MX2008013001A - Mutantes mejorados de glucosa deshidrogenasa soluble dependiente de pirroloquinolina quinona. - Google Patents

Abstract

La presente invención da a conocer un mutante de la glucosa deshidrogenasa soluble dependiente de PQQ (s-GDH; EC 1.1.5.2) con especificidad mejorada por glucosa en comparación con maltosa que tiene una sustitución de treonina en la posición 348 por ya sea glicina, alanina o serina, en donde el mutante comprende adicionalmente por lo menos una mutación para mejorar la estabilidad del mutante y una o más mutaciones para mejorar la afinidad del mutante hacia glucosa y/o una o más mutaciones para mejorar adicionalmente la especificidad del mutante por glucosa en comparación con maltosa y en donde la posición 348 corresponde a las posiciones de aminoácidos a partir de la secuencia de tipo silvestre de s-GDH de A. calcoaceticus. También se dan a conocer genes que codifican esta s-GDH mutante y diferentes aplicaciones de estos mutantes de s-GDH, particularmente para determinar la concentración de glucosa en una muestra.

Description

MUTANTES MEJORADOS DE GLUCOSA DESHIDROGENASA SOLUBLE DEPENDIENTE DE PIRROLOQUINOLINA QUINONA CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a un mutante de glucosa deshidrogenasa soluble dependiente de PQQ (s-GDH; EC 1.1.5.2) con especificidad mejorada por glucosa en comparación con maltosa, que tiene una sustitución de treonina en la posición 348 por ya sea glicina, alanina o serina y en donde el mutante comprende adicionalmente , por lo menos una mutación para mejorar la estabilidad del mutante y una o más mutaciones para mejorar la afinidad del mutante hacia hexosas, por ejemplo preferiblemente glucosa, y/o una o más mutaciones para mejorar adicionalmente la especificidad del mutante por glucosa en comparación con maltosa y en donde estas posiciones corresponden a las posiciones de aminoácidos conocidas a partir de la secuencia de tipo silvestre de s-GDH de A. calcoaceticus . También se dan a conocer genes que codifican esta s-GDH mutante y diferentes aplicaciones de estos mutantes de s-GDH, particularmente para determinar la concentración de glucosa en una muestra.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION La determinación de la concentración de glucosa en la sangre es extremadamente importante en el diagnóstico REF: 196469 clínico y en el manejo de la diabetes. Aproximadamente 150 millones de personas en todo el mundo sufren la enfermedad crónica diabetes mellitus, una cifra que puede duplicarse por ahí de 2025 de acuerdo con la HO. Aunque la diabetes se diagnostica y trata fácilmente, el manejo exitoso a largo plazo requiere herramientas de diagnóstico económicas que reporten de manera rápida y precisa las concentraciones de glucosa en la sangre. Las glucosa deshidrogenasas dependientes de PQQ (EC 1.1.5.2) catalizan una reacción en la cual la glucosa se oxida a gluconolactona . Consecuentemente, este tipo de enzima se utiliza en la medición del azúcar en la sangre. Una de estas herramientas es una tira de diagnóstico basada en la glucosa deshidrogenasa soluble (s-GlucDOR, EC 1.1.5.2), una enzima que contiene pirroloquinolina quinona derivada originalmente de Acinetobacter calcoaceticus . Las quinoproteínas utilizan quinona como cofactor para oxidar alcoholes, aminas y aldosas a sus lactonas, aldehidos y ácidos aldólicos correspondientes (Duine, J.A., Energy generation and the glucose dehydrogenase pathway in Acinetobacter, in "The Biology of Acinetobacter" Nueva York, Plenum Press (1991), páginas 295-312; Duine, J.A., Eur. J. Biochem. 200 (1991) 271-284; Davidson, V.L., in "Principies and applications of quinoproteins" , the whole book, Nueva York, Marcel Dekker (1993); Anthony, C, Biochem. J. 320 (1996) 697-711; Anthony, C. y Ghosh, M., Current Science 72 (1997) 716-727; Anthony, C, Biochem. Soc. Trans. 26 (1998) 413-417; Anthony, C. y Ghosh, M . , Prog. Biophys . Mol. Biol. 69 (1998) 1-22. Entre las quinoproteinas , aquellas que contiene el cofactor enlazado no covalentemente 2,7,9-tricarboxi-lH-pirrolo [ 2 , 3-f ] quinolin-4 , 5-diona ( PQQ) constituyen el subgrupo más grande (Duine 1991, supra) . Todas las glucosa deshidrogenasas de quinona bacterianas conocidas hasta ahora pertenecen a este subgrupo con PQQ como cofactor (Anthony y Ghosh 1997 supra; Goodwin, P.M. y Anthony, C., Adv. Microbiol. Physiol. 40 (1998) 1-80; Anthony, C., Adv. in Phot, and Resp. 15 (2004) 203-225). Dos tipos de glucosa deshidrogenase dependiente de PQQ (EC 1.1.5.2) se han caracterizado en bacterias; Una está enlazada a la membrana (m-GDH) ; la otra es soluble (s-GDH) . Ambos tipos no comparten ninguna homología de secuencias significativa (Cleton-Jansen, A.M. y colaboradores, Mol. Gen. Genet. 217 (1989) 430-436; Cleton-Jansen , A.M. y colaboradores, Antonie Van Leeuwenhoek 56 (1989) 73-79; Oubrie, A. y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci . E.U.A. 96 (1999) 11787-11791. También son diferentes respecto a tanto sus propiedades cinéticas así como también sus propiedades inmunológicas (Matsushita, K. y colaboradores, Bioscience Biotechnol. & Biochem. 59 (1995) 1548-1555). Las m-GDHs están difundidas en las bacterias Gram-negativas , las s-GDHs, sin embargo, solo se han encontrado en el espacio periplásmico de las cepas de Acinetobacter, como A. calcoaceticus (Duine, J. A., 1991a; Cleton-Jansen, A.M. y colaboradores, J. Bacteriol. 170 (1988) 2121-2125; Matsushita y Adachi, 1993) y A. baumannii (JP 11243949) . A través de la búsqueda de bases de datos de secuencias, se han identificado dos secuencias homologas a la s-GDH de A. calcoaceticus de longitud completa en E.coli K-12 y Synechocystis sp. Adicionalmente , dos secuencias incompletas homologas a la s-GDH de A. calcoaceticus también se encontraron en el genoma de P. aeruginosa y Bordetella pertussis (Oubrie y colaboradores 1999 a, b, c) y Enterobacter intermedium (Kim, C.H. y colaboradores, Current Microbiol. 47 (2003) 457-461), respectivamente. Las secuencias de aminoácidos deducidas de estas cuatro proteínas no caracterizadas están relacionadas estrechamente con la s-GDH de A. calcoaceticus con muchos residuos en el sitio activo putativo conservado absolutamente. Es probable que estas proteínas homologas tengan una estructura similar y catalicen reacciones similares dependientes de PQQ (Oubrie y colaboradores, 1999 a, b, c; Oubrie A., Biochim. Biophys . Acta 1647 (2003) 143-151; Reddy, S. y Bruice, T.C., J. Am. Chem. Soc. 126 (2004) 2431-2438; Yamada, M. y colaboradores, Biochim. Biophys. Acta 1647 (2003) 185-192) . Se ha descubierto que las s-GDHs y m-GDHs bacterianas poseen secuencias muy diferentes y una especificidad de substrato diferente. Por ejemplo, A. calcoaceticus contiene dos diferentes glucosa deshidrogenasas dependientes de PQQ, una designada m-GDH la cual es activa in vivo y la otra designada s-GDH para la cual solo se puede mostrar actividad in vitro. Cleton-Jansen y colaboradores, 1988 ; 1989 a, b clonaron los genes que codifican las dos enzimas de GDH y determinaron las secuencias de ADN de ambos de estos genes de GDH. No hay homología obvia entre la m-GDH y la s-GDH que corrobore el hecho que la m-GDH y la s-GDH representen dos moléculas completamente diferentes (Laurinavicius , V. y colaboradores, Biologija (2003) 31-34). El gen de s-GDH de A. calcoaceticus se ha clonado en E. coli. Después de ser producida en la célula, la s-GDH es translocada a través de la membrana citoplásmica en el espacio periplásmico (Duine, J.A., Energy generation and the glucose dehydrogenase pathway in Acinetobacter, in "The Biology of Acinetobacter", Nueva York, Plenum Press (1991), páginas 295-312; Matsushita, K. y Adachi, 0., Bacterial quinoproteins glucose dehydrogenase and alcohol dehydrogenase, in "Principies and applications of Quinoproteins", Nueva York, Marcel Dekker (1993) páginas 47-63) . Como la s-GDH nativa de A. calcoaceticus, la s-GDH recombinante expresada en E. coli es un homodímero, con una molécula de PQQ y tres iones de calcio por monómero (Dokter, P. y colaboradores, Biochem. J. 239 (1986) 163-167; Dokter, P. y colaboradores, FEMS Microbiol. Lett . 43 (1987) 195-200; Dokter, P. y colaboradores, Biochem. J. 254 (1988) 131-138; Olsthoorn, A.J. y Duine, J.A., Arch. Biochem. Biophys . 336 (1996) 42-48; Oubrie, A. y colaboradores, J. Mol. Biol. 289 (1999) 319-333; Oubrie, A. y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A 96 (1999) 11787-11791; Oubrie, A. y colaboradores, Embo J. 18 (1999) 5187-5194). La s-GDH oxida un amplio rango de mono- y disacáridos a las cetonas correspondientes las cuales se hidrolizan adicionalmente a los ácidos aldónicos y también es capaz de donar electrones al PMS (metosulfato de fenazina), DCPIP ( 2 , 6-dicloro-fenolindofenol ) , WB (azul de Wurster's) y ubiquinonas de cadena corta tales como la ubiquinona Ql y la ubiquinona Q2 (Matsushita, K. y colaboradores, Biochem. 28 (1989) 6276-6280; Matsushita, K. y colaboradores, Antonie Van Leeuwenhoek 56 (1989) 63-72), varios aceptores de electrones artificiales tal como metil-sulfato de N-metilfenazonio (Olsthoorn, A.J. y Duine, J.A. , Arch. Biochem. Biophys. 336 (1996) 42-48; Olsthoorn, AJ. y Duine, J.A., Biochem. 37 (1998) 13854-13861) y polímeros electroconductores (Ye, L. y colaboradores, Anal. Chem. 65 (1993) 238-241). En vista de la actividad específica alta de la s-GDH hacia glucosa (Olsthoorn, AJ. y Duine, J.A., (1996) supra) y su amplia especificidad hacia receptores de electrones artificiales, la enzima es muy adecuada para aplicaciones analíticas, particularmente para utilizarse en tiras (bio- ) sensoras o de prueba para la determinación de glucosa en aplicaciones de diagnóstico (Kaufmann, N. y colaboradores, Development and evaluation of a new system for determining glucose from fresh capillary blood and heparinized blood in "Glucotrend" (1997) 1-16, Boehringer Mannheim GmbH; Woosuck, S. y colaboradores, Sensors and Actuators B 100 (2004) 395-402). La oxidación de glucosa puede ser catalizada por al menos tres grupos muy distintos de enzimas, es decir, por glucosa deshidrogenasas dependientes de NAD/P, por glucosa oxidasas de flavoproteínas o por GDHs de quinoproteínas (Duine, J.A., Biosens. Bioelectronics 10 (1995) 17-23). Se ha observado una auto-oxidación preferiblemente lenta de la s-GDH reducida, demostrando que el oxígeno es un receptor de electrones muy pobre para la s-GDH (Olsthoorn y Duine, 1996) . La s-GDH puede donar eficientemente electrones de la quinona reducida a mediadores tales como P S, DCPIP, WB y ubiquinonas de cadena corta tales como Ql y Q2 , pero no puede donar eficientemente electrones directamente al oxígeno. Las tiras de prueba y sensores tradicionales para supervisar el nivel de glucosa en la sangre, suero y orina, por ejemplo de pacientes diabéticos utilizan glucosa oxidasa. El desempeño de la enzima es dependiente de la concentración de oxígeno. Las mediciones de glucosa a diferentes altitudes con diferentes concentraciones de oxigeno pueden conducir a resultados falsos. La ventaja principal de las glucosa deshidrogenasas dependientes de PQQ es su independencia del oxigeno. Esta característica importante se describe por ejemplo en la Patente estadounidense No. 6,103,509, en la cual se han investigado algunas características de la GDH enlazada a la membrana. Una contribución importante al campo ha sido el uso de la s-GDH junto con mediadores apropiados. Los métodos de ensayo y dispositivos de tiras de prueba basados en s-GDH se dan a conocer en detalle en la Patente estadounidense No. 5,484,708. Esta patente también contiene información detallada sobre el establecimiento de ensayos y la producción de tiras de prueba basadas en s-GDH para la medición de glucosa. Los métodos descritos ahí así como también en los documentos citados se incluyen en este documento a manera de referencia . Otras patentes o aplicaciones que se refieren al campo y que comprenden información específica sobre varios modos de aplicaciones para enzimas con actividad de glucosa deshidrogenasa son los documentos US 5,997,817; US 6,057,120; EP 0 620 283 y JP 11-243949-A. Un sistema comercial el cual utiliza la s-GDH y un indicador que produce un cambio de color cuando ocurre la reacción (Kaufmann y colaboradores, 1997, supra) es el sistema Glucotrend distribuido por Roche Diagnostics GmbH. A pesar de las ventajas descritas anteriormente para el uso de una s-GDH dependiente de PQQ, en la determinación de glucosa también se tiene que considerar una desventaja. La enzima tiene preferiblemente un espectro de substrato amplio en comparación con la m-GDH. Es decir, la s-GDH oxida no únicamente la glucosa sino también otros diversos azucares que incluyen maltosa, galactosa, lactosa, mañosa, xilosa y ribosa (Dokter y colaboradores 1986 a; Oubrie A., Biochim. Biophys . Acta 1647 (2003) 143-151). La reactividad hacia los azucares diferentes de glucosa puede deteriorar en ciertos casos la precisión para determinar los niveles de glucosa en la sangre. En pacientes particulares en diálisis peritoneal, tratados con icodextrina (un polímero de glucosa) pueden contener en sus fluidos corporales, por ejemplo en la sangre, altos niveles de otros azucares, especialmente de maltosa (Wens, R. y colaboradores, Perit. Dial. Int. 18 (1998) 603-609). Por lo tanto, las muestras clínicas como por ejemplo aquellas obtenidas de pacientes diabéticos, especialmente de pacientes con complicaciones renales y especialmente de pacientes bajo diálisis pueden contener niveles significativos de otros azucares, especialmente maltosa. Las determinaciones de glucosa en muestras obtenidas de estos pacientes críticos pueden ser deterioradas por la maltosa (Frampton, J.E. y Plosker, G.L., Drugs 63 (2003) 2079-2105) . Existen algunos reportes en la bibliografía sobre intentos para producir s-GDH dependientes de PQQ modificadas con una especificidad de substrato alterada. Igarashi, S. y colaboradores, Biochem. Biophys. Res. Commun. 