JP5438020B2 - 新規なフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質及びその改変体、並びにその利用 - Google Patents
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Description
(1)遊離アミンをFAODで消去する反応(以下「消去反応」と呼ぶ)
(2)消去反応で発生した過酸化水素を除去する反応(以下「除去反応」と呼ぶ)
(3)プロテアーゼにより、糖化タンパク質を糖化アミノ酸または糖化ペプチドに断片化する反応(以下「断片化反応」と呼ぶ)
(4)断片化された糖化アミノ酸または糖化ペプチドとFAODとが酸化還元反応を行い、これによって発色する反応(以下「発色反応」と呼ぶ)。
本発明にかかるタンパク質は、以下の(I)から(III)のいずれかに記載の、フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質である。つまり、
(I)配列番号1に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質;
(II)配列番号1に記載されるアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、且つフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質;
(III)配列番号1に記載されるアミノ酸配列と86.0%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
本発明にかかるポリヌクレオチドは、本発明にかかるタンパク質をコードするポリヌクレオチドであることを特徴としている。
(V)配列番号2に記載される塩基配列において、1つ以上30以下の塩基が置換、欠失、挿入および/または付加された塩基配列からなり、且つフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(VI)本発明にかかるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(VII)上記(IV)から(VI)の何れかのポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
本発明にかかるベクターは、上記本発明にかかるポリヌクレオチドを含むものである。上記本発明にかかるポリヌクレオチドを含むものであれば、その他の構成は特に限定されるものではない。
本発明にかかるタンパク質の製造方法は、上記本発明にかかる形質転換体を培養する工程(「培養工程」という)を含むことを特徴としている。本発明にかかるタンパク質の製造方法には、上記培養工程の他、形質転換体を用いたタンパク質生産において含まれ得るその他の工程が含まれていてもよい。その他の工程としては、例えば、培養工程後に、本発明にかかる形質転換体が生産したタンパク質を回収する工程や、当該タンパク質を精製する工程が挙げられる。
上記培養工程では、本発明にかかる形質転換体が栄養培地などで培養されることにより、多量の組換えタンパク質を安定して生産し得る。形質転換体の培養形態(培養方法、培養条件など)は、宿主の栄養生理的性質を考慮して選択すればよく、多くの場合は液体培養で行う。工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。
回収工程では、上記培養工程中に形質転換体によって生産された本発明にかかるタンパク質が回収される。
精製工程は、上記回収工程によって得られたタンパク質を精製する工程である。
本発明にかかる糖化タンパク質の測定方法(以下「本発明の測定方法」という)は、少なくとも糖化アミンに本発明にかかるタンパク質(またはフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ剤)を作用させることを特徴としている。以下に本発明の測定方法の一実施形態を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。また本項の説明において「本発明にかかるタンパク質」は「本発明にかかるフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ剤」と読み替えることが可能である。
(1)試料とプロテアーゼとを反応させて、試料中の糖化タンパク質を分解し、試料中の糖化タンパク質由来の糖化アミンを調製する工程(便宜上「第1工程」という)、
(2)前記(1)の工程によって得られた試料中の糖化タンパク質由来の糖化アミンに本発明にかかるタンパク質を作用させる工程(便宜上「第2工程」という)、および、
(3)前記(2)の工程において発生した過酸化水素の量または消費された酸素の量を測定する工程(便宜上「第3工程」という)、を含む糖化タンパク質を測定するための方法である。
第1工程は、試料中の糖化タンパク質を分解し、試料中の糖化タンパク質由来の糖化アミンを調製する工程である。
第2工程は、上記第1工程によって得られた試料中の糖化タンパク質由来の糖化ア
ミンに本発明にかかるタンパク質を作用させる工程である。
第3工程は、上記第2工程において発生した過酸化水素の量または消費された酸素の量を測定する工程である。第3工程は過酸化水素の量または酸素の量を測定し得る方法であれば、その具体的方法は特に限定されるものではない。したがって、公知の方法が適宜適用され得る。
本発明にかかる糖化タンパク質測定キット(以下「本発明のキット」という)は、少なくとも上記本発明にかかるタンパク質(またはフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ剤)を備えることを特徴としている。
