JP5438020B2 - 新規なフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質及びその改変体、並びにその利用 - Google Patents
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Description
本発明は、糖化タンパク質、特に糖化ヘモグロビンの測定に有用なフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質及びその改変体、当該タンパク質をコードする遺伝子、並びにその利用法に関する。
糖尿病患者の血糖コントロールマーカーとして、血液中に含まれる糖化タンパク質であるヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）や、グリコアルブミンの測定が重用されている。これらの糖化タンパク質は、血液中に存在するＤ−グルコースと、血液タンパク質を構成するアミノ酸残基とが非酵素的に反応して生成するため、血液中のグルコース量をよく反映する。
血液タンパク質の主な糖化部位は、内部リジン残基のε−アミノ基、およびアミノ末端（Ｎ末端）アミノ酸のα−アミノ基である。例えば、ＨｂＡ１ｃは、ヘモグロビンβ鎖のＮ末端アミノ酸であるバリンのα−アミノ基に、Ｄ−グルコースが結合して生じた糖化タンパク質である。
近年、血液中の糖化タンパク質を簡便且つ短時間で測定できる酵素的測定法（以下、「酵素法」と称する。）が開発され、既に商品化されている。酵素法を利用することにより、糖化タンパク質をハイスループットに測定することが可能となり、臨床検査分野で役立てられている。
酵素法は、まず、プロテアーゼで糖化タンパク質を加水分解し、次に、加水分解で生じたフルクトシルバリン、フルクトシルリジン、フルクトシルバリルヒスチジンなどの糖化アミノ酸をフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＤ）で酸化的加水分解する。最後に、オキシダーゼ反応により生じた過酸化水素を、ペルオキシダーゼ−色原体反応システムにより比色定量する（特許文献１から１１参照）。
酵素法による糖化タンパク質の測定では、主反応酵素であるフルクトシルアミノ酸オキシダーゼの基質特異性が重要な要素となる。例えば、ＨｂＡ１ｃの測定では、フルクトシルバリンに対する基質特異性に優れた酵素が望まれている。
さらに、糖化ヘモグロビンのβ鎖に特異的な測定を行うためには、フルクトシルバリルヒスチジンに作用する酵素が望まれている。これは、ヘモグロビンα鎖およびβ鎖のＮ末端アミノ酸が共にバリンであることから、β鎖に特異的な測定を行うためには、Ｎ末端アミノ酸２残基（すなわち、フルクトシルバリルヒスチジン）を認識する必要があるためである。（特許文献１２、特許文献１３参照）。
これまでに、フルクトシルバリルヒスチジンに作用するオキシダーゼを生産する菌株がスクリーニングされている（例えば、特許文献１４参照）。
また、フルクトシルバリルヒスチジンに作用するオキシダーゼに関して、遺伝子組み換え体を用いて当該オキシダーゼの産生、抽出、及び精製を行った報告があり、該オキシダーゼをコードする遺伝子も単離されている（特許文献１５、特許文献１７、非特許文献１、非特許文献２参照）。
Arch. Microbiol., 180: 227-231 (2003)
Biochem. Biophys. Res. Commun., 311: 104-111 (2003)
しかしながら、従来の、フルクトシルバリンに作用するフルクトシルアミノ酸オキシダーゼの多くは、より大きな基質であるフルクトシルバリルヒスチジンには実質的に作用しない。そのため、フルクトシルバリルヒスチジンに作用するフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを得るためには、多大な労力、時間、コストをかけてスクリーニングする必要があった。
さらに、特許文献１５、非特許文献１及び２に記載の、従来のフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼは熱安定性が悪く、液状の臨床診断薬中では長期保存できないという欠点があった。
また、酵素法では、プロテアーゼによる糖化タンパク質の加水分解工程で、不所望なフルクトシルリジンが比較的多量に生じる場合があるため、当該フルクトシルリジンに対する反応性が低いフルクトシルアミノ酸オキシダーゼが望まれる。特許文献１７には、配列番号１に記載のアミノ酸配列と相同性が８５．５％（図１参照）であって、且つ、フルクトシルリジンに対する反応性が２．５％であるケトアミンオキシダーゼが記載されている。このケトアミンオキシダーゼはフルクトシルバリルヒスチジンに反応するためフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼと言い換えることができる。しかしながら、当該フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼの他の酵素特性は不明であり、液状の臨床診断薬中で使用できるか否かはわからない。
つまり、フルクトシルバリルヒスチジンに作用するオキシダーゼとして、優れた熱安定性と、フルクトシルリジンに対する反応性の低さとを両立するものが見出されておらず、それ故に、公知のオキシダーゼを液状の臨床診断薬として用いる技術は、実用可能なレベルには至っていなかった。
更に具体的には、何らかの原因で試料中に遊離の糖化アミンが混入すると、従来のフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼを用いた測定では、測定値が異常に高値を示すことになる。当該問題は、特に高カロリー輸液用製剤が投与された患者で多く発生し、その理由は、輸液によって高濃度の糖およびアミノ酸が体内に補充された場合に、血中もしくは輸液バック中で遊離の糖化アミノ酸または糖化ペプチドが生成するためであると考えられている。特に、ＨｂＡ１ｃ測定の場合には、ＦＡＯＤがフルクトシルバリンにも反応してしまうと、フルクトシルバリンの混入によって異常に高い糖化タンパク質量を示すことになる。
そこで、測定対象物がＦＡＯＤとの酸化還元反応を行う前に、予め測定対象物とは別に遊離している糖化アミンをＦＡＯＤにより消去する系が開発されてきた（例えば、特許文献３、５、７、１６参照）。
しかしながら、これらの方法は消去反応においてＦＡＯＤを使用するため、当該消去反応時に過酸化水素が発生するという問題点がある。当該過酸化水素が測定対象物の酸化還元反応に持ち込まれると、測定値が上昇してしまう。それ故、当該方法では、測定対象物がＦＡＯＤとの酸化還元反応を行う前に、過酸化水素を除去する必要がある。
したがって、遊離糖化アミンをＦＡＯＤによって予め消去する工程を含む糖化アミン測定方法は、以下の（１）〜（４）の反応を含む。つまり、
（１）遊離アミンをＦＡＯＤで消去する反応（以下「消去反応」と呼ぶ）
（２）消去反応で発生した過酸化水素を除去する反応（以下「除去反応」と呼ぶ）
（３）プロテアーゼにより、糖化タンパク質を糖化アミノ酸または糖化ペプチドに断片化する反応（以下「断片化反応」と呼ぶ）
（４）断片化された糖化アミノ酸または糖化ペプチドとＦＡＯＤとが酸化還元反応を行い、これによって発色する反応（以下「発色反応」と呼ぶ）。
（１）遊離アミンをＦＡＯＤで消去する反応（以下「消去反応」と呼ぶ）
（２）消去反応で発生した過酸化水素を除去する反応（以下「除去反応」と呼ぶ）
（３）プロテアーゼにより、糖化タンパク質を糖化アミノ酸または糖化ペプチドに断片化する反応（以下「断片化反応」と呼ぶ）
（４）断片化された糖化アミノ酸または糖化ペプチドとＦＡＯＤとが酸化還元反応を行い、これによって発色する反応（以下「発色反応」と呼ぶ）。
上記除去反応では、例えば、水素供与体とＰＯＤ（peroxidase）との自己縮合、および／またはカタラーゼを共存させるが、過酸化水素を完全に除去できずに当該過酸化水素が発色反応に持ち込まれれば、測定値の上昇につながる可能性がある。
これらの反応において少なくとも消去反応と除去反応とは、発色反応よりも前に行う必要がある。また、断片化反応に用いるプロテアーゼによって酵素（ＦＡＯＤ）が分解されるため、プロテアーゼ耐性の高い酵素を選定するか、または消去反応および発色反応を断片化反応とは別に行う必要がある。よって、上記糖化アミン測定方法では、糖化アミン測定試薬の組成、当該糖化アミン測定試薬の添加時点、および反応順序が限定されるという問題点を有している。
また、血液サンプル中には糖化アルブミンが含まれているので、ＨｂＡ１ｃを測定する場合には、この影響を回避する必要がある。糖化アルブミンは、アルブミンのリジン残基のε−アミノ基が糖化されているため、プロテアーゼによる切断によって発生するフルクトシルリジンにＦＡＯＤが反応すると、測定値が高値化する。当該問題点を解決するためにも、フルクトシルバリルヒスチジンには反応するが、フルクトシルバリンおよびフルクトシルリジンへの反応性が低いＦＡＯＤが望まれているが、このようなＦＡＯＤは報告されていない。
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、糖化タンパク質、特に糖化ヘモグロビンの測定に有用なフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質とその改変体、および当該タンパク質をコードする遺伝子を新たに創出することにある。さらには、当該タンパク質を利用した糖化タンパク質（糖化ヘモグロビン等）の測定方法、糖化タンパク質（糖化ヘモグロビン等）測定用試薬組成物、糖化タンパク質（糖化ヘモグロビン等）測定キット、および糖化タンパク質（糖化ヘモグロビン等）センサー、等を提供することにある。
本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意検討を重ねた結果、微生物ゲノムデータベースに存在する機能未知のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ相同遺伝子のうち、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ ｎｏｄｏｒｕｍ（小麦ふ枯病菌）に由来する遺伝子産物が、フルクトシルバリルヒスチジンに作用するフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼであることを見出した。上記フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼのアミノ酸配列を配列番号１に示す。
そして本発明者らはさらに検討した結果、上記フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼが熱安定性、基質特異性及び基質との親和性が高いことを発見し、本発明を完成させるに至った。
また、本発明者らは、更に検討を重ねた結果、フルクトシルバリルヒスチジンの測定に有用なフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質であって、野生型タンパク質よりも基質特異性および／または熱安定性が向上した変異タンパク質（改変体）を取得することにも成功した。そして、本発明者らは、この変異タンパク質をフルクトシルバリルヒスチジン含有検体に作用させ、生じた過酸化水素をペルオキシダーゼ反応にて定量することによって、フルクトシルアミノ酸を測定することが可能であることも確認した。
すなわち本発明は、以下のような構成からなるものである。
本発明に係るタンパク質は、上記課題を解決するために、以下の（I）から（III）のいずれかに記載の、フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質であることを特徴としている。（I）配列番号１に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質。（II）配列番号１に記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、且つフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質。（III）配列番号１に記載されるアミノ酸配列と８６．０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
本発明に係るタンパク質は、上記（II）または（III）に記載のタンパク質であって、アミノ末端から５８番目のイソロイシン、および／または、アミノ末端から１１０番目のグリシンが他のアミノ酸に置換されていることが好ましい。
本発明に係るタンパク質は、上記（II）または（III）に記載のタンパク質であって、アミノ末端から２８２番目のフェニルアラニンが他のアミノ酸に置換されていることが好ましい。
本発明に係るタンパク質は、上記アミノ末端から５８番目のイソロイシンが、メチオニン、トレオニン、アラニン、アスパラギン、セリン、バリン、または、ロイシンに置換されていることが好ましい。
本発明に係るタンパク質は、上記アミノ末端から１１０番目のグリシンが、グルタミン、メチオニン、グルタミン酸、トレオニン、アラニン、システイン、ヒスチジン、リシン、アスパラギン、アルギニン、セリン、バリン、ロイシン、アスパラギン酸、イソロイシン、チロシンまたはフェニルアラニンに置換されていることが好ましい。
本発明に係るタンパク質は、上記アミノ末端から２８２番目のフェニルアラニンが、チロシンに置換されていることが好ましい。
本発明に係るポリヌクレオチドは、上記課題を解決するために、以下の（IV）から（VII）のいずれかのポリヌクレオチドからなる、フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであることを特徴としている。（IV）配列番号２に記載される塩基配列からなるポリヌクレオチド。（V）配列番号２に記載される塩基配列において、１つ以上３０以下の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加された塩基配列からなり、且つフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。（VI）本発明のタンパク質のうちの何れかのタンパク質をコードするポリヌクレオチド。（VII）上記（IV）から（VI）のいずれかのポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
なお、上記（II）において、置換、欠失、挿入および／または付加された塩基の数は、１〜２０個であることが好ましい。
本発明は更に、本発明のポリヌクレオチドのうちの何れかのポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、当該組換えベクターで宿主を形質転換した形質転換体を提供する。
本発明に係るタンパク質の製造方法は、上記の課題を解決するために、上記形質転換体を培養してフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質を生成させ、当該タンパク質を採取することを特徴としている。
本発明に係る糖化タンパク質の測定方法は、上記の課題を解決するために、糖化アミンに対して、本発明のタンパク質のうちの何れかのタンパク質を作用させる工程を含むことを特徴としている。
本発明に係る糖化ヘモグロビンの測定方法は、上記の課題を解決するために、試料中の糖化ヘモグロビンから糖化アミンを調製する工程と、次いで、当該試料に、本発明のタンパク質のうちの何れかのタンパク質を作用させる工程とを含むことを特徴としている。上記測定方法によれば、上記試料中における糖化ヘモグロビンの有無、及び糖化ヘモグロビンの量を測定することができる。
なお、上記糖化アミンを調製する工程は、糖化ヘモグロビンを適当な長さのペプチド断片又はアミノ酸に分解することにより行うことができる。また、調製される糖化アミンは、好ましくは、フルクトシルバリン、フルクトシルバリルヒスチジン、及びフルクトシルバリルヒスチジル基を末端に含む糖化ペプチドの少なくとも一種類を含むものであり、より好ましくは、ヘモグロビンのα鎖とβ鎖とを区別した測定が可能なように、フルクトシルバリルヒスチジン、及び／又は、フルクトシルバリルヒスチジル基を末端に含む糖化ペプチドを含むものである。
本発明は更に、本発明のタンパク質のうちの何れかのタンパク質を備える糖化タンパク質測定キット及び糖化タンパク質測定センサーを提供する。
本発明者らはＰｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ ｎｏｄｏｒｕｍのゲノム情報（http://genamics.com/cgi-bin/genamics/genomes/genomesearch.cgi?field=ID&query=1666参照）について鋭意研究を重ね、この菌がフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼを産生する可能性があることを突き止めた。この知見に基づき、さらに研究を重ねたところ、この菌の遺伝子から、フルクトシルバリルヒスチジンに作用するフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ（配列番号１にそのアミノ酸配列を示す）を発現させることに成功した。
配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質（適宜「配列番号１のタンパク質」という）が、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼを産生する可能性があることは、既に見出されているゲノム配列の相同性検索からある程度予測することができるが、フルクトシルバリルヒスチジンに作用するフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（つまり「フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ」）であることは、ゲノム情報やアミノ酸配列情報からは探索することはできない。また、現時点において、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの立体構造は解明されておらず、立体構造情報から酵素活性を類推することも不可能であった。さらに、相同性検索から選択された遺伝子をクローニングして発現させても、タンパク質が精製できなかったり、予測通りの酵素活性を有していなかったりする例は多数報告がなされている。
本発明により、糖化タンパク質、特に糖化ヘモグロビン測定用として有用なフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ剤、およびその利用法を提供することが可能となる。また本発明は、熱安定性、基質特異性及び基質との親和性が高いフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質、およびその利用法を提供することができる。
また、本発明により、基質特異性および／または熱安定性が更に優れたフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ改変体を提供することができるという効果を奏する。より具体的には、配列番号１に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質のアミノ末端から５８番目のイソロイシンを他のアミノ酸に置換することによって、当該タンパク質のフルクトシルバリルヒスチジンに対する基質特異性を更に上昇させることが可能となり、アミノ末端から１１０番目のグリシンを他のアミノ酸の置換することによって、当該タンパク質の熱安定性を更に上昇させることが可能となる。その結果、より正確に糖化タンパク質の量を測定することができるという効果を奏する。
本発明の実施の形態について詳細に説明すれば以下のとおりであるが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、本明細書中に記載された非特許文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。また本明細書中の「〜」は「以上、以下」を意味し、例えば明細書中で「★〜☆」と記載されていれば「★以上、☆以下」を示す。また本明細書中の「および／または」は、いずれか一方または両方を意味する。
＜１．本発明にかかるタンパク質＞
本発明にかかるタンパク質は、以下の（I）から（III）のいずれかに記載の、フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質である。つまり、
（I）配列番号１に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（II）配列番号１に記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、且つフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質；
（III）配列番号１に記載されるアミノ酸配列と８６．０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
本発明にかかるタンパク質は、以下の（I）から（III）のいずれかに記載の、フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質である。つまり、
（I）配列番号１に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（II）配列番号１に記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、且つフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質；
