 가진 자는 과도한 실험 없이도 본원에 제시된 안내에 따라 발현 벡터들, DNA 조절 서열들, 및 숙주 세포들 중에서 적절한 선택을 할 것이다.

본 발명은 또한 본 발명의 돌연변이체 s-GDH 의 제조에 적당한 조건 하에서 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는 본 발명의 s-GDH 변형체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 세균 숙주 세포에 있어서, 전형적인 배양 조건은 탄소 및 질소 공급원, 적절한 항생제 및 유도제 (사용된 발현 벡터에 좌우됨) 를 함유한 액체 배지이다. 전형적인 적절한 항생제로는 암피실린, 카나마이신, 클로로암페니콜, 테트라사이클린 등이 있다. 전형적인 유도제로는 IPTG, 글루코오스, 락토오스 등이 있다.

본 발명의 폴리펩티드는 돌연변이체 s-GDH 를 코딩하는 DNA 서열을 발현하는 숙주 세포에서 제조하여 수득하는 것이 바람직하다. 본 발명의 폴리펩티드는 또한 상기 돌연변이체 s-GDH 를 코딩하는 DNA 서열에 의해 인코딩되는 mRNA 의 시험관내 번역으로 수득할 수도 있다. 예를 들어, 상기 DNA 서열은 상기 기술한 바와 같이 합성하여 적당한 발현 벡터내로 삽입할 수 있고, 상기 벡터는 다시 시험관내 전사/번역 시스템에서 사용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 바람직한 구현예는, 상기 정의되고 기술된 바의 분리된 폴리뉴클레오티드를 포함하며 상기 폴리뉴클레오티드가 무세포 펩티드 합성 시스템에서 이의 발현을 촉진할 수 있는 프로모터 서열에 작동가능하게 연결되어 있는 발현 벡터이다.

예컨대 상기 기술한 절차들에 의해 제조된, 폴리펩티드를 그 후 분리하고, 다양한 일상적인 단백질 정제 기법을 사용하여 정제할 수 있다. 예를 들어, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피 및 친화 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피적 절차들을 이용할 수 있다.

본 발명의 개선된 s-GDH 변형체의 주요한 응용 중 하나는 당뇨병 환자들에서 혈중-글루코오스 수치를 모니터하는 테스트 스트립에서 사용하는 것이다. 상기 논의된 바와 같이, PQQ-의존성 글루코오스 탈수소효소의 산소에 대한 둔감함은, 글루코오스 산화효소에 대해 크게 유리한 점이다. 예컨대, 분석될 시료 내에 존재할 수 있는 말토오스, 갈락토오스, 및/또는 기타 관련 당에 기인한 간섭은, 이제 열 안정성 및 글루코오스에 대한 특이성이 모두 향상된 신규한 s-GDH 변형체를 사용하면 현저하게 감소될 수 있다. 물론 많은 종류의 시료가 조사될 수 있다. 이러한 시료들에 대한 바람직한 공급원은 혈청, 혈장, 장액 또는 소변과 같은 체액이다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 s-GDH 돌연변이체를 사용하여 시료 중의 글루코오스를 검출, 결정 또는 측정하는 방법을 포함한다. 시료 중의 글루코오스의 검출을 위한 향상된 방법이 글루코오스에 대한 상기 검출, 결정 또는 측정을 센서 또는 테스트 스트립 장치를 사용하여 수행하는 것을 특징으로 하는 것이 특별히 바람직하다.

또한 시료 중의 글루코오스의 검출 또는 측정을 위한 장치로서 본 발명에 따른 s-GDH 돌연변이체뿐 아니라 상기 측정에 필요한 기타 시약들을 포함하는 장치도 본 발명의 범위 내에 있다.

열 안정성이 향상된 본 발명의 s-GDH 변형체는 또한 시료 또는 반응기 내의 글루코오스에 대한 온라인 모니터링을 위한 바이오센서에서 크게 유리하게 사용될 수 있다(D'Costa, E.J., 등, Biosensors 2 (1986) 71-87; Laurinavicius, V., 등, Analytical Letters 32 (1999) 299-316; Laurinavicius, V., 등, Monatshefte fuer Chemie 130 (1999) 1269-1281; Woosuck, S. 등, Sensors and Actuators B 100 (2004) 395-402). 상기 목적을 위해, 상기 s-GDH 변형체를, 예를 들어, 상기 글루코오스 농도에 대한 더욱 정확한 결정을 위해 산소-둔감 유리질 전극을 산화환원 전도성 에폭시 네트워크를 함유한 오스뮴 착물로 코팅하는데 사용될 수 있다(Ye 등, 1993, 상기 참조).

하기 실시예에서, 모든 시약, 제한 효소 및 기타 물질들은, 다른 시중의 공급원에 대한 언급이 없는 한, Roche Diagnostics Germany 로부터 입수하였으며, 공급자에 의해 제공된 지시사항에 따라 이들을 사용하였다. DNA 의 정제, 특징분석 및 클로닝을 위해 이용된 조작 및 방법은 당업계에 익히 공지되어 있으며(Ausubel, F., 등, in "Current protocols in molecular biology" (1994) Wiley Verlag), 필요한 대로 당업자에 의해 적합화될 수 있다.

하기 실시예는 본 발명을 더욱 설명한다. 이들 실시예는 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 의도로 된 것이 아니라, 본 발명에 대한 추가의 이해를 제공하기 위한 것이다.

