JPWO2019045052A1 - 糖化ヘモグロビンオキシダーゼ改変体及び測定方法 - Google Patents
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Abstract
Description
このHbA1cを迅速かつ簡便に測定する方法として、従来、アマドリアーゼを用いる数種類の酵素的方法が知られている。
すなわちモデル基質として、下記3種のα−フルクトシルオクタペプチド(αF8P)を用意した:
α-fru-V-H-L-T-P-E-E-K(本明細書においてHbA1c型αF8Pという)
α-fru-V-H-L-T-P-V-E-K(本明細書においてHbS1c型αF8Pという)
α-fru-V-H-L-T-P-K-E-K(本明細書においてHbC1c型αF8Pという)
[1] HbS1cまたはHbC1cを含み得る試料に糖化ヘモグロビンオキシダーゼを作用させる工程を含む、試料中のHbS1cまたはHbC1cを測定する方法。
[2] 糖化ヘモグロビンオキシダーゼの作用により生じる還元型化合物の量を測定する、実施形態1に記載の方法。
[3] 測定される還元型化合物が過酸化水素である、実施形態2に記載の方法。
[4] 糖化ヘモグロビンオキシダーゼが(a)及び/又は(b)の性質を有する、実施形態1〜3のいずれかに記載の方法、
(a) HbS1c型αF8Pに対する活性とHbA1c型αF8Pに対する活性との比、すなわち相対活性[HbS1c/HbA1c]が0.45以上である、
(b) HbC1c型αF8Pに対する活性とHbA1c型αF8Pに対する活性との比、すなわち相対活性[HbC1c/HbA1c]が0.15以上である。
[5] 糖化ヘモグロビンオキシダーゼの至適pH範囲が6〜8、作用pH範囲が5〜9、至適温度範囲が25〜40℃であり、SDS-PAGE上での分子量が約45〜55KDaである、実施形態1〜4のいずれかに記載の方法。
[6] 糖化ヘモグロビンオキシダーゼが、以下の(i)〜(viii)からなる群より選択される糖化ヘモグロビンオキシダーゼ改変体である、実施形態1〜5のいずれかに記載の方法、
(i) 糖化ヘモグロビンオキシダーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における113位に対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸、アスパラギン酸、アラニン、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸に改変されている糖化ヘモグロビンオキシダーゼ改変体、
(ii) 糖化ヘモグロビンオキシダーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における109位に対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸、アラニン、アスパラギン酸、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸に改変されている糖化ヘモグロビンオキシダーゼ改変体、
(iii) 糖化ヘモグロビンオキシダーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における106位に対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸、アラニン、アスパラギン酸、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸に改変されている糖化ヘモグロビンオキシダーゼ改変体、
(iv) 糖化ヘモグロビンオキシダーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における102位に対応する位置のアミノ酸がアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸に改変されている糖化ヘモグロビンオキシダーゼ改変体、
(v) 前記(i)、(ii)、(iii)、又は(iv)において、配列番号1に示すアミノ酸配列における113位、109位、106位、及び102位に対応する位置以外の位置における1又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなる糖化ヘモグロビンオキシダーゼ改変体、
(vi) 前記(i)、(ii)、(iii)、又は(iv)において、当該糖化ヘモグロビンオキシダーゼの全長アミノ酸配列が配列番号1又は配列番号45のアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有し、当該糖化ヘモグロビンオキシダーゼにおける、配列番号1の60位に対応する位置のアミノ酸がグリシンであり、配列番号1の239位に対応する位置のアミノ酸がトリプトファン、フェニルアラニン又はチロシンであり、配列番号1の282位に対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸であり、配列番号1の376位に対応する位置のアミノ酸がグリシンであり、配列番号1の418位に対応する位置のアミノ酸がアルギニンであり、配列番号1の15〜20位に対応する位置のアミノ酸配列がGly-Xaa-Gly-Xaa-Xaa-Gly(ここでXaaは任意のアミノ酸を示す)である、糖化ヘモグロビンオキシダーゼ改変体、
(vii) 前記(i)、(ii)、(iii)、又は(iv)において、当該糖化ヘモグロビンオキシダーゼの全長アミノ酸配列が配列番号1又は配列番号45のアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有し、配列番号1又は配列番号45の相同性領域におけるアミノ酸配列と当該糖化ヘモグロビンオキシダーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが90%以上の配列同一性を有する糖化ヘモグロビンオキシダーゼ改変体、或いは
(viii) 前記(i)、(ii)、(iii)、又は(iv)において、当該糖化ヘモグロビンオキシダーゼの全長アミノ酸配列が配列番号1又は配列番号45のアミノ酸配列と50%以上の配列同一性を有し、配列番号1又は配列番号45の相同性領域におけるアミノ酸配列と当該糖化ヘモグロビンオキシダーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが70%以上の配列同一性を有し、当該糖化ヘモグロビンオキシダーゼにおける、配列番号1の60位に対応する位置のアミノ酸がグリシンであり、配列番号1の239位に対応する位置のアミノ酸がトリプトファン、フェニルアラニン又はチロシンであり、配列番号1の282位に対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸であり、配列番号1の376位に対応する位置のアミノ酸がグリシンであり、配列番号1の418位に対応する位置のアミノ酸がアルギニンであり、配列番号1の15〜20位に対応する位置のアミノ酸配列がGly-Xaa-Gly-Xaa-Xaa-Gly(ここでXaaは任意のアミノ酸を示す)である、糖化ヘモグロビンオキシダーゼ改変体。
[7] 試料中のHbS1cまたはHbC1cを測定するための糖化ヘモグロビンオキシダーゼ。
[8] HbS1cまたはHbC1cに糖化ヘモグロビンオキシダーゼを作用させて生じる還元型化合物の量を測定するためのものである、実施形態7に記載の糖化ヘモグロビンオキシダーゼ。
[9] 生じる還元型化合物が過酸化水素である、実施形態8に記載の糖化ヘモグロビンオキシダーゼ。
[10] 糖化ヘモグロビンオキシダーゼが(a)及び/又は(b)の性質を有する、実施形態7〜9のいずれかに記載の糖化ヘモグロビンオキシダーゼ、
(a) HbS1c型αF8Pに対する活性とHbA1c型αF8Pに対する活性との比、すなわち相対活性[HbS1c/HbA1c]が0.45以上である、
(b) HbC1c型αF8Pに対する活性とHbA1c型αF8Pに対する活性との比、すなわち相対活性[HbC1c/HbA1c]が0.15以上である。
[11] 糖化ヘモグロビンオキシダーゼの至適pH範囲が6〜8、作用pH範囲が5〜9、至適温度範囲が25〜40℃であり、SDS-PAGE上での分子量が約45〜55KDaである、実施形態7〜10のいずれかに記載の糖化ヘモグロビンオキシダーゼ。
[12] 糖化ヘモグロビンオキシダーゼが、以下の(i)〜(viii)からなる群より選択されるものである、実施形態7〜11のいずれかに記載の糖化ヘモグロビンオキシダーゼ、
(i) 糖化ヘモグロビンオキシダーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における113位に対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸、アスパラギン酸、アラニン、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸に改変されている糖化ヘモグロビンオキシダーゼ改変体、
(ii) 糖化ヘモグロビンオキシダーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における109位に対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸、アラニン、アスパラギン酸、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸に改変されている糖化ヘモグロビンオキシダーゼ改変体、
(iii) 糖化ヘモグロビンオキシダーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における106位に対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸、アラニン、アスパラギン酸、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸に改変されている糖化ヘモグロビンオキシダーゼ改変体、
(iv) 糖化ヘモグロビンオキシダーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における102位に対応する位置のアミノ酸がアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸に改変されている糖化ヘモグロビンオキシダーゼ改変体、
(v) 前記(i)、(ii)、(iii)、又は(iv)において、配列番号1に示すアミノ酸配列における113位、109位、106位、及び102位に対応する位置以外の位置における1又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなる糖化ヘモグロビンオキシダーゼ改変体、
(vi) 前記(i)、(ii)、(iii)、又は(iv)において、当該糖化ヘモグロビンオキシダーゼの全長アミノ酸配列が配列番号1又は配列番号45のアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有し、当該糖化ヘモグロビンオキシダーゼにおける、配列番号1の60位に対応する位置のアミノ酸がグリシンであり、配列番号1の239位に対応する位置のアミノ酸がトリプトファン、フェニルアラニン又はチロシンであり、配列番号1の282位に対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸であり、配列番号1の376位に対応する位置のアミノ酸がグリシンであり、配列番号1の418位に対応する位置のアミノ酸がアルギニンであり、配列番号1の15〜20位に対応する位置のアミノ酸配列がGly-Xaa-Gly-Xaa-Xaa-Gly(ここでXaaは任意のアミノ酸を示す)である、糖化ヘモグロビンオキシダーゼ改変体、
(vii) 前記(i)、(ii)、(iii)、又は(iv)において、当該糖化ヘモグロビンオキシダーゼの全長アミノ酸配列が配列番号1又は配列番号45のアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有し、配列番号1又は配列番号45の相同性領域におけるアミノ酸配列と当該糖化ヘモグロビンオキシダーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが90%以上の配列同一性を有する糖化ヘモグロビンオキシダーゼ改変体、或いは
(viii) 前記(i)、(ii)、(iii)、又は(iv)において、当該糖化ヘモグロビンオキシダーゼの全長アミノ酸配列が配列番号1又は配列番号45のアミノ酸配列と50%以上の配列同一性を有し、配列番号1又は配列番号45の相同性領域におけるアミノ酸配列と当該糖化ヘモグロビンオキシダーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが70%以上の配列同一性を有し、当該糖化ヘモグロビンオキシダーゼにおける、配列番号1の60位に対応する位置のアミノ酸がグリシンであり、配列番号1の239位に対応する位置のアミノ酸がトリプトファン、フェニルアラニン又はチロシンであり、配列番号1の282位に対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸であり、配列番号1の376位に対応する位置のアミノ酸がグリシンであり、配列番号1の418位に対応する位置のアミノ酸がアルギニンであり、配列番号1の15〜20位に対応する位置のアミノ酸配列がGly-Xaa-Gly-Xaa-Xaa-Gly(ここでXaaは任意のアミノ酸を示す)である、糖化ヘモグロビンオキシダーゼ改変体。
[13] コニオカエタ(Coniochaeta)属、ユーペニシリウム(Eupenicillium)属、ピレノケータ(Pyrenochaeta)属、アルスリニウム(Arthrinium)属、カーブラリア(Curvularia)属、ネオコスモスポラ(Neocosmospora)属、クリプトコッカス(Cryptococcus)属、フェオスフェリア(Phaeosphaeria)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、エメリセラ(Emericella)属、ウロクラディウム(Ulocladium)属、またはペニシリウム(Penicillium)属のアマドリアーゼに基づくものである、実施形態7〜12のいずれかに記載の糖化ヘモグロビンオキシダーゼ。
[14] アマドリアーゼがコニオカエタ エスピー(Coniochaeta sp.)、ユーペニシリウム テレナム(Eupenicillium terrenum)、ピレノケータ エスピー(Pyrenochaeta sp.)、アルスリニウム エスピー(Arthrinium sp.)、カーブラリア クラベータ(Curvularia clavata)、ネオコスモスポラ バシンフェクタ(Neocosmospora vasinfecta)、クリプトコッカス ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、フェオスフェリア ノドラム(Phaeosphaeria nodorum)、アスペルギルス ニードランス(Aspergillus nidulans)、エメリセラ ニードランス(Emericella nidulans)属、ウロクラディウム エスピー(Ulocladium sp.)、またはペニシリウム ヤンシネラム(Penicillium janthinelum)もしくはペニシリウム クリソゲナム(Penicillium chrysogenum)由来である、実施形態13に記載の糖化ヘモグロビンオキシダーゼ。
[15] 実施形態7〜14のいずれかに記載の糖化ヘモグロビンオキシダーゼを含む、HbS1cまたはHbC1c測定用試薬組成物。
[16] 実施形態7〜14のいずれかに記載の糖化ヘモグロビンオキシダーゼをコードする、遺伝子。
[17] 実施形態16に記載の遺伝子を含む、ベクター。
[18] 実施形態17に記載のベクターを含む、宿主細胞。
[19] 以下の工程を含む、糖化ヘモグロビンオキシダーゼの製造方法、
(i)実施形態18に記載の宿主細胞を、糖化ヘモグロビンオキシダーゼを発現しうる条件下で培養する工程、及び
(ii)培養物又は培養液から糖化ヘモグロビンオキシダーゼを単離する工程。
[20] 以下の工程を含む、アマドリアーゼ又はA1cオキシダーゼを改変して糖化ヘモグロビンオキシダーゼを作製する方法、
(i) アマドリアーゼ遺伝子又はA1cオキシダーゼ遺伝子を取得する、
(ii) アマドリアーゼ遺伝子又はA1cオキシダーゼ遺伝子をベクターに組み入れ、宿主細胞を形質転換し、アマドリアーゼ又はA1cオキシダーゼを発現させ、発現産物を単離する、(iii) 発現産物の相対活性[HbS1c/HbA1c]及び/又は相対活性[HbC1c/HbA1c]を測定する、(iv) アマドリアーゼ又はA1cオキシダーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における113位、109位、106位又は102位に対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸、アスパラギン酸、アラニン、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸に改変されるよう、前記アマドリアーゼ遺伝子又はA1cオキシダーゼ遺伝子を改変する、
(v) 改変後の遺伝子をベクターに組み入れ、宿主細胞を形質転換し、改変体を発現させ、発現産物を単離する、
(vi) 改変体の発現産物の相対活性[HbS1c/HbA1c]及び/又は相対活性[HbC1c/HbA1c]を測定し、工程(iii)の値と比較する、
(vii) 改変前のアマドリアーゼ若しくはA1cオキシダーゼの相対活性[HbS1c/HbA1c]と比較して、改変後の改変体の相対活性[HbS1c/HbA1c]が1.1倍以上増大している、かつ/又は改変前のアマドリアーゼ若しくはA1cオキシダーゼの相対活性[HbC1c/HbA1c]と比較して、改変後の改変体の相対活性[HbC1c/HbA1c]が1.1倍以上増大している場合、当該改変体を糖化ヘモグロビンオキシダーゼとする、並びに
(viii) 必要に応じて、工程(vii)の糖化ヘモグロビンオキシダーゼについて、工程(iv)〜(vi)を繰り返す。