本発明にかかる糖化タンパク質測定センサー(以下「本発明のセンサー」)は、糖化タンパク質を検出するために用いられるセンサーであり、少なくとも本発明にかかるタンパク質(またはフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ剤)を備えている。
表1に実施例において使用した活性測定試薬の組成を示した。なお、実施例において使用した試薬は特記しない限り、ナカライテスク社より購入したものを用いた。
下記実施例1〜3における活性測定法を以下に説明する。
活性値(U/ml)={ΔOD/min(ΔODtest−ΔODblank)×3.1(ml)×希釈倍率}/{13×1.0(cm)×0.1(ml)}
3.1(ml):全液量
13:ミリモル吸光係数
1.0cm:セルの光路長
0.1(ml):酵素サンプル液量
<3.実施例1:フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ遺伝子のクローニング>
Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼのcDNAクローニングを行うために、Phaeosphaeria nodorumのゲノムデータベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/genom_table.cgi?organism=fungi&database=321614)を検索した。
上記配列番号2に示した塩基配列を有するフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ遺伝子を含むプラスミドを作製し、大腸菌におけるフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼタンパク質の大量発現を試みた。
本発明にかかるフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ(IE353)、及び従来の酵素FPOX−CE及びFPOX−EE(ともにキッコーマン製)の、熱安定性、基質特異性及びフルクトシルバリルヒスチジン(F−VH)に対するKm値を測定した結果を表2に示す。
熱安定性(%)=(50℃、10分熱処理後の活性値)÷(熱処理なし活性値)×100
基質特異性は各基質を10mMになるように調製して、前述した活性測定法を用い、下記計算式により算出した。なお、下記式中で、F−Kは、酵素反応の基質としてのフルクトシルリジンを指す。また、当該式で定義される基質特異性の値が小さいほど、F−VHに対する特異性に優れ、好ましいと判定される。
基質特異性(F−K/F−VH)=(F−Kを基質としたときの活性値)÷(F−VHを基質としたときの活性値)
F−VHに対するKm値はF−VH濃度を1.75mM、0.88mM、0.58mM、0.35mM、0.25mM、0.18mMになるように試薬を調製し、それぞれを用いて前述した活性測定を実施し、ラインウィーバー・バークプロットより算出した。
以下の実施例4〜7、参考例1におけるFAODの活性測定方法を、以下に示す。
活性値(U/ml)={((ΔODtest/min)−(ΔODblank/min))×3.1ml×希釈倍率}/(13×1.0cm×0.1ml)
なお、上記計算式において、「3.1ml」は全液量を示し、「13」はミリモル吸光係数を示し、「1.0cm」はセルの光路長を示し、「0.1ml」は酵素サンプル液量を示す。
以下の実施例4〜7、参考例1におけるFAODの基質特異性評価方法を、以下に説明する。
(F−K/F−VH)=(F−Kを基質としたときの活性値)÷(F−VHを基質としたときの活性値)
なお、当該式で定義される活性値比の値が小さいほど、F−VHに対する特異性に優れ、好ましいと判定される。
以下の実施例4〜7、参考例1におけるFAODの熱安定性評価方法を、以下に説明する。
<9.実施例4:フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ遺伝子・タンパク質の改変>
配列番号1に示したアミノ酸配列の58番目のイソロイシンをランダムに他のアミノ酸に置換するために、プライマーR1およびプライマーR2を合成した。
・プライマーR1:5’-cttattgaggtcattgcctgcagattgcgatgaagg-3’(配列番号5)
・プライマーR2:5’-nnsatgggcgttagcttgcgaaacccagtggac-3’(配列番号6)
上記pIE353、プライマーR1、およびプライマーR2、およびKOD−Plus Site−Directed Mutagenesis Kit(東洋紡績製)を用いて、上記58番目のイソロイシンに変異が導入された組換えプラスミドを作製した。当該組換えプラスミドを用いてBL21 CodonPlus(DE3)−RILを形質転換した後、アンピシリン耐性を示す100個のコロニーをピックアップした。100個のコロニーに導入されている100個の組換えプラスミドの塩基配列を確認したところ、配列番号1に示したアミノ酸配列の58番目のイソロイシンが19種類のアミノ酸の各々に置換されたプラスミドを取得することに成功した。
まず、上述した活性測定方法にしたがって、野生型フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ(IE353)、および、19種類の精製酵素標品(IE353−I58T、IE353−I58A、IE353−I58V、IE353−I58L、IE353−I58G、IE353−I58M、IE353−I58F、IE353−I58S、IE353−I58Q、IE353−I58C、IE353−I58Y、IE353−I58N、IE353−I58K、IE353−I58H、IE353−I58R、IE353−I58D、IE353−I58E、IE353−I58W、IE353−I58P)の酵素活性を測定した。