하기 실시예, 서열 목록 및 도면은 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 제공되며, 본 발명의 진정한 범위는 첨부된 청구항에 개시되어 있다. 본 발명의 정신을 벗어나지 않으면서 상기 개시된 절차들에 변형을 가할 수 있음은 물론이다.

도 1: 서열 상동성에 따라 정렬된 A. 칼코아세티쿠스 PQQ-의존성 s-GDH (상단) 및 A. 바우마니 s-GDH (하단) 의 단백질 서열들.

도 2: 가용성 PQQ-의존성 글루코오스 탈수소효소의 야생형 또는 돌연변이된 DNA 서열들을 각각 포함한 실시예 1 에 언급된 pACSGDH 벡터에 대한 도시.

도 3: 가용성 PQQ-의존성 글루코오스 탈수소효소의 야생형 DNA 서열을 포함한 실시예 1 에 언급된 pACSGDH 벡터의 뉴클레오티드 (DNA) 서열.

실시예 1

대장균에서 야생형 A. 칼코아세티쿠스 가용성 PQQ-의존성 글루코오스 탈수소 효소의 클로닝 및 발현

표준 절차에 따라 아시네토박터 칼코아세티쿠스 계통 LMD 79.41 로부터 상기 s-GDH 유전자를 분리하였다. 상기 야생형 s-GDH 유전자를, 조정가능 발현을 위한 mgl 프로모터를 포함한 플라스미드 내로 서브클로닝(subcloning)하였다(특허 출원 WO 88/09373 참조). 상기 새로운 구축물을 pACSGDH 로 칭하였다(도 2 및 3 및 서열번호: 3 참조). 상기 재조합 플라스미드를 상기 대장균 군에서 선택한 숙주 유기체 내로 도입하였다. 이들 유기체들을 그 후 적절한 조건하에서 배양하고, s-GDH 활성을 나타내는 콜로니들을 선별하였다.

QIAGEN Plasmid Maxi Kit (Qiagen) 를 제조자의 프로토콜에 따라 사용하여 상기 언급한 클론의 하룻밤 배양액 200 ml 로부터 플라스미드 pACSGDH 를 분리하였다. 상기 플라스미드를 1 ml 2차 증류수에 재현탁시켰다. Beckman DU 7400 광도계를 이용하여 상기 플라스미드의 농도를 결정하였다.

수율은 600 μg 이었다. 그 후, 상기 플라스미드의 질을 아가로오스 겔 전기영동으로 결정하였다.

실시예 2

돌연변이체 T348G 및 돌연변이체 T348S 의 생성

추가로 개선된 변형체의 생성을 위한 출발 주형으로서 각각 T348G 또는 T348S 돌연변이를 가진 돌연변이된 s-GDH 를 제조하였다. 이들 s-GDH 의 돌연변이체들은 기질인 말토오스와 비교하여 글루코오스에 대해 향상된 기질 특이성을 갖는 것으로 공지되어 있기 때문에 선택되었다(WO 02/34919 참조).

QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, 카탈로그 200518) 를 사용하여 348 위치의 트레오닌을 글리신 또는 세린으로 치환하였다. 적절한 프라이머들을 설계하였다.

돌연변이유발을 위해 사용된 5'- 및 3'-프라이머는 서로 상보적이었으며, 중심적 위치에서 트레오닌에서 글리신으로의 (ACA 에서 GGG 로) 또는 트레오닌에서 세린으로의 (ACA 에서 TCA 로) 교체를 위한 변형된 코돈을 포함하였다. 이들 뉴클레오티드는 각 말단에 12 내지 16 개의 뉴클레오티드가 플랭킹(flanking)되었다. 상기 뉴클레오티드들의 서열은 상기 아미노산 교체를 위한 코돈에 플랭킹하는 센스 및 안티-센스 DNA-가닥과 동일하였다. 상기 프라이머들은 센스 가닥에 있어서의 코돈 ACA = 트레오닌 및 안티-센스 가닥에 있어서의 TGT 각각 대신, 센스에 있어서는 GGG = 글리신 또는 TCA = 세린을, 안티-센스 가닥에 있어서는 CCC = 글리신 또는 AGT = 세린을 각각 포함하였다. T348G 교체를 위한 상기 센스 및 안티센스 가닥은 각각 서열번호: 3 및 4 로 제시되어 있다.

PCR-반응 및 DpnI 절단을 매뉴얼에 따라 수행하였다. 그 후, 1 μl 의 시료를 XL-MRF'-세포들의 전기천공에 사용하였다. 전기천공은 BioRad E. coli Pulser (BioRad) 를 이용하여 0.2 cm 큐벳 내에서 2.5 KV 로 수행하였다. 37 ℃ 의 1 ml LB 에서 1 시간 동안 성장시킨 후, 세균을 "4 x 효모" 배지(20 g 효모 추출물 + 5 g NaCl, pH 7.0 내지 1 l Aqua dest.)-암피실린 한천 플레이트 (100 μ g / ml 암피실린) 상에 도말(plating)하고, 37℃ 에서 밤새 배양하였다. 돌연변이된 s-GDH 클론들을 하기 스크리닝 방법을 이용하여 조사하였다.

실시예 3

스크리닝

상기 기술한 한천 플레이트 상의 돌연변이체 콜로니들을 골라내어 웰당 200 μl "4 x 효모"-암피실린-배지가 담긴 마이크로티터 플레이트 (MTP) 내로 담고, 37 ℃ 에서 밤새 인큐베이션하였다. 이들 플레이트들은 마스터 플레이트 (master plate) 로 칭한다.