ヘモグロビンとしては、正常ヘモグロビンであるヘモグロビンA(HbA)の他に、異常ヘモグロビン、例えばヘモグロビンS(HbS)やヘモグロビンC(HbC)が挙げられる。本明細書において糖化ヘモグロビンとは、非酵素的に糖化されたヘモグロビンをいう。本明細書において糖化ヘモグロビンという場合、この用語は、糖化されたHbAのみならず、糖化された異常ヘモグロビン、例えば糖化されたHbS及び糖化されたHbCも包含するものとする。糖化ヘモグロビンは生体内では血液等に存在する。糖化ヘモグロビンの中でもHbAのβ鎖アミノ末端のバリンが糖化された糖化ヘモグロビンを特にヘモグロビンA1c(HbA1c)と言う。ここで、糖化されたHbSまたはHbCには、β鎖に結合した糖の種類に応じて種々の糖化HbSまたは糖化HbCがあり得る。しかしながら本明細書では、便宜上、糖化HbSという場合、特に断らない限り、これはHbSのβ鎖アミノ末端のバリンが糖化されたものをいうものとする(HbS1cということもできる)。また本明細書では、便宜上、糖化HbCという場合、特に断らない限り、これはHbCのβ鎖アミノ末端のバリンが糖化されたものをいうものとする(HbC1cということもできる)。
本発明における糖化ペプチドとは、糖化タンパク質由来の非酵素的に糖化されたペプチドを指し、ペプチドが直接非酵素的に糖化されたものや、プロテアーゼ等により糖化タンパク質が分解された結果生じたものや糖化タンパク質を構成する(ポリ)ペプチドが糖化されたものが含まれる。糖化ペプチドをフルクトシルペプチドと表記することもある。糖化タンパク質において、糖化を受けるペプチド側のアミノ基としては、アミノ末端のα−アミノ基、ペプチド内部のリジン残基側鎖のε−アミノ基などが挙げられるが、本発明における糖化ペプチドとは、より具体的には、α−アミノ基が糖化されたα−糖化ペプチド(α−フルクトシルペプチド)である。
本発明の糖化ヘモグロビンオキシダーゼは、HbA1c、より具体的にはHbA1cのβ鎖に直接作用する。ここで直接作用する、とは、アマドリアーゼが酸素の存在下で糖化ヘモグロビンのβ鎖のN末端のフルクトシル基に作用し、2-ケト-Dグルコースおよび過酸化水素、ヘモグロビンのβ鎖が生じることをいう。また本発明の糖化ヘモグロビンオキシダーゼは、HbA1c型αF8Pに作用する。さらに、重要なこととして、本発明の糖化ヘモグロビンオキシダーゼは、HbA1c型αF8Pのみならず、HbS1c型αF8P及び/又はHbC1c型αF8Pにも作用する。HbA1c型αF8Pに作用するアマドリアーゼがHbA1cにも作用することが知られていることから(特許文献21)、本発明の糖化ヘモグロビンオキシダーゼはHbA1cのみならず、糖化HbS及び/又は糖化HbCにも作用すると合理的に考えられる。すなわちある実施形態において、本発明の糖化ヘモグロビンオキシダーゼは、HbA1cのみならず、糖化HbS及び/又は糖化HbCにも作用する。
ある実施形態において、本発明の糖化ヘモグロビンオキシダーゼ改変体は、改変前のA1cオキシダーゼと比較してHbS1c型αF8Pに対する相対活性が向上している。HbS1c型αF8Pに対する相対活性とは、酵素量や反応条件を一定とした場合のHbS1c型αF8Pに対する活性とHbA1c型αF8P(正常型αF8P)に対する活性との比、すなわち(HbS1c型αF8Pに対する活性/HbA1c型αF8Pに対する活性)をいう。HbS1c型αF8Pに対する活性/HbA1c型αF8Pに対する活性を便宜上、本明細書において相対活性[HbS1c/HbA1c]と表記することがある。
アマドリアーゼは、ケトアミンオキシダーゼ、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、フルクトシルペプチドオキシダーゼ、フルクトシルアミンオキシダーゼとも呼ばれる。アマドリアーゼは、酸素の存在下で、イミノ2酢酸若しくはその誘導体(アマドリ化合物)を酸化して、グリオキシル酸若しくはα−ケトアルデヒド、アミノ酸若しくはペプチド、および過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素のことをいう。アマドリアーゼは、自然界に広く分布しており、微生物や、動物若しくは植物起源の酵素を探索することにより、得ることができる。微生物においては、例えば、糸状菌、酵母、若しくは細菌等から得ることができる。
アマドリアーゼをコードする遺伝子(以下、単に「アマドリアーゼ遺伝子」ともいう)を得るには、通常一般的に用いられている遺伝子のクローニング方法が用いられる。例えば、アマドリアーゼ生産能を有する微生物菌体や種々の細胞から常法、例えば、Current Protocols in Molecular Biology(WILEY Interscience,1989)記載の方法により、染色体DNAまたはmRNAを抽出することができる。さらにmRNAを鋳型としてcDNAを合成することができる。このようにして得られた染色体DNAまたはcDNAを用いて、染色体DNAまたはcDNAのライブラリーを作製することができる。
アマドリアーゼ遺伝子の変異処理は、企図する変異形態に応じた、公知の任意の方法で行うことができる。すなわち、アマドリアーゼ遺伝子あるいは当該遺伝子の組み込まれた組換え体DNAと変異原となる薬剤とを接触・作用させる方法;紫外線照射法;遺伝子工学的手法;または蛋白質工学的手法を駆使する方法等を広く用いることができる。
アマドリアーゼ遺伝子は、常法により、バクテリオファージ、コスミド、または原核細胞若しくは真核細胞の形質転換に用いられるプラスミド等のベクターに組み込むことができる。これを用いて、各々のベクターに対応する宿主を、常法により形質転換又は形質導入しうる。大腸菌の宿主としては、各種大腸菌株、例えばK−12株、JM109株(タカラバイオ社)、DH5α株(タカラバイオ社)等が挙げられるがこれに限らない。
アマドリアーゼの中でもHbA1cに直接作用するものをA1cオキシダーゼ(A1cOX)と呼ぶことがある。A1cOX遺伝子は特許文献20〜22の教示に基づき、上記のアマドリアーゼ遺伝子から作製しうる。これらの均等物も本発明に利用しうる。
A1cOX遺伝子に本発明の変異を導入することによりA1cOX改変体を作製し、糖化HbSや糖化HbCに対する相対活性の増大した糖化ヘモグロビンオキシダーゼを製造しうる。
本発明の糖化ヘモグロビンオキシダーゼは、配列番号1の113位、109位、106位及び/又は102位に対応する位置に、変異を有しうる。対応する位置については下記に説明する。ある実施形態では、Coniochaeta sp. NISL 9330由来アマドリアーゼ(配列番号1)に基づくA1cOX又はEmericella nidulans由来アマドリアーゼ(配列番号11)に基づくアマドリアーゼ(例えば配列番号45)に、以下の位置において1又は複数のアミノ酸置換を導入しうる:
(a)配列番号1の113位に対応する位置
(a’)配列番号1の109位に対応する位置
(b)配列番号1の106位に対応する位置
(c)配列番号1の102位に対応する位置
本明細書において、ある基準となるアミノ酸配列中の特定の位置が別の類似するアミノ酸配列中の特定の位置と対応する場合、これを対応する位置という。また対応する位置のアミノ酸を対応するアミノ酸という。本明細書では便宜上、配列番号1に示すConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列を基準として説明する。この場合、アミノ酸配列における「対応する位置」とは、配列番号1に示すConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列の特定の位置に対応する他の生物種由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列における位置をいう。
本明細書において、「配列番号1のアミノ酸配列の113位に対応する位置」とは、対象のアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1のアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号1の113位に対応する位置をいう。これは、上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図1又は図2より特定することができる。配列番号1の109位に対応する位置、106位に対応する位置、及び102位に対応する位置についても同様である。
アミノ酸配列の相同性、同一性又は類似性は、GENETYX(GENETYX社製)のマキシマムマッチングやサーチホモロジー等のプログラム、またはDNASIS Pro(日立ソリューションズ社製)のマキシマムマッチングやマルチプルアライメント、またはCLUSTAL Wのマルチプルアライメント等のプログラムにより計算することができる。アミノ酸配列同一性を計算するために、2以上のアマドリアーゼをアライメントしたときに、該2以上のアマドリアーゼにおいて同一であるアミノ酸の位置を調べることができる。こうした情報を基に、アミノ酸配列中の同一領域を決定できる。ここで2以上のアミノ酸配列について、同一性%とは、Blosum62等のアルゴリズムを利用して2以上のアミノ酸配列のアラインメントを行った際に、アラインメント可能であった領域の総アミノ酸数を分母とし、そのうち同一のアミノ酸によって占められる位置の数を分子としたときのパーセンテージをいう。故に、通常、2以上のアミノ酸配列に同一性が全く見られない領域がある場合、例えばC末端に同一性が全く見られない付加配列が一方のアミノ酸配列にある場合、当該同一性のない領域はアラインメント不可能であるため、同一性%の算出には利用されない。
