ES2624805T3

ES2624805T3 - Mutantes mejorados de glucosa deshidrogenasa soluble dependiente de pirroloquinolina quinona

Info

Publication number: ES2624805T3
Application number: ES07724148.7T
Authority: ES
Inventors: Mara Boenitz-Dulat; Daniela Beck; Peter Kratzsch; Rainer Schmuck; Herbert Von Der Eltz
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2006-04-13
Filing date: 2007-04-11
Publication date: 2017-07-17
Anticipated expiration: 2027-04-11
Also published as: JP2016119904A; PL3246402T3; KR20080106349A; PL2010649T3; BRPI0710131B1; JP5937547B2; US20090148874A1; JP6185617B2; CA2649135C; ES2807530T3; CN101421396B; AU2007237478B2; CN101421396A; JP5683809B2; BRPI0710131A2; EP2010649A1; JP2009533033A; JP2013198497A; AU2007237478A1; HK1131633A1

Abstract

Un mutante de glucosa deshidrogenasa soluble dependiente de PQQ (s-GDH; EC 1.1.5.2) con especificidad mejorada por la glucosa en comparación con la maltosa, que tiene una sustitución de treonina en la posición 348 por glicina, alanina o bien serina, en el que dicho mutante comprende adicionalmente a) al menos una mutación para mejorar la estabilidad del mutante, en el que dicha sustitución para mejorar la estabilidad se selecciona del grupo que consiste en D87R; N122K; S124K; S146G; V298L y L386F, b) al menos una mutación para mejorar la afinidad del mutante por la glucosa, y opcionalmente c) una o más mutaciones para mejorar aún más la especificidad del mutante por la glucosa en comparación con la maltosa, y en el que estas posiciones corresponden a las posiciones de aminoácidos conocidas de la secuencia natural de s-GDH de A. calcoaceticus (SEQ ID NO: 2).

Description

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acuerdo con la presente invención comprende una arginina en la posición 87, una lisina en la posición 122 y 124, una glicina en la posición 146, una leucina en la posición 298 y una fenilalanina en la posición 386 de la SEQ ID NO: 2, o en una posición correspondiente a dichas posiciones si se usa una s-GDH homóloga.

5 En otro modo de realización preferente, la presente invención se refiere a un mutante de glucosa deshidrogenasa soluble dependiente de PQQ (s-GDH; EC 1.1.5.2) con especificidad mejorada por la glucosa en comparación con la maltosa, que tiene una sustitución de treonina en la posición 348, ya sea por glicina o por alanina o por serina, en el que dicho mutante comprende adicionalmente al menos una mutación para mejorar la estabilidad del mutante y al menos una mutación para mejorar la afinidad por la glucosa del mutante.

10 El término "afinidad" por un sustrato es bien conocido en la técnica. Se da en mM como el así denominado valor de Km. Son conocidos diversos procedimientos en la técnica para determinar la afinidad de s-GDH, usando glucosa u otros azúcares como sustratos, véase, Igarashi, S., et al., Biochem Biophys Res Commun 264 (1999) 820.

15 En el cribado de nuevas variantes con el extracto bruto de E. coli, se realizó un cálculo del porcentaje del valor de Km para la evaluación más rápida de los clones generados. La afinidad hacia la glucosa por los mutantes de s-GDH candidatos se calculó de acuerdo con la cinética de Michaelis-Menten bien conocida.

El mutante de s-GDH de acuerdo con la presente invención tiene una afinidad mejorada por la glucosa en

20 comparación con un mutante que comprende una sustitución de treonina en la posición 348 por glicina, alanina o serina. Preferentemente, la afinidad por el sustrato de la glucosa se determina como se describe en detalle en la sección de ejemplos.

Preferentemente, la una o más mutaciones para mejorar la afinidad por la glucosa de un mutante de s-GDH que ya

25 comprende una sustitución de treonina en la posición 348 por glicina, alanina o bien serina es una sustitución de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en L110H o Y; N229A, G o S; Q246H, M o N; Y333A; G339T; M341V; V349A o G y V436P.

En caso de que el aminoácido correspondiente a la posición 110 de la secuencia natural de s-GDH conocida de A.