각 마스터 플레이트로부터, 5 μl 시료/웰을 웰당 5 μl 의 세포 파괴용 B (B = Bacterial Protein Extraction Reagent; Pierce No. 78248) 가 담긴 MTP 로 옮기고, s-GDH 의 활성화를 위해 240 μl 의 0.0556 mM 피롤로퀴놀린 퀴논 (PQQ); 50 mM Hepes; 15 mM CaCl₂ pH 7.0/웰을 첨가하였다. 완전효소 (holoenzyme) 의 형성을 완성하기 위해, 상기 MTP 를 25℃에서 2 시간 동안 및 10 ℃ 에서 밤새 인큐베이션하였다. 상기 플레이트는 작업 플레이트 (working plate) 로 칭한다.

상기 작업 플레이트로부터 웰당 4 x 10 μl 시료를 4 개의 비어있는 MTP 로 옮겼다. 그 후, 첫번째 분취물은 표준 농도 (즉 30 mM) 의 글루코오스로, 두번째 것은 감소된 글루코오스 농도 (30 mM 대신 1.9 mM) 로, 세번째 것은 기질로서 말토오스를 이용하여 시험하였고, 네번째 것은 64 ℃에서 30 분간 스트레스를 가한 후 첫번째 분취물과 동일하게 시험하였다. 모든 선택된 다른 당 분자들은 등몰 표준 농도, 즉 30 mM 로 사용되었다. 모든 검정에는 분석 대상의 당이 이미 함유된 90 μl 의 매개 용액 (mediator solution) (실시예 8 참조) 이 적용되었다.

dE/분을 계산하고, 기질로서 30 mM 글루코오스를 사용한 경우의 값을 100% 활성으로 정하였다. 다른 당으로 수득한 값을 상기 글루코오스 값과 비교하고, % 활성을 계산하였다((예컨대 말토오스에 있어서는 하기와 같이 함: dE/분 말토오스/dE 글루코오스)*100). 이는 상기 (변형체) 효소의 교차-반응성에 상당한다. 하기 표들에서, "M/G", 즉 기질로서 글루코오스 (G) 를 이용한 것과 비교한, 기질로서 말토오스 (M) 를 이용한 경우의 s-GDH 의 교차-반응성이 제공된다.

1.9 mM 글루코오스를 이용하여 수득된 값을 30 mM 글루코오스 값과 비교하고, % 상대 활성을 계산하였다((dE/분 1.9 mM 글루코오스/30 mM 글루코오스)*100). 이는 분석된 변형체의 Km-값에 대한 간접적인 지표로서의 %-값을 제공한다. 상기 계산에 따라, %-값이 더 높은 것은 Km-값이 더 낮다는 것 (=더 나음) 을 나타낸다.

야생형 (WT) s-GDH 와 비교한 T348G 및 T348S 돌연변이체들의 기본적인 특징들
효소	30 mM 당에서의 M/G (%)	% 상대 활성 1,9 mM / 30 mM 글루코오스	안정성, 30 분, 64 ℃	아미노산 (AA) 교체
WT	105 %	70%	80 %	-
돌연변이체 A	22 %	25 %	40 %	T348G
돌연변이체 A'	50 %	35 %	50 %	T348S

실시예 4

돌연변이체 s-GDH 의 서열분석

본 방법을 s-GDH T348G 에 대해 예시한다. 하기 상세된 서열분석은 또한 다른 s-GDH 돌연변이체들의 서열분석에도 사용가능하다.

s-GDH 돌연변이체의 서열분석을 위해 하기 프라이머들을 사용하였다:

센스 가닥: 5'-TTA ACG TGC TGA ACA GCC GG-3' (= 서열번호:6)

안티-센스 가닥: 5`-ATA TGG GTA AAG TAC TAC GC-3' (= 서열번호: 7)

약 22 % 말토오스/글루코오스 교차-반응성을 가진 s-GDH T348G 및 50 % 말토오스/글루코오스 교차-반응성을 가진 s-GDH T348S 돌연변이체 각각에 대한 유전자를 포함한 플라스미드들을 분리하고(High Pure Plasmid Isolation Kit, Roche Diagnostics GmbH, No.1754785), ABI Prism Dye Terminator Sequencing Kit 및 ABI 3/73 및 3/77 서열분석기 (Amersham Pharmacia Biotech) 를 이용하여 이에 대해 서열분석하였다.

서열분석에 의해 양 돌연변이체들에서 DNA 및 아미노산 수준에서의 목적 돌연변이들이 이루어진 것을 확인하였다. 이로써, 348 위치에서 T 에서 G 로 또는 S 로의 교체가 정말로 야기되었다. 상기 두 유전자들 상에서의 부가적인 돌연변이는 발견되지 않았다.

실시예 5

T348G (돌연변이체 A) 및 T348S (돌연변이체 A') 를 기초로 한 집중 돌연변이유발로 수득한 추가의 s-GDH 돌연변이체

본 발명자들이 수행한 이전의 연구로부터 후보 아미노산 위치들이 인지되었다. 이들 후보 아미노산 위치들은 열 안정성, 기질 특이성 또는 글루코오스에 대한 친화력과 같은 s-GDH 의 관련된 특징들에 영향을 미치는 것으로 알려졌거나 또는 그러한 것으로 추정되었는데, 이들을 T348G (돌연변이체 A) 에 기초하여 또는 T348S (돌연변이체 A') 에 기초하여 개별적으로 분석하였다.