（III）配列番号１に記載されるアミノ酸配列と８６．０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
上記配列番号１に示されるアミノ酸配列は、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ ｎｏｄｏｒｕｍのゲノムデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=NZ_AAGI00000000）に基づき探索をし、単離をしたフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼのアミノ酸配列である。
また、本発明は、上記で説示した本発明にかかるタンパク質のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、且つフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をも包含するが、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加される部位は、置換、欠失、挿入および／または付加後のタンパク質がフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有していれば、該アミノ酸配列中のどの部位であってもよい。ここで「１または数個のアミノ酸残基」とは、具体的には１０個以内の範囲のアミノ酸残基数であり、好ましくは６個以内の範囲のアミノ酸残基である。
また、本発明は、上記で説示した本発明にかかるタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１に示す）において、当該アミノ酸配列と８６．０％以上、より好ましくは９０．０％以上、より好ましくは９５．０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質を包含する。
なお、アミノ酸配列の相同性は、公知の方法で求めることができる。具体的には、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ（株式会社ゼネティックス社製の商品名）を当該商品のマニュアルに従って使用し、配列番号１に示すアミノ酸配列と比較対象のアミノ酸配列とのホモロジーサーチ（ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｓｅａｒｃｈ）により一致するアミノ酸配列の割合（％）として、相同性を計算することができる。相同性は、比較対象の配列の全領域にわたって最適な状態にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定され得る。ここで、比較対象の塩基配列またはアミノ酸配列を最適な状態にアラインメントするために、付加または欠失（例えば、ギャップ等）を許容してもよい。
上述した、「配列番号１に記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、且つフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質」、または、「配列番号１に記載されるアミノ酸配列と８６．０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質」では、配列番号１に記載されるアミノ酸配列において、アミノ末端から５８番目のイソロイシン、および／またはアミノ末端から１１０番目のグリシンが他のアミノ酸に置換されていることが好ましい。
上記タンパク質では、上記アミノ末端から５８番目のイソロイシンおよび／またはアミノ末端から１１０番目のグリシンが、他のアミノ酸に置換されている。上記他のアミノ酸としては特に限定されず、適宜公知のアミノ酸に置換され得る。置換されるアミノ酸としては、例えば、天然のタンパク質の構成成分である基本アミノ酸、何らかの化学修飾を受けた修飾アミノ酸、基本アミノ酸から誘導された特殊アミノ酸などを挙げることできるが、これらに限定されない。
アミノ末端から５８番目のイソロイシンを他のアミノ酸に置換することによって、上記タンパク質のフルクトシルバリルヒスチジンに対する基質特異性を更に上昇させることが可能となり、アミノ末端から１１０番目のグリシンを他のアミノ酸の置換することによって、上記タンパク質の熱安定性を更に上昇させることが可能となる。
以下に、まず、アミノ末端から５８番目のイソロイシンが他のアミノ酸に置換されている場合について、具体的に説明する。
上記アミノ末端から５８番目のイソロイシンは、例えばメチオニン、トレオニン、アラニン、アスパラギン、セリン、バリン、または、ロイシンに置換されていることが好ましい。上記構成であれば、フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼの基質特異性（フルクトシルバリルヒスチジンに対する反応性）を更に上昇させることができる。
フルクトシルバリルヒスチジンに対する基質特異性を更に上昇させる（換言すれば、フルクトシルバリンおよびフルクトシルリジンの両基質への反応性を大幅に低下させる）という観点からは、上記アミノ末端から５８番目のイソロイシンは、トレオニン、セリン、バリンまたはアラニンに置換されることが更に好ましい。
一方、基質特異性のみならず熱安定性をも上昇させるという観点からは、上記アミノ末端から５８番目のイソロイシンは、メチオニン、セリンまたはアラニンに置換されることが更に好ましい。
したがって、基質特異性を更に上昇させるとともに熱安定性をも上昇させるという観点からは、上記アミノ末端から５８番目のイソロイシンは、セリンまたはアラニンに置換されることが最も好ましいといえる。
アミノ末端から５８番目のイソロイシンが他のアミノ酸に置換されている場合には、アミノ末端から５８番目以外の部位においても、アミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加され得る。このとき、アミノ末端から５８番目以外で置換、欠失、挿入、および／または付加が生じる箇所としては、特に限定されない。
次いで、アミノ末端から１１０番目のグリシンが他のアミノ酸に置換されている場合について、具体的に説明する。
上記アミノ末端から１１０番目のグリシンは、例えば、トリプトファンおよびプロリン以外のアミノ酸に置換されていることが好ましい。更に具体的には、上記アミノ末端から１１０番目のグリシンは、グルタミン、メチオニン、グルタミン酸、トレオニン、アラニン、システイン、ヒスチジン、リシン、アスパラギン、アルギニン、セリン、バリン、ロイシン、アスパラギン酸、イソロイシン、チロシンまたはフェニルアラニンに置換されていることが好ましい。上記構成であれば、フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼの熱安定性を上昇させることができる。
熱安定性のみならず比活性をも上昇させるという観点からは、上記アミノ末端から１１０番目のグリシンは、グルタミン酸（Ｅ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）またはチロシン（Ｙ）に置換されることが更に好ましい。
熱安定性のみならずＫｍ評価をもより良いものとするという観点からは、上記アミノ末端から１１０番目のグリシンは、ヒスチジン（Ｈ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、チロシン（Ｙ）、またはフェニルアラニン（Ｆ）に置換されることが更に好ましい。
熱安定性のみならず基質特異性をも上昇させるという観点からは、上記アミノ末端から１１０番目のグリシンは、グルタミン酸（Ｅ）、またはアスパラギン酸（Ｄ）に置換されることが更に好ましい。
アミノ末端から１１０番目のグリシンが他のアミノ酸に置換されている場合には、アミノ末端から１１０番目以外の部位においても、アミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加され得る。このとき、アミノ末端から１１０番目以外で置換、欠失、挿入、および／または付加が生じる箇所としては、特に限定されない。
配列番号１に示されるアミノ酸配列において、アミノ末端から５８番目のアミノ酸と、アミノ末端から１１０番目のアミノ酸との両方が、他のアミノ酸に置換されていることが好ましい。上記構成によれば、フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼの熱安定性を上昇させる傾向を示すとともに、フルクトシルリジンへの反応性を低下させる傾向を示す。また、上述したように上記アミノ末端から１１０番目のグリシンが置換される具体的なアミノ酸は特に限定されないが、例えば、グルタミンであることが好ましい。上記構成であれば、更にフルクトシルバリンおよびフルクトシルリジンへの反応性を低下させることができる。
上記「配列番号１に記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、且つフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質」、または、「配列番号１に記載されるアミノ酸配列と８６．０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質」では、配列番号１に記載されるアミノ酸配列におけるアミノ末端から５８番目・１１０番目のアミノ酸以外に、アミノ末端から２８２番目のフェニルアラニンが他のアミノ酸に置換されていることが好ましい。上記構成によれば、フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼの熱安定性を上昇させることができる。
上記アミノ末端から２８２番目のフェニルアラニンが置換される具体的なアミノ酸としては特に限定されないが、例えば、チロシンであることが好ましい。上記構成であれば、更にフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼの熱安定性を上昇させることができる。
本発明におけるフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性は、後述する実施例の「活性測定法」の項において説明した方法によって測定される。フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を測定する場合、フルクトシルバリルヒスチジンを基質として用いればよい。なお、本発明の説明において「フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有する」とは、フルクトシルバリルヒスチジンを基質としたオキシダーゼ活性を少なくとも有すればよいが、好ましくは０．１Ｕ／ｍｇ‐ｐｒｏｔｅｉｎ以上を意味し、さらに好ましくは１．０Ｕ／ｍｇ‐ｐｒｏｔｅｉｎ以上を意味する。また、本発明にかかるタンパク質は、上記フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性に加えて、他の酵素活性（限定されないが、例えば、フルクトシルバリンに対するオキシダーゼ活性）をさらに有してよい。
上記本発明にかかるタンパク質は、例えば、自然界から単離した当該タンパク質を産生する生物（例えば、細菌、酵母、昆虫、線虫、ゼブラフィッシュ、哺乳類など）を用いて生産されてもよい。つまり、本発明にかかるタンパク質には、様々な生物種由来のタンパク質が包含される。また、本発明にかかるタンパク質は、遺伝子組み換え技術を用いて生産されてもよいし、またはアミノ酸合成機などを用いて化学合成されてもよい。遺伝子組み換え技術において、好適に用いられる各種組換えタンパク質発現系は、例えば、大腸菌発現系、昆虫細胞発現系、哺乳類細胞発現系、および無細胞発現系を用いてもよく、これらに限定されない。本発明のタンパク質等の製造方法については後述する。
また本発明にかかるタンパク質等は、例えば、分子間架橋および／または分子内架橋（例えば、ジスルフィド結合など）が施されたもの、化学修飾（例えば、糖鎖、リン酸もしくはその他の官能基など）されたもの、標識（例えば、ヒスチジンタグ、Ｍｙｃタグ、またはＦｌａｇタグなど）が付与されたもの、または融合タンパク質（例えば、ストレプトアビジン、シトクロム、ＧＳＴまたはＧＦＰなど）を付与されたものなどが含まれるが、特にこれらに限定されない。さらに、本発明にかかるタンパク質は、フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性が実質的に維持される限り、数種のタンパク質の断片を組み合わせて構成したキメラタンパク質も含み得る。
本発明にかかるタンパク質と、血清タンパク質、有機酸、または、デキストランをはじめとする賦形剤等とからフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ剤を構成してもよい。上記フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ剤には、酵素剤の構成物品として公知の物品が含まれていてもよい。
＜２．本発明にかかるポリヌクレオチド＞
本発明にかかるポリヌクレオチドは、本発明にかかるタンパク質をコードするポリヌクレオチドであることを特徴としている。
本発明にかかるポリヌクレオチドは、本発明にかかるタンパク質をコードするポリヌクレオチドであることを特徴としている。
つまり、本発明にかかるポリヌクレオチドは、以下の（IV）〜（VII）の何れかのポリヌクレオチドからなる、フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。
（IV）配列表の配列番号２に記載される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（V）配列番号２に記載される塩基配列において、１つ以上３０以下の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加された塩基配列からなり、且つフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（VI）本発明にかかるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（VII）上記（IV）から（VI）の何れかのポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（V）配列番号２に記載される塩基配列において、１つ以上３０以下の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加された塩基配列からなり、且つフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（VI）本発明にかかるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（VII）上記（IV）から（VI）の何れかのポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、「遺伝子」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。ここで、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ）、またはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態で存在し得る。ＤＮＡまたはＲＮＡは、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖）であっても、非コード鎖（アンチセンス鎖）であってもよい。
また、本発明にかかるポリヌクレオチドは化学的に合成してもよく、コードするタンパク質の発現が向上するように、コドンユーセージ（Ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ）を変更してもよい。勿論、同じアミノ酸をコードするコドン同士であれば置換することも可能である。
本発明にかかるポリヌクレオチドの作製方法としては特に限定されず、適宜公知の方法によって作製することが可能である。例えば、野生型のフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼをコードするポリヌクレオチド（配列番号２）に対して、必要に応じて適宜変異を導入することによって作製することが可能である。また、化学合成法によって作製することも可能である。
本発明にかかるポリヌクレオチドを作製する方法としては、通常行われるポリヌクレオチド改変方法が用いられる。すなわち、タンパク質の遺伝情報を有するポリヌクレオチドの特定の塩基を置換、欠失、挿入および／または付加することで、所望の組換えタンパク質の遺伝情報を有するポリヌクレオチドを作製することができる。ポリヌクレオチドの塩基を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット（ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；東洋紡績製，Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ製，ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製など）の使用、またはポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）の利用が挙げられる。これらの方法は当業者に公知である。
本発明にかかるポリヌクレオチドは、上記本発明にかかるタンパク質をコードしていればその塩基配列は特に限定されるものではない。よって本発明にかかるタンパク質のアミノ酸配列に応じた塩基配列からなる全てのポリヌクレオチドが本発明に含まれる。
本発明の一実施形態では、本発明にかかるポリヌクレオチドは、当該ポリヌクレオチドを構成する塩基の一部が化学的に合成された塩基（いわゆる非天然型塩基を含む）で置換されたものでもよい。また、本発明にかかるポリヌクレオチドが置換される部位は特に限定されず、置換後の塩基配列から発現するタンパク質が好適な性質を有していればよい。
本発明にかかるポリヌクレオチドは、本発明にかかるタンパク質をコードするポリヌクレオチドのみからなるものであってもよいが、その他の塩基配列が付加されていてもよい。付加される塩基配列としては、限定されないが、標識（例えば、ヒスチジンタグ、ＭｙｃタグまたはＦＬＡＧタグなど）、融合タンパク質（例えば、ストレプトアビジン、シトクロム、ＧＳＴ、ＧＦＰまたはＭＢＰなど）、プロモーター配列（例えば、酵母由来プロモーター配列、ファージ由来プロモーター配列または大腸菌由来プロモーター配列など）、およびシグナル配列（例えば、小胞体移行シグナル配列、および分泌配列など）をコードする塩基配列などが挙げられる。これらの塩基配列が付加される部位は特に限定されるものではなく、例えば、翻訳されるタンパク質のＮ末端であっても、Ｃ末端でもあってもよい。
また本発明にかかるポリヌクレオチドには、上記本発明にかかるタンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号２に示される塩基配列を有するポリヌクレオチド）、またはこれに相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドも含まれる。
ここで、「ストリンジェントな条件」とは、相同性が高い核酸同士、例えば完全にマッチしたハイブリッドの融解温度（Ｔｍ値）から１５℃、好ましくは１０℃、更に好ましくは５℃低い温度までの範囲の温度でハイブリダイズする条件をいう。例えば、一般的なハイブリダイゼーション用緩衝液中で、６８℃、２０時間の条件でハイブリダイズする条件をいう。更に具体的には、上記ハイブリダイゼーションは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）に記載されている周知の方法で行うことができる。
本発明にかかるポリヌクレオチドの塩基配列は、Science, 214: 1205 (1981)に記載されたジデオキシ法により決定され得る。
本発明にかかるポリヌクレオチドの一例に関して、以下に更に詳細に説明するが、本発明は、これに限定されない。なお、本発明にかかるポリヌクレオチドには、以下に記載する置換のあらゆる組み合わせによって生じるポリヌクレオチドが包含される。
まず、本発明の一例である、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、アミノ末端から５８番目のイソロイシンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドについて説明する。
本発明にかかるポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、アミノ末端から５８番目のイソロイシンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドであることが好ましい。更に具体的には、配列番号２に示されるポリヌクレオチドにおいて、「ａｔｔ（１７２番目〜１７４番目）」がイソロイシン以外をコードするコドンに置換されたポリヌクレオチドであることが好ましい。
上記「ａｔｔ」を置換する具体的なコドンとしては特に限定されないが、例えば、メチオニン、トレオニン、アラニン、アスパラギン、セリン、バリン、または、ロイシンをコードするコドンであることが好ましい。更に具体的には、上記「ａｔｔ」は、「ａｔｇ（メチオニンをコードするコドン）」、「ａｃｃ（トレオニンをコードするコドン）」、「ｇｃｔ（アラニンをコードするコドン）」、「ａａｃ（アスパラギンをコードするコドン）」、「ｔｃｇ（セリンをコードするコドン）」、「ｇｔｃ（バリンをコードするコドン）」、または、「ｃｔｃ（ロイシンをコードするコドン）」に置換されることが好ましいが、これらに限定されない。上記アミノ酸をコードする別のコドンに置換することも勿論可能である。