本明細書において「相同性領域」とは、2以上のアマドリアーゼをアライメントしたときに、ある基準となるアマドリアーゼと比較対象のアマドリアーゼの対応する位置におけるアミノ酸が同一であるか又は類似アミノ酸からなる領域であって、連続する3以上、4以上、5以上、6以上、7以上、8以上、9以上又は10以上のアミノ酸からなる領域をいう。例えば、図1では全長アミノ酸配列の配列同一性が、配列番号1のアマドリアーゼを基準として74%以上であるアマドリアーゼをアライメントした。このうち、配列番号1で示されるConiochaeta sp.由来アマドリアーゼを基準として第10位〜32位は同一又は類似アミノ酸からなり、よって相同性領域に該当する。同様に、配列番号1で示されるConiochaeta sp. 由来アマドリアーゼを基準として、10位〜32位、36〜41位、49〜52位、54〜58位、63〜65位、73〜75位、84〜86位、88〜90位、120〜122位、145〜150位、156〜162位、164〜170位、180〜182位、202〜205位、207〜211位、214〜224位、227〜230位、236〜241位、243〜248位、258〜261位、266〜268位、270〜273位、275〜287位、295〜297位、306〜308位、310〜316位、324〜329位、332〜334位、341〜344位、346〜355位、357〜363位、370〜383位、385〜387位、389〜394位、405〜410位及び423〜431位は相同性領域に該当しうる。ある実施形態においてアマドリアーゼの相同性領域はこれらの位置からなる領域である。別のアマドリアーゼを基準とした場合、配列番号1のこれらの位置にそれぞれ対応する位置も相同性領域に該当しうる。例えば、同様に、配列番号45で示されるEmericella nidulans由来アマドリアーゼを基準として、配列番号45の9位〜31位、35〜40位、48〜51位、53〜57位、62〜64位、72〜74位、83〜85位、87〜89位、119〜121位、144〜149位、155〜161位、163〜169位、179〜181位、202〜205位、207〜211位、214〜224位、227〜230位、236〜241位、243〜248位、258〜261位、266〜268位、270〜273位、275〜287位、295〜297位、306〜308位、310〜316位、324〜329位、332〜334位、341〜344位、346〜355位、357〜363位、370〜383位、385〜387位、389〜394位、405〜410位及び424〜432位は相同性領域に該当しうる。ある実施形態においてアマドリアーゼの相同性領域はこれらの位置からなる領域である。配列番号45の元となった配列番号11についても同様である。
アマドリアーゼの特定のアミノ酸残基は基質の糖部分(例えばフルクトシル基)と相互作用することが知られている。そしてそのようなアミノ酸残基は、各種アマドリアーゼにおいて保存性が高い。ある実施形態において、アマドリアーゼは、配列番号1の239位に対応する位置のアミノ酸がトリプトファン、フェニルアラニン又はチロシンであり、配列番号1の282位に対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸であり、配列番号1の376位に対応する位置のアミノ酸がグリシンであり、配列番号1の418位に対応する位置のアミノ酸がアルギニンである。これらのアミノ酸残基は、基質の糖部分(フルクトシル基)を認識することが知られている(J. Biol. Chem., 283, 27007-27016 (2008); Proteins, 84, 744-758 (2016))。
(i) 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における113位、109位、106位及び/又は102に対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸、アラニン、アスパラギン酸、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸に改変されている、
(ii) 前記(i)において、配列番号1に示すアミノ酸配列における113位、109位、106位、及び102位に対応する位置以外の位置における1又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されているたアミノ酸配列からなる、
(iii) 前記(i)若しくは(ii)において、当該糖化ヘモグロビンオキシダーゼの全長アミノ酸配列が配列番号1、配列番号22、配列番号24、配列番号11又は配列番号45のアミノ酸配列と70%以上、71%以上、72%以上、73%以上、74%以上、75%以上、76%以上、77%以上、78%以上、79%以上、80%以上、81%以上、82%以上、83%以上、84%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以上、または90%以上、例えば95%以上の配列同一性を有する、
(iv) 前記(i)、又は(ii)において、当該糖化ヘモグロビンオキシダーゼの全長アミノ酸配列が配列番号1又は配列番号11若しくは配列番号45のアミノ酸配列と70%以上、71%以上、72%以上、73%以上、74%以上、75%以上、76%以上、77%以上、78%以上、79%以上、80%以上、81%以上、82%以上、83%以上、84%以上、85%以上、または90%以上、例えば95%以上の配列同一性を有し、当該糖化ヘモグロビンオキシダーゼにおける、配列番号1の60位に対応する位置のアミノ酸がグリシンであり、配列番号1の239位に対応する位置のアミノ酸がトリプトファン、フェニルアラニン又はチロシンであり、配列番号1の282位に対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸であり、配列番号1の376位に対応する位置のアミノ酸がグリシンであり、配列番号1の418位に対応する位置のアミノ酸がアルギニンであり、配列番号1の15〜20位に対応する位置のアミノ酸配列がGly-Xaa-Gly-Xaa-Xaa-Gly(ここでXaaは任意のアミノ酸を示す)である、
(v) 前記(i)、(ii)若しくは(iii)において、当該糖化ヘモグロビンオキシダーゼの全長アミノ酸配列が配列番号1、配列番号22、配列番号24、配列番号11又は配列番号45のアミノ酸配列と70%以上、71%以上、72%以上、73%以上、74%以上、75%以上、80%以上、85%以上、または90%以上の配列同一性を有し、配列番号1または配列番号22若しくは24の第10位〜32位、36〜41位、49〜52位、54〜58位、73〜75位、84〜86位、88〜90位、120〜122位、145〜150位、156〜162位、164〜170位、180〜182位、202〜205位、207〜211位、214〜224位、227〜230位、236〜241位、243〜248位、258〜261位、266〜268位、270〜273位、275〜287位、295〜297位、306〜308位、310〜316位、324〜329位、332〜334位、341〜344位、346〜355位、357〜363位、370〜383位、385〜387位、389〜394位、405〜410位及び423〜431位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該糖化ヘモグロビンオキシダーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが80%以上、85%以上、90%、95%以上、98%以上、例えば99%以上の配列同一性を有する、
(vi) 前記(i)又は(ii)において、当該糖化ヘモグロビンオキシダーゼの全長アミノ酸配列が配列番号1又は配列番号11若しくは配列番号45のアミノ酸配列と50%以上、55%以上、60%以上、61%以上、62%以上、63%以上、64%以上、65%以上、66%以上、67%以上、68%以上、69%以上、70%以上、71%以上、72%以上、73%以上、74%以上、75%以上、76%以上、77%以上、78%以上、79%以上、80%以上、85%以上、例えば90%以上の配列同一性を有し、配列番号1の第10位〜32位、36〜41位、49〜52位、54〜58位、63〜65位、73〜75位、84〜86位、88〜90位、120〜122位、145〜150位、156〜162位、164〜170位、180〜182位、202〜205位、207〜211位、214〜224位、227〜230位、236〜241位、243〜248位、258〜261位、266〜268位、270〜273位、275〜287位、295〜297位、306〜308位、310〜316位、324〜329位、332〜334位、341〜344位、346〜355位、357〜363位、370〜383位、385〜387位、389〜394位、405〜410位及び423〜431位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該糖化ヘモグロビンオキシダーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが65%以上、66%以上、67%以上、68%以上、69%以上、70%以上、71%以上、72%以上、73%以上、74%以上、75%以上、76%以上、77%以上、78%以上、79%以上、80%以上、81%以上、82上、83%以上、84%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以上、90%以上の配列同一性を有し、当該糖化ヘモグロビンオキシダーゼにおける、配列番号1の60位に対応する位置のアミノ酸がグリシンであり、配列番号1の239位に対応する位置のアミノ酸がトリプトファン、フェニルアラニン又はチロシンであり、配列番号1の282位に対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸であり、配列番号1の376位に対応する位置のアミノ酸がグリシンであり、配列番号1の418位に対応する位置のアミノ酸がアルギニンであり、配列番号1の15〜20位に対応する位置のアミノ酸配列がGly-Xaa-Gly-Xaa-Xaa-Gly(ここでXaaは任意のアミノ酸を示す)である。この糖化ヘモグロビンオキシダーゼは、