264 (1999) 820-824 reportan que la introducción de una mutación puntual en la posición Glu277 conduce a mutantes con un perfil alterado de especificidad de substrato. Sode, documento EP 1 176 202, reporta que ciertas sustituciones de aminoácidos dentro de la s-GDH conducen al mutante s-GDH con una afinidad mejorada por glucosa. En el documento EP 1 167 519 el mismo autor reporta sobre la s-GDH mutante con estabilidad mejorada. Además, el mismo autor reporta en el documento JP2004173538 sobre otros mutantes de s-GDH con afinidad mejorada por glucosa. Kratzsch, P. y colaboradores, documento WO 02/34919 reportan que la especificidad de la s-GDH por glucosa en comparación con otros substratos de azúcar, especialmente en comparación con la maltosa, se puede mejorar por medio de sustituciones de aminoácidos en ciertas posiciones de la s-GDH. Es central y crucial una sustitución en la posición de aminoácido 348. Una s-GDH mutante que comprende por ejemplo una glicina en la posición 348 en lugar de una treonina presente en la s-GDH de tipo silvestre tiene una selectividad enormemente mejorada por glucosa del substrato en comparación con por ejemplo la maltosa del substrato. También dan a conocer que un mutante doble que tiene sustituciones en las posiciones 348 y 428 tiene una especificidad aún más mejorada por glucosa. En el documento WO 2006/008132 se muestra que una inserción de aminoácido entre los aminoácidos 428 y 429 de s-GDH, especialmente en combinación con una sustitución de aminoácido apropiada en la posición 348 tiene efectos muy favorables sobre la especificidad hacia el substrato. Los mutantes que comprenden esta inserción son por ejemplo más específicos para la glucosa del substrato en comparación con la maltosa del substrato. Sin embargo, mientras que se han reportado algunos mejoramientos sobre la especificidad hacia glucosa, parece que frecuente y desafortunadamente estos me oramientos van de la mano con desventajas como por ejemplo una estabilidad reducida, una actividad reducida y/o una afinidad reducida por glucosa de esta s-GDH mutante. Por ejemplo, se ha vuelto evidente que la especificidad mejorada de un mutante de s-GDH que comprende una sustitución de aminoácido en la posición 348 es a expensas de la estabilidad, afinidad y actividad del mutante en comparación con la enzima de tipo silvestre. Por lo tanto, existe una gran demanda y necesidad clínica por formas mutantes, mejoradas, adicionales de la s- GDH que tengan una alta especificidad por glucosa y las cuales presenten al mismo tiempo una termoestabilidad razonable, asi como también mejoramientos en la actividad especifica o afinidad por glucosa o que presenten mejoramientos en tanto la actividad especifica como la afinidad por glucosa. La tarea de la presente invención fue proporcionar nuevos mutantes o variantes de s-GDH con el mejoramiento significativo de la termoestabilidad, actividad especifica y afinidad por glucosa en comparación con un mutante con especificidad mejorada que comprende una sustitución en la posición 348. Se ha descubierto que es posible mejorar significativamente la termoestabilidad, la actividad especifica y la afinidad por glucosa de un mutante de s-GDH que tiene una sustitución en la posición 348 al seleccionar mutaciones de las posiciones proporcionadas en las reivindicaciones anexas. Debido a las propiedades mejoradas de las nuevas formas de s-GDH, es posible un progreso técnico significativo para las determinaciones de glucosa en varios campos de aplicaciones. Los mutantes de s-GDH mejorados de acuerdo con esta invención se pueden utilizar por ejemplo con gran ventaja para la detección o medición especifica de glucosa en muestras biológicas.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención se refiere a mutantes de s-GDH. Un mutante de glucosa deshidrogenasa soluble dependiente de PQQ (s-GDH; EC 1.1.5.2) se da a conocer con especificidad mejorada por glucosa en comparación con maltosa, que tiene una sustitución de treonina en la posición 348 por ya sea glicina, alanina o serina y en donde el mutante comprende adicionalmente por lo menos una mutación para mejorar la estabilidad del mutante, por lo menos una mutación para mejorar la afinidad del mutante a la glucosa y opcionalmente una o más mutaciones para mejorar adicionalmente la especificidad del mutante por glucosa en comparación con maltosa y en donde las posiciones proporcionadas corresponden a las posiciones de aminoácidos conocidas a partir de la secuencia de tipo silvestre de s-GDH de A. calcoaceticus (SEC ID NO: 2) También se da a conocer un polinucleótido aislado que codifica una proteina mutante de s-GDH, un vector de expresión que comprende el polinucleótido aislado que está unido de manera operable a una secuencia promotora capaz de promover la expresión del polinucleótido en una célula hospedera y una célula hospedera que comprende el vector de expresión . Además, se describe un proceso para generar mutantes de s-GDH que comprende cultivar la célula hospedera transfectada con un vector de expresión apropiado bajo condiciones adecuadas para la producción de un mutante de s-GDH. Además se da a conocer un método para detectar, determinar o medir la glucosa en una muestra utilizando un mutante de s-GDH mejorado de acuerdo con la presente invención, el mejoramiento comprende poner en contacto la muestra con el mutante. También se describe un dispositivo para la detección o medición de glucosa en una muestra que comprende un mutante mejorado de s-GDH de acuerdo con la presente invención y otros reactivos requeridos para la medición. En una primera modalidad, la invención se refiere a un mutante de la glucosa deshidrogenasa soluble dependiente de PQQ (s-GDH; EC 1.1.5.2) con especificidad mejorada por glucosa en comparación con maltosa, que tiene una sustitución de treonina en la posición 348 por ya sea glicina, alanina o serina y en donde el mutante comprende por lo menos una mutación para mejorar la estabilidad del mutante y comprende adicionalmente por lo menos una mutación para mejorar la afinidad del mutante a la glucosa y opcionalmente una o más mutaciones para mejorar adicionalmente la especificidad del mutante por glucosa en comparación con maltosa y en donde las posiciones proporcionadas corresponden a las posiciones de aminoácidos conocidas a partir de la secuencia de tipo silvestre de s-GDH de A. calcoaceticus (SEC ID NO: 2) . Como se describe en el documento WO 02/34919, una sustitución del aminoácido en la posición 348 de la secuencia de s-GDH que corresponde a la secuencia de tipo silvestre aislada de A. calcoaceticus, se puede utilizar para mejorar significativamente la especificidad hacia glucosa de la s-GDH. Esto es por qué los mejoramientos descritos en la estructura de la presente invención se describen y se basan todos en un mutante de s-GDH que comprende una sustitución de aminoácido en la posición 348. Preferiblemente, el residuo treonina en la posición 348 es sustituido por un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste de alanina, glicina y serina. En una modalidad preferida adicional, la glicina o serina se utiliza para sustituir la treonina en la posición 348. La terminología T348G es conocida para la persona experta e indica que la treonina en la posición 348 es reemplazada por glicina. Como se describiera anteriormente en este documento, dos tipos de enzimas de quinoproteínas completamente diferentes con actividad de glucosa deshidrogenasa (enlazada a la membrana y soluble) se agrupan juntas bajo EC 1.1.5.2. Estos dos tipos parecen no estar relacionados entre sí. Para el propósito de esta invención, solo es relevante la forma soluble de GDH (s-GDH) y los mutantes mejorados de la misma se describen en este documento posteriormente . Se sabe en la técnica que la secuencia de ADN de tipo silvestre de una glucosa deshidrogenasa dependiente de PQQ soluble se puede aislar de cepas de Acinetobacter. Se prefiere mucho más el aislamiento de s-GDH de la cepa de tipo Acinetobacter calcoaceticus LMD 79.41. La secuencia de polipéptido de esta s-GDH de tipo silvestre (la proteina madura) se proporciona en la SEC ID NO: 2 y la secuencia de ADN se proporciona en la SEC ID NO: 1, respectivamente. Otras cepas LMD de Acinetobacter también se pueden utilizar como fuente de la s-GDH de tipo silvestre. Estas secuencias se pueden alinear a la secuencia obtenida de A. calcoaceticus y se pueden hacer comparaciones de secuencias. También parece factible seleccionar genotecas de ADN de otras cepas bacterianas, como se describe por ejemplo para E.coli K-12 (Oubrie, A. y colaboradores, J. Mol. Biol. 289 (1999) 319-333) e identificar secuencias relacionadas con la s-GDH en estos genomas. Estas secuencias y las secuencias homologas todavía no identificadas se pueden utilizar para generar mutantes de s-GDH con termoestabilidad mejorada. Los logros de la presente invención se describen con lujo de detalle al hacer referencia a las posiciones de aminoácidos conocidas a partir de la SEC ID NO: 2, la secuencia de tipo silvestre de la s-GDH aislada de la cepa LMD 79.41 de tipo Acinetobacter calcoaceticus . Las posiciones de aminoácidos en diferentes aislados de s-GDH que corresponden a las posiciones de la SEC ID NO: 2 se identifican fácilmente por medio de la comparación de secuencias apropiada. El alineamiento y la comparación múltiples de una secuencia de s-GDH con la secuencia de tipo silvestre de la SEC ID NO: 2 se realiza preferiblemente con el programa PileUpMR del Paquete de GCG Versión 10.2 (Genetics Computer Group, Inc.) . El programa PileUpMR crea un alineamiento de secuencias múltiple utilizando una simplificación del método de alineamiento progresivo de Feng, D. F. y Doolittle, R. F. , J. Mol. Evol . 25 (1987) 351-360 y por consiguiente se definen las matrices de puntuación para residuos de aminoácidos idénticos, similares o diferentes. Este proceso comienza con el alineamiento por pares de las dos secuencias más similares, produciendo una agrupación de dos secuencias alineadas. Esta agrupación entonces se puede alinear a la siguiente secuencia más relacionada o agrupación de secuencias alineadas. Dos agrupaciones de secuencias se pueden alinear por medio de una extensión simple del alineamiento por pares de secuencias individuales. El alineamiento final se logra por medio de una serie de alineamientos por pares progresivos que incluyen secuencias y agrupaciones cada vez más diferentes, hasta que todas las secuencias han sido incluidas en el alineamiento por pares final. Asi, las posiciones de aminoácidos en otras moléculas homologas de s-GDH se pueden identificar fácilmente como correspondientes a las posiciones proporcionadas para la s-GDH de A. calcoaceticus en la SEC ID NO: 2. Esto es por qué las posiciones de aminoácidos proporcionadas en este documento se deben entender como las posiciones de aminoácidos de la SEC ID NO: 2 o como las posiciones que corresponden a la misma en otra molécula de s-GDH homologa. El término "mutante" o "variante" en el sentido de la presente invención se refiere a una proteina de s-GDH la cual comparada con la secuencia de aminoácidos de tipo silvestre proporcionada en la SEC ID NO: 2 exhibe por lo menos una sustitución, supresión o inserción de aminoácido. El mutante de s-GDH puede comprender otras sustituciones y/o supresiones y/o inserciones con la condición de que un mutante de s-GDH de la invención no difiera por más de 45 aminoácidos de la s-GDH de la SEC ID NO: 2, por ejemplo que exhiba a lo sumo 45 sustituciones, inserciones o supresiones de aminoácidos en total. El término "una mutación para mejorar la estabilidad" se refiere a cualquier sustitución y/o supresión y/o inserción de aminoácido que mejore la termoestabilidad de un mutante de s-GDH en un modelo de tensión térmica a corto plazo.