更に、本発明にかかるポリヌクレオチドは、上記置換に加えて、配列番号１に示されるアミノ酸配列におけるアミノ末端から２８２番目のフェニルアラニンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドであることが好ましい。更に具体的には、配列番号２に示されるポリヌクレオチドにおいて、「ｔｔｃ（８４４番目〜８４６番目）」がフェニルアラニン以外をコードするコドンに置換されたポリヌクレオチドであることが好ましい。
上記「ｔｔｃ」を置換する具体的なコドンとしては特に限定されないが、例えば、チロシンをコードするコドンであることが好ましい。更に具体的には、上記「ｔｔｃ」は、「ｔａｔ（チロシンをコードするコドン）」に置換されることが好ましいが、これに限定されない。上記「ｔｔｃ」を、チロシンをコードする別のコドンに置換することも勿論可能である。
更に、本発明にかかるポリヌクレオチドは、上記置換に加えて、配列番号１に示されるアミノ酸配列におけるアミノ末端から１１０番目のグリシンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドであることが好ましい。更に具体的には、配列番号２に示されるポリヌクレオチドにおいて、「ｇｇａ（３２８番目〜３３０番目）」がグリシン以外をコードするコドンに置換されたポリヌクレオチドであることが好ましい。
上記「ｇｇａ」を置換する具体的なコドンとしては特に限定されないが、例えば、グルタミンをコードするコドンであることが好ましい。更に具体的には、上記「ｇｇａ」は、「ｃａｇ（グルタミンをコードするコドン）」に置換されることが好ましいが、これに限定されない。上記「ｇｇａ」を、グルタミンをコードする別のコドンに置換することも勿論可能である。
次いで、本発明の一例である、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、アミノ末端から１１０番目のグリシンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドについて説明する。
本発明にかかるポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、アミノ末端から１１０番目のグリシンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドであることが好ましい。更に具体的には、配列番号２に示されるポリヌクレオチドにおいて、「ｇｇａ（３２８番目〜３３０番目）」がグリシン以外をコードするコドンに置換されたポリヌクレオチドであることが好ましい。
上記「ｇｇａ」を置換する具体的なコドンとしては特に限定されないが、例えば、トリプトファンおよびプロリン以外のアミノ酸をコードするコドンであることが好ましい。更に具体的には、グルタミン、メチオニン、グルタミン酸、トレオニン、アラニン、システイン、ヒスチジン、リシン、アスパラギン、アルギニン、セリン、バリン、ロイシン、アスパラギン酸、イソロイシン、チロシンまたはフェニルアラニンをコードするコドンであることが好ましい。更に具体的には、上記「ｇｇａ」は、「ａｃｇ（トレオニンをコードするコドン）」、「ｇｃｇ（アラニンをコードするコドン）」、「ｇｔｇ（バリンをコードするコドン）」、「ｃｔｇ（ロイシンをコードするコドン）」、「ａｔｔ（イソロイシンをコードするコドン）」、「ａｔｇ（メチオニンをコードするコドン）」、「ｔｔｃ（フェニルアラニンをコードするコドン）」、「ｔｃｃ（セリンをコードするコドン）」、「ｃａｇ（グルタミンをコードするコドン）」、「ｔｇｔ（システインをコードするコドン）」、「ｔａｃ（チロシンをコードするコドン）」、「ａａｃ（アスパラギンをコードするコドン）」、「ａａｇ（リジンをコードするコドン）」、「ｃａｃ（ヒスチジンをコードするコドン）」、「ａｇｇ（アルギニンをコードするコドン）」、「ｇａｃ（アスパラギン酸をコードするコドン）」、または「ｇａｇ（グルタミン酸をコードするコドン）」に置換されることが好ましいが、これらに限定されない。上記アミノ酸（置換後のアミノ酸）をコードする別のコドンに置換することも勿論可能である。
更に、本発明にかかるポリヌクレオチドは、上記置換に加えて、配列番号１に示されるアミノ酸配列におけるアミノ末端から２８２番目のフェニルアラニンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドであることが好ましい。更に具体的には、配列番号２に示されるポリヌクレオチドにおいて、「ｔｔｃ（８４４番目〜８４６番目）」がフェニルアラニン以外をコードするコドンに置換されたポリヌクレオチドであることが好ましい。
上記「ｔｔｃ」を置換する具体的なコドンとしては特に限定されないが、例えば、チロシンをコードするコドンであることが好ましい。更に具体的には、上記「ｔｔｃ」は、「ｔａｔ（チロシンをコードするコドン）」に置換されることが好ましいが、これに限定されない。上記「ｔｔｃ」を、チロシンをコードする別のコドンに置換することも勿論可能である。
＜３．本発明にかかる組換えベクター・形質転換体＞
本発明にかかるベクターは、上記本発明にかかるポリヌクレオチドを含むものである。上記本発明にかかるポリヌクレオチドを含むものであれば、その他の構成は特に限定されるものではない。
本発明にかかるベクターは、上記本発明にかかるポリヌクレオチドを含むものである。上記本発明にかかるポリヌクレオチドを含むものであれば、その他の構成は特に限定されるものではない。
本発明にかかるベクターを構成するベースとなるベクターとしては、宿主に対して好適なベクターが適宜選択され得る。例えば、ベースとなるベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、アデノウイルス、またはレトロウイルスなどを使用することが可能であるが、これらに限定されない。
本発明にかかるベクターとしてプラスミドベクターを用いる場合、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）、ｐＵＣ１８などが使用できる。この場合、ベクターが導入される宿主としては、例えば、酵母、大腸菌（エシェリヒア・コリーＷ３１１０（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、エシェリヒア・コリーＣ６００、エシェリヒア・コリーＪＭ１０９、エシェリヒア・コリーＤＨ５α）、昆虫細胞、哺乳類細胞などが利用可能である。
更に、具体的には、上記宿主として、大腸菌（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉなど）等の細菌、酵母（例えば、出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、分裂酵母Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅなど）、昆虫細胞、線虫（例えば、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓなど）、アフリカツメガエル（例えば、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓなど）の卵母細胞、哺乳類細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞）や各種ヒト培養細胞などを用いることが可能であるが、これらに限定されない。また、本明細書中で使用される場合、用語「形質転換体」には、細胞、組織または器官だけでなく、生物個体をも含まれる。
本発明にかかるベクターは、導入されるべき宿主に依存して、発現制御領域（例えば、プロモーター、ターミネーター、および／または複製起点等）を含有することが可能である。プロモーターとしては、ウイルス性プロモーター（例えば、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター等）などが挙げられるが、これに限定されない。
上記ベクターは、少なくとも１つの選択マーカーを含むことが好ましい。このようなマーカーとしては、アンピシリン、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、ネオマイシン耐性遺伝子などが挙げられる。上記選択マーカーを用いれば、本発明にかかるポリヌクレオチドが宿主に導入されたか否か、さらには宿主中で確実に発現しているか否かを確認することができる。
上記宿主に本発明にかかるベクターを導入する方法としては特に限定されるものではないが、例えば、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。更に具体的には、エシェリヒア属に属する宿主微生物にベクターを導入する場合は、カルシウムイオンの存在下で組換えＤＮＡを導入する方法や、エレクトロポレーション法を用いる方法が適用され得る。その他、市販のコンピテントセル（例えば、コンピテントハイＪＭ１０９、コンピテントハイＤＨ５α；東洋紡績製）を用いて遺伝子導入が行われても良い。
本発明にかかるベクターを構築するには、本発明にかかるポリヌクレオチド（遺伝子）を分離および精製した後、制限酵素処理などを用いて切断した該ポリヌクレオチドの断片と、ベースとなるベクターを制限酵素で切断して得た直鎖ポリヌクレオチドとを結合閉鎖させて構築することができる。結合閉鎖する際には、ベクターおよび該ポリヌクレオチドの性質に応じてＤＮＡリガーゼなどが使用され得る。本発明のベクターを複製可能な宿主に導入した後、ベクターのマーカーおよび酵素活性の発現を指標としてスクリーニングして、本発明のポリヌクレオチド（遺伝子）を含有する形質転換体を得ることができる。よって、本発明にかかるベクターには薬剤耐性遺伝子などのマーカー遺伝子が含まれていることが好ましい。
なお本発明は、上記本発明にかかるベクターで形質転換された形質転換体を包含する。本発明にかかるベクターによって形質転換される宿主は、特に限定されないが、上述したように酵母、大腸菌、昆虫細胞、および哺乳類細胞などが挙げられる。
＜４．本発明にかかるタンパク質の製造方法＞
本発明にかかるタンパク質の製造方法は、上記本発明にかかる形質転換体を培養する工程（「培養工程」という）を含むことを特徴としている。本発明にかかるタンパク質の製造方法には、上記培養工程の他、形質転換体を用いたタンパク質生産において含まれ得るその他の工程が含まれていてもよい。その他の工程としては、例えば、培養工程後に、本発明にかかる形質転換体が生産したタンパク質を回収する工程や、当該タンパク質を精製する工程が挙げられる。
本発明にかかるタンパク質の製造方法は、上記本発明にかかる形質転換体を培養する工程（「培養工程」という）を含むことを特徴としている。本発明にかかるタンパク質の製造方法には、上記培養工程の他、形質転換体を用いたタンパク質生産において含まれ得るその他の工程が含まれていてもよい。その他の工程としては、例えば、培養工程後に、本発明にかかる形質転換体が生産したタンパク質を回収する工程や、当該タンパク質を精製する工程が挙げられる。
（４−１）培養工程
上記培養工程では、本発明にかかる形質転換体が栄養培地などで培養されることにより、多量の組換えタンパク質を安定して生産し得る。形質転換体の培養形態（培養方法、培養条件など）は、宿主の栄養生理的性質を考慮して選択すればよく、多くの場合は液体培養で行う。工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。
上記培養工程では、本発明にかかる形質転換体が栄養培地などで培養されることにより、多量の組換えタンパク質を安定して生産し得る。形質転換体の培養形態（培養方法、培養条件など）は、宿主の栄養生理的性質を考慮して選択すればよく、多くの場合は液体培養で行う。工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。
培養工程で用いられる栄養培地の栄養源としては、培養に通常用いられるものが広く使用されてよい。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、ラクトース、糖蜜、またはピルビン酸などが使用される。また、窒素源としては資化可能な窒素化合物であればよく、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、または大豆粕アルカリ抽出物などが使用される。これらに加えて、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて培地に添加されてよい。
本発明にかかる形質転換体の培養温度は、当該形質転換体が本発明にかかるタンパク質を生産可能な範囲内であれば適宜変更し得るが、例えば、大腸菌（エシェリヒア・コリー）を宿主として利用する場合、好ましくは２０〜４２℃程度であり、より好ましくは２０〜３０℃である。当該温度範囲であれば、活性を有するタンパク質を多く生産することができる。
培養時間は、本発明にかかるタンパク質が最高収量に達する適当な時期に培養を完了すればよく、通常は６〜４８時間程度である。培地のｐＨは本発明にかかる形質転換体が好適に発育し、且つ本発明にかかるタンパク質を生産可能な範囲内で適宜変更し得るが、好ましくはｐＨ６．０〜９．０程度の範囲である。
（４−２）回収工程
回収工程では、上記培養工程中に形質転換体によって生産された本発明にかかるタンパク質が回収される。
回収工程では、上記培養工程中に形質転換体によって生産された本発明にかかるタンパク質が回収される。
本発明にかかる形質転換体がタンパク質を細胞外に分泌する場合、その培養物には本発明のタンパク質が含まれている。よって培養物を本発明にかかるタンパク質としてそのまま利用することが可能である。この時、例えばろ過や遠心分離などにより、培養液と本発明にかかる形質転換体とを分離してもよい。
また本発明にかかるタンパク質が形質転換体内に存在する場合、形質転換体を培養して得られた培養物から、ろ過または遠心分離などの手段を用いて形質転換体を採取し、該形質転換体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊後、目的のタンパク質を回収すればよい。また、必要に応じて、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡなど）および界面活性剤（例えば、トリトン−Ｘ１００など）を添加して本発明にかかるタンパク質を可溶化し、当該タンパク質を水溶液として分離採取してもよい。
（４−３）精製工程
精製工程は、上記回収工程によって得られたタンパク質を精製する工程である。
精製工程は、上記回収工程によって得られたタンパク質を精製する工程である。
精製工程の具体的な方法は特に限定されるものではないが、例えば、本発明にかかるタンパク質を含む溶液を、減圧濃縮、膜濃縮、塩析処理（例えば、硫酸アンモニウムまたは硫酸ナトリウムなどを用いる）、または親水性有機溶媒（例えばメタノール、エタノール、アセトンなど）による分別沈殿法に供すればよい。上記操作によって、目的である本発明にかかるタンパク質を沈殿させ、精製することができる。
また、前記精製工程では、加熱処理、等電点処理、ゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、またはこれらの組み合わせを用いて精製を行ってもよい。
上記手法を用いて得られた目的のタンパク質を含む精製酵素は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行えば単一のバンドを示す程度に純化されていることが好ましい。
上記の精製酵素は、例えば凍結乾燥、真空乾燥、またはスプレードライなどにより粉末化して流通させることが可能である。また、精製酵素を使用する際は、その用途によって適宜緩衝液に溶解した状態で使用することができる。緩衝液としては、例えば、ホウ酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、およびＧＯＯＤ緩衝液などが目的のタンパク質の性質、および／または実験条件もしくは環境に応じて好適に選択されてよい。さらに、アミノ酸（例えば、グルタミン酸、グルタミン、またはリジンなど）、および血清アルブミンなどを精製酵素に添加することにより、タンパク質を安定化することができる。
＜５．本発明にかかる糖化タンパク質の測定方法＞
本発明にかかる糖化タンパク質の測定方法（以下「本発明の測定方法」という）は、少なくとも糖化アミンに本発明にかかるタンパク質（またはフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ剤）を作用させることを特徴としている。以下に本発明の測定方法の一実施形態を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。また本項の説明において「本発明にかかるタンパク質」は「本発明にかかるフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ剤」と読み替えることが可能である。
本発明にかかる糖化タンパク質の測定方法（以下「本発明の測定方法」という）は、少なくとも糖化アミンに本発明にかかるタンパク質（またはフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ剤）を作用させることを特徴としている。以下に本発明の測定方法の一実施形態を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。また本項の説明において「本発明にかかるタンパク質」は「本発明にかかるフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ剤」と読み替えることが可能である。
本発明にかかる測定方法の一実施形態は、
（１）試料とプロテアーゼとを反応させて、試料中の糖化タンパク質を分解し、試料中の糖化タンパク質由来の糖化アミンを調製する工程（便宜上「第１工程」という）、
（２）前記（１）の工程によって得られた試料中の糖化タンパク質由来の糖化アミンに本発明にかかるタンパク質を作用させる工程（便宜上「第２工程」という）、および、
（３）前記（２）の工程において発生した過酸化水素の量または消費された酸素の量を測定する工程（便宜上「第３工程」という）、を含む糖化タンパク質を測定するための方法である。
（１）試料とプロテアーゼとを反応させて、試料中の糖化タンパク質を分解し、試料中の糖化タンパク質由来の糖化アミンを調製する工程（便宜上「第１工程」という）、
（２）前記（１）の工程によって得られた試料中の糖化タンパク質由来の糖化アミンに本発明にかかるタンパク質を作用させる工程（便宜上「第２工程」という）、および、
（３）前記（２）の工程において発生した過酸化水素の量または消費された酸素の量を測定する工程（便宜上「第３工程」という）、を含む糖化タンパク質を測定するための方法である。
この実施形態における一具体例としては、酵素法が挙げられる。酵素法においては、試料中の糖化タンパク質をアミノ酸、またはペプチドのレベルまで酵素（例えば、プロテアーゼ）を用いて断片化する（第１工程）。次に、生じた糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドに、ＦＡＯＤを加え、酸化還元反応により過酸化水素を発生させる（第２工程）。この試料にペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）、および酸化により発色する還元剤を添加し、ＰＯＤを触媒として過酸化水素と還元剤との間で酸化還元反応を生じさせる（第３工程）。酸化還元反応により還元剤を発色させ、この発色強度を測定することにより過酸化水素量を測定できる（第３工程）。
以下に各工程について説明する。
（５−１）第１工程
第１工程は、試料中の糖化タンパク質を分解し、試料中の糖化タンパク質由来の糖化アミンを調製する工程である。
第１工程は、試料中の糖化タンパク質を分解し、試料中の糖化タンパク質由来の糖化アミンを調製する工程である。
上記「糖化タンパク質」とは、タンパク質を構成するアミノ酸残基の一部または全部に糖が結合した（糖化した）タンパク質を意味する。糖化タンパク質としては、特に限定されるものではないが、例えば、タンパク質のアミノ末端アミノ酸のα−アミノ基が糖化されたもの（例えばＨｂＡ１ｃ）等が挙げられる。なお上記例示したＨｂＡ１ｃは、糖尿病の診断など臨床診断の指標として使用されている。また、上記糖化タンパク質は、糖化したタンパク質とその他の任意の物質とが結合したタンパク質複合体であってもよい。
上記プロテアーゼとしては、試料中に含まれる糖化タンパク質を糖化アミノ酸または糖化ペプチドに分解し得るものであれば特に限定されるものではない。例えば臨床検査において使用されているプロテアーゼが好ましく利用され得る。
また上記「試料」は、糖化タンパク質の有無や濃度を検出すべき対象物であれば特に限定されるものではなく、例えば、全血、血漿、血清、血球等の他に、尿、髄液等の生体試料（すなわち生体から採取された試料）や、ジュース等の飲料水、醤油、ソース等の食品類等の試料に対しても適用できる。本発明の方法は、糖尿病の診断に応用することができるため、上記の中でも特に全血試料、血球試料に有用である。特に限定されるものではないが、赤血球内の糖化ヘモグロビンを測定する場合には、全血をそのまま溶血したり、全血から分離した赤血球を溶血したりして、この溶血試料を測定用の試料とすればよい。
試料とプロテアーゼとを反応させる際の具体的な条件は、所望の糖化アミンが調製され得る条件であれば特に限定されるものではなく、試料の濃度や種類、プロテアーゼの種類や濃度に応じて適宜好適な条件を検討の上、採用されればよい。
本発明の測定方法に好適に使用できるプロテアーゼの濃度は、例えば０．１Ｕ〜１ＭＵ／ｍｌ（より好ましくは１Ｕ〜５００ＫＵ／ｍｌ、最も好ましくは５Ｕ〜１００ＫＵ／ｍｌ）である。上記のプロテアーゼの濃度は、限定されるものではなく、反応条件、試料の種類並びに状態、実験者の手技および使用する試薬の種類などに応じて、好適に決定され得る。