(a) 改変前のA1cオキシダーゼと比較して、HbS1c型αF8Pに対する活性とHbA1c型αF8Pに対する活性との比が増大している、すなわち相対活性[HbS1c/HbA1c]が増大している、かつ/又は
(b) 改変前のA1cオキシダーゼと比較して、HbC1c型αF8Pに対する活性とHbA1c型αF8Pに対する活性との比が増大している、すなわち相対活性[HbC1c/HbA1c]が増大している、か、並びに/或いは、
(c) HbS1c型αF8Pに対する活性とHbA1c型αF8Pに対する活性との比、すなわち相対活性[HbS1c/HbA1c]が0.45以上、0.5以上、0.6以上、0.7以上、0.8以上、例えば0.9以上である、かつ/又は
(d) HbC1c型αF8Pに対する活性とHbA1c型αF8Pに対する活性との比、すなわち相対活性[HbC1c/HbA1c]が0.15以上、0.2以上、0.3以上、0.4以上、0.5以上、0.6以上、0.7以上、0.8以上、例えば0.9以上である。
(i)糖化ヘモグロビンオキシダーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における113位、109位、106位、及び/又は102位に対応する位置のアミノ酸の1、2または3つが、グルタミン酸、アスパラギン酸、アラニン、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸に改変されており、かつ、
(a) HbS1c型αF8Pに対する活性とHbA1c型αF8Pに対する活性との比、すなわち相対活性[HbS1c/HbA1c]が0.45以上である、及び/又は
(b) HbC1c型αF8Pに対する活性とHbA1c型αF8Pに対する活性との比、すなわち相対活性[HbC1c/HbA1c]が0.15以上、例えば0.2以上である。
ある実施形態において、本発明は、糖化ヘモグロビンオキシダーゼ産生能を有する菌株を当該糖化ヘモグロビンオキシダーゼを発現しうる条件下で培養する工程、及び培養物又は培養液から糖化ヘモグロビンオキシダーゼを単離する工程を含む、糖化ヘモグロビンオキシダーゼの製造方法を提供する。この方法には、本発明の糖化ヘモグロビンオキシダーゼをコードする遺伝子を組み込んだベクターで形質転換された宿主細胞を用いることができる。ここで糖化ヘモグロビンオキシダーゼを発現しうる条件とは、糖化ヘモグロビンオキシダーゼ遺伝子が転写、翻訳され、当該遺伝子によりコードされるポリペプチドが産生されることをいう。
基質としてHbA1cを認識し、かつ、糖化HbS及び/又は糖化HbCを認識し、
作用として糖化ヘモグロビンのβ鎖を酸化して過酸化水素を生成し、
至適pH範囲をpH6〜8の範囲に有し、
作用pH範囲をpH5〜9の範囲に有し、
作用温度が25〜40℃であり、
SDS−PAGE上での分子量が約45〜55KDa、例えば約48〜50KDaであるものであり得る。
ある実施形態において本発明は、糖化ヘモグロビンオキシダーゼを含む、糖化ヘモグロビン測定用試薬組成物、測定試薬又はキットを提供する。ある実施形態において本発明は、糖化ヘモグロビンオキシダーゼを含む、HbS1c又はHbC1c測定用試薬組成物、測定試薬又はキットを提供する。該組成物、試薬又はキットは、還元型化合物の測定用試薬、過酸化水素の測定用試薬、緩衝剤、界面活性剤、塩類、防腐剤などを含み得る。また、溶解補助剤、安定化剤、反応性向上剤、糖化ヘモグロビン変性剤、還元剤、牛血清アルブミン、糖類(グリセリン、乳糖、シュークロース等)等を添加してもよい。該組成物、試薬又はキットは、必要に応じ、その他の公知の安定化剤や夾雑物質の消去系などを追加しうる。糖化ヘモグロビンに作用するプロテアーゼ等を使用し糖化ペプチドを酵素法により測定する従来の各種の試薬やキットに用いられている技術を、適宜改変して本発明の組成物、試薬又はキットに用いることができる。本発明の組成物、測定試薬又はキットはプロテアーゼを含んでもよく、含まなくともよい。
ある実施形態において、本発明は糖化ヘモグロビンの測定方法を提供する。糖化ヘモグロビン測定は、定性的又は定量的な方法であり得る。定量法は、糖化ヘモグロビンを含む試料と本発明の糖化ヘモグロビンオキシダーゼとを接触させる工程、及び反応生成物又は消費物を測定する工程を含み得る。糖化ヘモグロビンは未変性でもよく、または変性したものでもよい。該定量法についていう接触とは、糖化ヘモグロビンオキシダーゼが糖化ヘモグロビンの酸化反応を触媒しうるように、該酵素と試料とを物理的に一緒にするあらゆる態様を包含し、例えば溶液中で遊離の酵素と糖化ヘモグロビンを混合する場合のみならず、固相担体に担持された酵素に糖化ヘモグロビンを含む溶液試料を添加又は滴下するような態様も包含する。
以下に、モデル基質としてHbA1c型αF8P、HbS1c型αF8P、又はHbC1c型αF8Pを用いた、アマドリアーゼ活性の測定方法を例示するが、測定方法はこれに限らない。これらの基質は合成基質でありうる(ペプチド研究所製)。本明細書において、特に断らない限り、酵素力価は、HbA1c型αF8Pを基質として測定した時の、1分間に1μmolの過酸化水素を生成する酵素量を1Uと定義する。
(試薬1):5U/ml パーオキシダーゼ(東洋紡製)、0.49mM 4−アミノアンチピリン(和光純薬工業社製)を含む0.1M リン酸緩衝液 pH6.5
(試薬2):15mM TOOS(N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-m-トルイジンナトリウム、同仁化学研究所製)溶液
500mgのTOOSをイオン交換水に溶解し、100mlに定容する。
(試薬3):300μMHbA1c型、HbC1c型、又はHbS1c型αF8P(ペプチド研究所製)溶液(終濃度10μM)
B:活性測定法
2.7mlの試薬1、100μlの試薬2、および100μlの酵素液を混和し、37℃で5分間予備加温する。その後、試薬3を100μl加えて良く混ぜた後、分光光度計(U−3900、日立ハイテクサイエンス社製)により、555nmにおける吸光度の経時変化を37℃で観測し、555nmにおける吸光度の1分間あたりの変化量(ΔAs)を測定する。なお、対照液は、100μlの試薬3の代わりに100μlのイオン交換水を加える以外は前記と同様にして、555nmにおける吸光度の1分間あたりの変化量(ΔA0)を測定する。37℃で1分間当たりに生成される過酸化水素のマイクロモル数を酵素液中の活性単位(U)とし、下記の式に従って算出する。
活性(U/ml)={(ΔAs−ΔA0)×3.0×df}÷(39.2×0.5×0.1)
ΔAs:反応液の1分間あたりの吸光度変化
ΔA0:対照液の1分間あたりの吸光度変化
39.2:反応により生成されるキノイミン色素のミリモル吸光係数(mM-1・cm-1)
0.5:1 molの過酸化水素による生成されるキノイミン色素のmol数
df:希釈係数。
本発明者は、HbA1cのみならずHbS1cやHbC1cにも対応可能な糖化ヘモグロビンオキシダーゼが必要である、という新規の課題を見出し、A1cOXに特定のアミノ酸置換を導入して糖化ヘモグロビンオキシダーゼを作製することによりこの課題を解決した。本発明の変異は適宜組み合わせることができる。また本発明の知見に基づいてさらなる改変体を作製することもできる。したがってある実施形態において本発明は、以下の工程を含む、アマドリアーゼ又はA1cオキシダーゼを改変して糖化ヘモグロビンオキシダーゼを作製する方法を提供する:
(i) アマドリアーゼ遺伝子又はA1cオキシダーゼ遺伝子を取得する、
(ii) アマドリアーゼ遺伝子又はA1cオキシダーゼ遺伝子をベクターに組み入れ、宿主細胞を形質転換し、アマドリアーゼ又はA1cオキシダーゼを発現させ、発現産物を単離する、(iii) 発現産物の相対活性[HbS1c/HbA1c]及び/又は相対活性[HbC1c/HbA1c]を測定する、(iv) アマドリアーゼ又はA1cオキシダーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における113位、109位、106位又は102位に対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸、アスパラギン酸、アラニン、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸に改変されるよう、前記アマドリアーゼ遺伝子又はA1cオキシダーゼ遺伝子を改変する、