단일 아미노산 치환이 T348G 또는 T348S 돌연변이체 각각에 어떠한 영향을 미칠 수 있는지 평가하기 위해 단일 아미노산 위치들에 대해 집중 돌연변이유발을 실시하였다.

QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, 카탈로그 200518) 를 사용하여, 야생형 s-GDH-단백질의 87, 110, 122, 124, 145, 146, 169, 171, 187, 246, 294, 298, 300, 313, 323, 333, 339, 341, 349, 378, 428, 및 436 위치들 각각에서의 야생형 아미노산들을 성공적으로 치환하였다.

돌연변이유발에 사용된 5'- 및 3'-프라이머들을 서로 상보적이도록 선택하였는데, 이들은 중심부 위치에 NNN (N = A, C, G 또는 T) 을 포함하였다. 목적하는 위치에 존재하고 조사 대상의 아미노산 위치를 코딩하는 3 개의 무작위 혼입된 N 뉴클레오티드들의 각 말단에 12 내지 16 개의 뉴클레오티드들을 플랭킹하였는데, 이들은 상기 주형의 센스 및 안티센스 DNA-가닥과 동일하였다. 상기 프라이머들은 상기 야생형 코돈 대신 NNN 을 포함하였고, 따라서 상기 올리고뉴클레오티드들은 모든 가능한 코돈을 코딩하였다.

조사 대상의 위치들 각각에 있어서, 1회의 PCR 반응을 실시하였다.

상기 PCR-반응 및 DpnI-제한 엔도뉴클레아제 절단은 QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, 카탈로그 200518) 에 제공된 매뉴얼에 따라 실시하였다.

각 PCR 반응으로부터 1 μl 는 XL1F-세포들의 전기천공에 사용하였다. 세포들을 성장시키고, 상기 클론들의 s-GDH-활성을 상기 기술한 바와 같이 결정하였다.

상기 평가에서 모든 20 개의 가능한 아미노산들의 치환이 다루어질 통계적 가망성을 높이기 위해, 각 위치에 대해 200 개 클론들을 실시예 3 에서 기술한 바와 같이 스크리닝하였다. 흥미있는 클론들을 실시예 4 에 제시된 방법에 따라 서열분석하였다.

표 2 및 3 으로부터 돌연변이체 A 또는 돌연변이체 A' 각각의 기질 특이성, 글루코오스에 대한 친화력 및/또는 열 안정성에 대해 긍정적인 영향을 갖는 아미노산 교체를 유추할 수 있다.

실시예 6

열 안정성이 향상된 돌연변이체들의 규명

실험을, 말토오스와 비교하여 글루코오스에 대한 기질 특이성이 다소 더 양호하나 열 안정성이 너무 낮거나 또는 글루코오스에 대한 친화력이 너무 낮은 등의 불리점을 대가로 하는 돌연변이체들로 확대시켰다.

소위 돌연변이체 6 은 글루코오스에 대해 측정된 반응성의 단지 약 1.5% 로서 말토오스에 대해 상당히 유리한 낮은 교차-반응성을 갖고 있다. 돌연변이체 6 은 Y171G, E245D, M341V 및 T348G 아미노산 치환을 특징으로 하며, 428 및 429 위치 사이에 프롤린 삽입 (ins429P) 을 갖는다.

이들 목적하는 아미노산 치환들을 도입하기 위해 하기 프라이머들을 사용하였다:

상기 결과들은, D87R, N122K, S124K, S146A 또는 G, 바람직하게는 G, S146G, L187F 또는 M; N267Y, V298L, T313D 및 L386F 아미노산 교체들이 상기 기본 돌연변이체 6 의 열 안정성을 향상시킨다는 것을 보여준다.

치환 D87R; N122K; S124K; S146G; V298L 및 L386F 는 열 안정성의 향상에 상당히 강한 영향을 미친다.

실시예 7

말토오스와 비교하여 글루코오스에 대해 높은 기질 특이성을 가지며 글루코오스에 대한 친화력이 향상된 돌연변이체들의 생성

WO 02/34919 에서는, s-GDH 의 상이한 위치들에서의 여러 아미노산 교체가 규명되었는데, 이들은 예컨대, 말토오스와 비교하여 글루코오스에 대한 기질 특이성을 강화하는 것으로 나타났다. T348G 아미노산 교체와 다른 위치 예를 들어 169, 171, 245, 341 및/또는 349 위치들에서의 아미노산 치환들을 조합한 결과 기질 특이성이 더욱 강화되었다. 말토오스와 비교하여 글루코오스에 대한 특이성이 향상되었으나 기질 글루코오스에 대한 친화력은 오히려 낮은 여러 상이한 s-GDH 돌연변이체들을 선별하여, 이들의 글루코오스에 대한 친화력을 향상시키고자 하는 시도가 이루어졌다.

표 2 및 3 에 요약된 실험들로부터 알 수 있듯이, L110H 또는 Y; N229A, G 또는 S; Q246H, M 또는 N; Y333A; G339T; M341V; V349A 또는 G 및 V436P 아미노산 치환은 글루코오스에 대한 s-GDH 돌연변이체의 친화력을 강화시키는데 적절한 것으로 보인다. 친화력에 대한 영향력이 가장 큰 것은 L110H, Q246H; G339T; M341V; V349G 및 V436P 돌연변이체들에서 나타난다. 친화력에 대한 더욱 강한 향상은 Q246H, M341V; V349G 및 V436P 아미노산 교체들에서 발견되었다. 실시예 6 에서 이미 예시한 바와 동일한 전략에 의해 기존의 돌연변이체들에 점돌연변이가 도입되며, 따라서 여기서는 Q246H 치환들에 대한 특이적 프라이머들만이 제공된다.