また上記「糖化アミン」は、試料中に含まれる糖化タンパク質に由来の糖化アミノ酸や糖化ペプチドなどが挙げられる。糖化ペプチドの長さは特に限定されるものではないが、本発明のタンパク質が作用し得る長さ、例えばアミノ酸残基数が２〜６の範囲のものが挙げられる。
（５−２）第２工程
第２工程は、上記第１工程によって得られた試料中の糖化タンパク質由来の糖化ア
ミンに本発明にかかるタンパク質を作用させる工程である。
第２工程は、上記第１工程によって得られた試料中の糖化タンパク質由来の糖化ア
ミンに本発明にかかるタンパク質を作用させる工程である。
本発明にかかるタンパク質が有し得るフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性は特に限定されるものではないが、フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性が高いほど高感度で糖化アミンを検出することができ、フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼタンパク質の使用量を少なくすることができるために好ましい。
なお本発明の測定方法に好適に使用できるフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼタンパク質の濃度は、例えば０．１〜５００Ｕ／ｍｌ（好ましくは０．５〜２００Ｕ／ｍｌ、最も好ましくは１．０〜１００Ｕ／ｍｌ）である。ただし上記のフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼの濃度は、特に限定されるものではなく、反応条件、試料の種類並びに状態、実験者の手技および使用する試薬の種類などに応じて、適宜、決定され得る。
なお、１単位（Ｕ）の定義は、後述する実施例の「活性測定法」に記載したものと同一である。
また、本発明にかかるタンパク質が糖化アミンに作用すると、酸化的加水分解反応により酸素が消費され、過酸化水素が発生する。
（５−３）第３工程
第３工程は、上記第２工程において発生した過酸化水素の量または消費された酸素の量を測定する工程である。第３工程は過酸化水素の量または酸素の量を測定し得る方法であれば、その具体的方法は特に限定されるものではない。したがって、公知の方法が適宜適用され得る。
第３工程は、上記第２工程において発生した過酸化水素の量または消費された酸素の量を測定する工程である。第３工程は過酸化水素の量または酸素の量を測定し得る方法であれば、その具体的方法は特に限定されるものではない。したがって、公知の方法が適宜適用され得る。
第３工程に用いられる方法は、限定されないが、例えば、酵素法などが挙げられる。酵素法においては、試料中の糖化タンパク質をアミノ酸、またはペプチドのレベルまで酵素（例えば、プロテアーゼ）を用いて断片化する。次に、生じた糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドに、フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼを加え、酸化還元反応により過酸化水素を発生させる。この試料に、ペルオキシダーゼ（以下ＰＯＤと省略する）、および酸化により発色する還元剤を添加し、前記ＰＯＤを触媒として前記過酸化水素と前記還元剤との間で酸化還元反応を生じさせる。前記酸化還元反応により前記還元剤を発色させ、この発色強度を測定することにより前記過酸化水素量を測定できる。
第３工程において好適なＰＯＤは、西洋ワサビ、微生物などに由来するものである。また、前記のＰＯＤの好適な使用濃度は、０．０１〜１００単位（Ｕ）／ｍＬである。
第３工程において好適な過酸化水素の測定方法としては、ＰＯＤの存在下でのカップラー（４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）並びに３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）など）に対してフェノール系、アニリン系またはトルイジン系の水素供与体（いわゆる、トリンダー試薬）を酸化縮合反応させることにより色素を生成する方法、または、ＰＯＤの存在下で直接酸化呈色するロイコ色素を使用する方法が採用され得る。これらの方法は、当業者に公知であり、一般に容易に使用され得る。
上記トリンダー試薬としては、限定されないが、例えば、フェノール及びその誘導体を好適に用いることができる。
第３工程において好適に使用可能な上記カップラーとしては、４−アミノアンチピリン、アミノアンチピリン誘導体、バニリンジアミンスルホン酸、メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）（更に具体的には、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン）およびスルホン化メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＳＭＢＴＨ）（更に具体的には、スルホン化３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン）などが挙げられる。
第３工程において好適に使用できる前記ロイコ色素としては、特に限定されないが、例えば、トリフェニルメタン誘導体、フェノチアジン誘導体、ジフェニルアミン誘導体などが使用できる。
第３工程における前記過酸化水素量の測定において、前記ＰＯＤ等を用いた発色方法以外に、各種センサー系を用いた測定法が当業者に一般的に知られている（限定されないが、例えば、特開２００１−２０４４９４号公報を参照のこと）。具体的には、各種センサー系に用いる電極としては、酸素電極、カーボン電極、金電極、または白金電極などが挙げられる。本発明において、作用電極として酵素を固定化したこれらの電極を用い、対極（例えば、白金電極など）、および参照電極（例えば、Ａｇ／Ｃｌ電極など）と共に、本発明に好適な条件下の緩衝液中に挿入して一定温度に保持しながら、作用電極に一定の電圧を加え、さらに試料を添加して、酵素反応の結果生じる過酸化水素に起因する電流の増加値を測定することができる。
また、カーボン電極、金電極、および白金電極などを用いてアンペロメトリック系で測定する方法として、固定化電子メディエーターを用いる系がある。例えば、作用電極として、酵素および電子メディエーター（例えば、フェリシアン化カリウム、フェロセン、オスミウム誘導体、およびフェナジンメトサルフェートなど）を吸着、または共有結合法により高分子マトリクスに固定化した電極を用い、対極（例えば、白金電極など）、および参照電極（例えば、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極など）と共に、本発明に好適な条件下の緩衝液中に挿入して一定温度に保持する。続いて、作用電極に一定の電圧を加え、試料を添加して酵素反応の結果生じる過酸化水素に起因する電流の増加値を測定することができる。
第３工程で消費された酸素量を測定することで糖化アミン量を測定することもできる（限定されないが、例えば、特開２００１−２０４４９４号公報を参照のこと）。具体的には、酸素電極を用い、電極表面に酸素を固定化して、本発明に好適な条件下の緩衝液中に挿入して一定温度に保持する。ここに試料を加えて、電流の減少値を測定する。
カーボン電極、金電極、白金電極などを用いてアンペロメトリック系で測定する場合には、作用電極として酵素を固定化したこれらの電極を用い、対極（例えば、白金電極など）、および参照電極（例えば、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極など）と共に、メディエーターを含む電流の増加量を測定する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェロセン、オスミウム誘導体、およびフェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。
本発明の測定法において、各工程を実施する系（例えば、各反応溶液中）に、本発明のタンパク質の安定性を増すために不活性タンパク質を添加してもよい。不活性タンパク質は、血清アルブミン類、グロブリン類または繊維性タンパク質類であることが好ましい。更に好ましいタンパク質は、ウシ血清アルブミンであり、ｗｔ／ｖｏｌにおける好ましい濃度は、０．０５〜１％である。好ましい不活性タンパク質は、酵素分解を起こすプロテアーゼ不純物を含まないものである。
フルクトシルバリルヒスチジン濃度の測定は、試料の特定体積および試薬の特定体積を用いて行われる。吸光度測定は、試料ブランクを測定するために、当該試料と試薬とを混合後であって、かつフルクトシルバリルヒスチジンによる有意な吸光度変化が起こる前にできるだけ速やかに行われる。０．５〜５秒後の第１の吸光度測定が適当である。第２の吸光度測定は、吸光度が定常的になった後、典型的には１ｍｇ／ｄＬのフルクトシルバリルヒスチジン濃度において３７℃にて３〜５分間である。典型的には、該試薬は既知のフルクトシルバリルヒスチジン濃度を有する水性または血清溶液にて標準化される。
＜６．本発明にかかる糖化タンパク質測定キット＞
本発明にかかる糖化タンパク質測定キット（以下「本発明のキット」という）は、少なくとも上記本発明にかかるタンパク質（またはフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ剤）を備えることを特徴としている。
本発明にかかる糖化タンパク質測定キット（以下「本発明のキット」という）は、少なくとも上記本発明にかかるタンパク質（またはフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ剤）を備えることを特徴としている。
本発明のキットは、例えば、糖化ヘモグロビン測定キットであってもよい。本発明のキットに含まれる、本発明にかかるタンパク質（またはフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ剤）の形態は特に限定されるものではないが、例えば、水溶液、懸濁液または凍結乾燥粉末など形態が採用され得る。上記凍結乾燥粉末は常法に従って作製され得る。
本発明のキットは、様々な添加物を備え得るが、当該添加物の配合法は特に制限されるものではない。例えば、本発明にかかるタンパク質を含む緩衝液に添加剤を配合する方法、添加剤を含む緩衝液に本発明にかかるタンパク質を配合する方法、または本発明にかかるタンパク質および安定化剤を緩衝液に同時に配合する方法などが挙げられる。
本発明のキットは、少なくとも上記本発明にかかるタンパク質（またはフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ剤）、ペルオキシダーゼ、および色原体を備える試薬組成物により構成されていてもよい。
本発明の測定方法においてフルクトシルバリルヒスチジンの酸化に由来する過酸化水素の検出には、ペルオキシダーゼ反応を利用する。よって上記試薬組成物には、ペルオキシダーゼおよび色原体（過酸化水素発色試薬）が好ましく用いられる。上記ペルオキシダーゼおよび色原体（過酸化水素発色試薬）の具体的な構成は、何ら制限されるものではない。
本発明に用いられる色原体（過酸化水素発色試薬）は、溶液において安定であり、且つビリルビン干渉が低いものであることが好ましい。本発明に好適に用いることができる色原体（過酸化水素発色試薬）としては、例えば、４−アミノアンチピリン及び３−メチル−２−ベンゾチアゾリンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）から選択される化合物と、フェノール、その誘導体、アニリン、及びその誘導体から選択される化合物とを組み合わせてなる試薬が挙げられる。また、本発明において用いられる色原体（過酸化水素発色試薬）は、ベンジジン類、ロイコ色素類、４−アミノアンチピリン、フェノール類、ナフトール類およびアニリン誘導体類であってもよい。
また本発明において好適に用いられるペルオキシダーゼは、西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼが好ましい。前記ペルオキシダーゼは、高純度かつ低価格のものが商業的に入手可能である。酵素濃度は、迅速かつ完全な反応のために充分高くなければならず、好ましくは、１，０００〜５０，０００Ｕ／Ｌである。
また上記試薬組成物には、上記構成の他、緩衝剤（例えば、ホウ酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、およびＧＯＯＤ緩衝液など）が含まれていてもよい。さらに上記試薬組成物には、酵素反応を妨害するイオンを捕捉するキレート試薬（例えば、ＥＤＴＡおよびＯ−ジアニシジンなど）、過酸化水素の定量の妨害物質であるアスコルビン酸を消去するアスコルビン酸オキシダーゼ、各種界面活性剤（例えば、トリトンＸ−１００およびＮＰ−４０など）、ならびに各種抗菌剤および防腐剤（例えば、ストレプトマイシンおよびアジ化ナトリウムなど）などが含まれていてもよい。これらの試薬は、単一試薬でも２種類以上の試薬を組み合わせてなるものであってもよい。
上記緩衝剤としては特に限定されないが、６〜８．５のｐＨ範囲において充分な緩衝能力を有する任意の緩衝剤を使用することができる。このｐＨ範囲の緩衝剤としては、リン酸塩、トリス、ビス−トリスプロパン、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、２−モルフォリノエタンスルホン酸１水和物（ＭＥＳ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）（piperazine-1,4-bis (2-ethanesulfonic acid)）（ＰＩＰＥＳ）、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonic acid）（ＨＥＰＥＳ）、および３−［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）などが挙げられる。特に、好ましい緩衝剤はＭＥＳおよびＰＩＰＥＳである。また特に、好ましい濃度範囲は２０〜２００ｍＭであり、好ましいｐＨ範囲はｐＨ６〜７である。
本発明のキットには、例えば、フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ、緩衝液、プロテアーゼ、ＰＯＤ、発色試薬、酵素反応を妨害するイオンを捕捉するキレート試薬、過酸化水素の定量の妨害物質であるアスコルビン酸を消去するアスコルビン酸オキシダーゼ、界面活性剤、安定化剤、賦形剤、抗菌剤、防腐剤、ウェルプレート、蛍光スキャナー、自動分析機、および本発明にかかる測定方法を紙などの記録媒体に記載した取り扱い説明書などが含まれていてもよい。
本発明の測定キットは、本発明の糖化タンパク質の測定方法、およびフルクトシルアミノ酸の測定に利用し得るものであり、とりわけ、糖化ヘモグロビンの測定に好適に利用し得る。
＜７．本発明にかかる糖化タンパク質測定センサー＞
本発明にかかる糖化タンパク質測定センサー（以下「本発明のセンサー」）は、糖化タンパク質を検出するために用いられるセンサーであり、少なくとも本発明にかかるタンパク質（またはフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ剤）を備えている。
本発明にかかる糖化タンパク質測定センサー（以下「本発明のセンサー」）は、糖化タンパク質を検出するために用いられるセンサーであり、少なくとも本発明にかかるタンパク質（またはフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ剤）を備えている。
本発明のセンサーは、本発明の測定方法の実施に用いられる。とりわけ、糖化ヘモグロビンの測定に好適に利用し得る。よって、本発明のセンサーは、本発明の測定方法の実施に用いられる物品により構成されていてもよい。上記物品の説明については、本発明の測定方法および本発明のキットの項における緩衝剤等の説明を援用することができる。
本発明のセンサーの一実施形態は、本発明にかかるタンパク質（またはフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ剤）を支持体に固定して用いることができる。支持体としては、本発明にかかるタンパク質（またはフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ剤）を固定化できるものであれば、特に限定されるものではなく、形状や材質は該タンパク質の性質に応じて好適なものを使用してよい。支持体の形状は、本発明にかかるタンパク質（またはフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ剤）が固定化できる十分な面積を有するものであれば、特に限定されるものではないが、例えば、基板、ビーズおよび膜などが挙げられる。支持体の材料としては、例えば、無機系材料、天然高分子、および合成高分子などが挙げられる。
なお、本発明は上記の各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種種の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。
＜１．活性測定試薬＞
表１に実施例において使用した活性測定試薬の組成を示した。なお、実施例において使用した試薬は特記しない限り、ナカライテスク社より購入したものを用いた。
表１に実施例において使用した活性測定試薬の組成を示した。なお、実施例において使用した試薬は特記しない限り、ナカライテスク社より購入したものを用いた。
＜２．活性測定法＞
下記実施例１〜３における活性測定法を以下に説明する。
下記実施例１〜３における活性測定法を以下に説明する。
各基質に対する酵素活性は、酵素反応により生成する過酸化水素を追随するペルオキシダーゼ反応により生じた色素の吸光度の増加で測定した。活性測定試薬３ｍｌを３７℃で５分間予備加温後、予め、酵素希釈液（５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５））で希釈した酵素溶液０．１ｍｌを加え、反応を開始する。
３７℃で５分間反応させ、５００ｎｍの吸光度変化を測定する（ΔＯＤｔｅｓｔ／ｍｉｎ）。盲検では、酵素溶液の代わりに酵素希釈液０．１ｍｌを加え、上記同様に操作を行って吸光度変化を測定した（ΔＯＤｂｌａｎｋ／ｍｉｎ）。得られた吸光度変化より、下記計算式に基づき酵素活性を算出した。尚、上記条件で１分間に１マイクロモルの基質を酸化する酵素量を１単位（Ｕ）とする。
−計算式−
活性値（Ｕ／ｍｌ）＝｛ΔＯＤ／ｍｉｎ（ΔＯＤｔｅｓｔ−ΔＯＤｂｌａｎｋ）×３．１（ｍｌ）×希釈倍率｝／｛１３×１．０（ｃｍ）×０．１（ｍｌ）｝
３．１（ｍｌ）：全液量
１３：ミリモル吸光係数
１．０ｃｍ：セルの光路長
０．１（ｍｌ）：酵素サンプル液量
＜３．実施例１：フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ遺伝子のクローニング＞
Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼのｃＤＮＡクローニングを行うために、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ ｎｏｄｏｒｕｍのゲノムデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/genom_table.cgi?organism=fungi&database=321614）を検索した。
活性値（Ｕ／ｍｌ）＝｛ΔＯＤ／ｍｉｎ（ΔＯＤｔｅｓｔ−ΔＯＤｂｌａｎｋ）×３．１（ｍｌ）×希釈倍率｝／｛１３×１．０（ｃｍ）×０．１（ｍｌ）｝
３．１（ｍｌ）：全液量
１３：ミリモル吸光係数
１．０ｃｍ：セルの光路長
０．１（ｍｌ）：酵素サンプル液量
＜３．実施例１：フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ遺伝子のクローニング＞
Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼのｃＤＮＡクローニングを行うために、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ ｎｏｄｏｒｕｍのゲノムデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/genom_table.cgi?organism=fungi&database=321614）を検索した。
ゲノムデータベースから、ＦＡＤ依存オキシドレダクターゼ（ＦＡＤ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ）をコードすることが予測される遺伝子を抽出した。検索結果から得られた種々の遺伝子のうち、フルクトシルバリンに実質的に作用する酵素をコードする可能性を有するという観点からさらに絞り込みを行った結果、GenBank no. AAGI01000177 239512 bp Phaeosphaeria nodorum SN15 cont1.177, whole genome shotgun Sequence(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?tool=portal&db=nuccore&term=&query%5Fkey=11&dopt=gb&dispmax=20&page=1&qty=1&WebEnv=0x3fThZQ1ubv2E4QUtcTFzS2yHOV3ljOuR6kUwGyNOVEiqCGdFac8yYAlfzZG%2DvpBxXqNrPNESW3skk%402644558678701720%5F0135SID&WebEnvRq=1)の75,143 bpから76,625 bpの配列に相当する遺伝子をクローニング候補遺伝子とした。