(v) 改変後の遺伝子をベクターに組み入れ、宿主細胞を形質転換し、改変体を発現させ、発現産物を単離する、
(vi) 改変体の発現産物の相対活性[HbS1c/HbA1c]及び/又は相対活性[HbC1c/HbA1c]を測定し、工程(iii)の値と比較する、
(vii) 改変前のアマドリアーゼ若しくはA1cオキシダーゼの相対活性[HbS1c/HbA1c]と比較して、改変後の改変体の相対活性[HbS1c/HbA1c]が1.1倍以上増大しているか、又は改変前のアマドリアーゼ若しくはA1cオキシダーゼの相対活性[HbC1c/HbA1c]と比較して、改変後の改変体の相対活性[HbC1c/HbA1c]が1.1倍以上増大している場合、当該改変体を糖化ヘモグロビンオキシダーゼとする、並びに
(viii) 必要に応じて、工程(vii)の改変体について、工程(iv)〜(vi)を繰り返す。上記工程(iii)や(vi)の評価基質は、便宜上αF8Pとすることができるが、6アミノ酸以上の鎖長を有する他のフルクトシル基質やHbA1c、HbS1c、HbC1cを用いてもよい。
以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲は、それらの例により何ら限定されるものではない。
Coniochaeta属由来アマドリアーゼ遺伝子(配列番号23)の組換え体プラスミドを有する大腸菌JM109(pKK223−3−CFP−T7−H38−GY)株(国際公開第2016/159384号参照)を、3mlのLB−amp培地[1%(w/v)バクトトリプトン、0.5%(w/v)ペプトン、0.5%(w/v)NaCl、50μg/ml アンピシリン]に接種して、37℃で16時間振とう培養し、培養物を得た。
得られた組換え体プラスミドpKK223−3−CFP−T7−H38−GYを鋳型として、配列番号25、26の合成オリゴヌクレオチド、KOD−Plus−Neo(東洋紡績社製)を用い、以下の条件でPCRを行った。
上記のようにして得られたアマドリアーゼを生産する形質転換大腸菌(JM109)を、終濃度0.1mMとなるようにIPTGを添加したLB−amp培地100mlに植菌し、25℃で16時間培養した。得られた培養菌体を10mM リン酸カリウム緩衝液(pH7.5)で洗浄した後、同緩衝液に菌体を懸濁して超音波破砕処理を行い、20,000×gで10分間遠心分離し、粗酵素液40mlを調製した。
精製CFP-T7-H40-3M標品を用いて10μM のHbA1c型、HbS1c型及びHbC1c型のαF8Pを基質とした時の活性を測定した。その結果CFP-T7-H40-3Mの、HbA1c型αF8Pに対する活性を100%とした場合、HbS1c型αF8Pに対する活性は39%であり、HbC1c型αF8Pに対する活性は11%であった。
上記のCFP-T7-H40-3M(A1cOX)に基づき、鋳型としてpKK223−3−CFP−T7−H40−3Mさらに以下のプライマーを使用し、下記の変異を導入した。プラスミド調製、導入変異の配列確認、精製酵素の調製等は上記と同様の方法により行った。変異導入時のPCRの班応益組成および反応条件は、下記プライマーを用いる点以外は、組み換体プラスミドpKK223−3−CFP−T7−H39−1Mを調製する時と同一の条件で実施した。
配列番号31、32 導入変異:K102A
配列番号31、33 導入変異:K102E
配列番号34、35 導入変異:K106A
配列番号34、36 導入変異:K106D
配列番号37、38 導入変異:K113A
配列番号37、39 導入変異:K113E
配列番号37、40 導入変異:K113S
配列番号37、41 導入変異:K113T
配列番号37、42 導入変異:K113N
配列番号37、43 導入変異:K113Q
配列番号37、44 導入変異:K113D
得られた各種の精製酵素標品を用いてHbA1c型及びHbS1c型のαF8Pを基質とした時の活性を測定した。結果を下記の表に示す。各酵素の、HbA1c型αF8Pに対する活性を100%としたときの、HbS1c型αF8Pに対する相対活性を示す。
配列番号45は、国際公開第WO2015/005258号に開示されているEmericella nidulans由来糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ(FPOX-42、本明細書中ではEn42FXと表記する)のアミノ酸配列であり、配列番号46の遺伝子にコードされている。En42FX遺伝子をpET22bプラスミドベクターにサブクローニングしたpET22b-En42FX(調製方法は国際公開第WO2016/063984号参照)を鋳型にして、以下のプライマーを使用し、下記の変異を導入した。プラスミド調製は(1.Coniochaeta属由来アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミドの調製)および(2.Coniochaeta属由来アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミドの部位特異的改変操作)と同様の方法により行った。変異導入時のPCRは(2.Coniochaeta属由来アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミドの部位特異的改変操作)に記載の方法に沿って、pET22b-En42FXを鋳型として、下記プライマーを用いて実施した。PCR反応条件、導入変異の配列確認等は、(2.Coniochaeta属由来アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミドの部位特異的改変操作)と同一の条件で実施した。
配列番号47、48 導入変異:R105A
配列番号47、49 導入変異:R105S
配列番号47、50 導入変異:R105L
配列番号47、52 導入変異:R105N
配列番号47、53 導入変異:R105Q
配列番号47、54 導入変異:R105D
配列番号47、55 導入変異:R105E
配列番号56、57 導入変異:R108A
配列番号56、58 導入変異:R108S
配列番号56、59 導入変異:R108L
配列番号56、61 導入変異:R108Q
配列番号56、62 導入変異:R108D
配列番号56、63 導入変異:R108E
配列番号64、65 導入変異:S112D
配列番号64、66 導入変異:S112E
各改変型En42FX生産株を、0.1mMのIPTGを添加したLB−amp培地50mlにおいて、25℃で16時間培養した。その後、各菌体をpH7.0の10mMリン酸緩衝液で洗浄、超音波破砕、15,000rpmで10分間遠心分離し、各粗酵素液4.0mlを調製した。各粗酵素液はAmicon Ultra Ultracel−30K(ミリポア社製)を用いて、およそ1.0mlに濃縮して活性測定に使用した。
得られた各種の精製酵素標品を用いてHbA1c型及びHbS1c型のαF8Pを基質とした時の活性を測定した。結果を下記の表に示す。各酵素の、HbA1c型αF8Pに対する活性を100%としたときの、HbS1c型αF8P及びHbS1c型αF8Pに対する相対活性を示す。
配列番号1 Coniochaeta属由来のアマドリアーゼ(CFP-T7)
配列番号2 CFP-T7遺伝子配列
配列番号3 Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ
配列番号4 Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ
配列番号5 Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ
配列番号6 Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ
配列番号7 Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ
配列番号8 Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ
配列番号9 Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ
配列番号10 Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ
配列番号11 Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ
配列番号12 Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ
配列番号13 Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ
配列番号14 Ao2 (Aspergillus oryzae由来アマドリアーゼ、別称FaoAo2)
配列番号15 Af2 (Aspergillus fumigatus由来アマドリアーゼ、別称AmadoriaseII)
配列番号16 At (Aspergillus terreus由来アマドリアーゼ、別称FAOD-A)
配列番号17 Fo (Fusarium oxysporum由来アマドリアーゼ)