配列番号1に示したアミノ酸配列の58番目のイソロシンの置換に加えて他のアミノ酸をも置換した場合に、当該変異タンパク質の特性がどのように変化するか検討した。
・プライマーY1:5’-tatacgcgcttcaagatgcatcaaccctttggcg-3’(配列番号7)
・プライマーY2:5’-gccaggaaactcgtcgcagactttgatcacg-3’(配列番号8)
上記pIE353、プライマーY1、プライマーY2、およびKOD−Plus Site−Directed Mutagenesis Kit(東洋紡績製)を用いて、上記282番目のフェニルアラニンがチロシンに置換された組換えプラスミドを作製した。更に詳細には、配列番号1に示したアミノ酸配列の282番目のフェニルアラニンをコードする塩基配列(ttc)がチロシン(Y)をコードする塩基配列(tat)に置換された組換えプラスミド(pIE353−F282Y)を取得することに成功した。なお、後述する表4に示すように、pIE353−F282Yから得られる精製酵素標品(IE353−F282Y)は、野生型のフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼと比較して、熱安定性が向上していた。
配列番号1に示したアミノ酸配列における58番目のイソロシンの置換、および282番目のフェニルアラニンの置換に加えて他のアミノ酸をも置換した場合に、当該変異タンパク質の特性がどのように変化するか検討した。
・プライマーQ1:5’-taccaagctctcgtggacgcgggcttggat-3’(配列番号9)
・プライマーQ2:5’-cagtaccaagctctcgtggacgcgggctt-3’(配列番号10)
上記pIE353−F282Y、プライマーY1、プライマーY2、およびKOD−Plus Site−Directed Mutagenesis Kit(東洋紡績製)を用いて、上記282番目のフェニルアラニンがチロシンに置換されるとともに、110番目のグリシンがグルタミンに置換された組換えプラスミドを作製した。更に詳細には、配列番号1に示したアミノ酸配列の282番目のフェニルアラニンをコードする塩基配列(ttc)がチロシン(Y)をコードする塩基配列(tat)に置換されるとともに、配列番号1に示したアミノ酸配列の110番目のグリシンをコードする塩基配列(gga)がグルタミン(Q)をコードする塩基配列(cag)に置換された組換えプラスミド(pIE353−G110Q+F282Y)を取得しすることに成功した。
上述した実施例10では110番目のグリシンをグルタミンに置換しているが、他のアミノ酸に置換した場合にも同様の効果があるか否かを検証した。更に具体的には、IE353−I58T+F282Yに対して、更に110番目のグリシンを他のアミノ酸に置換し、これらの精製酵素標品の基質特異性を調べた。
・プライマーR3:5’-snnagacttcaggtctgcaatgtctttttc-3’(配列番号11)
・プライマーR4:5’-taccaagctctcgtggacgcgggcttggat-3’(配列番号12)
実施例9で取得した発現プラスミドpIE353−I58T+G110Q+F282Y、プライマーR3、プライマーR4、および、KOD−Plus Site−Directed Mutagenesis Kitを用いて、更に110番目のグリシンに変異が導入された組換えプラスミドを作製した。
以下の実施例8〜10におけるFAODの活性測定方法を、以下に示す。
(計算式)
活性値(U/mL)={((ΔODtest/min)−(ΔODblank/min))×3.1mL×希釈倍率}/(13×1.0cm×0.1mL)
なお、上記計算式において、「3.1mL」は全液量を示し、「13」はミリモル吸光係数を示し、「1.0cm」はセルの光路長を示し、「0.1mL」は酵素サンプル液量を示す。
以下の実施例8〜10における比活性は、精製酵素標品の活性値(U/mL)と、280nmにおける吸光度(A280)とに基づいて、以下計算式にて算出した。
(計算式)
比活性(U/A280)=活性値(U/mL)/A280(Abs)
なお、比活性の値が高いほど好ましいと判定される。
以下の実施例8〜10におけるKm評価方法について、以下に説明する。
(計算式)
Km評価=基質濃度1.75mMでの活性値(U/mL)/基質濃度0.35mMでの活性値(U/mL)
なお、当該計算式で定義されるKm評価の値が大きいほど、Km値(Michaelis 定数)が低減する(換言すれば、基質と酵素との親和性が向上する)ので、好ましいと判定される。
以下の実施例8〜10におけるFAODの基質特異性評価方法を、以下に説明する。
(F−V/F−VH)=(F−Vを基質としたときの活性値)/(F−VHを基質としたときの活性値)
(F−K/F−VH)=(F−Kを基質としたときの活性値)/(F−VHを基質としたときの活性値)
なお、当該計算式で定義される活性値比の値が小さいほど、F−VHに対する特異性に優れ、好ましいと判定される。
以下の実施例8〜10におけるFAODの熱安定性評価方法を、以下に説明する。
熱安定性(%)=[(50℃、10分間加熱処理後の活性値)/(加熱処理前の活性値)]×100
なお、当該計算式で定義される熱安定性の値が高いほど、熱安定性に優れ、好ましいと判定される。
配列番号1に示したアミノ酸配列の110番目のグリシンをランダムに他のアミノ酸に置換するために、プライマーR3およびプライマーR4を合成した。
・プライマーR3:5’-snnagacttcaggtctgcaatgtctttttc-3’(配列番号11)