30 calcoaceticus (SEQ ID NO: 2) esté sustituido en una variante de la presente invención, es preferente que el aminoácido leucina de origen natural esté sustituido por un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en histidina y tirosina. Es más preferente la sustitución en la posición 110 por histidina.

En caso de que el aminoácido correspondiente a la posición 229 de la secuencia natural de s-GDH conocida de A.

35 calcoaceticus (SEQ ID NO: 2) esté sustituido en una variante de la presente invención, es preferente que el aminoácido asparagina de origen natural esté sustituido por un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en alanina, glicina y serina. Es más preferente la sustitución en la posición 229 por alanina.

En caso de que el aminoácido correspondiente a la posición 349 de la secuencia natural de s-GDH conocida de A.

40 calcoaceticus (SEQ ID NO: 2) esté sustituido en una variante de la presente invención, es preferente que el aminoácido valina de origen natural esté sustituido por un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en alanina y glicina. Es más preferente la sustitución en la posición 349 por glicina.

También preferente, la mutación para mejorar la afinidad por la glucosa se selecciona del grupo que consiste en 45 L110H, Q246H; G339T; M341V, V349G y V436P.

También preferente, dicha sustitución para mejorar la afinidad por la glucosa se selecciona de Q246H; G339T; M341V y V349G. Una s-GDH preferente de acuerdo con la presente invención comprende dos o tres de estas sustituciones o todas estas cuatro sustituciones.

50 En otro modo de realización preferente, el mutante de s-GDH descrito anteriormente con especificidad mejorada por la glucosa en comparación con la maltosa, que tiene una sustitución de treonina en la posición 348 por glicina, alanina o bien serina y que comprende al menos una mutación para mejorar la estabilidad, comprende adicionalmente una o más mutaciones para mejorar la especificidad de sustrato del mutante por la glucosa en

55 comparación con la maltosa.

Para ciertas aplicaciones, la especificidad de sustrato de un mutante de s-GDH con especificidad mejorada por la glucosa en comparación con la maltosa, que tiene una sustitución de treonina en la posición 348 por glicina, alanina

o bien serina, puede todavía no ser suficiente para ciertas aplicaciones de rutina.

60 En ciertos modos de realización, puede ser necesario generar un mutante de s-GDH que, además de la mutación analizada anteriormente en la posición 348, comprenda una o más mutaciones adicionales para mejorar aún más la especificidad del mutante por la glucosa en comparación con la maltosa.

65 El término "especificidad de sustrato" o "especificidad" es bien conocido para el técnico experto.

Para el cálculo de la especificidad de sustrato o la reactividad cruzada, un modo fácil es establecer la actividad medida con glucosa como sustrato como el 100 % y comparar la actividad medida con el otro azúcar seleccionado con el valor de glucosa. A veces, para no ser redundante, se usa simplemente el término especificidad sin hacer especial referencia a la glucosa por una parte y a otro sustrato de azúcar seleccionado por otra parte.

5 El experto en el campo apreciará que la comparación de las actividades enzimáticas se realiza mejor a concentraciones equimolares de las moléculas de sustrato investigadas usando condiciones de ensayo bien definidas. De lo contrario, tienen que hacerse correcciones para las diferencias en las concentraciones.

10 Tienen que elegirse condiciones de ensayo estandarizadas y bien definidas para evaluar (las mejoras en) la especificidad de sustrato. La actividad enzimática de s-GDH por la glucosa como sustrato, así como para otros sustratos de azúcar seleccionados, se mide como se describe en la sección de ejemplos.

Sobre la base de las mediciones de la actividad enzimática por la glucosa o la maltosa, respectivamente, se evalúa 15 la reactividad cruzada (y la mejora de la misma).

La reactividad (cruzada) de s-GDH por la maltosa en porcentaje se calcula como

reactividad cruzada [%] = (actividad de maltosa/actividad de glucosa) x 100 %.

20 La reactividad (cruzada) por la maltosa de s-GDH natural de acuerdo con la fórmula anterior se ha determinado como aproximadamente del 105 % (véase el documento WO 02/34919).