Como se mencionara anteriormente, los mejoramientos en la especificidad hacia glucosa parecen ser posibles únicamente y en su mayor parte a expensas de una estabilidad reducida, una afinidad reducida a la glucosa o una actividad especifica reducida o a cualquier combinación de estas propiedades desventajosas. La estabilidad de acuerdo con la presente invención se evalúa en este modelo de tensión a corto plazo y la estabilidad de s-GDH determinada en este modelo es referida como termoestabilidad . La termoestabilidad se determina al medir la actividad de la enzima s-GDH sin tensión y con tensión de una muestra. Al establecer la actividad de la muestra sin tensión a 100%, la actividad restante después del tratamiento de tensión se puede calcular en porcentaje. Para los mutantes de s-GDH con especificidad de substrato mejorada, se seleccionaron las condiciones de tensión de 64°C durante 30 minutos. Utilizando estas condiciones, la enzima de tipo silvestre tiene aproximadamente 80% de su actividad original remanente, mientras que la mayoría de los mutantes con especificidad mejorada por glucosa tienen únicamente 10% o menos de su actividad enzimática inicial remanente después de sujetarlos a este modelo de tensión a corto plazo. Preferiblemente, la mutación para mejorar la estabilidad de una variante de s-GDH que tiene una sustitución de treonina en la posición 348 por ya sea glicina, alanina o serina es una sustitución. Preferiblemente, la sustitución se selecciona del grupo que consiste de D87R; N122K; S124K; S146A o G; L187F o M; N267Y; V298L; T313D y L386F. También la sustitución preferida para mejorar la estabilidad de una variante de s-GDH se selecciona del grupo que consiste de D87R; N122K; S124K; S146G; V298L y L386F. En modalidades preferidas adicionales, las combinaciones de dos, tres o cuatro de estas sustituciones o también las preferidas de todas estas cinco sustituciones se utilizan en una s-GDH mutada para mejorar la estabilidad de este mutante. En una modalidad preferida, el mutante de s-GDH de acuerdo con la presente invención comprende una arginina en la posición 87 como se sabe a partir de la s-GDH de tipo silvestre de A. calcoaceticus (SEC ID NO: 2) o en una posición que corresponde a la posición 87 en una enzima homologa . En una modalidad preferida adicional, el mutante de s-GDH de acuerdo con la presente invención comprende una lisina en la posición 122 como se sabe a partir de la s-GDH de tipo silvestre de A. calcoaceticus (SEC ID NO: 2) o en una posición que corresponde a la posición 122 en una enzima homologa . En una modalidad preferida adicional, el mutante de s-GDH de acuerdo con la presente invención comprende una lisina en la posición 124 como se sabe a partir de la s-GDH de tipo silvestre de A. calcoaceticus (SEC ID NO: 2) o en una posición que corresponde a la posición 124 en una enzima homologa . En una modalidad preferida adicional, el mutante de s-GDH de acuerdo con la presente invención comprende glicina en la posición 146 como se sabe a partir de la s-GDH de tipo silvestre de A. calcoaceticus (SEC ID NO: 2) o en una posición que corresponde a la posición 146 en una enzima homologa. En una modalidad preferida adicional, el mutante de s-GDH de acuerdo con la presente invención comprende leucina en la posición 298 como se sabe a partir de la s-GDH de tipo silvestre de A. calcoaceticus (SEC ID NO: 2) o en una posición que corresponde a la posición 298 en una enzima homologa . En una modalidad preferida adicional, el mutante de s-GDH de acuerdo con la presente invención comprende fenilalanina en la posición 386 como se sabe a partir de la s-GDH de tipo silvestre de A. calcoaceticus (SEC ID NO: 2) o en una posición que corresponde a la posición 386 en una enzima homologa. Se ha descubierto que seis posiciones de s-GDH parecen ser bastante importantes para lograr mejoramientos significativos en términos de termoestabilidad, es decir las posiciones 87, 122, 124, 146, 298 y 386. Lo que es significativamente relevante en este punto es el hecho que se ha descubierto que estas sustituciones tienen un efecto pronunciado sobre la termoestabilidad de mutantes los cuales han sido generados previamente a fin de mejorar la especificidad hacia glucosa, pero a expensas de una termoestabilidad reducida. En una modalidad preferida, el mutante de s-GDH de acuerdo con la presente invención comprende una arginina en la posición 87, una lisina en las posiciones 122 y 124, una glicina en la posición 146, una leucina en la posición 298 y una fenilalanina en la posición 386 de la SEC ID NO: 2 o en una posición que corresponde a las posiciones si se utiliza una s-GDH homologa. En una modalidad preferida adicional, la presente invención se refiere a un mutante de la glucosa deshidrogenasa soluble dependiente de PQQ (s-GDH; EC 1.1.5.2) con especificidad mejorada por glucosa en comparación con maltosa, que tiene una sustitución de treonina en la posición 348 ya sea por glicina o por alanina o por serina, en donde el mutante comprende adicionalmente por lo menos una mutación para mejorar la estabilidad del mutante y por lo menos una mutación para mejorar la afinidad por glucosa del mutante. El término "afinidad" por un substrato es bien conocido en la técnica. Se proporciona en m como el comúnmente llamado valor Km. Diversos métodos se conocen en la técnica para determinar la afinidad de la s-GDH, utilizando glucosa u otros azúcares como substratos, véase Igarashi, S. y colaboradores, Biochem Biophys Res Commun 264 (1999) 820. En la selección de nuevos variantes con un extracto crudo de E. coli, un cálculo de porcentaje del valor Km se realizó para la evaluación más rápida de clones generados. La afinidad hacia glucosa por los mutantes candidatos de s-GDH se calculó de acuerdo con la cinética bien conocida de Michaelis-Menten . El mutante de s-GDH de acuerdo con la presente invención tiene una afinidad mejorada por glucosa en comparación con un mutante que comprende una sustitución de treonina en la posición 348 por ya sea glicina, alanina o serina. Preferiblemente, la afinidad para el substrato glucosa se determina como se describe en detalle en la sección de ejemplos. Preferiblemente, una o más mutaciones para mejorar la afinidad por glucosa de un mutante de s-GDH que ya comprende una -sustitución de treonina en la posición 348 por ya sea glicina, alanina o serina es una sustitución de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de L110H o Y; N229A, G o S; Q246H, M o N; Y333A; G339T; M341V; V349A o G y V436P. En caso de que el aminoácido que corresponde a la posición 110 de la secuencia de tipo silvestre de s-GDH conocida a partir de A. calcoaceticus (SEC ID NO: 2) sea sustituido en una variante de la presente invención, se prefiere que el aminoácido de origen natural leucina sea sustituido por un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de histidina y tirosina. La sustitución más preferida en la posición 110 es por histidina. En caso de que el aminoácido que corresponde a la posición 229 de la secuencia de tipo silvestre de s-GDH conocida a partir de A. calcoaceticus (SEC ID NO: 2) sea sustituida en una variante de la presente invención, se prefiere que el aminoácido de origen natural asparagina sea sustituido por un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de alanina, glicina y serina. La sustitución más preferida en la posición 229 es por alanina. En caso de que el aminoácido que corresponde a la posición 349 de la secuencia de tipo silvestre de s-GDH conocida a partir de A. calcoaceticus (SEC ID NO: 2) sea sustituido en una variante de la presente invención, se prefiere que el aminoácido de origen natural valina sea sustituido por un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de alanina y glicina. La sustitución más preferida en la posición 349 es por glicina. También, la mutación preferida para mejorar la afinidad por glucosa se selecciona del grupo que consiste de L110H, Q246H; G339T; 341V, V349G y V436P. También, la sustitución preferida para mejorar la afinidad por glucosa se selecciona de Q246H; G339T; M341V y V349G. Una s-GDH preferida de acuerdo con la presente invención comprende dos o tres de estas sustituciones o todas estas cuatro sustituciones. En una modalidad preferida adicional, el mutante de s-GDH descrito anteriormente con especificidad mejorada por glucosa en comparación con maltosa, que tiene una sustitución de treonina en la posición 348 por ya sea glicina, alanina o serina y que comprende por lo menos una mutación para mejorar la estabilidad comprende adicionalmente una o más mutaciones para mejorar la especificidad de substrato del mutante hacia glucosa en comparación con la maltosa. Para ciertas aplicaciones, la especificidad de substrato de un mutante de s-GDH con especificidad mejorada por glucosa en comparación con maltosa, que tiene una sustitución de treonina en la posición 348 por ya sea glicina, alanina o serina puede no ser suficiente todavía para ciertas aplicaciones de rutina. En ciertas modalidades, se puede requerir el generar un mutante de s-GDH que además de la mutación descrita anteriormente en la posición 348 comprenda una o más mutaciones adicionales para mejorar adicionalmente la especificidad del mutante por glucosa en comparación con maltosa . El término "especificidad de substrato" o "especificidad" es bien conocido para la persona experta. A fin de calcular la especificidad de substrato o reactividad cruzada, una manera fácil es establecer la actividad medida con glucosa como substrato a 100% y comparar la actividad medida con la otra azúcar seleccionada al valor de glucosa. Algunas veces, con el fin de no ser redundantes, el término especificidad se usa simplemente sin hacer referencia especial a la glucosa por una parte y otro substrato de azúcar seleccionado por otra parte. El experto en la técnica apreciará que la comparación de actividades enzimáticas se hace mejor en concentraciones equimolares de las moléculas de substrato investigadas utilizando condiciones de ensayo bien definidas. De otra manera, se tienen que hacer correcciones para las diferencias en las concentraciones. Se tienen que seleccionar condiciones de ensayo estandarizadas y bien definidas a fin de evaluar (mejoramientos en) la especificidad para un substrato. La actividad enzimática de s-GDH para glucosa como substrato asi como también para otros substratos de azúcar seleccionados se mide como se describe en la sección de Ejemplos. En base a las mediciones de la actividad enzimática para glucosa o para maltosa, respectivamente, se valora la reactividad cruzada (y el mejoramiento de la misma) . La reactividad (cruzada) de s-GDH para maltosa en porcentaje se calcula como Reactividad cruzada [%] = (actividad maltosa/actividad glucosa) x 100%. La reactividad (cruzada) para maltosa de la s-GDH de tipo silvestre de acuerdo con la fórmula anterior se ha determinado como aproximadamente 105% (véase el documento WO 02/34919) . La especificidad se calcula de acuerdo con la siguiente fórmula: actividad glucosa mutante actividad maltosa tipo silvestre especificidad = x actividad maltosa mutante actividad glucosa tipo silvestre Los me oramientos en la especificidad de un mutante novedoso de s-GDH se reconocen como valores más pequeños en el cálculo anterior, en comparación con un mutante de s-GDH con especificidad mejorada por glucosa en comparación con maltosa, que tiene una sustitución de treonina en la posición 348 por ya sea glicina, alanina o serina. Como apreciará la persona experta, los miembros absolutos dependerán del número y clase de mutaciones ya presentes en un mutante. El número y clase de mutaciones ya presentes en un mutante se pueden denominar los antecedentes del mutante. Cualquier mutación novedosa se compara mejor directamente con los antecedentes del mutante.