配列番号18 Ao1 (Aspergillus oryzae由来アマドリアーゼ、別称FaoAo 1)
配列番号19 Af1 (Aspergillus fumigatus由来アマドリアーゼ、別称AmadoriaseI)
配列番号20 Pi (Pichia sp.由来アマドリアーゼ)
配列番号21 Dh (Debaryomyces hansenii由来アマドリアーゼ)
配列番号22 CFP-T7-H38-GY アミノ酸配列
配列番号23 CFP-T7-H38-GY遺伝子配列
配列番号24 CFP-T7-H40-3M アミノ酸配列
配列番号25〜44 プライマー
配列番号45 En42FXアミノ酸配列
配列番号46 En42FX遺伝子配列
配列番号47〜66 プライマー
Claims (20)
- HbS1cまたはHbC1cを含み得る試料に糖化ヘモグロビンオキシダーゼを作用させる工程を含む、試料中のHbS1cまたはHbC1cを測定する方法。
- 糖化ヘモグロビンオキシダーゼの作用により生じる還元型化合物の量を測定する、請求項1に記載の方法。
- 測定される還元型化合物が過酸化水素である、請求項2に記載の方法。
- 糖化ヘモグロビンオキシダーゼが(a)及び/又は(b)の性質を有する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法、
(a) HbS1c型αF8Pに対する活性とHbA1c型αF8Pに対する活性との比、すなわち相対活性[HbS1c/HbA1c]が0.45以上である、
(b) HbC1c型αF8Pに対する活性とHbA1c型αF8Pに対する活性との比、すなわち相対活性[HbC1c/HbA1c]が0.15以上である。 - 糖化ヘモグロビンオキシダーゼの至適pH範囲が6〜8、作用pH範囲が5〜9、至適温度範囲が25〜40℃であり、SDS-PAGE上での分子量が約45〜55KDaである、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 糖化ヘモグロビンオキシダーゼが、以下の(i)〜(viii)からなる群より選択される糖化ヘモグロビンオキシダーゼ改変体である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法、
(i) 糖化ヘモグロビンオキシダーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における113位に対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸、アスパラギン酸、アラニン、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸に改変されている糖化ヘモグロビンオキシダーゼ改変体、
(ii) 糖化ヘモグロビンオキシダーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における109位に対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸、アラニン、アスパラギン酸、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸に改変されている糖化ヘモグロビンオキシダーゼ改変体、
(iii) 糖化ヘモグロビンオキシダーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における106位に対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸、アラニン、アスパラギン酸、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸に改変されている糖化ヘモグロビンオキシダーゼ改変体、
(iv) 糖化ヘモグロビンオキシダーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における102位に対応する位置のアミノ酸がアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸に改変されている糖化ヘモグロビンオキシダーゼ改変体、
(v) 前記(i)、(ii)、(iii)、又は(iv)において、配列番号1に示すアミノ酸配列における113位、109位、106位、及び102位に対応する位置以外の位置における1又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなる糖化ヘモグロビンオキシダーゼ改変体、
(vi) 前記(i)、(ii)、(iii)、又は(iv)において、当該糖化ヘモグロビンオキシダーゼの全長アミノ酸配列が配列番号1又は配列番号45のアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有し、当該糖化ヘモグロビンオキシダーゼにおける、配列番号1の60位に対応する位置のアミノ酸がグリシンであり、配列番号1の239位に対応する位置のアミノ酸がトリプトファン、フェニルアラニン又はチロシンであり、配列番号1の282位に対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸であり、配列番号1の376位に対応する位置のアミノ酸がグリシンであり、配列番号1の418位に対応する位置のアミノ酸がアルギニンであり、配列番号1の15〜20位に対応する位置のアミノ酸配列がGly-Xaa-Gly-Xaa-Xaa-Gly(ここでXaaは任意のアミノ酸を示す)である、糖化ヘモグロビンオキシダーゼ改変体、
(vii) 前記(i)、(ii)、(iii)、又は(iv)において、当該糖化ヘモグロビンオキシダーゼの全長アミノ酸配列が配列番号1又は配列番号45のアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有し、配列番号1又は配列番号45の相同性領域におけるアミノ酸配列と当該糖化ヘモグロビンオキシダーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが90%以上の配列同一性を有する糖化ヘモグロビンオキシダーゼ改変体、或いは
(viii) 前記(i)、(ii)、(iii)、又は(iv)において、当該糖化ヘモグロビンオキシダーゼの全長アミノ酸配列が配列番号1又は配列番号45のアミノ酸配列と50%以上の配列同一性を有し、配列番号1又は配列番号45の相同性領域におけるアミノ酸配列と当該糖化ヘモグロビンオキシダーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが70%以上の配列同一性を有し、当該糖化ヘモグロビンオキシダーゼにおける、配列番号1の60位に対応する位置のアミノ酸がグリシンであり、配列番号1の239位に対応する位置のアミノ酸がトリプトファン、フェニルアラニン又はチロシンであり、配列番号1の282位に対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸であり、配列番号1の376位に対応する位置のアミノ酸がグリシンであり、配列番号1の418位に対応する位置のアミノ酸がアルギニンであり、配列番号1の15〜20位に対応する位置のアミノ酸配列がGly-Xaa-Gly-Xaa-Xaa-Gly(ここでXaaは任意のアミノ酸を示す)である、糖化ヘモグロビンオキシダーゼ改変体。 - 試料中のHbS1cまたはHbC1cを測定するための糖化ヘモグロビンオキシダーゼ。
- HbS1cまたはHbC1cに糖化ヘモグロビンオキシダーゼを作用させて生じる還元型化合物の量を測定するためのものである、請求項7に記載の糖化ヘモグロビンオキシダーゼ。
- 生じる還元型化合物が過酸化水素である、請求項8に記載の糖化ヘモグロビンオキシダーゼ。
- 糖化ヘモグロビンオキシダーゼが(a)及び/又は(b)の性質を有する、請求項7〜9のいずれか1項に記載の糖化ヘモグロビンオキシダーゼ、
(a) HbS1c型αF8Pに対する活性とHbA1c型αF8Pに対する活性との比、すなわち相対活性[HbS1c/HbA1c]が0.45以上である、
(b) HbC1c型αF8Pに対する活性とHbA1c型αF8Pに対する活性との比、すなわち相対活性[HbC1c/HbA1c]が0.15以上である。 - 糖化ヘモグロビンオキシダーゼの至適pH範囲が6〜8、作用pH範囲が5〜9、至適温度範囲が25〜40℃であり、SDS-PAGE上での分子量が約45〜55KDaである、請求項7〜10のいずれか1項に記載の糖化ヘモグロビンオキシダーゼ。
- 糖化ヘモグロビンオキシダーゼが、以下の(i)〜(viii)からなる群より選択されるものである、請求項7〜11のいずれか1項に記載の糖化ヘモグロビンオキシダーゼ、
(i) 糖化ヘモグロビンオキシダーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における113位に対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸、アスパラギン酸、アラニン、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸に改変されている糖化ヘモグロビンオキシダーゼ改変体、
(ii) 糖化ヘモグロビンオキシダーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における109位に対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸、アラニン、アスパラギン酸、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸に改変されている糖化ヘモグロビンオキシダーゼ改変体、
(iii) 糖化ヘモグロビンオキシダーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における106位に対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸、アラニン、アスパラギン酸、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸に改変されている糖化ヘモグロビンオキシダーゼ改変体、
(iv) 糖化ヘモグロビンオキシダーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における102位に対応する位置のアミノ酸がアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸に改変されている糖化ヘモグロビンオキシダーゼ改変体、
(v) 前記(i)、(ii)、(iii)、又は(iv)において、配列番号1に示すアミノ酸配列における113位、109位、106位、及び102位に対応する位置以外の位置における1又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなる糖化ヘモグロビンオキシダーゼ改変体、
(vi) 前記(i)、(ii)、(iii)、又は(iv)において、当該糖化ヘモグロビンオキシダーゼの全長アミノ酸配列が配列番号1又は配列番号45のアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有し、当該糖化ヘモグロビンオキシダーゼにおける、配列番号1の60位に対応する位置のアミノ酸がグリシンであり、配列番号1の239位に対応する位置のアミノ酸がトリプトファン、フェニルアラニン又はチロシンであり、配列番号1の282位に対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸であり、配列番号1の376位に対応する位置のアミノ酸がグリシンであり、配列番号1の418位に対応する位置のアミノ酸がアルギニンであり、配列番号1の15〜20位に対応する位置のアミノ酸配列がGly-Xaa-Gly-Xaa-Xaa-Gly(ここでXaaは任意のアミノ酸を示す)である、糖化ヘモグロビンオキシダーゼ改変体、
(vii) 前記(i)、(ii)、(iii)、又は(iv)において、当該糖化ヘモグロビンオキシダーゼの全長アミノ酸配列が配列番号1又は配列番号45のアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有し、配列番号1又は配列番号45の相同性領域におけるアミノ酸配列と当該糖化ヘモグロビンオキシダーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが90%以上の配列同一性を有する糖化ヘモグロビンオキシダーゼ改変体、或いは
(viii) 前記(i)、(ii)、(iii)、又は(iv)において、当該糖化ヘモグロビンオキシダーゼの全長アミノ酸配列が配列番号1又は配列番号45のアミノ酸配列と50%以上の配列同一性を有し、配列番号1又は配列番号45の相同性領域におけるアミノ酸配列と当該糖化ヘモグロビンオキシダーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが70%以上の配列同一性を有し、当該糖化ヘモグロビンオキシダーゼにおける、配列番号1の60位に対応する位置のアミノ酸がグリシンであり、配列番号1の239位に対応する位置のアミノ酸がトリプトファン、フェニルアラニン又はチロシンであり、配列番号1の282位に対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸であり、配列番号1の376位に対応する位置のアミノ酸がグリシンであり、配列番号1の418位に対応する位置のアミノ酸がアルギニンであり、配列番号1の15〜20位に対応する位置のアミノ酸配列がGly-Xaa-Gly-Xaa-Xaa-Gly(ここでXaaは任意のアミノ酸を示す)である、糖化ヘモグロビンオキシダーゼ改変体。 - コニオカエタ(Coniochaeta)属、ユーペニシリウム(Eupenicillium)属、ピレノケータ(Pyrenochaeta)属、アルスリニウム(Arthrinium)属、カーブラリア(Curvularia)属、ネオコスモスポラ(Neocosmospora)属、クリプトコッカス(Cryptococcus)属、フェオスフェリア(Phaeosphaeria)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、エメリセラ(Emericella)属、ウロクラディウム(Ulocladium)属、またはペニシリウム(Penicillium)属のアマドリアーゼに基づくものである、請求項7〜12のいずれか1項に記載の糖化ヘモグロビンオキシダーゼ。
- アマドリアーゼがコニオカエタ エスピー(Coniochaeta sp.)、ユーペニシリウム テレナム(Eupenicillium terrenum)、ピレノケータ エスピー(Pyrenochaeta sp.)、アルスリニウム エスピー(Arthrinium sp.)、カーブラリア クラベータ(Curvularia clavata)、ネオコスモスポラ バシンフェクタ(Neocosmospora vasinfecta)、クリプトコッカス ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、フェオスフェリア ノドラム(Phaeosphaeria nodorum)、アスペルギルス ニードランス(Aspergillus nidulans)、エメリセラ ニードランス(Emericella nidulans)属、ウロクラディウム エスピー(Ulocladium sp.)、またはペニシリウム ヤンシネラム(Penicillium janthinelum)もしくはペニシリウム クリソゲナム(Penicillium chrysogenum)由来である、請求項13に記載の糖化ヘモグロビンオキシダーゼ。
- 請求項7〜14のいずれか1項に記載の糖化ヘモグロビンオキシダーゼを含む、HbS1cまたはHbC1c測定用試薬組成物。
- 請求項7〜14のいずれか1項に記載の糖化ヘモグロビンオキシダーゼをコードする、遺伝子。
- 請求項16に記載の遺伝子を含む、ベクター。
- 請求項17に記載のベクターを含む、宿主細胞。
- 以下の工程を含む、糖化ヘモグロビンオキシダーゼの製造方法、
(i)請求項18に記載の宿主細胞を、糖化ヘモグロビンオキシダーゼを発現しうる条件下で培養する工程、及び
(ii)培養物又は培養液から糖化ヘモグロビンオキシダーゼを単離する工程。 - 以下の工程を含む、アマドリアーゼ又はA1cオキシダーゼを改変して糖化ヘモグロビンオキシダーゼを作製する方法、
(i) アマドリアーゼ遺伝子又はA1cオキシダーゼ遺伝子を取得する、
(ii) アマドリアーゼ遺伝子又はA1cオキシダーゼ遺伝子をベクターに組み入れ、宿主細胞を形質転換し、アマドリアーゼ又はA1cオキシダーゼを発現させ、発現産物を単離する、(iii) 発現産物の相対活性[HbS1c/HbA1c]及び/又は相対活性[HbC1c/HbA1c]を測定する、(iv) アマドリアーゼ又はA1cオキシダーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における113位、109位、106位又は102位に対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸、アスパラギン酸、アラニン、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸に改変されるよう、前記アマドリアーゼ遺伝子又はA1cオキシダーゼ遺伝子を改変する、
(v) 改変後の遺伝子をベクターに組み入れ、宿主細胞を形質転換し、改変体を発現させ、発現産物を単離する、
(vi) 改変体の発現産物の相対活性[HbS1c/HbA1c]及び/又は相対活性[HbC1c/HbA1c]を測定し、工程(iii)の値と比較する、
(vii) 改変前のアマドリアーゼ若しくはA1cオキシダーゼの相対活性[HbS1c/HbA1c]と比較して、改変後の改変体の相対活性[HbS1c/HbA1c]が1.1倍以上増大している、かつ/又は改変前のアマドリアーゼ若しくはA1cオキシダーゼの相対活性[HbC1c/HbA1c]と比較して、改変後の改変体の相対活性[HbC1c/HbA1c]が1.1倍以上増大している場合、当該改変体を糖化ヘモグロビンオキシダーゼとする、並びに
(viii) 必要に応じて、工程(vii)の糖化ヘモグロビンオキシダーゼについて、工程(iv)〜(vi)を繰り返す。
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