・プライマーR4:5’-taccaagctctcgtggacgcgggcttggat-3’(配列番号12)
上記pIE353、プライマーR3、およびプライマーR4、およびKOD−Plus Site−Directed Mutagenesis Kit(東洋紡績製)を用いて、上記110番目のグリシンに変異が導入された組換えプラスミドを作製した。当該組換えプラスミドを用いてBL21 CodonPlus(DE3)−RILを形質転換した後、アンピシリン耐性を示す100個のコロニーをピックアップした。100個のコロニーに導入されている100個の組換えプラスミドの塩基配列を確認したところ、配列番号1に示したアミノ酸配列の110番目のグリシンが19種類のアミノ酸(野生型のグリシンを除く)の各々に置換されたプラスミドを取得することに成功した。
まず、上述した活性測定方法(基質としては、フルクトシルバリルヒスチジンを用いた)にしたがって、野生型フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ(IE353)、および、19種類の精製酵素標品(IE353−G110Q、IE353−G110A、IE353−G110V、IE353−G110L、IE353−G110I、IE353−G110M、IE353−G110F、IE353−G110S、IE353−G110T、IE353−G110C、IE353−G110Y、IE353−G110N、IE353−G110K、IE353−G110H、IE353−G110R、IE353−G110D、IE353−G110E、IE353−G110W、IE353−G110P)の酵素活性を測定した。
配列番号1に示したアミノ酸配列の110番目のグリシンの置換に加えて他のアミノ酸をも置換した場合に、当該変異タンパク質の特性がどのように変化するか検討した。
・プライマーY1:5’-tatacgcgcttcaagatgcatcaaccctttggcg-3’(配列番号7)
・プライマーY2:5’-gccaggaaactcgtcgcagactttgatcacg-3’(配列番号8)
上記pIE353、プライマーY1、プライマーY2、およびKOD−Plus Site−Directed Mutagenesis Kit(東洋紡績製)を用いて、上記282番目のフェニルアラニンがチロシンに置換された組換えプラスミドを作製した。更に詳細には、配列番号1に示したアミノ酸配列の282番目のフェニルアラニンをコードする塩基配列(ttc)がチロシン(Y)をコードする塩基配列(tat)に置換された組換えプラスミド(pIE353−F282Y)を取得することに成功した。
Claims (13)
- 以下の(I)または(II)に記載のタンパク質のアミノ末端から110番目のグリシンが、グルタミン、メチオニン、グルタミン酸またはトレオニンに置換されている、フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
(I)配列番号1に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
(II)配列番号1に記載されるアミノ酸配列のアミノ末端から110番目のアミノ酸以外の部位において、1または数個のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列からなり、且つフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質。 - アミノ末端から58番目のイソロイシンが他のアミノ酸に置換されている請求項1に記載のタンパク質。
- アミノ末端から282番目のフェニルアラニンが他のアミノ酸に置換されている請求項2に記載のタンパク質。
- 上記アミノ末端から58番目のイソロイシンが、メチオニン、トレオニン、アラニン、アスパラギン、セリン、バリン、または、ロイシンに置換されていることを特徴とする請求項2または3に記載のタンパク質。
- 上記アミノ末端から282番目のフェニルアラニンが、チロシンに置換されている請求項3に記載のタンパク質。
- 以下の(VI)のポリヌクレオチドからなる、フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(VI)請求項1〜5の何れか1項に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。 - 請求項6に記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
- 請求項7に記載の組換えベクターで宿主を形質転換した形質転換体。
- 請求項8に記載の形質転換体を培養してフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質を生成させ、当該タンパク質を採取する、フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質の製造方法。
- 糖化アミンに対して、請求項1〜5の何れか1項に記載のタンパク質を作用させる工程を含む、糖化タンパク質の測定方法。
- 試料中に含まれる糖化ヘモグロビンを測定する方法であって、
上記試料中の糖化ヘモグロビンから糖化アミンを調製する工程と、次いで、
上記試料に、請求項1〜5の何れか1項に記載のタンパク質を作用させる工程と、を含む、糖化ヘモグロビンの測定方法。 - 請求項1〜5の何れか1項に記載のタンパク質を備える、糖化タンパク質測定キット。
- 請求項1〜5の何れか1項に記載のタンパク質を備える、糖化タンパク質測定センサー。
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