실시예 3 에 기재된 바의 스크리닝 Km-값 측정을 통한 글루코오스에 대한 친화력 결정을 실시하였다. 상이한 기질 농도 대 효소 활성의 좌표(plot)들로부터 겉보기 Km-값을 계산하였다.

특이 활성을 실시예 8 에 기재된 바와 같이 분석하였다.

기질 특이성, 친화력 및/또는 안정성을 향상시키는데 적절한 것으로 규명된 교체들을 조합하여, 말토오스와 비교하여 글루코오스에 대한 특이성이 현저하게 향상된 돌연변이된 s-GDH 내로 도입하였다.

모든 돌연변이체 유형들에 대해 부가적인 아미노산 교체 Q246H 이 글루코오스에 대한 친화력을 강화시키고 특이 활성을 향상시키는 결과를 산출한 것을 명백하게 알 수 있다. 돌연변이체 6 은 돌연변이체 13 으로서의 T348G, N122K, L169F, Y171G, E245D, M341V 위치에서의 아미노산 교체 및 429 위치에서의 프롤린 삽입 및 부가적인 Q246H 를 갖는다. 돌연변이체 J 는 돌연변이체 G 로서의 T348G, Y171G, E245D, M341V, N428P 위치에서의 아미노산 교체 및 부가적인 Q246H 를 갖는다.

돌연변이체 22 는 T348G, N122K, S124K, L169F, Y171G, E245D, Q246H, M341V, L386F 위치에서의 아미노산 교체 및 위치 429 에서의 프롤린 삽입을 갖는다. 돌연변이체 29 는 T348G 를 제외하고는 돌연변이체 22 의 모든 교체를 갖는데, T348G 는 T348S 로 교체되어 있으며, 이는 속도의 향상을 야기하였다. 돌연변이체 30 및 31 은 부가적으로 G339T 및 V436P 를 교체함으로써 글루코오스에 대한 훨씬 더 높은 Km-값을 달성하였다.

실시예 8

야생형 또는 변형체 s-GDH 의 정제 및 각각의 효소 활성 및 특이 활성의 분석

적절한 s-GDH 발현 벡터를 포함한 대장균 세포를 배양시키고(4 x 효모-Amp. 37 ℃), 수확한 후, 인산칼륨 완충액 pH 7.0 에 재현탁시켰다. French Press 통과 (700-900 bar) 에 의해 세포 파괴를 실시하였다. 원심분리 후, 상청액을 10 mM 인산칼륨 완충액 pH 7.0 으로 평형화된 S-세파로오스 (Amersham Pharmacia Biotec) 컬럼에 적용하였다. 세정 후, 염 구배 0-1 M NaCl 를 사용하여 상기 s-GDH 를 용출하였다. s-GDH 활성을 나타내는 분획들을 모아서, 인산칼륨 완충액 pH 7.0 에 대해 투석하고, 재-평형화한 S-세파로오스 컬럼 상에서 다시 크로마토그래피하였다. 활성 분획들을 모은 후, Superdex® 200 컬럼 (Amersham) 을 이용한 겔 여과에 적용하였다. 활성 분획들을 모아서, CaCl₂ (3 mM 최종 농도) 첨가 후 -20 ℃ 에서 보관하였다.

Pierce 사의 Protein Assay Reagent no. 23225 를 사용하여 단백질 측정을 실시하였다(BSA 를 이용한 검정 곡선, 30 분 37 ℃).

효소 활성 측정을 위해, 상기 s-GDH 시료를 1 mg 단백질/ml 이 되도록 0.0556 mM 피롤로퀴놀린 퀴논 (PQQ); 50 mM Hepes; 15 mM CaCl₂ pH 7.0 로 희석하고, 재구성 또는 활성화를 위해 25 ℃에서 30 분간 인큐베이션하였다.

활성화 후, 시료를 50 mM Hepes; 15 mM CaCl₂ pH 7.0 로 희석하여 대략 0,02 U/ml 로 하고, 각 희석된 시료 50 μl 를 매개자로서 0.315 mg (4-(디메틸포스피닐메틸)-2-메틸-피라졸로-[1.5a]-이미다졸-3-일)-(4-니트로-소페닐)-아민 (특허 US 5,484,708 참조)/ml 및 30 mM 당을 함유한 1000 μl 의 0.2 M 시트르산 완충 용액 (pH 5.8; 25 ℃) 에 첨가하였다.

25 ℃에서의 처음 5 분 동안 620 nm 에서의 흡광을 모니터하였다.

1 Unit 효소 활성은 상기 검정 조건 하에서의 1 mMol 매개자/분의 전환에 해당한다.

계산:

부피 활성 (U/ml) = (총 부피 * dE/분 [U/ml]) : (ε* 시료 부피 * 1)

(ε = 흡광 계수; ε_{620 nm} = 30[1* mmol^-1 * cm^-1]).

특이 활성 (U/mg) = (부피 활성 U/ml) ÷ (단백질 농도 mg/ml) 로서, 결과는 U/mg 이다.