Preferiblemente, la mutación para mejorar adicionalmente la especificidad de substrato para glucosa en comparación con maltosa es una sustitución de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de Q145P; D163G o N; Q164F; L169F; Y171G; I208L o V; T224I; E245D; G276S; A294D o E; V300A, S, N, Y o I; T307G; T323V; A354Y, E o L; R378I, M, A o D; N428P y la inserción 429 P. El término "inserción 429" se utiliza para indicar que entre la posición 428 y la posición 429 de la SEC ID N0:2 se inserta una prolina. En caso de que el aminoácido que corresponde a la posición 169 de la secuencia de tipo silvestre de s-GDH conocida a partir de A. calcoaceticus (SEC ID NO: 2) sea sustituida en una variante de la presente invención, se prefiere que el aminoácido de origen natural leucina sea sustituido por fenilalanina , tirosina o triptófano. La sustitución más preferida en la posición 169 es por fenilalanina . En caso de que el aminoácido que corresponde a la posición 171 de la secuencia de tipo silvestre de s-GDH conocida a partir de A. calcoaceticus (SEC ID NO: 2) sea sustituida en una variante de la presente invención, se prefiere que el aminoácido de origen natural tirosina sea sustituido por un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de alanina, metionina, glicina. La sustitución más preferida en la posición 171 es por glicina.

En caso de que el aminoácido que corresponde a la posición 245 de la secuencia de tipo silvestre de s-GDH conocida a partir de A. calcoaceticus (SEC ID NO: 2) sea sustituido en una variante de la presente invención, se prefiere que el aminoácido de origen natural ácido glutámico sea sustituido por ácido aspártico, asparagina o glutamina. La sustitución más preferida en la posición 245 es por ácido aspártico . En caso de que el aminoácido que corresponde a la posición 341 de la secuencia de tipo silvestre de s-GDH conocida a partir de A. calcoaceticus (SEC ID NO: 2) sea sustituido en una variante de la presente invención, se prefiere que el aminoácido de origen natural metionina sea sustituido por valina, alanina, leucina o isoleucina. La sustitución más preferida en la posición 341 es por valina. También se ha descubierto que es posible mejorar adicionalmente la especificidad de substrato de una variante de s-GDH que ya comprende una sustitución en la posición 348 por medio de la inserción de un aminoácido, preferiblemente una prolina, entre la posición 428 y 429. También, la mutación adicional preferida para mejorar la especificidad para un substrato para glucosa en comparación con maltosa se selecciona del grupo que consiste de L169F; Y171G; E245D; N428P y la inserción 429P. Preferiblemente, la mutación adicional para mejorar la especificidad para un substrato para glucosa en comparación con maltosa se selecciona del grupo que consiste de L169F; Y171G; E245D; y N428P. En las modalidades preferidas adicionales, las combinaciones de dos, tres o todas estas cuatro sustituciones se utilizan para mejorar la especificidad de substrato para glucosa en comparación con maltosa de ese mutante. También, la mutación adicional preferida para mejorar la especificidad de un substrato para glucosa en comparación con maltosa se selecciona del grupo que consiste de L169F; Y171G; E245D; y la inserción 429P. En las modalidades preferidas adicionales, las combinaciones de dos o las tres sustituciones se utilizan junto con la inserción 429P en una s-GDH mutada para mejorar la especificidad de substrato para glucosa en comparación con maltosa de ese mutante. Como se describe en los documentos WO 02/34919 y WO 2006/008132, respectivamente, una sustitución en la posición 428 por medio de la cual la asparagina es reemplazada por prolina o una inserción del aminoácido prolina entre la posición 428 y 429, respectivamente, mejora adicionalmente la especificidad de un mutante de s-GDH que ya comprende una sustitución en la posición 348. En una modalidad preferida adicional, la presente invención se refiere por lo tanto a un mutante de la glucosa deshidrogenasa soluble dependiente de PQQ (s-GDH; EC 1.1.5.2) con una especificidad mejorada por glucosa en comparación con maltosa, que tiene una sustitución de treonina en la posición 348 por ya sea glicina, alanina o serina y ya sea una sustitución en la posición 428 por medio de la cual la asparagina es reemplazada por prolina o una inserción del aminoácido prolina entre la posición 428 y 429, en donde el mutante comprende adicionalmente por lo menos una mutación para mejorar la estabilidad del mutante, por lo menos una mutación para mejorar la actividad especifica del mutante y opcionalmente una o más mutaciones para mejorar la afinidad del mutante hacia glucosa y/o una o más mutaciones para mejorar adicionalmente la especificidad del mutante por glucosa en comparación con maltosa y en donde las posiciones proporcionadas corresponden a las posiciones de aminoácidos conocidas a partir de la secuencia de tipo silvestre de s-GDH de A. calcoaceticus (SEC ID NO: 2) . En otra modalidad, la presente invención se refiere a un mutante de la glucosa deshidrogenasa soluble dependiente de PQQ (s-GDH; EC 1.1.5.2) con especificidad mejorada por glucosa en comparación con maltosa, que tiene una sustitución de treonina en la posición 348 por ya sea glicina, alanina o serina, en donde el mutante comprende adicionalmente por lo menos una mutación para mejorar la estabilidad del mutante y por lo menos una mutación para mejorar la actividad especifica del mutante. El término "actividad especifica" es bien conocido en la técnica. Se utiliza para describir la actividad enzimática por cantidad de proteina. En la técnica se conocen varios métodos para determinar la actividad especifica de una s-GDH, utilizando glucosa u otros azúcares como substratos, véase por ejemplo Igarashi, S. y colaboradores, Biochem Biophys Res Commun 264 (1999) 820. El mutante de s-GDH de acuerdo con la presente invención tiene una actividad especifica mejorada para el substrato glucosa en comparación con un mutante que comprende una sustitución de treonina en la posición 348 por ya sea glicina, alanina o serina. Preferiblemente, la mutación para mejorar la actividad especifica para glucosa es una sustitución de aminoácido seleccionado del grupo que consiste de H30F o R; A301G o S y A302S o T. Como apreciará la persona experta, es posible emprender sustituciones de aminoácidos, por ejemplo mutaciones taciturnas, las cuales no influyen en las propiedades de la s-GDH a un grado significativo. Sin embargo, la variante de acuerdo con la presente invención no tendrá más de 45 intercambios de aminoácidos en comparación con la SEC ID NO: 2. Preferiblemente, la variante comprenderá 20 o menos sustituciones de aminoácidos, más preferiblemente, solo estarán presentes 15 sustituciones de aminoácidos o menos sustituciones. Algunas variantes especificas de s-GDH de acuerdo con la presente invención se proporcionan en la sección de ejemplos. Las variantes preferidas de s-GDH con baja interferencia de glucosa y características mejoradas con respecto a la termoestabilidad y la afinidad de un substrato por glucosa comprenden las mutaciones con las siguientes sustituciones : N122K+L169F+Y171G+E245D+M341V+T348G+ins429P; N122K+S124K+L169F+Y171G+E245D+ 341V+T348G+ins429P; N122K+S124K+L169F+Y171G+E245D+M341V+T348G+L386F+ins429P; N122K+S124K+L169F+Y171G+E245D+Q246H+M341V+T348G+L386F +ins429P; D87R+N122K+S124K+S146G+L169F+Y171G+E245D+Q246H+V298L+ M341V+T348S+L386F+ins429P; D87R+N122K+S124K+S146G+L169F+Y171G+E245D+Q246H+V298L+ +G339T+M341V+T348G+L386F+ins429P; D87R+N122K+S124K+S146G+L169F+Y171G+E245D+Q246H+V298L+ M341V+T348S+L386F+ins 29P+V436P; D87R+N122K+S124K+S146G+L169F+Y171G+E245D+Q246H+V298L+ M34lV+T348S+V349G+A354T+L386F+ins429P; D87R+L110H+N122K+S124K+S146G+L169F+Y171G+E245D+Q246H+V298L+ M341V+T348S+L386F+ins429P. En la técnica se conocen numerosas posibilidades para producir proteínas mutantes. En base a los descubrimientos importantes de la presente invención que dan a conocer la importancia crítica de ciertos residuos para mejorar la termoestabilidad, la afinidad por glucosa y la especificidad de un substrato de una s-GDH mutante, la persona experta ahora puede producir fácilmente variantes apropiadas adicionales de s-GDH que albergan estas y otras modificaciones favorables. Estas variantes por ejemplo se pueden obtener por medio de los métodos conocidos como mutagénesis aleatoria (Leung, D. . y colaboradores, Technique 1 (1989) 11-15) y/o mutagénesis dirigida al sitio (Hill, D. E. y colaboradores, Methods Enzymol. 155 (1987) 558-568). Un método alternativo para producir una proteina con las propiedades deseadas es proporcionar construcciones quiméricas, las cuales contienen elementos de secuencias de por lo menos dos diferentes fuentes o sintetizar completamente un gen apropiado de s-GDH. Estos procedimientos conocidos en la técnica se pueden utilizar en combinación con la información dada a conocer en la presente invención para proporcionar mutantes o variantes de s-GDH que comprenden por ejemplo sustituciones de aminoácidos adicionales en combinación con la importancia critica conocida de una sustitución en la posición 348 de la SEC ID NO:2. Una variante de s-GDH de acuerdo con la presente invención se puede producir por ejemplo al iniciar a partir de un gen de s-GDH aislado de la cepa LMD 79.41 de tipo Acinetojacter calcoaceticus asi como también al iniciar a partir de una secuencia homologa. En el contexto de esta solicitud, se propone que el término "homólogo" comprenda una secuencia de aminoácidos de s-GDH con por lo menos 90% de identidad en comparación con la SEC ID NO: 2. En otras palabras, después del alineamiento apropiado utilizando el programa PileUpMR, por lo menos 90% de los aminoácidos de esta s-GDH homologa son idénticos a los aminoácidos descritos en la SEC ID NO: 2. Se entenderá que las variaciones de secuencias de ADN y aminoácidos existen naturalmente o se pueden introducir intencionalmente utilizando métodos conocidos en la técnica. Estas variaciones pueden dar por resultado hasta 10% de diferencias de aminoácidos en la secuencia total, debido a supresiones, sustituciones, inserciones, inversiones o adiciones de uno o más residuos de aminoácidos en la secuencia en comparación con la SEC ID NO: 2. Estas sustituciones de aminoácidos pueden hacerse, por ejemplo, en base a la similitud en la polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o carácter anfipático de los residuos involucrados. Por ejemplo, los aminoácidos de carga negativa incluyen ácido aspártico y ácido glutámico; los aminoácidos de carga positiva incluyen lisina y arginina; los aminoácidos con grupos principales sin carga polar o grupos principales no polares que tienen valores de hidrofilicidad similares incluyen los siguientes: leucina, isoleucina, valina, glicina, alanina, asparagina, glutamina, serina, treonina, fenilalanina y tirosina. Otras variantes contempladas incluyen sales y ásteres de los polipéptidos mencionados anteriormente, asi como también precursores de los polipéptidos mencionados anteriormente, por ejemplo, precursores que tienen una sustitución N-terminal tales como metionina, N-formilmetionina utilizados como secuencias líderes. Estas variaciones se pueden hacer sin apartarse necesariamente del alcance y el espíritu de la presente invención . De acuerdo con procedimientos conocidos en el estado de la técnica y de acuerdo con los procedimientos proporcionados en la sección de ejemplos, es posible obtener secuencias de po 1 i nuc 1 eó t i do s que codifican cualquiera de los mutantes de s-GDH descritos anteriormente. Por lo tanto, la invención comprende también secuencias de po 1 i nuc 1 eó t i do s aisladas que codifican proteínas mutantes de s-GDH de acuerdo con la presente invención como se describiera anteriormente. La presente invención incluye además un vector de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención unida de manera operable a una secuencia promotora capaz de dirigir su expresión en una célula hospedera.