次に、上記クローニング候補遺伝子のｃＤＮＡについて、スプライシング部位（エキソン-イントロン）の予測ツール(http://www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html)の使用や、既知の他の生物種のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ遺伝子との比較により、タンパク質をコードする部分に対応するｃＤＮＡ全配列を推定した。この情報をもとに、定法である遺伝子断片のＰＣＲによる全合成、すなわち全ＲＮＡの調製からｍＲＮＡの抽出を経て逆転写を行うことでｃＤＮＡ全配列を合成した。前記のｃＤＮＡを、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ ｈｉｇｈ（東洋紡績社製）を用いて末端の平滑化を行い、ｐＵＣ１１８のＳｍａＩ部位へサブクローニングした。ｃＤＮＡ部分についてシーケンス解析を行った結果、配列番号２に示した塩基配列が得られた。配列番号２に示した塩基配列におけるｃＤＮＡのコーディング領域は１番目の塩基から１３１４番目の塩基であり、開始コドンは１番目の塩基から３番目の塩基、終止コドンＴＡＧは１３１２番目の塩基から１３１４番目の塩基に相当する。配列番号２に示した塩基配列から明らかとなったアミノ酸配列は、配列番号１に示した。
なお、後述の実施例２及び３に示すように、得られたｃＤＮＡは、新規なフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼをコードするものであった。
＜４．実施例２：フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ遺伝子の大腸菌での大量発現と精製、酵素アッセイ＞
上記配列番号２に示した塩基配列を有するフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ遺伝子を含むプラスミドを作製し、大腸菌におけるフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼタンパク質の大量発現を試みた。
上記配列番号２に示した塩基配列を有するフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ遺伝子を含むプラスミドを作製し、大腸菌におけるフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼタンパク質の大量発現を試みた。
フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ遺伝子の終止コドンを除いた全長ｃＤＮＡ領域（配列番号２に示した塩基配列の１番目から１３１１番目の塩基まで）をＰＣＲで増幅した。その際、アミノ酸配列のＮ末端側に配列番号３に示すプライマーＰ１（5’-GGAATTCCATATGGCGCCCTCCAGAGCAAACACCAGTGTCATT-3’）（上記塩基配列における「CATATG」はＮｄｅI部位）を用いてＮｄｅＩ切断部位を挿入し、Ｃ末端側に配列番号４に示すプライマーＰ２（5’-CCGCTCGAGCAAGTTCGCCCTCGGCTTATCATGATTCCAACC-3’）（上記塩基配列における「CTCGAG」はＸｈｏＩ部位）を用いてＸｈｏＩ切断部位を導入した。本ＤＮＡ断片をｐＥＴ−２３ｂベクター（ノバジェン社）のＮｄｅＩ−ＸｈｏＩ部位へＴ７プロモーターと正方向になるようにサブクローニングした。作製したプラスミドは、フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ発現用プラスミドとしてｐＩＥ３５３と命名した。
前記のプラスミドｐＩＥ３５３を用いて大腸菌ＢＬ２１ ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬ（ストラタジーン社）を形質転換した。その後、アンピシリン耐性を示す形質転換体ＢＬ２１ ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬ（ｐＩＥ３５３）を選択した。
前記形質転換体の培養用の培地として、２００ｍｌのＴＢ培地を容積２Ｌの坂口フラスコに分注し、１２１℃、２０分間オートクレーブを行ったものを用いた。前記培地を放冷後、別途無菌濾過したアンピシリンを終濃度が１００μｇ／ｍｌになるように培地に添加した。この培地に１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地で予め３０℃、１６時間培養したＢＬ２１ ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬ（ｐＩＥ３５３）の培養液を２ｍｌ接種した。
続いて、３０℃で２４時間通気攪拌培養を行った。培養終了後、菌体を遠心分離により集菌し、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁した後、細胞を超音波破砕した。
次に、前記懸濁液を遠心分離して、上清液を粗酵素液として得た。フルクトシルバリルヒスチジンを基質として含む酵素活性測定試薬を用いて測定した粗酵素液のフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性は、約１．０Ｕ／ｍｌであった。得られた粗酵素液についてＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−Ｈｉｓ−ｔａｇ−（東洋紡績製）を用いて、規定のプロトコールに従って精製し、精製酵素標品（ＩＥ３５３）を得た。本方法により得られたＩＥ３５３標品は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により、単一であることが確認された。
前記ＩＥ３５３標品の酵素活性を、フルクトシルバリルヒスチジンを基質として含む酵素活性測定試薬を用いて測定し、フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有することを確認した。
＜５．実施例３：各フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼタンパク質の特性評価＞
本発明にかかるフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ（ＩＥ３５３）、及び従来の酵素ＦＰＯＸ−ＣＥ及びＦＰＯＸ−ＥＥ（ともにキッコーマン製）の、熱安定性、基質特異性及びフルクトシルバリルヒスチジン（Ｆ−ＶＨ）に対するＫｍ値を測定した結果を表２に示す。
本発明にかかるフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ（ＩＥ３５３）、及び従来の酵素ＦＰＯＸ−ＣＥ及びＦＰＯＸ−ＥＥ（ともにキッコーマン製）の、熱安定性、基質特異性及びフルクトシルバリルヒスチジン（Ｆ−ＶＨ）に対するＫｍ値を測定した結果を表２に示す。
熱安定性は５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に各酵素を０．１ｍｇ／ｍＬになるように調製し、５０℃、１０分間熱処理を行い、下記計算式により算出した。
熱安定性（％）＝（５０℃、１０分熱処理後の活性値）÷（熱処理なし活性値）×１００
基質特異性は各基質を１０ｍＭになるように調製して、前述した活性測定法を用い、下記計算式により算出した。なお、下記式中で、Ｆ−Ｋは、酵素反応の基質としてのフルクトシルリジンを指す。また、当該式で定義される基質特異性の値が小さいほど、Ｆ−ＶＨに対する特異性に優れ、好ましいと判定される。
基質特異性（Ｆ−Ｋ／Ｆ−ＶＨ）＝（Ｆ−Ｋを基質としたときの活性値）÷（Ｆ−ＶＨを基質としたときの活性値）
Ｆ−ＶＨに対するＫｍ値はＦ−ＶＨ濃度を１．７５ｍＭ、０．８８ｍＭ、０．５８ｍＭ、０．３５ｍＭ、０．２５ｍＭ、０．１８ｍＭになるように試薬を調製し、それぞれを用いて前述した活性測定を実施し、ラインウィーバー・バークプロットより算出した。
熱安定性（％）＝（５０℃、１０分熱処理後の活性値）÷（熱処理なし活性値）×１００
基質特異性は各基質を１０ｍＭになるように調製して、前述した活性測定法を用い、下記計算式により算出した。なお、下記式中で、Ｆ−Ｋは、酵素反応の基質としてのフルクトシルリジンを指す。また、当該式で定義される基質特異性の値が小さいほど、Ｆ−ＶＨに対する特異性に優れ、好ましいと判定される。
基質特異性（Ｆ−Ｋ／Ｆ−ＶＨ）＝（Ｆ−Ｋを基質としたときの活性値）÷（Ｆ−ＶＨを基質としたときの活性値）
Ｆ−ＶＨに対するＫｍ値はＦ−ＶＨ濃度を１．７５ｍＭ、０．８８ｍＭ、０．５８ｍＭ、０．３５ｍＭ、０．２５ｍＭ、０．１８ｍＭになるように試薬を調製し、それぞれを用いて前述した活性測定を実施し、ラインウィーバー・バークプロットより算出した。
＜６．活性測定方法＞
以下の実施例４〜７、参考例１におけるＦＡＯＤの活性測定方法を、以下に示す。
以下の実施例４〜７、参考例１におけるＦＡＯＤの活性測定方法を、以下に示す。
各基質に対するＦＡＯＤの酵素活性は、酵素反応によって生成される過酸化水素を用いたペルオキシダーゼ反応により生じた色素の吸光度の増加を測定した。
まず、活性測定試薬３ｍｌを３７℃にて５分間加温した後、当該活性測定試薬に、予め酵素希釈液（０．１％トリトンＸ１００を含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５））にて希釈した酵素溶液０．１ｍｌを加え、反応を開始した。
３７℃にて５分間反応させた後、単位時間あたりの５００ｎｍの吸光度変化を測定した（ΔＯＤｔｅｓｔ／ｍｉｎ）。盲検としては、酵素溶液の代わりに酵素希釈液０．１ｍｌを用い、同様の操作を行って吸光度変化を測定した（ΔＯＤｂｌａｎｋ／ｍｉｎ）。
下記計算式に基づいて、得られた吸光度変化から酵素活性を算出した。なお、上記条件下で１分間に１マイクロモルの基質を酸化する酵素量を１単位（Ｕ）と規定した。
−計算式−
活性値（Ｕ／ｍｌ）＝｛（（ΔＯＤｔｅｓｔ／ｍｉｎ）−（ΔＯＤｂｌａｎｋ／ｍｉｎ））×３．１ｍｌ×希釈倍率｝／（１３×１．０ｃｍ×０．１ｍｌ）
なお、上記計算式において、「３．１ｍｌ」は全液量を示し、「１３」はミリモル吸光係数を示し、「１．０ｃｍ」はセルの光路長を示し、「０．１ｍｌ」は酵素サンプル液量を示す。
活性値（Ｕ／ｍｌ）＝｛（（ΔＯＤｔｅｓｔ／ｍｉｎ）−（ΔＯＤｂｌａｎｋ／ｍｉｎ））×３．１ｍｌ×希釈倍率｝／（１３×１．０ｃｍ×０．１ｍｌ）
なお、上記計算式において、「３．１ｍｌ」は全液量を示し、「１３」はミリモル吸光係数を示し、「１．０ｃｍ」はセルの光路長を示し、「０．１ｍｌ」は酵素サンプル液量を示す。
＜７．基質特異性評価方法＞
以下の実施例４〜７、参考例１におけるＦＡＯＤの基質特異性評価方法を、以下に説明する。
以下の実施例４〜７、参考例１におけるＦＡＯＤの基質特異性評価方法を、以下に説明する。
各基質（Ｆ−Ｋ：フルクトシルリジン、Ｆ−Ｖ：フルクトシルバリン、Ｆ−ＶＨ：フルクトシルバリルヒスチジン）の濃度が２ｍＭになるように活性測定試薬を調製し、上述した活性測定法に従って、下記計算式により活性値比（基質特異性）を算出した。
（Ｆ−Ｖ／Ｆ−ＶＨ）＝（Ｆ−Ｖを基質としたときの活性値）÷（Ｆ−ＶＨを基質としたときの活性値）
（Ｆ−Ｋ／Ｆ−ＶＨ）＝（Ｆ−Ｋを基質としたときの活性値）÷（Ｆ−ＶＨを基質としたときの活性値）
なお、当該式で定義される活性値比の値が小さいほど、Ｆ−ＶＨに対する特異性に優れ、好ましいと判定される。
（Ｆ−Ｋ／Ｆ−ＶＨ）＝（Ｆ−Ｋを基質としたときの活性値）÷（Ｆ−ＶＨを基質としたときの活性値）
なお、当該式で定義される活性値比の値が小さいほど、Ｆ−ＶＨに対する特異性に優れ、好ましいと判定される。
＜８．熱安定性評価方法＞
以下の実施例４〜７、参考例１におけるＦＡＯＤの熱安定性評価方法を、以下に説明する。
以下の実施例４〜７、参考例１におけるＦＡＯＤの熱安定性評価方法を、以下に説明する。
精製酵素標品を０．１ｍｇ／ｍｌになるように５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解し、５０℃にて１０分間の加熱処理を施した。なお、後述する３重変異タンパク質では、加熱温度は５５℃とした。そして、以下の計算式に基づいて、精製酵素標品の熱安定性（％）を算出した。
熱安定性（％）＝[（５０℃、１０分間加熱処理後の活性値）／（加熱処理前の活性値）]×１００
＜９．実施例４：フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ遺伝子・タンパク質の改変＞
配列番号１に示したアミノ酸配列の５８番目のイソロイシンをランダムに他のアミノ酸に置換するために、プライマーＲ１およびプライマーＲ２を合成した。
・プライマーＲ１：5’-cttattgaggtcattgcctgcagattgcgatgaagg-3’（配列番号５）
・プライマーＲ２：5’-nnsatgggcgttagcttgcgaaacccagtggac-3’（配列番号６）
上記ｐＩＥ３５３、プライマーＲ１、およびプライマーＲ２、およびＫＯＤ−Ｐｌｕｓ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（東洋紡績製）を用いて、上記５８番目のイソロイシンに変異が導入された組換えプラスミドを作製した。当該組換えプラスミドを用いてＢＬ２１ ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬを形質転換した後、アンピシリン耐性を示す１００個のコロニーをピックアップした。１００個のコロニーに導入されている１００個の組換えプラスミドの塩基配列を確認したところ、配列番号１に示したアミノ酸配列の５８番目のイソロイシンが１９種類のアミノ酸の各々に置換されたプラスミドを取得することに成功した。
＜９．実施例４：フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ遺伝子・タンパク質の改変＞
配列番号１に示したアミノ酸配列の５８番目のイソロイシンをランダムに他のアミノ酸に置換するために、プライマーＲ１およびプライマーＲ２を合成した。
・プライマーＲ１：5’-cttattgaggtcattgcctgcagattgcgatgaagg-3’（配列番号５）
・プライマーＲ２：5’-nnsatgggcgttagcttgcgaaacccagtggac-3’（配列番号６）
上記ｐＩＥ３５３、プライマーＲ１、およびプライマーＲ２、およびＫＯＤ−Ｐｌｕｓ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（東洋紡績製）を用いて、上記５８番目のイソロイシンに変異が導入された組換えプラスミドを作製した。当該組換えプラスミドを用いてＢＬ２１ ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬを形質転換した後、アンピシリン耐性を示す１００個のコロニーをピックアップした。１００個のコロニーに導入されている１００個の組換えプラスミドの塩基配列を確認したところ、配列番号１に示したアミノ酸配列の５８番目のイソロイシンが１９種類のアミノ酸の各々に置換されたプラスミドを取得することに成功した。
具体的には、配列番号１に示したアミノ酸配列の５８番目をコードする塩基配列（ａｔｔ）がトレオニン（Ｔ）をコードする塩基配列（ａｃｃ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の５８番目をコードする塩基配列（ａｔｔ）がアラニン（Ａ）をコードする塩基配列（ｇｃｔ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｉ５８Ａ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ａと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の５８番目をコードする塩基配列（ａｔｔ）がバリン（Ｖ）をコードする塩基配列（ｇｔｃ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｉ５８Ｖ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｖと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の５８番目をコードする塩基配列（ａｔｔ）がロイシン（Ｌ）をコードする塩基配列（ｃｔｃ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｉ５８Ｌ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｌと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の５８番目をコードする塩基配列（ａｔｔ）がメチオニン（Ｍ）をコードする塩基配列（ａｔｇ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｉ５８Ｍ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｍと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の５８番目をコードする塩基配列（ａｔｔ）がフェニルアラニン（Ｆ）をコードする塩基配列（ｔｔｃ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｉ５８Ｆ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｆと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の５８番目をコードする塩基配列（ａｔｔ）がセリン（Ｓ）をコードする塩基配列（ｔｃｇ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｉ５８Ｓ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｓと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の５８番目をコードする塩基配列（ａｔｔ）がグルタミン（Ｑ）をコードする塩基配列（ｃａａ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｉ５８Ｑ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｑと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の５８番目をコードする塩基配列（ａｔｔ）がシステイン（Ｃ）をコードする塩基配列（ｔｇｃ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｉ５８Ｃ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｃと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の５８番目をコードする塩基配列（ａｔｔ）がチロシン（Ｙ）をコードする塩基配列（ｔａｃ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｉ５８Ｙ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｙと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の５８番目をコードする塩基配列（ａｔｔ）がアスパラギン（Ｎ）をコードする塩基配列（ａａｃ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｉ５８Ｎ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｎと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の５８番目をコードする塩基配列（ａｔｔ）がリジン（Ｋ）をコードする塩基配列（ａａｇ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｉ５８Ｋ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｋと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の５８番目をコードする塩基配列（ａｔｔ）がヒスチジン（Ｈ）をコードする塩基配列（ｃａｃ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｉ５８Ｈ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｈと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の５８番目をコードする塩基配列（ａｔｔ）がアルギニン（Ｒ）をコードする塩基配列（ｃｇｃ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｉ５８Ｒ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｒと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の５８番目をコードする塩基配列（ａｔｔ）がアスパラギン酸（Ｄ）をコードする塩基配列（ｇａｃ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｉ５８Ｄ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｄと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の５８番目をコードする塩基配列（ａｔｔ）がグルタミン酸（Ｅ）をコードする塩基配列（ｇａａ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｉ５８Ｅ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｅと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の５８番目をコードする塩基配列（ａｔｔ）がトリプトファン（Ｗ）をコードする塩基配列（ｔｇｇ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｉ５８Ｗ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｗと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の５８番目をコードする塩基配列（ａｔｔ）がプロリン（Ｐ）をコードする塩基配列（ｃｃｃ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｉ５８Ｐ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｐと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の５８番目をコードする塩基配列（ａｔｔ）がグリシン（Ｇ）をコードする塩基配列（ｇｔｔ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｉ５８Ｇ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｇと呼ぶ。