La especificidad se calcula de acuerdo con la siguiente fórmula: 25 actividad por glucosa del mutante actividad por maltosa natural especificidad = ---------------------------------------------------x ------------------------------------------------actividad por maltosa del mutante actividad por glucosa natural

30 Las mejoras en la especificidad de un mutante de s-GDH novedoso son reconocidas como valores más pequeños en el cálculo anterior, en comparación con un mutante de s-GDH con especificidad mejorada por la glucosa en comparación con la maltosa, que tiene una sustitución de treonina en la posición 348 por glicina, alanina o bien serina.

35 Como el experto en la técnica apreciará, los números absolutos dependerán del número y tipo de mutaciones ya presentes en un mutante. El número y tipo de mutaciones ya presentes en un mutante se pueden denominar el fondo de mutante. Cualquier mutación novedosa se puede comparar directamente con el fondo de mutante.

Preferentemente, la mutación para mejorar aún más la especificidad de sustrato por la glucosa en comparación con

40 la maltosa es una sustitución de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en Q145P; D163G o N; Q164F; L169F; Y171G; I208L o V; T224I; E245D; G276S; A294D o E; V300A, S, N, Y o I; T307G; T323V; A354Y, E o L; R378I, M, A o D; N428P y la inserción 429 P. El término "inserción 429" se usa para indicar que entre la posición 428 y la posición 429 de la SEQ ID NO: 2 se inserta una prolina.

45 En caso de que el aminoácido correspondiente a la posición 169 de la secuencia natural de s-GDH conocida de A. calcoaceticus (SEQ ID NO: 2) esté sustituido en una variante de la presente invención, es preferente que el aminoácido leucina de origen natural esté sustituido por fenilalanina, tirosina o triptófano. Es más preferente la sustitución en la posición 169 por fenilalanina.

50 En caso de que el aminoácido correspondiente a la posición 171 de la secuencia natural de s-GDH conocida de A. calcoaceticus (SEQ ID NO: 2) esté sustituido en una variante de la presente invención, es preferente que el aminoácido tirosina de origen natural esté sustituido por un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en el grupo que consiste en alanina, metionina, glicina. Es más preferente la sustitución en la posición 171 por glicina.

55 En caso de que el aminoácido correspondiente a la posición 245 de la secuencia natural de s-GDH conocida de A. calcoaceticus (SEQ ID NO: 2) esté sustituido en una variante de la presente invención, es preferente que el aminoácido ácido glutámico de origen natural esté sustituido por ácido aspártico, asparagina o glutamina. Es más preferente la sustitución en la posición 245 por ácido aspártico.

60 En caso de que el aminoácido correspondiente a la posición 341 de la secuencia natural de s-GDH conocida de A. calcoaceticus (SEQ ID NO: 2) esté sustituido en una variante de la presente invención, es preferente que el aminoácido metionina de origen natural esté sustituido por valina, alanina, leucina o isoleucina. Es más preferente la sustitución en la posición 341 por valina.

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Un vector de expresión que comprende un polinucleótido aislado como se define y se describe anteriormente, ligado operativamente a una secuencia promotora que puede promover su expresión en un sistema de síntesis de péptido libre de células, representa otro modo de realización preferente de la presente invención.

Los polipéptidos producidos, por ejemplo, por procedimientos como se describe anteriormente, se pueden aislar y purificar a continuación mediante diversas técnicas de purificación de proteínas rutinarias. Por ejemplo, se pueden emplear procedimientos cromatográficos tales como cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de filtración en gel y cromatografía de afinidad.

Una de las principales aplicaciones de las variantes mejoradas de s-GDH de la presente invención es para el uso en tiras de prueba para controlar el nivel de glucosa en sangre en pacientes diabéticos. La insensibilidad de la glucosa deshidrogenasa dependiente de PQQ hacia el oxígeno es, como se analiza anteriormente, una gran ventaja sobre la glucosa oxidasa. La interferencia debido a, por ejemplo, maltosa, galactosa, y/u otros azúcares relacionados que pueden estar presentes en una muestra a analizar, se puede reducir significativamente ahora usando las variantes de s-GDH novedosas que tienen tanto termoestabilidad mejorada como mejor especificidad hacia la glucosa. Por supuesto, se pueden investigar muchos tipos de muestras. Los líquidos corporales como suero, plasma, líquido intestinal u orina son las fuentes preferentes para dichas muestras.