La presente invención incluye además un vector de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención unida de manera operable a una secuencia promotora capaz de dirigir su expresión en una célula hospedera. Los vectores preferidos son plásmidos tal como pACSGDH mostrado en las Figuras 2 y 3. Los vectores de expresión útiles en la presente invención contienen típicamente un origen de replicación, una resistencia a antibióticos para la selección, un promotor para la expresión y la totalidad o parte de la variante del gen de s-GDH. Los vectores de expresión también pueden incluir otras secuencias de ADN conocidas en la técnica, como secuencias de señal (para un mejor plegamiento, transporte dentro del periplasma o secreción), inductores para una mejor modulación de la expresión o sitios de escisión para la clonación . Las características del vector de expresión seleccionado deben ser compatibles con la célula hospedera, la cual se debe emplear. Por ejemplo, cuando se clona en un sistema de células de E.coli, el vector de expresión debe contener promotores aislados del genoma de células de E. coli (por ejemplo, lac o trp) . Se pueden utilizar orígenes de replicación adecuados como el origen de replicación de plásmidos ColEl. Los promotores adecuados incluyen, por ejemplo, lac y trp. También se prefiere que el vector de expresión incluya una secuencia que codifica un marcador de selección como un gen de resistencia a antibióticos. Como los marcadores seleccionables , se puede emplear convenientemente la resistencia a la ampicilina o la resistencia a la canamicina. Todos estos materiales son conocidos en la técnica y están disponibles comercialmente . Los vectores de expresión adecuados que contienen las secuencias de codificación y de control deseadas se pueden construir utilizando técnicas estándar de ADN recombinante conocidas en la técnica, muchas de las cuales se describen en Sambrook y colaboradores, in "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (1989) Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press. La presente invención se refiere adicionalmente a células hospederas que contienen un vector de expresión el cual comprende una secuencia de ADN que codifica la totalidad o parte de la s-GDH mutante. Las células hospederas contienen preferiblemente un vector de expresión que comprende la totalidad o parte de una de las secuencias de ADN que codifican una s-GDH mutante que tiene una o más mutaciones mostradas en los Ejemplos 2-8. Las células hospederas adecuadas incluye, por ejemplo, HB101 de E. coli (ATCC 33694) disponible de Promega (2800 oods Hollow Road, Madison, I, EUA) , XLl-Blue MRF' disponible de Stratagene (11011 North Torrey Pine Road, La Jolla, CA, EUA) y similares.

Los vectores de expresión se pueden introducir en las células hospederas por medio de varios métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la transformación de células hospederas con vectores de expresión se puede llevar a cabo por medio del método de transformación de protoplastos mediado por polietilenglicol (Sambrook y colaboradores 1989, supra) . Sin embargo, otros métodos para introducir vectores de expresión en células hospederas, por ejemplo, también se puede emplear la electroporación, inyección biolistica o fusión de protoplastos. Una vez que un vector de expresión que contiene una variante de s-GDH ha sido introducido en una célula hospedera apropiada, la célula hospedera se puede cultivar bajo condiciones que permiten la expresión de las variantes deseadas de s-GDH. Las células hospederas que contienen el vector de expresión deseado con la secuencia de ADN que codifica la totalidad o parte de la s-GDH mutante se pueden identificar fácilmente por medio de ya sea la selección antibiótica. La expresión de las variantes de s-GDH se puede identificar por medio de diferentes métodos como la medición de la producción de transcripciones de ARNm de s-GDH, la detección de manera inmunológica del producto génico o la detección de la actividad enzimática del producto génico. Preferiblemente, se aplica un ensayo enzimático. La presente invención también enseña la generación y selección de mutantes de s-GDH. La mutagénesis aleatoria y mutagénesis de saturación se realizan como se sabe en la técnica. Las variantes se seleccionan para la termoestabilidad (actividad sin tratamiento de tensión térmica en comparación con la actividad restante después del tratamiento con tensión térmica) . Las condiciones de ensayo seleccionadas se adaptan para asegurar que se puedan medir los mejoramientos pequeños esperados que son producidos, por ejemplo, por una sustitución individual de aminoácido. Un modo preferido de selección de mutantes apropiados se proporciona en el Ejemplo 3. Cualquier cambio o mejoramiento en comparación con la enzima de partida (mutante o de tipo silvestre) se puede detectar claramente. Por supuesto, se debe entender que no todos los vectores de expresión y secuencias reguladoras de ADN funcionarían igualmente bien para expresar las secuencias de ADN de la presente invención. Ni todas las células hospederas funcionarán igualmente bien con el mismo sistema de expresión. Sin embargo, una persona de experiencia ordinaria en la técnica hará una selección apropiada entre los vectores de expresión, secuencias reguladoras de ADN y células hospederas utilizando la guía proporcionada en este documento sin experimentación indebida. La invención también se refiere a un proceso para generar variantes de s-GDH de la presente invención que comprende cultivar una célula hospedera de la invención bajo condiciones adecuadas para la producción de la s-GDH mutante de la invención. Para las células hospederas bacterianas, las condiciones de cultivo típicas son un medio líquido que contiene fuentes de carbono y nitrógeno, el antibiótico y el agente de inducción apropiados (dependiendo del vector de expresión utilizado) . Los antibióticos apropiados, típicos, incluyen ampicilina, canamicina, cloranfenicol , tetraciclina y similares. Los agentes de inducción típicos incluyen IPTG, glucosa, lactosa y similares. Se prefiere que los polipéptidos de la presente invención se obtengan por medio de la producción en células hospederas que expresan una secuencia de ADN que codifica la s-GDH mutante. Los polipéptidos de la presente invención también se pueden obtener por medio de la traducción in vitro del ARNm codificado por una secuencia de ADN que codifica la s-GDH mutante. Por ejemplo, las secuencias de ADN se pueden sintetizar como se describiera anteriormente y se pueden insertar en un vector de expresión adecuado, el cual a su vez se puede utilizar en un sistema de transcripción/traducción in vitro. Un vector de expresión que comprende un polinucleótido aislado definido y descrito anteriormente que está unido de manera operable a una secuencia promotora capaz de promover su expresión en un sistema de síntesis de péptidos libre de células representa otra modalidad preferida de la presente invención. Los polipéptidos producidos por medio de por ejemplo los procedimientos descritos anteriormente entonces se pueden aislar y purificar utilizando diversas técnicas de purificación de proteínas rutinarias. Por ejemplo, se pueden emplear procedimientos cromatográficos tales como la cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de filtración en gel y cromatografía de afinidad. Una de las aplicaciones principales de las variantes de s-GDH mejoradas de la invención es para el uso en tiras de prueba para supervisar el nivel de glucosa en la sangre en pacientes diabéticos. La insensibilidad de la glucosa deshidrogenasa dependiente de PQQ hacia el oxígeno es, como se describiera anteriormente, una gran ventaja sobre la glucosa oxidasa. La interferencia debido a por ejemplo maltosa, galactosa y/u otros azúcares relacionados los cuales pueden estar presentes en una muestra a ser analizada ahora se pueden reducir significativamente utilizando las variantes novedosas de s-GDH que tienen tanto termoestabilidad mejorada así como también especificidad mejorada hacia glucosa. Por supuesto, muchas clases de muestras se pueden investigar. Los fluidos corporales como suero, plasma, fluido intestinal u orina son fuentes preferidas para estas muestras. La invención también comprende un método para detectar, determinar o medir glucosa en una muestra utilizando un mutante de s-GDH de acuerdo con la presente invención. Se prefiere especialmente que el método mejorado para la detección de glucosa en una muestra esté caracterizado porque la detección, determinación o medición de glucosa se realiza utilizando un dispositivo de sensores o tiras de prueba. También está dentro del alcance de la invención un dispositivo para la detección o medición de glucosa en una muestra que comprende un mutante de s-GDH de acuerdo con esta invención así como también otros reactivos requeridos para la medición . Las variantes de s-GDH con termoestabilidad mejorada de esta invención también se pueden utilizar para tener una gran ventaja en los biosensores (D'Costa, E.J. y colaboradores, Biosensors 2 (1986) 71-87; Laurinavicius , V. y colaboradores, Analytical Letters 32 (1999) 299-316; Laurinavicius, V. y colaboradores, Monatshefte fuer Chemie 130 (1999) 1269-1281; Woosuck, S. y colaboradores, Sensors and Actuators B 100 (2004) 395-402) para la supervisión en línea de glucosa en una muestra o un reactor. Para este propósito, las variantes de s-GDH se pueden utilizar, por ejemplo, para revestir un electrodo de vidrio insensible al oxígeno con un complejo de osmio que contiene una red de epoxi conductiva redox (Ye y colaboradores, 1993 supra) para una determinación más precisa de la concentración de glucosa. En los siguientes ejemplos, todos los reactivos, enzimas de restricción y otros materiales se obtuvieron de Roche Diagnostics Germany, a menos que se especifiquen otras fuentes comerciales y se utilizaron de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por los proveedores. Las operaciones y métodos empleados para la purificación, caracterización y clonación de ADN son bien conocidos en la técnica (Ausubel, F. y colaboradores, in "Current protocols in molecular biology" (1994) Wiley Verlag) y se pueden adaptar como sea requerido por la persona experta. Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente la presente invención. Estos ejemplos no se proponen para limitar el alcance de la presente invención, sino que proporcionan un entendimiento adicional de la invención. Los siguientes ejemplos, listado de secuencias y figuras se proporcionan para ayudar en el entendimiento de la presente invención, el alcance verdadero el cual se expone en las reivindicaciones anexas. Se debe entender que se pueden hacer modificaciones en los procedimientos expuestos sin apartarse del espíritu de la invención.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Figura 1: Secuencias de proteínas de la s-GDH dependiente de PQQ de A. calcoaceticus (parte superior) y s-GDH de A. baumannii (parte inferior) alineadas de acuerdo con la homología de secuencias (cuyo título es "secuencias de aminoácidos de A. calcoaceticus (parte superior) y A. baumannii (parte inferior)"). Figura 2: Ilustración del vector pACSGDH referido en el Ejemplo 1 que contiene las secuencias de ADN de tipo silvestre y mutado, respectivamente, de la glucosa deshidrogenasa dependiente de PQQ soluble (cuyo título es "Diagrama esquemático del plásmido con un gen para s-GDH (pACSGDH ) " ) . Figura 3: Secuencia de nucleótidos (ADN) del vector pACSGDH referido en el Ejemplo 1 que contiene la secuencia de ADN de tipo silvestre de la glucosa deshidrogenasa dependiente de PQQ soluble.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Ejemplo 1 Clonación y expresión de la glucosa deshidrogenasa dependiente de PQQ soluble de A. calcoaceticus de tipo silvestre en E. coli El gen de s-GDH se aisló de la cepa LMD 79.41 de Acinetobacter calcoaceticus de acuerdo con procedimientos estándar. El gen de s-GDH de tipo silvestre se subclonó en un plásmido que contiene el promotor mgl para la expresión ajustable (véase la solicitud de patente WO 88/09373) . La nueva construcción se denominó pACSGDH (véase las Figuras 2 y 3 asi como también la SEC ID NO: 3) . Los plásmidos recombinantes se introdujeron en un organismo hospedante seleccionado del grupo de E. coli. Estos organismos entonces se cultivaron bajo condiciones apropiadas y se seleccionaron las colonias que mostraban actividad de s-GDH. El plásmido pACSGDH se aisló de un cultivo durante toda la noche de 200 mi del clon mencionado anteriormente utilizando el equipo QIAGEN Plasmid Maxi KitMR (Qiagen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El plásmido se resuspendió en 1 mi de agua bidestilada. La concentración del plásmido se determinó utilizando un fotómetro Beckman DU 7400MR. El rendimiento fue 600 µg . Entonces la calidad del plásmido se determinó por medio de la electroforesis de gel de agarosa.