取得した各プラスミドを用いてＢＬ２１ ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬを形質転換した後、アンピシリン耐性を示す形質転換体をそれぞれ選抜した。
上述した上記ＩＥ３５３の場合と同様に、各形質転換体を培養し、得られた粗酵素液から精製を行うことにより、それぞれの精製酵素標品（ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ａ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｖ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｌ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｇ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｍ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｆ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｓ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｑ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｃ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｙ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｎ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｋ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｈ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｒ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｄ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｅ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｗ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｐ）を得た。各精製酵素標品をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分析し、各精製酵素標品が単一のタンパク質であることを確認した。
＜１０．実施例５：フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ変異タンパク質の特性評価＞
まず、上述した活性測定方法にしたがって、野生型フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ（ＩＥ３５３）、および、１９種類の精製酵素標品（ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ａ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｖ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｌ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｇ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｍ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｆ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｓ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｑ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｃ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｙ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｎ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｋ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｈ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｒ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｄ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｅ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｗ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｐ）の酵素活性を測定した。
まず、上述した活性測定方法にしたがって、野生型フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ（ＩＥ３５３）、および、１９種類の精製酵素標品（ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ａ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｖ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｌ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｇ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｍ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｆ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｓ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｑ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｃ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｙ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｎ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｋ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｈ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｒ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｄ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｅ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｗ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｐ）の酵素活性を測定した。
上記精製酵素標品の中でフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するものは、ＩＥ３５３、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｍ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｓ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｖ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ａ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｎ、およびＩＥ３５３−Ｉ５８Ｌであった。
これらの精製酵素標品に関して、上述した基質特異性評価方法および熱安定性評価方法に従って、更に基質特異性および熱安定性を評価した。その結果を、表３に示す。
表３に示すように、配列番号１に示したアミノ酸配列の５８番目のイソロイシンを他のアミノ酸（Ｔ、Ｍ、Ｓ、Ｖ、Ａ，Ｎ、またはＬ）に置換した変異タンパク質は、野生型フルクトシルバリスヒスチジンオキシダーゼタンパク質と比較してＦ−Ｋ／Ｆ−ＶＨ、Ｆ−Ｖ／Ｆ−ＶＨが低減すること、つまり基質特異性が向上していることが明らかになった。更に、５８番目のイソロイシンをメチオニン（Ｍ）、アラニン（Ａ）またはセリン（Ｓ）に置換した変異タンパク質は、野生型のタンパク質と比較して熱安定性も向上していることが明らかになった。
＜１１．実施例６：更なるアミノ酸置換を含むフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ変異タンパク質（２重変異タンパク質）、および当該変異タンパク質の特性評価＞
配列番号１に示したアミノ酸配列の５８番目のイソロシンの置換に加えて他のアミノ酸をも置換した場合に、当該変異タンパク質の特性がどのように変化するか検討した。
配列番号１に示したアミノ酸配列の５８番目のイソロシンの置換に加えて他のアミノ酸をも置換した場合に、当該変異タンパク質の特性がどのように変化するか検討した。
まず、配列番号１に示したアミノ酸配列の２８２番目のフェニルアラニンがチロシンに置換された変異タンパク質の発現プラスミドを作製した。以下に、当該発現プラスミドの作製方法を説明する。
配列番号１に示したアミノ酸配列の２８２番目のフェニルアラニンをチロシンに置換するために、プライマーＹ１およびプライマーＹ２を合成した。
・プライマーＹ１：5’-tatacgcgcttcaagatgcatcaaccctttggcg-3’（配列番号７）
・プライマーＹ２：5’-gccaggaaactcgtcgcagactttgatcacg-3’（配列番号８）
上記ｐＩＥ３５３、プライマーＹ１、プライマーＹ２、およびＫＯＤ−Ｐｌｕｓ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（東洋紡績製）を用いて、上記２８２番目のフェニルアラニンがチロシンに置換された組換えプラスミドを作製した。更に詳細には、配列番号１に示したアミノ酸配列の２８２番目のフェニルアラニンをコードする塩基配列（ｔｔｃ）がチロシン（Ｙ）をコードする塩基配列（ｔａｔ）に置換された組換えプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｆ２８２Ｙ）を取得することに成功した。なお、後述する表４に示すように、ｐＩＥ３５３−Ｆ２８２Ｙから得られる精製酵素標品（ＩＥ３５３−Ｆ２８２Ｙ）は、野生型のフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼと比較して、熱安定性が向上していた。
・プライマーＹ１：5’-tatacgcgcttcaagatgcatcaaccctttggcg-3’（配列番号７）
・プライマーＹ２：5’-gccaggaaactcgtcgcagactttgatcacg-3’（配列番号８）
上記ｐＩＥ３５３、プライマーＹ１、プライマーＹ２、およびＫＯＤ−Ｐｌｕｓ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（東洋紡績製）を用いて、上記２８２番目のフェニルアラニンがチロシンに置換された組換えプラスミドを作製した。更に詳細には、配列番号１に示したアミノ酸配列の２８２番目のフェニルアラニンをコードする塩基配列（ｔｔｃ）がチロシン（Ｙ）をコードする塩基配列（ｔａｔ）に置換された組換えプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｆ２８２Ｙ）を取得することに成功した。なお、後述する表４に示すように、ｐＩＥ３５３−Ｆ２８２Ｙから得られる精製酵素標品（ＩＥ３５３−Ｆ２８２Ｙ）は、野生型のフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼと比較して、熱安定性が向上していた。
上記ｐＩＥ３５３−Ｆ２８２Ｙ、プライマーＲ１、およびプライマーＲ２、およびＫＯＤ−Ｐｌｕｓ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（東洋紡績製）を用いて、２８２番目のアミノ酸であるフェニルアラニンからチロシンへの置換に加えて、更に５８番目のイソロイシンが他のアミノ酸へ置換された変異タンパク質の発現プラスミドを作製した。なお、当該発現プラスミドの作製方法は、５８番目のイソロイシンのみを置換したときと基本的に同じであるので、ここでは、その詳細な説明を省略する。
以上のようにして作製した発現プラスミドを用いて、表３に示す精製酵素標品と同様の方法にて各精製酵素標品を取得し、これらの精製酵素標品の基質特異性および熱安定性を評価した。その結果を、表４に示す。
また、熱安定性に関しては、好ましい特性が得られているものが多く得られた。例えば、置換したアミノ酸が特にＭ、Ａの場合には、野生型と比較して熱安定性が大幅に向上していた。
＜１２．実施例７：更なるアミノ酸置換を含むフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ変異タンパク質（３重変異タンパク質）、および当該変異タンパク質の特性評価＞
配列番号１に示したアミノ酸配列における５８番目のイソロシンの置換、および２８２番目のフェニルアラニンの置換に加えて他のアミノ酸をも置換した場合に、当該変異タンパク質の特性がどのように変化するか検討した。
配列番号１に示したアミノ酸配列における５８番目のイソロシンの置換、および２８２番目のフェニルアラニンの置換に加えて他のアミノ酸をも置換した場合に、当該変異タンパク質の特性がどのように変化するか検討した。
まず、配列番号１に示したアミノ酸配列の２８２番目のフェニルアラニンがチロシンに置換されるとともに、１１０番目のグリシンがグルタミンに置換された変異タンパク質の発現プラスミドを作製した。以下に、当該発現プラスミドの作製方法を説明する。
配列番号１に示したアミノ酸配列の２８２番目のフェニルアラニンをチロシンに置換するために、プライマーＱ１およびプライマーＱ２を合成した。
・プライマーＱ１：5’-taccaagctctcgtggacgcgggcttggat-3’（配列番号９）
・プライマーＱ２：5’-cagtaccaagctctcgtggacgcgggctt-3’（配列番号１０）
上記ｐＩＥ３５３−Ｆ２８２Ｙ、プライマーＹ１、プライマーＹ２、およびＫＯＤ−Ｐｌｕｓ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（東洋紡績製）を用いて、上記２８２番目のフェニルアラニンがチロシンに置換されるとともに、１１０番目のグリシンがグルタミンに置換された組換えプラスミドを作製した。更に詳細には、配列番号１に示したアミノ酸配列の２８２番目のフェニルアラニンをコードする塩基配列（ｔｔｃ）がチロシン（Ｙ）をコードする塩基配列（ｔａｔ）に置換されるとともに、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目のグリシンをコードする塩基配列（ｇｇａ）がグルタミン（Ｑ）をコードする塩基配列（ｃａｇ）に置換された組換えプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｑ＋Ｆ２８２Ｙ）を取得しすることに成功した。
・プライマーＱ１：5’-taccaagctctcgtggacgcgggcttggat-3’（配列番号９）
・プライマーＱ２：5’-cagtaccaagctctcgtggacgcgggctt-3’（配列番号１０）
上記ｐＩＥ３５３−Ｆ２８２Ｙ、プライマーＹ１、プライマーＹ２、およびＫＯＤ−Ｐｌｕｓ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（東洋紡績製）を用いて、上記２８２番目のフェニルアラニンがチロシンに置換されるとともに、１１０番目のグリシンがグルタミンに置換された組換えプラスミドを作製した。更に詳細には、配列番号１に示したアミノ酸配列の２８２番目のフェニルアラニンをコードする塩基配列（ｔｔｃ）がチロシン（Ｙ）をコードする塩基配列（ｔａｔ）に置換されるとともに、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目のグリシンをコードする塩基配列（ｇｇａ）がグルタミン（Ｑ）をコードする塩基配列（ｃａｇ）に置換された組換えプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｑ＋Ｆ２８２Ｙ）を取得しすることに成功した。
上記ｐＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｑ＋Ｆ２８２Ｙ、プライマーＲ１、およびプライマーＲ２、およびＫＯＤ−Ｐｌｕｓ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（東洋紡績製）を用いて、２８２番目のアミノ酸であるフェニルアラニンからチロシンへの置換および１１０番目のアミノ酸であるグリシンからグルタミンへの置換に加えて、更に５８番目のイソロイシンが他のアミノ酸へ置換された変異タンパク質の発現プラスミドを作製した。なお、当該発現プラスミドの作製方法は、５８番目のイソロイシンのみを置換したときと基本的に同じであるので、ここでは、その詳細な説明を省略する。
以上のようにして作製した発現プラスミドを用いて、表３に示す精製酵素標品と同様の方法にて各精製酵素標品を取得し、これらの精製酵素標品の基質特異性および熱安定性を評価した。その結果を、表５に示す。
また、置換したアミノ酸がＭ、Ａ、Ｓの場合には、熱安定性も向上していることが明らかになった。よって、配列番号１に示したアミノ酸配列に更なる変異が導入されたフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ改変体に関しても、５８番目のイソロイシンを他のアミノ酸に置換することによって基質特異性が向上することが明らかになった。
＜１３．参考例１：更なるアミノ酸置換を含むフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ変異タンパク質（３重変異タンパク質）、および当該変異タンパク質の特性評価＞
上述した実施例１０では１１０番目のグリシンをグルタミンに置換しているが、他のアミノ酸に置換した場合にも同様の効果があるか否かを検証した。更に具体的には、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｆ２８２Ｙに対して、更に１１０番目のグリシンを他のアミノ酸に置換し、これらの精製酵素標品の基質特異性を調べた。
上述した実施例１０では１１０番目のグリシンをグルタミンに置換しているが、他のアミノ酸に置換した場合にも同様の効果があるか否かを検証した。更に具体的には、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｆ２８２Ｙに対して、更に１１０番目のグリシンを他のアミノ酸に置換し、これらの精製酵素標品の基質特異性を調べた。
まず、配列番号１に示したアミノ酸配列の２８２番目のフェニルアラニンがチロシンに置換されるとともに、５８番目のイソロイシンがトレオニンに置換された変異タンパク質の発現プラスミドを作製した。以下に、当該発現プラスミドの作製方法を説明する。