La invención también comprende un procedimiento para detectar, determinar o medir glucosa en una muestra usando un mutante de s-GDH de acuerdo con la presente invención. Es especialmente preferente que el procedimiento mejorado para la detección de glucosa en una muestra se caracterice porque dicha detección, determinación o medición de la glucosa se lleva a cabo usando un dispositivo sensor o de tira de prueba.

También está dentro del alcance de la presente invención un dispositivo para la detección o medición de glucosa en una muestra que comprende un mutante de s-GDH de acuerdo con la presente invención, así como otros reactivos necesarios para dicha medición.

Las variantes de s-GDH con termoestabilidad mejorada de la presente invención también se pueden usar con gran ventaja en biosensores (D'Costa, E.J., et al, Biosensores 2 (1986) 71-87; Laurinavicius, V., et al, Analytical Letters 32 (1999) 299-316; Laurinavicius, V., et al, Monatshefte fuer Chemie 130 (1999) 1269-1281; Woosuck, S. et al, Sensors and Actuators B 100 (2004) 395-402) para el control en línea de la glucosa en una muestra o un reactor. Con este propósito, las variantes de s-GDH se pueden usar, por ejemplo, para recubrir un electrodo vítreo insensible al oxígeno con un complejo de osmio que contiene una red epoxi conductora redox (Ye et al., 1993 supra) para la determinación más exacta de la concentración de glucosa.

En los siguientes ejemplos, todos los reactivos, enzimas de restricción y otros materiales se obtuvieron de Roche Diagnostics Alemania, a menos que se especifiquen otras fuentes comerciales, y se usaron de acuerdo con las instrucciones dadas por los proveedores. Las operaciones y procedimientos empleados para la purificación, caracterización y clonación de ADN son bien conocidos en la técnica (Ausubel, F., et al., En " Current protocols in molecular biology" (1994) Wiley Verlag) y se pueden adaptar según sea necesario por el experto en la técnica.

Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente la presente invención. Estos ejemplos no están destinados a limitar el alcance de la presente invención, sino que proporcionan una mayor comprensión de la invención.

Los siguientes ejemplos, listado de secuencias y figuras se proporcionan para ayudar a la comprensión de la presente invención, cuyo verdadero alcance se expone en las reivindicaciones adjuntas.

Descripción de las figuras

Figura 1: Secuencias de proteínas de s-GDH dependiente de PQQ de A. calcoaceticus (parte superior) y s-GDH de

A. baumannii (parte inferior) alineadas de acuerdo con la homología de secuencia.

Figura 2: Ilustración del vector pACSGDH al que se hace referencia en el ejemplo 1 que contiene las secuencias de ADN natural o mutado, respectivamente, de glucosa deshidrogenasa dependiente de PQQ soluble.

Figura 3: Secuencia de nucleótidos (ADN) del vector pACSGDH al que se hace referencia en el ejemplo 1 que contiene la secuencia de ADN natural de glucosa deshidrogenasa dependiente de PQQ soluble.

Ejemplo 1

Clonación y expresión de glucosa deshidrogenasa soluble dependiente de PQQ natural de A. calcoaceticus en E. coli

Se aisló el gen de s-GDH de la cepa LMD 79.41 de Acinetobacter calcoaceticus de acuerdo con procedimientos estándares. Se subclonó el gen de s-GDH natural en un plásmido que contenía el promotor mgl para expresión regulable (véase la solicitud de patente WO 88/09373). La nueva construcción se denominó pACSGDH (véanse las

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Las reacciones de PCR y las digestiones de endonucleasa de restricción DpnI se llevaron a cabo de acuerdo con el manual proporcionado con el kit de mutagénesis dirigida a sitio QuickChange (Stratagene, Cat. 200518).

5 A partir de cada reacción de PCR, se usó 1 µl para la electroporación de células XL1F. Se hicieron crecer las células y se determinaron las actividades de s-GDH de los clones como se describe anteriormente.

Para aumentar la probabilidad estadística de que todas las 20 posibles sustituciones de aminoácidos estén cubiertas en esta evaluación, se cribaron 200 clones para cada posición como se describe en el ejemplo 3. Se secuenciaron 10 los clones de interés de acuerdo con el procedimiento dado en el ejemplo 4.