글루코오스 및 말토오스 (Merck, Germany) 를 각각 이용하여 상기 검정을 실시하였다.

효소 활성 및 특이 활성과 관련된 결과는 앞서의 실시예들에 제시된 표에 포함시켰다.

<110> Roche Diagnostics GmbH F. Hoffmann La Roche AG <120> Improved mutants of pyrroloquinoline quinone dependent soluble glucose dehydrogenase <130> 23713 WO <150> EP06007779 <151> 2006-04-13 <160> 21 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 1362 <212> DNA <213> Acinetobacter calcoaceticus <220> <221> CDS <222> (1)..(1362) <400> 1 gat gtt cct cta act cca tct caa ttt gct aaa gcg aaa tca gag aac 48 Asp Val Pro Leu Thr Pro Ser Gln Phe Ala Lys Ala Lys Ser Glu Asn 1 5 10 15 ttt gac aag aaa gtt att cta tct aat cta aat aag ccg cac gcg ttg 96 Phe Asp Lys Lys Val Ile Leu Ser Asn Leu Asn Lys Pro His Ala Leu 20 25 30 tta tgg gga cca gat aat caa att tgg tta act gag cga gca aca ggt 144 Leu Trp Gly Pro Asp Asn Gln Ile Trp Leu Thr Glu Arg Ala Thr Gly 35 40 45 aag att cta aga gtt aat cca gag tcg ggt agt gta aaa aca gtt ttt 192 Lys Ile Leu Arg Val Asn Pro Glu Ser Gly Ser Val Lys Thr Val Phe 50 55 60 cag gta cca gag att gtc aat gat gct gat ggg cag aat ggt tta tta 240 Gln Val Pro Glu Ile Val Asn Asp Ala Asp Gly Gln Asn Gly Leu Leu 65 70 75 80 ggt ttt gcc ttc cat cct gat ttt aaa aat aat cct tat atc tat att 288 Gly Phe Ala Phe His Pro Asp Phe Lys Asn Asn Pro Tyr Ile Tyr Ile 85 90 95 tca ggt aca ttt aaa aat ccg aaa tct aca gat aaa gaa tta ccg aac 336 Ser Gly Thr Phe Lys Asn Pro Lys Ser Thr Asp Lys Glu Leu Pro Asn 100 105 110 caa acg att att cgt cgt tat acc tat aat aaa tca aca gat acg ctc 384 Gln Thr Ile Ile Arg Arg Tyr Thr Tyr Asn Lys Ser Thr Asp Thr Leu 115 120 125 gag aag cca gtc gat tta tta gca gga tta cct tca tca aaa gac cat 432 Glu Lys Pro Val Asp Leu Leu Ala Gly Leu Pro Ser Ser Lys Asp His 130 135 140 cag tca ggt cgt ctt gtc att ggg cca gat caa aag att tat tat acg 480 Gln Ser Gly Arg Leu Val Ile Gly Pro Asp Gln Lys Ile Tyr Tyr Thr 145 150 155 160 att ggt gac caa ggg cgt aac cag ctt gct tat ttg ttc ttg cca aat 528 Ile Gly Asp Gln Gly Arg Asn Gln Leu Ala Tyr Leu Phe Leu Pro Asn 165 170 175 caa gca caa cat acg cca act caa caa gaa ctg aat ggt aaa gac tat 576 Gln Ala Gln His Thr Pro Thr Gln Gln Glu Leu Asn Gly Lys 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Val Ala Ala Gly Val 290 295 300 cct gtg acg aaa gaa tct gaa tgg act ggt aaa aac ttt gtc cca cca 960 Pro Val Thr Lys Glu Ser Glu Trp Thr Gly Lys Asn Phe Val Pro Pro 305 310 315 320 tta aaa act tta tat acc gtt caa gat acc tac aac tat aac gat cca 1008 Leu Lys Thr Leu Tyr Thr Val Gln Asp Thr Tyr Asn Tyr Asn Asp Pro 325 330 335 act tgt gga gag atg acc tac att tgc tgg cca aca gtt gca ccg tca 1056 Thr Cys Gly Glu Met Thr Tyr Ile Cys Trp Pro Thr Val Ala Pro Ser 340 345 350 tct gcc tat gtc tat aag ggc ggt aaa aaa gca att act ggt tgg gaa 1104 Ser Ala Tyr Val Tyr Lys Gly Gly Lys Lys Ala Ile Thr Gly Trp Glu 355 360 365 aat aca tta ttg gtt cca tct tta aaa cgt ggt gtc att ttc cgt att 1152 Asn Thr Leu Leu Val Pro Ser Leu Lys Arg Gly Val Ile Phe Arg Ile 370 375 380 aag tta gat cca act tat agc act act tat gat gac gct gta ccg atg 1200 Lys Leu Asp Pro Thr Tyr Ser Thr Thr Tyr Asp Asp Ala Val Pro Met 385 390 395 400 ttt aag agc aac aac cgt tat cgt gat gtg att gca agt cca gat ggg 1248 Phe Lys Ser Asn Asn Arg Tyr Arg Asp Val Ile Ala Ser Pro Asp Gly 405 410 415 aat gtc tta tat gta tta act gat act gcc gga aat gtc caa aaa gat 1296 Asn Val Leu Tyr Val Leu Thr Asp Thr Ala Gly Asn Val Gln Lys Asp 420 425 430 gat ggc tca gta aca aat aca tta gaa aac cca gga tct ctc att aag 1344 Asp Gly Ser Val Thr Asn Thr Leu Glu Asn Pro Gly Ser Leu Ile Lys 435 440 445 ttc acc tat aag gct aag 1362 Phe Thr Tyr Lys Ala Lys 450 <210> 2 <211> 454 <212> PRT <213> Acinetobacter calcoaceticus <400> 2 Asp Val Pro Leu Thr Pro Ser Gln Phe Ala Lys Ala Lys Ser Glu Asn 1 5 10 15 Phe Asp Lys Lys Val Ile Leu Ser Asn Leu Asn Lys Pro His Ala Leu 20 25 30 Leu Trp Gly Pro Asp Asn Gln Ile Trp Leu Thr Glu Arg Ala Thr Gly 35 40 45 Lys Ile Leu Arg Val Asn Pro Glu Ser Gly Ser Val Lys Thr Val Phe 50 55 60 Gln Val Pro Glu Ile Val Asn Asp Ala Asp Gly Gln Asn Gly Leu Leu 65 70 75 80 Gly Phe Ala Phe His Pro Asp Phe Lys Asn Asn Pro Tyr Ile Tyr Ile 85 90 95 Ser Gly Thr Phe Lys Asn Pro Lys Ser Thr Asp Lys Glu Leu Pro Asn 100 105 110 Gln Thr Ile Ile Arg Arg Tyr Thr Tyr Asn Lys Ser Thr Asp Thr Leu 115 120 125 Glu Lys Pro Val Asp Leu Leu Ala Gly Leu Pro Ser Ser Lys Asp His 130 135 140 Gln Ser Gly Arg Leu Val Ile Gly Pro Asp Gln Lys Ile Tyr Tyr Thr 145 150 155 160 Ile Gly Asp Gln Gly Arg Asn Gln Leu Ala Tyr Leu Phe Leu Pro Asn 165 170 175 Gln Ala Gln His Thr Pro Thr Gln Gln Glu Leu Asn Gly Lys Asp Tyr 180 185 190 His Thr Tyr Met Gly Lys Val Leu Arg Leu Asn Leu Asp Gly Ser Ile 195 200 205 Pro Lys Asp Asn Pro Ser Phe Asn Gly Val Val Ser His Ile Tyr Thr 210 215 220 Leu Gly His Arg Asn Pro Gln Gly Leu Ala Phe Thr Pro Asn Gly Lys 225 230 235 240 Leu Leu Gln Ser Glu Gln Gly Pro Asn Ser Asp Asp Glu Ile Asn Leu 245 250 255 Ile Val Lys Gly Gly Asn Tyr Gly Trp Pro Asn Val Ala Gly Tyr Lys 260 265 270 Asp Asp Ser Gly Tyr Ala Tyr Ala Asn Tyr Ser Ala Ala Ala Asn Lys 275 280 285 Ser Ile Lys Asp Leu Ala Gln Asn Gly Val Lys Val Ala Ala Gly Val 290 295 300 Pro Val Thr Lys Glu Ser Glu Trp Thr Gly Lys Asn Phe Val Pro Pro 305 310 315 320 Leu Lys Thr Leu Tyr Thr Val Gln Asp Thr Tyr Asn Tyr Asn Asp Pro 325 330 335 Thr Cys Gly Glu Met Thr Tyr Ile Cys Trp Pro Thr Val Ala Pro Ser 340 345 350 Ser Ala Tyr Val Tyr Lys Gly Gly Lys Lys Ala Ile Thr Gly Trp Glu 355 360 365 Asn Thr Leu Leu Val Pro Ser Leu Lys Arg Gly Val Ile Phe Arg Ile 370 375 380 Lys Leu Asp Pro Thr Tyr Ser Thr Thr Tyr Asp Asp Ala Val Pro Met 385 390 395 400 Phe Lys Ser Asn Asn Arg Tyr Arg Asp Val Ile Ala Ser Pro Asp Gly 405 410 415 Asn Val Leu Tyr Val Leu Thr Asp Thr Ala Gly Asn Val Gln Lys Asp 420 425 430 Asp Gly Ser Val Thr Asn Thr Leu Glu Asn Pro Gly Ser Leu Ile Lys 435 440 445 Phe Thr Tyr Lys Ala Lys 450 <210> 3 <211> 4373 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence vector pACSGDH <400> 3 cactaactga ttacgcaccg catgtaaccg ttttcaatct gtgagtaaat tcacagttta 60 ttaacattgt gatagctatg atgacaacgt ttgtcgcact gtaactaacg tgtaacagtt 120 agttgtcagt tttgctgggg tatttcgctt ataaaaaccg ttatcacaat atcccgcgac 180 taccggacaa aaataaagag ttgaataaga gcttatccca ttagggctat tttacttgcc 240 attttggacc tgggcagtgc tcgccaaaac gcgttagcgt tttgaacgcg ctagcggcgg 300 cccgaagggc gagcgtagcg agtcaaacct cacgtactac gtgtacgctc cggtttttgc 360 gcgctgtccg tgtccaaact gctgcgccaa taacgcctgg tgggataggc tctaaatacg 420 cttcggcgtt cagtaacacg cgttaacgtg ctgaacagcc gggcattttt ttacgctata 480 ccctacataa taaaaccgga gctaccatga ataagaaggt actgaccctt tctgccgtga 540 tggcaagtct gttattcggc gcgcacgcgc atgccgccga tgttcctcta actccatctc 600 aatttgctaa agcgaaatca gagaactttg acaagaaagt tattctatct aatctaaata 660 agccgcacgc gttgttatgg ggaccagata atcaaatttg gttaactgag cgagcaacag 720 gtaagattct aagagttaat ccagagtcgg gtagtgtaaa aacagttttt caggtaccag 780 agattgtcaa tgatgctgat gggcagaatg gtttattagg ttttgccttc catcctgatt 840 ttaaaaataa tccttatatc tatatttcag gtacatttaa aaatccgaaa tctacagata 900 aagaattacc gaaccaaacg attattcgtc gttataccta taataaatca acagatacgc 960 tcgagaagcc agtcgattta ttagcaggat taccttcatc aaaagaccat cagtcaggtc 1020 gtcttgtcat tgggccagat caaaagattt attatacgat tggtgaccaa gggcgtaacc 1080 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Claims (16)

