JP2009533033A - ピロロキノリンキノン依存性可溶性グルコース脱水素酵素の改善された変異体 - Google Patents
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Abstract
Description
血中グルコース濃度の測定は、臨床診断および糖尿病の管理において極めて重要である。WHOによると、世界中でおよそ15000万人が慢性疾患真性糖尿病を患っており、数値は2025年までに倍増する可能性がある。糖尿病は容易に診断および治療されるが、首尾よい長期管理には、血中グルコース濃度を速く正確に報告する低コスト診断ツールを必要とする。PQQ-依存性グルコース脱水素酵素(EC 1.1.5.2)は、グルコースがグルコノラクトンに酸化される反応を触媒する。その結果、この型の酵素は、血糖の測定に使用される。これらのツールの1つは、最初にアシネトバクター・カルコアセチカス(Acinetobacter calcoaceticus)に元々由来するピロロキノリンキノン含有酵素である可溶性グルコース脱水素酵素(s-GlucDOR、EC 1.1.5.2)に基づいた診断片である。
本発明は、s-GDHの変異体に関する。マルトースと比べてグルコースに対する改善された特異性を有し、グリシン、アラニンまたはセリンのいずれかによる348位のトレオニンの置換を有するPQQ-依存性可溶性グルコース脱水素酵素(s-GDH;EC 1.1.5.2)の変異体であって、さらに、該変異体の安定性を改善するための少なくとも1つの変異、グルコースに対する変異体の親和性を改善するための少なくとも1つの変異、および任意に、マルトースと比べてグルコースに対する該変異体の特異性をさらに改善するための1つ以上の変異を含み、示した位置は、A.カルコアセチカスs-GDH野生型配列(配列番号:2)で既知のアミノ酸位置に対応する変異体が開示される。
第1の態様において、本発明は、グリシン、アラニンまたはセリンのいずれかによる348位のトレオニンの置換を有し、マルトースと比べてグルコースに対する改善された特異性を有するPQQ-依存性可溶性グルコース脱水素酵素(s-GDH;EC 1.1.5.2)の変異体であって、該変異体の安定性を改善するための少なくとも1つの変異を含み、グルコースに対する該変異体の親和性を改善するための少なくとも1つの変異、および任意に、マルトースと比べてグルコースに対する該変異体の特異性をさらに改善するための1つ以上の変異をさらに含み、ここで、示した位置は、A.カルコアセチカスs-GDH野生型配列(配列番号:2)で既知のアミノ酸位置に対応する変異体に関する。
交差反応性[%] = (活性マルトース/活性グルコース) × 100%
で計算される。
に従って計算される。
を有する変異体を含む。
野生型A.カルコアセチカス可溶性PQQ依存性グルコース脱水素酵素の大腸菌でのクローニングおよび発現
s-GDH遺伝子を、標準の手順に従ってアシネトバクターカルコアセチカス LMD 79.41株から単離した。野生型s-GDH遺伝子を、調節可能な発現のためのmglプロモーターを含むプラスミドにサブクローニングした(参照、特許出願 WO 88/09373)。新しい構築物をpACSGDHと呼んだ(図2および3ならびに配列番号3を参照)。組換えプラスミドを大腸菌群から選択した宿主生物体に導入した。次にこれらの生物体を適切な条件下で培養し、s-GDH活性を示すコロニーを選択した。
変異体T348Gおよび変異体T348Sの作製
さらに改善されたバリアントの作製のための開始鋳型として、変異T348Gおよび変異T348Sのそれぞれを有する変異s-GDHを製造した。これらは基質マルトースと比較してグルコースに対する改善された基質特異性を有することが公知であるためにこれらのs-GDH変異体が選ばれた(WO02/34919参照)。
スクリーニング
上記の寒天プレート上の変異体コロニーを200μl 「4×酵母」-アンピシリン-培地/ウェルを含むマイクロタイタープレート(MTP)に選び取り、37℃で一晩インキュベートした。これらのプレートをマスタープレートと呼ぶ。
変異体s-GDHの配列決定
s-GDH T348Gについて方法を例示する。以下に詳細に説明される配列決定はまた、他のs-GDH変異体の配列決定に使用され得る。
T348G(変異体A)およびT348S(変異体A')に基づく飽和突然変異誘発によって得られたさらなるs-GDH変異体
候補アミノ酸位置は、本発明者らによって行われた以前の研究から本発明者らに公知であった。熱安定性、基質特異性またはグルコースに対する親和性などのs-GDHの関連特性に影響を及ぼすことが疑われるまたは既知のこれらの候補アミノ酸位置を、T348G(変異体A)またはT348S(変異体A')に基づいて個々に分析した。
改善された熱安定性を有する変異体の同定
実験は、非常に低い熱安定性またはグルコースに対する非常に低い親和性のような不利の犠牲を払うがマルトースと比較してグルコースに対するかなり良好な基質特異性を有する変異体まで拡張した。
マルトースと比較してグルコースに対する高い基質特異性およびグルコースに対する親和性の改善を有する変異体の作製
WO 02/34919において、s-GDHの異なる位置でのいくつかのアミノ酸交換が、例えば、マルトースと比較して、グルコースに対する基質特異性を増強することが同定され、示された。他の位置、例えば、169位、171位、245位、341位および/または349位のアミノ酸置換とアミノ酸交換T348Gの組み合わせによって、基質特異性がさらに増強された。基質グルコースに対してかなり低い親和性を有するがマルトースと比較してグルコースに対する改善された特異性を有するいくつかの異なるs-GDH変異体を選択し、グルコースに対するその親和性を改善するように試みた。