Tabla 2: Efecto de las sustituciones de aminoácidos adicionales sobre las características básicas del mutante A (= T348G)

Enzima: M/G a azúcar 30 mM en % % de actividad relativa de glucosa 1,9 mM / 30 mM Estabilidad, 30 min, 64 ºC Intercambio de aminoácidos (AA)

Wt-GlucDOR: 105 % 70 % 80 % -

Mutante A: 22 % 25 % 40 % T348G

Mutante A/1: - 30 % - + L 110 H

Mutante A/2: - 28 % - + L110 Y

Mutante A/3: 40 % 50 % - + Q 246 H

Mutante A/4: 33 % 30 % - + Q 246 M

Mutante A/5: 35 % 33 % - + Q 246 N

Mutante A/6: - 30 % - + Y 333 A

Mutante A/7: 55 % 40 % - + G 339 T

Mutante A/8: 30 % 45 % - + V 436 P

Mutante A/9: 28 % 30 % - + M 341 V

Mutante A/10: 25 % 28 % 40 % + V 349 A

Mutante A/11: 26 % 28 % 40 % + V 349 G

Mutante A/12: 20 % 27 % - + Q 145 P

Mutante A/13: 17 % 30 % - + A 294 D

Mutante A/14: 15 % 30 % - + A 294 E

Mutante A/15: 20 % 28 % - + V 300 A

Mutante A/16: 20 % 28 % - + V 300 S

Mutante A/17: 20 % 28 % - + V 300 N

Mutante A/18: 20 % 28 % - + V 300 Y

Mutante A/19: 20 % 28 % - + V 300 I

Mutante A/20: 17 % 25 % - + T 323 V

Mutante A/21: 18 % 26 % - + R 378 I

Mutante A/22: 19 % 26 % - + R 378 M

Mutante A/23: 17 % 26 % - + R 378 A

Mutante A/24: 17 % 28 % - + R 378 D

Mutante A/25: 15 % 22 % - + E 245 D

Mutante A/26: 18 % 32 % 30 % + L 169 F

Mutante A/27: 18 % 31 % 28 % + Y 171 G

Mutante A/28: 12 % 20 % 20 % + Ins 429 P

Mutante A/29: - - 50 % + D 87 R

Mutante A/30: - - 70 % + S 146 A

Mutante A/31: - - 75 % + S 146 G

Mutante A/32: - - 45 % + L 187 F

Mutante A/33: - - 50 % + N 122 K

Mutante A/34: - - 45 % + S 124 K

Mutante B: 10 % 35 % 50 % T 348 G+N 428 P

Tabla 3: Efecto de las sustituciones de aminoácidos adicionales sobre las características básicas del mutante A '(= T348S)

Wt-GlucDOR: 105 % 70 % 80 % -

Mutante A': 50 % 35 % 50 % T348S

Mutante A’/1: 55 % 47 % - + L 110 H

Mutante A'/ 2: 65 % 70 % - + Q 246 H

Mutante A’/3: 58 % 50 % - + Q 246 M

Mutante A’/4: 60 % 55 % - + Q246 N

Mutante A’/5: 59 % 50 % - + G 339 T

Mutante A’/6: 60 % 60 % - + V 436 P

Mutante A’/7: 40 % 35 % - + A 294 D

Mutante A’/8: 38 % 32 % - + A 294 E

Mutante A’/9: 41 % 45 % - + T 323 V

Mutante A’/10: 43 % 47 % - + R 378 I

Mutante A’/11: 44 % 47 % - + R 378 M

Mutante A’/12: 40 % 50 % - + R 378 A

Mutante A’/13: 40 % 50 % - + R 378 D

Mutante A’/14: - - 60 % + D 87 R

Mutante A’/15: - - 80 % + S 146 A

Mutante A’/16: - - 85 % + S 146 G

Mutante A’/17: - - 65 % + V 298 L

Mutante A’/18: - - 60 % + T 313 D

Mutante A’/19: - - 75 % + L 386 F

Los intercambios de aminoácidos con un efecto positivo sobre la especificidad del sustrato, afinidad por la glucosa y/o termoestabilidad del mutante A o mutante A', respectivamente, se pueden derivar de las tablas 2 y 3.