配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目のグリシンをランダムに他のアミノ酸に置換するために、プライマーＲ３およびプライマーＲ４を合成した。
・プライマーＲ３：5’-snnagacttcaggtctgcaatgtctttttc-3’（配列番号１１）
・プライマーＲ４：5’-taccaagctctcgtggacgcgggcttggat-3’（配列番号１２）
実施例９で取得した発現プラスミドｐＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｑ＋Ｆ２８２Ｙ、プライマーＲ３、プライマーＲ４、および、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いて、更に１１０番目のグリシンに変異が導入された組換えプラスミドを作製した。
・プライマーＲ３：5’-snnagacttcaggtctgcaatgtctttttc-3’（配列番号１１）
・プライマーＲ４：5’-taccaagctctcgtggacgcgggcttggat-3’（配列番号１２）
実施例９で取得した発現プラスミドｐＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｑ＋Ｆ２８２Ｙ、プライマーＲ３、プライマーＲ４、および、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いて、更に１１０番目のグリシンに変異が導入された組換えプラスミドを作製した。
当該組換えプラスミドを用いてＢＬ２１ ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬを形質転換した後、アンピシリン耐性を示す１００個のコロニーをピックアップした。１００個のコロニーに導入されている１００個の組換えプラスミドの塩基配列を確認したところ、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目のグリシンが１９種類のアミノ酸（野生型も含む）の各々に置換されたプラスミドを取得することに成功した。
具体的には、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目をコードする塩基配列（ｇｇａ）がアラニン（Ａ）をコードする塩基配列（ｇｃｇ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ａ＋Ｆ２８２Ｙ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ａ＋Ｆ２８２Ｙと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目をコードする塩基配列（ｇｇａ）がバリン（Ｖ）をコードする塩基配列（ｇｔｇ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｖ＋Ｆ２８２Ｙ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｖ＋Ｆ２８２Ｙと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目をコードする塩基配列（ｇｇａ）がロイシン（Ｌ）をコードする塩基配列（ｃｔｇ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｌ＋Ｆ２８２Ｙ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｌ＋Ｆ２８２Ｙと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目をコードする塩基配列（ｇｇａ）がメチオニン（Ｍ）をコードする塩基配列（ａｔｇ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｍ＋Ｆ２８２Ｙ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｍ＋Ｆ２８２Ｙと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目をコードする塩基配列（ｇｇａ）がフェニルアラニン（Ｆ）をコードする塩基配列（ｔｔｃ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｆ＋Ｆ２８２Ｙ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｆ＋Ｆ２８２Ｙと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目をコードする塩基配列（ｇｇａ）がセリン（Ｓ）をコードする塩基配列（ｔｃｃ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｓ＋Ｆ２８２Ｙ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｓ＋Ｆ２８２Ｙと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目をコードする塩基配列（ｇｇａ）がトレオニン（Ｔ）をコードする塩基配列（ａｃｇ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｔ＋Ｆ２８２Ｙ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｔ＋Ｆ２８２Ｙと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目をコードする塩基配列（ｇｇａ）がシステイン（Ｃ）をコードする塩基配列（ｔｇｔ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｃ＋Ｆ２８２Ｙ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｃ＋Ｆ２８２Ｙと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目をコードする塩基配列（ｇｇａ）がチロシン（Ｙ）をコードする塩基配列（ｔａｃ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｙ＋Ｆ２８２Ｙ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｙ＋Ｆ２８２Ｙと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目をコードする塩基配列（ｇｇａ）がアスパラギン（Ｎ）をコードする塩基配列（ａａｃ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｎ＋Ｆ２８２Ｙ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｎ＋Ｆ２８２Ｙと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目をコードする塩基配列（ｇｇａ）がリジン（Ｋ）をコードする塩基配列（ａａｇ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｋ＋Ｆ２８２Ｙ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｋ＋Ｆ２８２Ｙと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目をコードする塩基配列（ｇｇａ）がヒスチジン（Ｈ）をコードする塩基配列（ｃａｃ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｈ＋Ｆ２８２Ｙ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｈ＋Ｆ２８２Ｙと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目をコードする塩基配列（ｇｇａ）がアルギニン（Ｒ）をコードする塩基配列（ａｇｇ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｒ＋Ｆ２８２Ｙ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｒ＋Ｆ２８２Ｙと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目をコードする塩基配列（ｇｇａ）がアスパラギン酸（Ｄ）をコードする塩基配列（ｇａｃ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｄ＋Ｆ２８２Ｙ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｄ＋Ｆ２８２Ｙと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目をコードする塩基配列（ｇｇａ）がグルタミン酸（Ｅ）をコードする塩基配列（ｇａｇ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｅ＋Ｆ２８２Ｙ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｅ＋Ｆ２８２Ｙと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目をコードする塩基配列（ｇｇａ）がトリプトファン（Ｗ）をコードする塩基配列（ｔｇｇ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｗ＋Ｆ２８２Ｙ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｗ＋Ｆ２８２Ｙと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目をコードする塩基配列（ｇｇａ）がプロリン（Ｐ）をコードする塩基配列（ｃｃｃ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｐ＋Ｆ２８２Ｙ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｐ＋Ｆ２８２Ｙと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目をコードする塩基配列（ｇｇａ）がイソロイシン（Ｉ）をコードする塩基配列（ａｔｔ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｉ＋Ｆ２８２Ｙ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｉ＋Ｆ２８２Ｙと呼ぶ。
上記精製酵素標品の中でフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するものは、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｑ＋Ｆ２８２Ｙ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｖ＋Ｆ２８２Ｙ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｌ＋Ｆ２８２Ｙ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｉ＋Ｆ２８２Ｙ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｍ＋Ｆ２８２Ｙ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｆ＋Ｆ２８２Ｙ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｓ＋Ｆ２８２Ｙ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｔ＋Ｆ２８２Ｙ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｙ＋Ｆ２８２Ｙ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｎ＋Ｆ２８２Ｙ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｈ＋Ｆ２８２Ｙ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｒ＋Ｆ２８２Ｙ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｅ＋Ｆ２８２Ｙ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｋ＋Ｆ２８２Ｙ、および、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｄ＋Ｆ２８２Ｙであった。これらの精製酵素標品に関して基質特異性を評価した。その結果を、表６に示す。
＜１４．活性測定方法＞
以下の実施例８〜１０におけるＦＡＯＤの活性測定方法を、以下に示す。
以下の実施例８〜１０におけるＦＡＯＤの活性測定方法を、以下に示す。
各基質に対するＦＡＯＤの酵素活性は、酵素反応によって生成される過酸化水素を用いたペルオキシダーゼ反応により生じた色素の吸光度の増加を測定することによって求めた。
まず、活性測定試薬３ｍＬを３７℃にて５分間加温した後、当該活性測定試薬に、予め酵素希釈液（０．１％トリトンＸ１００を含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５））にて希釈した酵素溶液０．１ｍＬを加え、反応を開始した。
３７℃にて５分間反応させた後、単位時間あたりの５００ｎｍの吸光度変化を測定した（ΔＯＤｔｅｓｔ／ｍｉｎ）。盲検としては、酵素溶液の代わりに酵素希釈液０．１ｍＬを用い、同様の操作を行って吸光度変化を測定した（ΔＯＤｂｌａｎｋ／ｍｉｎ）。
下記計算式に基づいて、得られた吸光度変化から酵素活性を算出した。なお、上記条件下で１分間に１マイクロモルの基質を酸化する酵素量を１単位（Ｕ）と規定した。
（計算式）
活性値（Ｕ／ｍＬ）＝｛（（ΔＯＤｔｅｓｔ／ｍｉｎ）−（ΔＯＤｂｌａｎｋ／ｍｉｎ））×３．１ｍＬ×希釈倍率｝／（１３×１．０ｃｍ×０．１ｍＬ）
なお、上記計算式において、「３．１ｍＬ」は全液量を示し、「１３」はミリモル吸光係数を示し、「１．０ｃｍ」はセルの光路長を示し、「０．１ｍＬ」は酵素サンプル液量を示す。
（計算式）
活性値（Ｕ／ｍＬ）＝｛（（ΔＯＤｔｅｓｔ／ｍｉｎ）−（ΔＯＤｂｌａｎｋ／ｍｉｎ））×３．１ｍＬ×希釈倍率｝／（１３×１．０ｃｍ×０．１ｍＬ）
なお、上記計算式において、「３．１ｍＬ」は全液量を示し、「１３」はミリモル吸光係数を示し、「１．０ｃｍ」はセルの光路長を示し、「０．１ｍＬ」は酵素サンプル液量を示す。
＜１５．比活性の算出方法＞
以下の実施例８〜１０における比活性は、精製酵素標品の活性値（Ｕ／ｍＬ）と、２８０ｎｍにおける吸光度（Ａ２８０）とに基づいて、以下計算式にて算出した。
（計算式）
比活性（Ｕ／Ａ２８０）＝活性値（Ｕ／ｍＬ）／Ａ２８０（Ａｂｓ）
なお、比活性の値が高いほど好ましいと判定される。
以下の実施例８〜１０における比活性は、精製酵素標品の活性値（Ｕ／ｍＬ）と、２８０ｎｍにおける吸光度（Ａ２８０）とに基づいて、以下計算式にて算出した。
（計算式）
比活性（Ｕ／Ａ２８０）＝活性値（Ｕ／ｍＬ）／Ａ２８０（Ａｂｓ）
なお、比活性の値が高いほど好ましいと判定される。
＜１６．Ｋｍ評価方法＞
以下の実施例８〜１０におけるＫｍ評価方法について、以下に説明する。
以下の実施例８〜１０におけるＫｍ評価方法について、以下に説明する。
基質であるフルクトシルバリルヒスチジンの濃度が１．７５ｍＭまたは０．３５ｍＭに調製された活性測定試薬を調製した。
上述した活性測定法にしたがって、各活性測定試薬を用いた場合の精製酵素標品の活性値を求めた。次いで、下記計算式に基づいてＫｍ評価を行った。
（計算式）
Ｋｍ評価＝基質濃度１．７５ｍＭでの活性値（Ｕ／ｍＬ）／基質濃度０．３５ｍＭでの活性値（Ｕ／ｍＬ）
なお、当該計算式で定義されるＫｍ評価の値が大きいほど、Ｋｍ値（Michaelis 定数）が低減する（換言すれば、基質と酵素との親和性が向上する）ので、好ましいと判定される。
（計算式）
Ｋｍ評価＝基質濃度１．７５ｍＭでの活性値（Ｕ／ｍＬ）／基質濃度０．３５ｍＭでの活性値（Ｕ／ｍＬ）
なお、当該計算式で定義されるＫｍ評価の値が大きいほど、Ｋｍ値（Michaelis 定数）が低減する（換言すれば、基質と酵素との親和性が向上する）ので、好ましいと判定される。
＜１７．基質特異性評価方法＞
以下の実施例８〜１０におけるＦＡＯＤの基質特異性評価方法を、以下に説明する。
以下の実施例８〜１０におけるＦＡＯＤの基質特異性評価方法を、以下に説明する。
各基質（Ｆ−Ｋ：フルクトシルリジン、Ｆ−Ｖ：フルクトシルバリン、Ｆ−ＶＨ：フルクトシルバリルヒスチジン）の濃度が２ｍＭになるように活性測定試薬を調製し、上述した活性測定法に従って活性値を算出し、下記計算式により活性値比（基質特異性）を算出した。つまり、
（Ｆ−Ｖ／Ｆ−ＶＨ）＝（Ｆ−Ｖを基質としたときの活性値）／（Ｆ−ＶＨを基質としたときの活性値）
（Ｆ−Ｋ／Ｆ−ＶＨ）＝（Ｆ−Ｋを基質としたときの活性値）／（Ｆ−ＶＨを基質としたときの活性値）
なお、当該計算式で定義される活性値比の値が小さいほど、Ｆ−ＶＨに対する特異性に優れ、好ましいと判定される。
（Ｆ−Ｖ／Ｆ−ＶＨ）＝（Ｆ−Ｖを基質としたときの活性値）／（Ｆ−ＶＨを基質としたときの活性値）
（Ｆ−Ｋ／Ｆ−ＶＨ）＝（Ｆ−Ｋを基質としたときの活性値）／（Ｆ−ＶＨを基質としたときの活性値）
なお、当該計算式で定義される活性値比の値が小さいほど、Ｆ−ＶＨに対する特異性に優れ、好ましいと判定される。
＜１８．熱安定性評価方法＞
以下の実施例８〜１０におけるＦＡＯＤの熱安定性評価方法を、以下に説明する。
以下の実施例８〜１０におけるＦＡＯＤの熱安定性評価方法を、以下に説明する。
精製酵素標品を０．１ｍｇ／ｍＬになるように５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解し、５０℃にて１０分間の加熱処理を施した。そして、以下の計算式に基づいて、精製酵素標品の熱安定性（％）を算出した。つまり、
熱安定性（％）＝[（５０℃、１０分間加熱処理後の活性値）／（加熱処理前の活性値）]×１００
なお、当該計算式で定義される熱安定性の値が高いほど、熱安定性に優れ、好ましいと判定される。
熱安定性（％）＝[（５０℃、１０分間加熱処理後の活性値）／（加熱処理前の活性値）]×１００
なお、当該計算式で定義される熱安定性の値が高いほど、熱安定性に優れ、好ましいと判定される。
＜１９．実施例８：フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ遺伝子・タンパク質の改変＞
配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目のグリシンをランダムに他のアミノ酸に置換するために、プライマーＲ３およびプライマーＲ４を合成した。
・プライマーＲ３：5’-snnagacttcaggtctgcaatgtctttttc-3’（配列番号１１）
・プライマーＲ４：5’-taccaagctctcgtggacgcgggcttggat-3’（配列番号１２）
上記ｐＩＥ３５３、プライマーＲ３、およびプライマーＲ４、およびＫＯＤ−Ｐｌｕｓ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（東洋紡績製）を用いて、上記１１０番目のグリシンに変異が導入された組換えプラスミドを作製した。当該組換えプラスミドを用いてＢＬ２１ ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬを形質転換した後、アンピシリン耐性を示す１００個のコロニーをピックアップした。１００個のコロニーに導入されている１００個の組換えプラスミドの塩基配列を確認したところ、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目のグリシンが１９種類のアミノ酸（野生型のグリシンを除く）の各々に置換されたプラスミドを取得することに成功した。
配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目のグリシンをランダムに他のアミノ酸に置換するために、プライマーＲ３およびプライマーＲ４を合成した。
・プライマーＲ３：5’-snnagacttcaggtctgcaatgtctttttc-3’（配列番号１１）
・プライマーＲ４：5’-taccaagctctcgtggacgcgggcttggat-3’（配列番号１２）
上記ｐＩＥ３５３、プライマーＲ３、およびプライマーＲ４、およびＫＯＤ−Ｐｌｕｓ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（東洋紡績製）を用いて、上記１１０番目のグリシンに変異が導入された組換えプラスミドを作製した。当該組換えプラスミドを用いてＢＬ２１ ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬを形質転換した後、アンピシリン耐性を示す１００個のコロニーをピックアップした。１００個のコロニーに導入されている１００個の組換えプラスミドの塩基配列を確認したところ、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目のグリシンが１９種類のアミノ酸（野生型のグリシンを除く）の各々に置換されたプラスミドを取得することに成功した。