野生型またはバリアントs-GDHの精製ならびに酵素活性および比活性それぞれの分析
適切なs-GDH発現ベクターを含む大腸菌細胞を増殖し(4×酵母-Amp.37℃)、回収し、pH7.0リン酸カリウムバッファ中に再懸濁した。細胞破砕をフレンチプレス通過(700〜900bar)によって実施した。遠心分離の後、上清を10 mMリン酸カリウムバッファpH7.0で平衡化したS-セファロース(Amersham Pharmacia Biotec)カラムにかけた。洗浄後、s-GDHを塩勾配0〜1MのNaClを使用して溶出した。s-GDH活性を示す画分をプールし、リン酸カリウムバッファpH7.0に対して透析し、再平衡化されたS-セファロースカラム上でリクロマトグラフィーした。活性画分をプールし、Superdex(登録商標)200 カラム(Amersham)を用いてゲル濾過に供した。活性画分をプールし、CaCl2(3mM 終濃度)の添加後、-20℃で保存した。
体積活性(U/ml)=(全体積×dE/分 [U/ml]):(ε×試料体積×1)
(ε=吸光係数;ε620nm=30[1×mmol-1×cm-1])。
比活性(U/mg)=体積活性U/mlをタンパク質濃度mg/mlで割ってU/mgとなる。
Claims (16)
- マルトースと比較してグルコースに対する改善された特異性を有し、かつグリシン、アラニンまたはセリンのいずれかによる位置348のトレオニンの置換を有するPQQ依存性可溶性グルコース脱水素酵素(s-GDH;EC1.1.5.2)の変異体であって、前記変異体は、
a) 変異体の安定性を改善するための少なくとも1つの変異
b) 変異体のグルコースに対する親和性を改善するための少なくとも1つの変異、および任意に
c) マルトースと比較してグルコースに対する変異体の特異性をさらに改善するための1つ以上の変異
をさらに含み、
これらの位置はA.カルコアセチカスs-GDH野生型配列(配列番号2)で公知のアミノ酸位置に対応する、変異体。 - 安定性を改善するための前記変異は、L110H、Q246H;G339T;M341V;V349GおよびV436Pからなる群より選択されるアミノ酸置換である、請求項1記載のs-GDH変異体。
- グルコースに対する親和性を改善するための前記変異は、L110HまたはY;N229A、GまたはS;Q246H、MまたはN;Y333A;G339T;M341V;V349AまたはGおよびV436Pからなる群より選択される、請求項1記載のs-GDH変異体。
- マルトースと比較してグルコースに対する変異体の特異性を改善するための前記変異は、Q145P;D163GまたはN;Q164F;L169F;Y171G;I208LまたはV;T224I;E245D;G276S;A294DまたはE;V300A、S、N、YまたはI;T307G;T323V; A354Y、EまたはL;R378I、M、AまたはD;N428Pおよび挿入429P
からなる群より選択されるアミノ酸置換である、請求項1記載のs-GDH変異体。 - 安定性を改善するための前記置換は、D87R;N122K;S124K;S146G;V298LおよびL386Fからなる群より選択される、請求項2記載のs-GDH変異体。
- グルコースに対する親和性を改善するための前記置換は、L110H、Q246H; G339T;M341V;V349GおよびV436Pからなる群より選択される、請求項3記載のs-GDH変異体。
- マルトースと比較してグルコースに対する変異体の特異性を改善するための前記置換は、L169F;Y171G;E245D;N428Pおよび挿入429Pからなる群より選択される、請求項4記載のs-GDH変異体。
- 請求項1〜7いずれか記載のs-GDH変異体タンパク質をコードする単離ポリヌクレオチド。
- 宿主細胞で発現を促進し得るプロモーター配列に作動可能に連結された、請求項8記載の単離ポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
- 請求項9記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
- 酵素変異体の産生に適切な条件下で請求項10記載の宿主細胞を培養する工程を含む、s-GDH変異体の作製方法。
- 無細胞ペプチド合成系で発現を促進し得るプロモーター配列に作動可能に連結された、請求項11記載の単離ポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
- 酵素変異体の産生に適切な条件下の無細胞ペプチド合成系において請求項12記載の構築物を用いる、s-GDH変異体の作製方法。
- 請求項1〜7いずれか記載のs-GDH変異体を用いて試料中のグルコースを検出、決定または測定する方法であって、該改善が試料と該変異体を接触させる工程を含む、方法。
- 前記グルコースの検出、決定または測定が、センサーまたは試験用細片デバイスを用いて行うことをさらに特徴とする、請求項14記載の方法。
- 請求項1〜7いずれか記載のs-GDH変異体および測定に必要な他の試薬を含む、試料中のグルコースを検出または測定するためのデバイス。
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