5 Ejemplo 6 Identificación de mutantes con termoestabilidad mejorada

Los experimentos se han ampliado a los mutantes que tienen una especificidad de sustrato por la glucosa bastante 10 buena en comparación con la maltosa, pero a costa de desventajas como termoestabilidad demasiado baja o afinidad por la glucosa demasiado baja.

El así denominado mutante 6 tiene una reactividad cruzada baja bastante favorable por la maltosa que es solo aproximadamente un 1,5 % de la reactividad medida para la glucosa. El mutante 6 se caracteriza por las 15 sustituciones de aminoácidos Y171G, E245D, M341V y T348G y tiene una inserción de una prolina (ins429P) entre las posiciones 428 y 429.

Se usaron los siguientes cebadores para introducir estas sustituciones de aminoácidos deseadas:

D87R:

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N122K y S124K:

V298L:

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L386F:

Tabla 4: Mutaciones con un impacto positivo sobre la termoestabilidad de los mutantes de s-GDH que ya comprenden otros mutantes para, por ejemplo, mejorar la especificidad por la glucosa

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Enzima: % M/G a azúcar 30 mM en Estabilidad, 30 min, 64 ºC Intercambios de aminoácidos

WT: 105 % 80 % -

Mutante A: 25 % 40 % T348G

Mutante V: 25 % 50 % T348G+T313D

Mutante VI: 25 % 45 % T348G+N267Y

Mutante 6: 1,5 % 5 % N122K+L169F+Y171G+E245D+M341V+ T348G+ins429P

Mutante 19: 2 % 10 % N122K+S124K+L169F+Y171G+E245D+ M341V+T348G+ins429P

Mutante 21: 2 % 15 % N122K+S124K+L169F+Y171G+E245D+ M341V+T348G+L386F+ins429P

Mutante 24: 2 % 25 % N122K+S124K+L169F+Y171G+E245D+ M341V+T348G+L386F+ins429P

Mutante 22: 2,5 % 20 % N122K+S124K+L169F+Y171G+E245D+ Q246H+M341V+T348G+L386F +ins429P

Mutante 25: 2,5 % 55 % N122K+S124K+L169F+Y171G+E245D+ Q246H+M341V+T348G+L386F +ins429P

Mutante 29: 2,5 % 75 % D87R+N122K+S124K+S146G+L169F+ Y171G+E245D+Q246H+V298L+ M341V+T348S+L386F+ins429P

Mutante 30: 2,5 % 60 % D87R+N122K+S124K+S146G+L169F+ Y171G+E245D+Q246H+V298L+ +G339T+M341V+T348G+L386F+ins429P

Mutante 31: 3 % 80 % D87R+N122K+S124K+S146G+L169F+ Y171G+E245D+Q246H+V298L+ M341V+T348S+L386F+ins429P+V436P

Mutante 32: 3,3 % 67 % D87R+N122K+S124K+S146G+L169F+ Y171G+E245D+Q246H+V298L+ M341V+T348S+V349G+A354T+L386F+ ins429P

Mutante 33: 4,3 % 80 % D87R+L110H+N122K+S124K+S146G+L169F+Y171G+E2 45D+Q246H+V298L+ M341V+T348S+L386F+ins429P

10 Los resultados anteriores muestran que los intercambios de aminoácidos D87R, N122K, S124K, S146A o G, preferentemente G, S146G, L187F o M; N267Y, V298L, T313D y L386F mejoran la termoestabilidad del mutante 6 básico.

15 Las sustituciones D87R; N122K; S124K; S146G; V298L y L386F tienen efectos bastante fuertes sobre las mejoras en la termoestabilidad.

Ejemplo 7

20 Generación de mutantes con alta especificidad de sustrato por la glucosa en comparación con la maltosa y mejora de la afinidad hacia la glucosa

En el documento WO 02/34919, se han identificado varios intercambios de aminoácidos en diferentes posiciones de s-GDH y se muestra que potencian la especificidad de sustrato por la glucosa en comparación con, por ejemplo, la

25 maltosa. Las combinaciones del intercambio de aminoácidos T348G con sustituciones de aminoácidos en otras posiciones, por ejemplo, en las posiciones 169, 171, 245, 341 y/o 349, potenciaban la especificidad de sustrato además. Se seleccionaron varios mutantes de s-GDH diferentes con especificidad mejorada por la glucosa, pero en comparación con la maltosa con una afinidad bastante baja por el sustrato glucosa, y se hicieron intentos por mejorar su afinidad por la glucosa.