Ejemplo 2 Generación de T348G mutante y T348S mutante Como plantillas de inicio para la generación de variantes mejoradas adicionales se manufacturó la s-GDH mutada con las mutaciones T348G o T348S, respectivamente. Estos mutantes de s-GDH se seleccionaron debido a que se sabe que tienen una especificidad de substrato mejorada por glucosa en comparación con el substrato maltosa (véase el documento WO 02/34919) . El equipo QuickChange Site-Directed Mutagenesis KitMR (Stratagene, Cat . 200518) se utilizó para sustituir la treonina en la posición 348 por una glicina o una serina. Los cebadores apropiados se diseñaron. El cebador 5' y el cebador 3' utilizados para la mutagénesis fueron complementarios entre si y contenían el codón modificado para el intercambio de treonina a glicina (ACA a GGG) o de treonina a serina (ACA a TCA) en una posición central. Estos nucleótidos estuvieron flanqueados por 12 a 16 nucleótidos en cada extremo. Las secuencias de los nucleótidos fueron idénticas a la cadena de ADN homosentido y antisentido que flanqueaba el codón para el intercambio de aminoácidos. En lugar de los codones ACA = treonina para la cadena homosentido y TGT para la cadena antisentido, respectivamente, los cebadores contenidos GGG = glicina o TCA = serina, respectivamente, para la cadena homosentido y CCC = glicina o AGT = serina, respectivamente, para la cadena antisentido. La cadena homosentido y la cadena antisentido para el intercambio de T348G se proporcionan como las SEC ID NOs: 3 y 4, respectivamente. CATTTGCTGG CCAGGGGTTG CACCGTCAT (=SEC ID NO: 4) ATGACGGTGC AACCCCTGGC CAGCAAATG (=SEC ID NO: 5) La reacción PCR y la digestión de Dpnl se realizaron de acuerdo con el manual. Después de esto, 1 µ? de muestra se utilizó para la electroporación de células XL-MRF' . La electroporación se logró con 2.5 KV en cubetas de 0.2 cm utilizando un Generador de Impulsos de E. coli BioRadMR (BioRad) . Después del crecimiento en 1 mi de LB a 37°C durante una hora, las bacterias se colocaron en placas de agar con medio de "4 x levadura" (20 g de extracto de lavadura + 5 g de NaCl, pH 7.0 a 1 1 de agua destilada) -Ampicilina (100 µ?/p?? de Ampicilina) y se desarrollaron durante toda la noche a 37°C. Los clones de s-GDH mutada se examinaron utilizando el siguiente método de selección.

Ejemplo 3 Selección Las colonias de mutantes en las placas de agar descritas anteriormente se recogieron en placas de microtitulo (MTPs) que contenían 200 µ? de medio de "4 x lavadura"-Ampicilina por pocilio y se incubaron durante toda la noche a 37°C. Estas placas se denominaron placas maestras. Para cada placa maestra, 5 µ? de muestra/pocilio se transfirieron a una MTP que contenía 5 µ? por pocilio de B (B = Reactivo de Extracción de Proteínas Bacterianas; Pierce No. 78248) para la ruptura de células y se agregaron 240 µ? de pirroloquinolina quinona 0.0556 mM (PQQ); Hepes 50 mM; CaCl2 15 mM pH 7.0/pocillo para la activación de s-GDH. Para completar la formación de la holoenzima, la MTP se incubó a 25°C durante 2 horas y a 10°C durante toda la noche. Esta placa se denominó placa de trabajo. Para la placa de trabajo se transfirieron 4 x 10 µ? de muestra por pocilio a cuatro MTPs vacias. Después, la primera alícuota se sometió a prueba con glucosa a una concentración estándar (es decir 30 m ) , la segunda con una concentración reducida de glucosa (1.9 mM en lugar de 30 mM) , la tercera con maltosa como substrato y la cuarta se sometió a tensión durante 30 minutos a 64 °C antes de someter a prueba esa alícuota del mismo modo que la primera alícuota. Todas las otras moléculas de azúcar seleccionadas se utilizaron en una concentración estándar equimolar, es decir a 30 mM. Para todos los ensayos, se aplicaron 90 µ? de solución mediadora (véase el Ejemplo 8) que ya contenía el azúcar a ser analizada. El valor dE/minuto se calculó y el valor utilizando glucosa 30 mM como substrato se estableció a 100% de actividad. El valor obtenido con la otra azúcar se comparó con el valor de glucosa y se calculó en porcentaje de actividad ((por ejemplo para maltosa como: dE/minuto maltosa/dE de glucosa)* 100). Esto es equivalente a la reactividad cruzada de la enzima (variante) . En las siguientes Tablas se proporciona "M/G", es decir la reactividad cruzada de s-GDH con maltosa (M) como substrato en comparación con glucosa (G) como substrato.

El valor obtenido con la glucosa 1.9 mM se comparó con el valor de glucosa 30 mM y se calculó en porcentaje de actividad relativa ((dE/minuto glucosa 1.9 mM/glucosa 30 mM) * 100). Esto proporciona un valor de % el cual es un indicador indirecto del valor Km para la variante analizada. De acuerdo con este cálculo, un valor de % más alto indica un valor Km más bajo (= mejor).

Tabla 1 : Características básicas de los mutantes T3486 y T348S en comparación con la s-GDH de tipo silvestre (WT) Ejemplo 4 Secuenciación de una s-GDH mutante El método se ejemplifica para el T348G de s-GDH. La secuenciación detallada posteriormente también se puede utilizar para la secuenciación de otros mutantes de s-GDH. Los siguientes cebadores se utilizaron para la secuenciación de un mutante de s-GDH: Cadena homosentido: 5'-TTA ACG TGC TGA ACA GCC GG-3' (= SEC ID NO: 6) Cadena antisentido: 5' -ATA TGG GTA AAG TAC TAC GC-3' (= SEC ID NO: 7) Los plásmidos que contenían el gen para el mutante T348G de s-GDH, mutante que tiene aproximadamente 22% de reactividad cruzada de maltosa/glucosa y T348S de s-GDH, mutante que tiene 50% de reactividad cruzada de maltosa/glucosa, respectivamente, se aislaron (High Puré Plasmid Isolation KitMR, Roche Diagnostics GmbH, No.1754785) y se secuenciaron utilizando el equipo ABI Prism Dye Terminator Sequencing KitMR y el secuenciador ABI 3/73 y 3/77MR (Amersham Pharmacia Biotech) . La secuenciación confirmó que las mutaciones deseadas en el ADN y en el nivel de aminoácidos se habían logrado para ambos mutantes. Esto dio por resultado un intercambio de T a G o a S, respectivamente, en la posición 348. No se ha descubierto una mutación adicional en los dos genes.