1. 348 위치의 트레오닌이 글리신, 알라닌 또는 세린 중 하나로 치환된 것으로서 말토오스와 비교하여 글루코오스에 대한 특이성이 향상된 PQQ-의존 가용성 글루코오스 탈수소효소 (s-GDH; EC 1.1.5.2) 의 돌연변이체로서, 부가적으로 하기를 포함하고:

   a) 상기 돌연변이체의 안정성을 향상시키는 적어도 하나의 돌연변이 및

   b) 글루코오스에 대한 상기 돌연변이체의 친화력을 향상시키는 적어도 하나의 돌연변이;

   이들 위치들은 A. 칼코아세티쿠스 s-GDH 야생형 서열 (서열번호: 2) 로부터 공지된 아미노산 위치들에 대응하고,

   상기 글루코오스에 대한 친화력을 향상시키는 돌연변이가 L110H 또는 Y; N229A, G 또는 S; Q246H, M 또는 N; Y333A; G339T; M341V; V349A 또는 G 및 V436P 로 이루어진 군에서 선택되고,

   상기 안정성을 향상시키는 치환이 D87R; N122K; S124K; S146G; V298L 및 L386F 로 이루어진 군에서 선택되는, 돌연변이체.
2. 삭제
3. 제 1 항에 있어서, 상기 돌연변이가 L110H, Q246H; G339T; M341V; V349G 및 V436P 로 이루어진 군에서 선택되는 s-GDH 돌연변이체.
4. 제 1 항에 있어서, 상기 돌연변이체가 부가적으로 하기를 포함하고:

   c) 말토오스와 비교하여 글루코오스에 대한 상기 돌연변이체의 특이성을 추가로 향상시키는 하나 이상의 돌연변이 또는 돌연변이들;

   상기 말토오스와 비교하여 글루코오스에 대한 상기 돌연변이체의 특이성을 향상시키는 돌연변이가 Q145P; D163G 또는 N; Q164F; L169F; Y171G; I208L 또는 V; T224I; E245D; G276S; A294D 또는 E; V300A, S, N, Y 또는 I; T307G; T323V; A354Y, E 또는 L; R378I, M, A 또는 D; N428P 및 삽입 429 P 로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 치환인 s-GDH 돌연변이체.
5. 삭제
6. 제 3 항에 있어서, 상기 글루코오스에 대한 친화력을 향상시키는 치환이 L110H, Q246H; G339T; M341V; V349G 및 V436P 로 이루어진 군에서 선택되는 s-GDH 돌연변이체.
7. 제 4 항에 있어서, 상기 말토오스와 비교하여 글루코오스에 대한 상기 돌연변이체의 특이성을 향상시키는 치환이 L169F; Y171G; E245D; N428P 및 삽입 429P 로 이루어진 군에서 선택되는 s-GDH 돌연변이체.
8. 제 1 항에 따른 s-GDH 돌연변이체 단백질을 인코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
9. 제 8 항에 정의된 바의 분리된 폴리뉴클레오티드가 숙주 세포에서 그의 발현을 촉진할 수 있는 프로모터 서열에 작동가능하게 연결되어 포함되어 있는 발현 벡터.
10. 제 9 항의 발현 벡터를 포함한 숙주 세포.
11. 제 10 항의 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는, 제 1 항, 제 3 항, 제 4 항, 제 6 항 또는 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 s-GDH 돌연변이체의 제조 방법.
12. 제 8 항에 정의된 바의 분리된 폴리뉴클레오티드가 무세포 펩티드 합성 시스템에서 그의 발현을 촉진할 수 있는 프로모터 서열에 작동가능하게 연결되어 포함되어 있는 발현 벡터.
13. 무세포 펩티드 합성 시스템에서 제 12 항의 발현 벡터를 이용하여, 제 1 항, 제 3 항, 제 4 항, 제 6 항 또는 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 s-GDH 돌연변이체를 제조하는 방법.
14. 제 1 항, 제 3 항, 제 4 항, 제 6 항 또는 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 s-GDH 돌연변이체를 사용하여 시료 중의 글루코오스를 검출, 결정 또는 측정하는 방법으로서, 상기 시료를 상기 돌연변이체에 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
15. 제 14 항에 있어서, 상기 글루코오스에 대한 검출, 결정 또는 측정이 센서 또는 테스트 스트립 장치를 이용하여 수행되는 것을 추가로 특징으로 하는 방법.
16. 시료 중의 글루코오스를 검출 또는 측정하는 장치로서, 제 1 항, 제 3 항, 제 4 항, 제 6 항 또는 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 s-GDH 돌연변이체를 포함한 장치.

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