30 Como es conocido a partir de los experimentos resumidos en las tablas 2 y 3, las sustituciones de aminoácidos L110H o Y; N229A, G o S; Q246H, M o N; Y333A; G339T; M341V; V349A o G y V436P parecen apropiadas para

potenciar la afinidad de un mutante de s-GDH por la glucosa. Se observan los efectos más fuertes sobre la afinidad con los mutantes L110H, Q246H; G339T; M341V; V349G y V436P. Se encontraron otras fuertes mejoras de afinidad con los intercambios de aminoácidos Q246H, M341V; V349G y V436P. Se introducen mutaciones puntuales en los mutantes ya existentes mediante la misma estrategia que ya se ejemplifica en el ejemplo 6, por lo tanto, aquí se dan solo los cebadores específicos para las sustituciones Q246H.

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10 Se realizó la determinación de la afinidad por la glucosa a través del cribado de la medición del valor de Km como se describe en el ejemplo 3. Se calculó el valor de Km aparente a partir de las gráficas de diferente concentración de sustrato frente a la actividad enzimática.

La actividad específica se resolvió como se ha descrito en el ejemplo 8.

15 Las combinaciones de los intercambios identificados como apropiados para mejorar la especificidad de sustrato, afinidad y/o estabilidad se han introducido en s-GDH mutada con especificidad claramente mejorada por la glucosa en comparación con la maltosa.

20 Tabla 5: Combinación de diversas sustituciones de aminoácidos en mutantes de s-GDH con especificidad de sustrato mejorada por la glucosa en comparación con la maltosa

Enzimas: Valor de Km de cribado en % Valor de Km ap. en mM de glucosa Valor de Km ap. en mM de maltosa M/G en % Actividad específica U/mg

WT: 70 0,7 1,4 105 800

Mutante 6: 8 64,7 714 1,5 268

Mut.13 (= mutante 6+Q246H): 20 17,1 208 3 430

Mutante G: 12 11 110 2 351

Mut.J (= mutante G+Q246H): 18 8 143 3 489

Mutante 22: 18 11 n.d. 2,5 400

Mutante 23 (= Mutante 22+Q246N): 15 13 n.d. 2 350

Mutante 29 (como el mutante 22, pero T348S): 21 11 n.d. 2,5 400

Mutante 30 (= mutante 22+G339T): 26 9 n.d. 2,5 350

Mutante 31 (= mutante 29+V436P): 33 6 n.d. 3 380

Mutante 32 (= mutante 29+V349G+A354T): 32 n.d. n.d. 3,3 220.

Mutante 33 (= mutante 29+ L110H): 28 n.d. n.d. 4,3 350

Se puede ver claramente que, en todos los tipos mutantes, el intercambio de aminoácidos adicional Q246H producía

25 un potenciamiento de la afinidad hacia la glucosa y una mejora sobre la actividad específica. El mutante 6 tiene los intercambios de aminoácidos en la posición T348G, N122K, L169F, Y171G, E245D, M341V y una inserción de prolina en la posición 429 como el mutante 13 y Q246H adicional. El mutante J tiene los intercambios de aminoácidos en la posición T348G, Y171G, E245D, M341V, N428P como el mutante G y Q246H adicional.

30 El mutante 22 tiene los intercambios de aminoácidos en la posición T348G, N122K, S124K, L169F, Y171G, E245D, Q246H, M341V, L386F y una inserción de prolina en la posición 429. El mutante 29 tiene todos los intercambios del mutante 22 excepto T348G, que se intercambia a T348S, y daba lugar a una mejora de la velocidad. Los mutantes 30 y 31 conseguían valores aún más altos de Km por la glucosa intercambiando adicionalmente G339T y V436P.

35 Ejemplo 8

Purificación de s-GDH natural o variante y análisis de la actividad enzimática y la actividad específica, respectivamente

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Claims

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