Ejemplo 5 Mutantes de s-GDH adicionales obtenidos por medio de la mutagénesis de saturación en base al T348G (mutante A) y T348S (mutante A' ) Las posiciones de aminoácidos candidatas son conocidas para los inventores de estudios previos conducidos por ellos. Estas posiciones de aminoácidos candidatas que se sospecha o se sabe que influyen en características relevantes de la s-GDH como termoestabilidad, especificidad de substrato o afinidad por glucosa se analizaron individualmente en base a ya sea el T348G (mutante A) o en base al T348S (mutante A'). La mutagénesis de saturación se realizó para posiciones de aminoácidos individuales a fin de evaluar que efecto podría tener esta sustitución de aminoácido individual sobre el mutante T348G o T348S, respectivamente. El equipo QuickChange Site-Directed Mutagénesis KitMR (Stratagene, Cat . 200518) se utilizó para sustituir sucesivamente los aminoácidos de tipo silvestre en las posiciones 87, 110, 122, 124, 145, 146, 169, 171, 187, 246, 294, 298, 300, 313, 323, 333, 339, 341, 349, 378, 428 y 436 de la proteína de s-GDH de tipo silvestre, respectivamente. El cebador 5' y el cebador 3' utilizados para la mutagénesis se seleccionaron para que fueran complementarios entre sí y contuvieran NNN (N = A, C, G o T) en una posición central. Los tres nucleótidos incorporados aleatoriamente N, los cuales están en la posición deseada y que codifican la posición de aminoácido bajo investigación estuvieron flanqueados por 12 a 16 nucleótidos en cada extremo los cuales eran idénticos a la cadena de ADN homosentido y antisentido de la plantilla. En lugar del codón de tipo silvestre, los cebadores contenían NNN por lo tanto los oligonucleótidos codificaron cada codón posible. Para cada una de las posiciones bajo investigación, se realizó una reacción PCR. Las reacciones PCR y las digestiones de endonucleasa de restricción Dpnl se realizaron de acuerdo con el manual proporcionado con el equipo QuickChange Site-Directed Mutagenesis KitMR (Stratagene, Cat. 200518) . De cada reacción PCR se utilizó 1 µ? para la electroporación de células XLIF. Las células se desarrollaron y las actividades de s-GDH de los clones se determinaron como se describiera anteriormente. Para incrementar la probabilidad estadística de que las 20 sustituciones de aminoácidos posibles sean cubiertas en esta evaluación, se seleccionaron 200 clones para cada posición como se describe en el Ejemplo 3. Los clones interesantes se secuenciaron de acuerdo con el método proporcionado en el Ejemplo 4.

Tabla 2 : Efecto de sustituciones de aminoácidos adicionales sobre características básicas del mutante A (=T348G) Enzima M/G en azúcar % de actividad relativa Estabilidad, Intercambio de 30 mM en % glucosa 1.9 mM/30 mM 30 min, 64eC aminoácidos (AA) Wt-GlucDOR 105% 70% 80% - Mutante A 22% 25% 40% T348G Mutante A/1 - 30% - + L 110 H Enzima M/G en % de actividad Estabilidad, Intercambio azúcar 30 relativa 30 min, 64°C de mM en % glucosa 1.9 mM/30 aminoácidos mM (AA) Muíante A/2 - 28% - + L110 Y Mutante A/3 40% 50% - + Q 246 H Muíante A/4 33% 30% - + Q 246 M Mutante A/5 35% 33% - + Q 246N Mutante A/6 - 30% - + Y 333 A Mutanle A/7 55% 40% - + G 339 T Mulante A/8 30% 45% - + V 436 P Mutanle A/9 28% 30% - + M 341 V Mutante A/10 25% 28% 40% + V 349 A Mutante A/11 26% 28% 40% + V 349 G Mutanle A/12 20% 27% - + Q 145 P Mutante A/13 17% 30% - + A 294 D Mutante A/14 15% 30% - + A 294 E Mutante A/15 20% 28% - + V 300 A Mutante A/16 20% 28% - + V 300 S Mutante A/17 20% 28% - + V 300 N Mutante A/18 20% 28% - + V 300 Y Mutante A/19 20% 28% - + V 300 I Mutante A/20 17% 25% - + T 323 V Mutante A/21 18% 26% - + R 378 I Mutante A/22 19% 26% - + R 378 M Mutante A/23 17% 26% - + R 378 A Mutante A/24 17% 28% - + R 378 D Enzima M/G en azúcar % de actividad relativa Estabilidad, Intercambio de 30 mM en % glucosa 1.9 mM/30 mM 30 min, 64°C aminoácidos (AA) Muíante A/25 15% 22% - + E 245 D Mutante A/26 18% 32% 30% + L 169 F Mutante A/27 18% 31 % 28% + Y 171 G Mutante A/28 12% 20% 20% + Ins 429 P Mutante A/29 - - 50% + D 87 R Mutante A/30 - - 70% + S 146 A Mutante A/31 - 75% + S 146 G Mutante A/32 - - 45% + L 187 F Mutante A/33 - - 50% + N 122 K Mutante A/34 - - 45% + S 124 K Mutante B 10% 35% 50% T 348 G + N 428 P Tabla 3 : Efecto de sustituciones de aminoácidos adicionales sobre características básicas del mutante A' (=T348S) Enzima M/G en azúcar % de actividad relativa Estabilidad, Intercambio de 30 mM en % glucosa 1.9 mM/30 mM 30 min, 64"C aminoácidos (AA) Wt-GlucDOR 105% 70% 80% - Mutante A' 50% 35% 50% T348S Mutante A71 55% 47% - + L 1 10 H Mutante A72 65% 70% - + Q 246 H Mutante A73 58% 50% + Q 246 M Mutante A74 60% 55% - + Q 246 N Enzima M/G en % de actividad relativa Estabilidad, Intercambio de azúcar 30 glucosa 1.9 mM/30 mM 30 min, 64°C aminoácidos mM en % (AA) Muíante A75 59% 50% - + G 339 T Mutante A76 60% 60% - + V 436 P Mutante A77 40% 35% - + A 294 D Mutante A78 38% 32% - + A 294 E Mutante A79 41 % 45% - + T 323 V Mutante 43% 47% + R 378 I A710 Mutante 44% 47% + R 378 M A71 1 Mutante 40% 50% + R 378 A A712 Mutante 40% 50% + R 378 D A713 Mutante 60% + D 87 R A714 Mutante 80% + S 146 A A715 Mutante 85% + S 146 G A716 Mutante 65% + V 298 L A717 Mutante 60% + T 313 D A718 Mutante 75% + L 386 F A719 Los intercambios de aminoácidos con un efecto positivo sobre la especificidad de substrato, afinidad por glucosa y/o termoestabilidad del mutante A o el mutante A' , respectivamente, se pueden derivar de las Tablas 2 y 3.

Ejemplo 6 Identificación de mu antes con termoestabilidad mejorada Los experimentos se han expandido a mutantes que tienen una especificidad de substrato bastante buena por glucosa en comparación con maltosa, pero a costa de desventajas como una termoestabilidad muy baja o una afinidad muy baja por glucosa. El comúnmente llamado mutante 6 tiene una baja reactividad cruzada muy favorable para la maltosa que es de solo aproximadamente 1.5% de la reactividad medida para la glucosa. El mutante 6 se caracteriza por las sustituciones de aminoácidos Y171G, E245D, M341V y T348G y tiene una inserción de una prolina (ins429P) entre las posiciones 428 y 429. Los siguientes cebadores se utilizaron para introducir estas sustituciones de aminoácidos deseadas: Cadena homosentido 5 ' -CCTATAAGAAAAAGACAGATACGCTCG-3 ' (SEC ID NO:8) Cadena antisentido 5 ' -CGAGCGTATCTGTCTTTTTCTTATAGG-3 ' (SEC ID: NO: 9) D87R: Cadena antisentido 5 ' -TTCCATCCTCGAGAGATTGTCAAT-3 ' (SEC ID NO:10) Cadena antisentido 5 ' -ATTGACAATCTCTCTGAGGATGGAA-3 ' (SEC ID: NO: 11) N122K y S124K: Cadena homosentido 5' -CGTTATACCTATAAGAAAAAGACAGATACGCTCG-3 ' (SEC ID NO: 12) Cadena antisentido 5 ' -CGAGCGTATCTGTCTTTTTCTTATAGGTATAACG-3 ' (SEC ID NO: 13 ) S146G: Cadena homosentido 5 ' -AAAAGACCATCAGGGTGGTCTCGAGAAG-3 ' (SEC ID NO:14) Cadena antisentido 5 ' -CTTCTCGAGACCACCCTGATGGTCTTTT-3 ' (SEC ID: NO:15) V298L: Cadena homosentido 5 ' -GCTCAAAATGGATTAAAAGTAGCCGCA-3 ' (SEC ID NO:16) Cadena antisentido 5 ' -TGCGGCTACTTTATTTCCATTTTGAGC-3 ' (SEC ID: NO: 17) L386F: Cadena homosentido 5 ' -CCGTATTAAGTTCGATCCAACTTATAGC-3 ' (SEC ID NO: 18) Cadena antisentido 5' -GCTATAAGTTGGATCGAACTTAATACGG-3' (SEC ID: NO:19) Tabla 4 : Mutaciones con un impacto positivo sobre la termoestabilidad de mutantes de s-GDH que ya comprenden otros mutantes para mejorar por ejemplo la especificidad por glucosa Enzima M/G en azúcar Estabilidad, Intercambio de aminoácidos 30 mM en % 30 min, 64°C WT 105% 80% Mutante A 25% 40% T348G Mutante V 25% 50% T348G +T313D Muíante VI 25% 45% T348G +N267Y Mutante 6 1.5% 5% N122K+L169F+Y171G + E245D+M341V+ T348G + ins429P Mutante 19 2% 10% N122K+S124K+L169F+Y171G+E245D+ M341V+T348G + ins429P Mutante 21 2% 15% N122K+S124K+L169F+Y171G+E245D+ M341V+T348G+L386F+¡ns429P Mutante 24 2% 25% N122K+S124K+L169F+Y171G+E245D+ M341V+T348G + L386F + ins429P Mutante 22 2.5% 20% N122K+S124K+L169F+Y171G+E245D+ Q246H + M341V+T348G + L386F + ins429P Mutante 25 2.5% 55% N122K+S124K+L169F+Y171G+E245D+ Q246H + M341V+T348G + L386F+ins429P Mutante 29 2.5% 75% D87R+N122K+S124K+S146G+L169F+ Y171G + E245D+Q246H+V298L+ M341V+T348S+L386F + ins429P Enzima M/G en Estabilidad, Intercambio de aminoácidos azúcar 30 30 min, 64°C mM en % Mutante 2.5% 60% D87R+N122K+S124K+S146G+L 169F+ Y171G + E245D+Q246H+V298L+ G339T+M341V+T348G+L386F+Í ns429P Mutante 3% 80% D87R+N122K+S124K+S146G+L 31 169F+ Y171 G + E245D+Q246H+V298L+ M341V+T348S+L386F+ins429P +V436P Mutante 3.3% 67% D87R+N122K+S124K+S146G+L 32 169F+ Y171 G+E245D+Q246H+V298L+ M341V+T348S+V349G+A354T+ L386F+ ins429P Mutante 4.3% 80% D87R+L110H+N122K+S124K+S146 33 G+L169F+Y171 G+E245D+Q246H+ V298L+M341 V+T348S+L386F+ins4 29P Los resultados muestran que los intercambios de aminoácidos D87R, N122K, S124K, S146A o G, preferiblemente G, S146G, L187F o M; N267Y, V298L, T313D y L386F mejoran la termoestabilidad del mutante básico 6. Las sustituciones D87R; N122K; S124K; S146G; V298L y L386F tienen efectos muy fuertes sobre los mejoramientos en la termoestabilidad.

Ejemplo 7 Generación de mutantes con una alta especificidad de substrato por glucosa en comparación con maltosa y el mejoramiento de la afinidad hacia glucosa En el documento WO 02/34919, varios intercambios de aminoácidos en diferentes posiciones de la s-GDH se han identificado y mostrado para mejorar la especificidad de substrato por glucosa en comparación con por ejemplo maltosa. Las combinaciones del intercambio de aminoácido T348G con sustituciones de aminoácidos en otras posiciones por ejemplo en las posiciones 169 , 171 , 245 , 341 y/o 349 mejoraron adicionalmente la especificidad de substrato. Varios mutantes diferentes de s-GDH con especificidad mejorada por glucosa en comparación con maltosa pero con una afinidad bastante baja por el substrato glucosa se seleccionaron y se hicieron intentos para mejorar su afinidad por glucosa. Como se sabe a partir de los experimentos resumidos en las Tablas 2 y 3 las sustituciones de aminoácidos L110H o Y; N229A, G o S ; Q246H, M o N ; Y333A; G339T; M341V; V349A o G y V436P parecen apropiadas para mejorar la afinidad de un mutante de s-GDH por glucosa. Los efectos más fuertes sobre la afinidad se observan con los mutantes L110H, Q246H; G339T; M341V; V349G y V436P. Los mejoramientos fuertes adicionales de la afinidad se encontraron con los intercambios de aminoácidos Q246H, M341V; V349G y V436P. Las mutaciones puntuales se introducen en mutantes ya existentes por medio de la misma estrategia como ya se explicó en el Ejemplo 6, por lo tanto en este punto solo se proporcionan los cebadores específicos para las sustituciones Q246H. Cadena homosentido 5 ' -GGTAAATTATTGCAGTCTGATCATGGCCC-3' (SEC ID NO: 20) Cadena antisentido 5 ' -GGGCCATGATCAGACTGCAATAATTTACC- 3 (SEC ID: NO:21) Se realizó la determinación de la afinidad hacia glucosa por vía de la selección de medición de valor Km como se describe en el Ejemplo 3. El valor Km aparente se calculó a partir de los diagramas de una concentración de substrato diferente contra actividad de enzima. La actividad específica se resolvió como se describe en el Ejemplo 8. Las combinaciones de intercambios identificados como apropiados para mejorar la especificidad de substrato, afinidad y/o estabilidad se han introducido en la s-GDH mutada con una especificidad estrictamente mejorada por glucosa en comparación con maltosa.

Tabla 5 : Combinación de varias sustituciones de aminoácidos en mutantes de s-GDH con especificidad de substrato mejorada por glucosa en comparación con maltosa Enzimas selección de valor Km valor Km M/G Actividad valor Km aprox. aprox. en % específica en % Glucosa mM Maltosa mM U/mg WT 70 0.7 1.4 105 800 Mutante 6 8 64.7 714 1 .5 268 Mut.13 (=Mutante 6 +Q246H) 20 17.1 208 3 430 Mutante G 12 11 1 10 2 351 Mut.J (=Mutante G + Q246H) 18 8 143 3 489 Mutante 22 18 1 1 n.d. 2.5 400 Mutante 23 (=mutante 22, + 15 13 n.d. 2 350 Q246N) Mutante 29 (como el mutante 21 11 n.d. 2.5 400 22, excepto por T348S) Mutante 30 (= mutante 26 9 n.d. 2.5 350 22 + G339T Mutante 31 ( = mutante 33 6 n.d. 3 380 29 + V436P) Mutante 32 ( = mutante 32 n.d. n.d. 3.3 220 29 + V349G + A354T) Mutante 33 ( = mutante 28 n.d. n.d. 4.3 350 29 + L1 10H) Se puede observar claramente que en todos los tipos de mutantes, el intercambio de aminoácido adicional Q246H produjo un mejoramiento de afinidad hacia glucosa y un mejoramiento concerniente a la actividad especifica. El mutante 6 tiene los intercambios de aminoácidos en la posición T348G, N122K, L169F, Y171G, E245D, M341V y una inserción de prolina en la posición 429 como el mutante 13 y Q246H adicional. El mutante J tiene los intercambios de aminoácidos en la posición T348G, Y171G, E245D, 341V, N428P como el mutante G y Q246H adicional. El mutante 22 tiene los intercambios de aminoácidos en la posición T348G, N122K, S124K, L169F, Y171G, E245D, Q246H, M341V, L386F y una inserción de prolina en la posición 429. El mutante 29 tiene todos los intercambios del mutante 22 excepto T348G, el cual se intercambia a T348S y dio por resultado un mejoramiento de la velocidad. Los mutantes 30 y 31 lograron valores Km aún más altos para glucosa al intercambiar adicionalmente G339T y V436P.

Ejemplo 8 Purificación de la s-GDH de tipo silvestre o variante y análisis de la actividad enzimática y actividad especifica, respectivamente Las células de E. coli que comprendían un vector de expresión de s-GDH apropiado se desarrollan (4 x levadura-Ampicilina 37°C), se recolectaron y se resuspendieron en amortiguador de fosfato de potasio pH 7.0. La ruptura de células se realizó por medio del pasaje de Prensa Francesa (700-900 bares) . Después de la centrifugación, el sobrenadante se aplicó a una columna de S-SepharoseMR (Amersham Pharmacia Biotec) equilibrada con amortiguador de fosfato de potasio 10 mM pH 7.0. Después del lavado, la s-GDH se eluyó utilizando un gradiente de sal de NaCl 0-1 M. Las fracciones que mostraban actividad de s-GDH se acumularon, se dializaron contra amortiguador de fosfato de potasio pH 7.0 y se sometieron a la cromatografía de nuevo en la columna S-sepharoseMR equilibrada de nuevo. Las fracciones activas se acumularon y se sujetaron a la filtración de gel utilizando una columna Superdex 200MR (Amersham) . Las fracciones activas se acumularon y después de la adición de CaCl2 (concentración final 3 mM) se almacenaron a -20°C. La determinación de proteínas se realizó utilizando el Reactivo de Ensayo de Proteínas no. 23225 de Pierce (curva de calibración con BSA, 30 Minutos 37°C) . Para la medición de la actividad de enzima, las muestras de s-GDH se diluyeron a 1 mg de proteína/ml con pirroloquinolina quinona 0.0556 mM (PQQ); Hepes 50 mM; CaCl2 15 mM pH 7.0 y se incubaron a 25°C durante 30 minutos para la reconstitución o la activación.

Después de la activación, las muestras se diluyeron con Hepes 50 mM; CaCl2 15 mM pH 7.0 a aproximadamente 0.02 U/ml y se agregaron 50 µ? de cada muestra diluida a 1000 µ? de una solución amortiguadora de citrato 0.2 M (pH 5.8; a 25°C) que contenia 0.315 mg de ( 4- (dimetilfosfinilmetil ) -2-metil-pirazolo-[1.5a] -imidazol-3-il ) - (4-nitro-sofenil) -amina (véase la Patente estadounidense No. 5 , 484 , 708 ) /mi como mediador y azúcar 30 mM. La extinción a 620 nm se supervisa durante los primeros 5 minutos a 25°C. Una unidad de actividad de enzima corresponde a la conversión de mediador 1 mMol/minuto bajo las condiciones de ensayo anteriores.

Cálculo: Actividad de Volumen (U/ml) = (volumen total * dE/minuto [U/ml]): (e * volumen de muestra * 1) (e = coeficiente de extinción; e620 nm = 30 [1* mmol"1 * cm'1] ) . Actividad Especifica (U/mg) = Actividad de volumen U/ml dividida por la concentración de proteina mg/ml resultados en U/mg Los ensayos se realizaron con glucosa y maltosa (Merck, Alemania), respectivamente. Los resultados que se refieren a la actividad de enzima asi como también la actividad especifica se han incluido en las Tablas proporcionadas en los Ejemplos previos . Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (16)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un mutante de glucosa deshidrogenasa soluble dependiente de PQQ (s-GDH; EC 1.1.5.2) con especificidad mejorada por glucosa en comparación con maltosa, que tiene una sustitución de treonina en la posición 348 por ya sea glicina, alanina o serina, caracterizado porque comprende adicionalmente a) por lo menos una mutación para mejorar la estabilidad del mutante, b) por lo menos una mutación para mejorar la afinidad del mutante hacia glucosa y opcionalmente , c) una o más mutaciones para mejorar adicionalmente la especificidad del mutante por glucosa en comparación con maltosa y en donde estas posiciones corresponden a las posiciones de aminoácidos conocidas a partir de la secuencia de tipo silvestre de s-GDH de A. calcoaceticus (SEC ID NO: 2) .
2. 2. El mutante de s-GDH de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la mutación para mejorar la afinidad hacia glucosa se selecciona del grupo que consiste de L110H o Y; N229A, G o S; Q246H, M o N; Y333A; G339T; M341V; V349A o G y V436P.
3. 3. El mutante de s-GDH de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la mutación se selecciona del grupo que consiste de LllOH, Q246H; G339T; M341V; V349A y V436P.
4. 4. El mutante de s-GDH de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la mutación para mejorar la especificidad del mutante por glucosa en comparación con maltosa es una sustitución de aminoácido seleccionado del grupo que consiste de Q145P; D163G o N; Q164F; L169F; Y171G; I208L o V; T224I; E245D; G276S; A294D o E; V300A, S, N, Y o I; T307G; T323V; A354Y, E o L; R378I, M, A o D; N428P y la inserción 429 P.
5. 5. El mutante de s-GDH de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la sustitución para mejorar la estabilidad se selecciona del grupo que consiste de D87R; N122K; S124K; S146G; V298L y L386F.
6. 6. El mutante de s-GDH de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la sustitución para mejorar la afinidad hacia glucosa se selecciona del grupo que consiste de LllOH, Q246H; G339T; M341V; V349G y V436P.
7. 7. El mutante de s-GDH de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la sustitución para mejorar la especificidad del mutante por glucosa en comparación con maltosa se selecciona del grupo que consiste de L169F; Y171G; E245D; N428P y la inserción 429P.
8. 8. Un polinucleótido aislado, caracterizado porque codifica una proteina mutante de s-GDH de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
9. 9. Un vector de expresión que comprende un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque se une de manera operable a una secuencia promotora capaz de promover la expresión del polinucleótido en una célula hospedera.
10. 10. Una célula hospedera, caracterizada porque comprende el vector de expresión de conformidad con la reivindicación 9.
11. 11. Un proceso para generar mutantes de s-GDH, caracterizado porque comprende cultivar la célula hospedera de conformidad con la reivindicación 10 bajo condiciones adecuadas para la producción de los mutantes de enzimas.
12. 12. Un vector de expresión, caracterizado porque comprende un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 11 unido de manera operable a una secuencia promotora capaz de promover su expresión en un sistema de síntesis de péptidos libre de células.
13. 13. Un proceso para generar mutantes de s-GDH con la construcción de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque es en un sistema de síntesis de péptidos libre de células bajo condiciones adecuadas para la producción de los mutantes de enzimas.
14. 14. Un método para detectar, determinar o medir la glucosa en una muestra utilizando un mutante de s-GDH de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque comprende poner en contacto la muestra con el mutante.
15. 15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado adicionalmente porque la detección, determinación o medición de glucosa se realiza utilizando un dispositivo de sensores o tiras de prueba.
16. 16. Un dispositivo para la detección o medición de glucosa en una muestra, caracterizado porque comprende un mutante de s-GDH de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y otros reactivos requeridos para la medición .