具体的には、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目のグリシンをコードする塩基配列（ｇｇａ）がトレオニン（Ｔ）をコードする塩基配列（ａｃｇ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｔ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｔと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目のグリシンをコードする塩基配列（ｇｇａ）がアラニン（Ａ）をコードする塩基配列（ｇｃｇ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｇ１１０Ａ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ａと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目のグリシンをコードする塩基配列（ｇｇａ）がバリン（Ｖ）をコードする塩基配列（ｇｔｇ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｖ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｖと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目のグリシンをコードする塩基配列（ｇｇａ）がロイシン（Ｌ）をコードする塩基配列（ｃｔｇ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｌ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｌと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目のグリシンをコードする塩基配列（ｇｇａ）がイソロイシン（Ｉ）をコードする塩基配列（ａｔｔ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｉ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｉと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目のグリシンをコードする塩基配列（ｇｇａ）がメチオニン（Ｍ）をコードする塩基配列（ａｔｇ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｍ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｍと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目のグリシンをコードする塩基配列（ｇｇａ）がフェニルアラニン（Ｆ）をコードする塩基配列（ｔｔｃ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｆ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｆと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目のグリシンをコードする塩基配列（ｇｇａ）がセリン（Ｓ）をコードする塩基配列（ｔｃｃ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｓ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｓと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目のグリシンをコードする塩基配列（ｇｇａ）がグルタミン（Ｑ）をコードする塩基配列（ｃａｇ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｑ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｑと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目のグリシンをコードする塩基配列（ｇｇａ）がシステイン（Ｃ）をコードする塩基配列（ｔｇｔ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｃ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｃと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目のグリシンをコードする塩基配列（ｇｇａ）がチロシン（Ｙ）をコードする塩基配列（ｔａｃ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｙ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｙと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目のグリシンをコードする塩基配列（ｇｇａ）がアスパラギン（Ｎ）をコードする塩基配列（ａａｃ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｎ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｎと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目のグリシンをコードする塩基配列（ｇｇａ）がリジン（Ｋ）をコードする塩基配列（ａａｇ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｋ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｋと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目のグリシンをコードする塩基配列（ｇｇａ）がヒスチジン（Ｈ）をコードする塩基配列（ｃａｃ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｈ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｈと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目のグリシンをコードする塩基配列（ｇｇａ）がアルギニン（Ｒ）をコードする塩基配列（ａｇｇ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｒ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｒと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目のグリシンをコードする塩基配列（ｇｇａ）がアスパラギン酸（Ｄ）をコードする塩基配列（ｇａｃ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｄ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｄと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目のグリシンをコードする塩基配列（ｇｇａ）がグルタミン酸（Ｅ）をコードする塩基配列（ｇａｇ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｅ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｅと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目のグリシンをコードする塩基配列（ｇｇａ）がトリプトファン（Ｗ）をコードする塩基配列（ｔｇｇ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｗ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｗと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目のグリシンをコードする塩基配列（ｇｇａ）がプロリン（Ｐ）をコードする塩基配列（ｃｃｃ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｐ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｐと呼ぶ。
取得した各プラスミドを用いてＢＬ２１ ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬを形質転換した後、アンピシリン耐性を示す形質転換体をそれぞれ選抜した。
上述した上記ＩＥ３５３の場合と同様に、各形質転換体を培養し、得られた粗酵素液から精製を行うことにより、それぞれの精製酵素標品（ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｑ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ａ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｖ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｌ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｉ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｍ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｆ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｓ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｔ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｃ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｙ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｎ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｋ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｈ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｒ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｄ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｅ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｗ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｐ）を得た。
各精製酵素標品をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分析し、各精製酵素標品が単一のタンパク質であることを確認した。
＜２０．実施例９：フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ変異タンパク質の特性評価＞
まず、上述した活性測定方法（基質としては、フルクトシルバリルヒスチジンを用いた）にしたがって、野生型フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ（ＩＥ３５３）、および、１９種類の精製酵素標品（ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｑ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ａ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｖ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｌ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｉ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｍ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｆ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｓ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｔ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｃ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｙ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｎ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｋ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｈ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｒ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｄ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｅ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｗ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｐ）の酵素活性を測定した。
まず、上述した活性測定方法（基質としては、フルクトシルバリルヒスチジンを用いた）にしたがって、野生型フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ（ＩＥ３５３）、および、１９種類の精製酵素標品（ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｑ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ａ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｖ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｌ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｉ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｍ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｆ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｓ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｔ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｃ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｙ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｎ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｋ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｈ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｒ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｄ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｅ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｗ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｐ）の酵素活性を測定した。
ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｐはフルクトシルバリルヒスチジン活性が検出できなかったため、その他の精製酵素標品に関して、熱安定性、比活性、Ｋｍ値、および基質特異性に関する評価を実施した。その結果を、表７に示す。なお、表７において「Ｘのアミノ酸」とは、１１０番目のグリシンが置換されたアミノ酸（換言すれば、ＩＥ３５３−Ｇ１１０ＸにおけるＸ）を示す。
また、比活性、Ｋｍ評価、基質特異性（Ｆ−Ｋ／Ｆ−ＶＨ、Ｆ−Ｖ／Ｆ−ＶＨ）に関しても、好ましい特性を有する改変タンパク質が存在することも明らかになった。例えば、置換したアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）の場合、比活性が約２．５倍上昇し、基質特異性も向上している。よって、１１０番目のグリシンを他のアミノ酸に置換することにより熱安定性のみならず、他の特性も向上するものが得られることが明らかになった。
＜２１．実施例１０：更なるアミノ酸置換を含むフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ変異タンパク質（２重変異タンパク質）、および当該変異タンパク質の特性評価＞
配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目のグリシンの置換に加えて他のアミノ酸をも置換した場合に、当該変異タンパク質の特性がどのように変化するか検討した。
配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目のグリシンの置換に加えて他のアミノ酸をも置換した場合に、当該変異タンパク質の特性がどのように変化するか検討した。
まず、配列番号１に示したアミノ酸配列の２８２番目のフェニルアラニンがチロシンに置換された変異タンパク質の発現プラスミドを作製した。以下に、当該発現プラスミドの作製方法を説明する。
配列番号１に示したアミノ酸配列の２８２番目のフェニルアラニンをチロシンに置換するために、プライマーＹ１およびプライマーＹ２を合成した。
・プライマーＹ１：5’-tatacgcgcttcaagatgcatcaaccctttggcg-3’（配列番号７）
・プライマーＹ２：5’-gccaggaaactcgtcgcagactttgatcacg-3’（配列番号８）
上記ｐＩＥ３５３、プライマーＹ１、プライマーＹ２、およびＫＯＤ−Ｐｌｕｓ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（東洋紡績製）を用いて、上記２８２番目のフェニルアラニンがチロシンに置換された組換えプラスミドを作製した。更に詳細には、配列番号１に示したアミノ酸配列の２８２番目のフェニルアラニンをコードする塩基配列（ｔｔｃ）がチロシン（Ｙ）をコードする塩基配列（ｔａｔ）に置換された組換えプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｆ２８２Ｙ）を取得することに成功した。
・プライマーＹ１：5’-tatacgcgcttcaagatgcatcaaccctttggcg-3’（配列番号７）
・プライマーＹ２：5’-gccaggaaactcgtcgcagactttgatcacg-3’（配列番号８）
上記ｐＩＥ３５３、プライマーＹ１、プライマーＹ２、およびＫＯＤ−Ｐｌｕｓ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（東洋紡績製）を用いて、上記２８２番目のフェニルアラニンがチロシンに置換された組換えプラスミドを作製した。更に詳細には、配列番号１に示したアミノ酸配列の２８２番目のフェニルアラニンをコードする塩基配列（ｔｔｃ）がチロシン（Ｙ）をコードする塩基配列（ｔａｔ）に置換された組換えプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｆ２８２Ｙ）を取得することに成功した。
上述した各種精製酵素標品と同様の方法にて、所望の精製酵素標品（ＩＥ３５３−Ｆ２８２Ｙ）を得た。
下記表８に示すように、ｐＩＥ３５３−Ｆ２８２Ｙから得られる精製酵素標品（ＩＥ３５３−Ｆ２８２Ｙ）は、野生型のフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ（ＩＥ３５３）と比較して、熱安定性が向上していた。
以上のようにして作製した発現プラスミドを用いて、表７に示す精製酵素標品と同様の方法にて各精製酵素標品を取得し、これらの精製酵素標品の特性を評価した。なお、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｐ＋Ｆ２８２Ｙはフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性が検出できなかったので、その他の精製酵素標品に関して、その特性を評価した。その結果を、表９に示す。なお、表９において「Ｘのアミノ酸」とは、１１０番目のグリシンが置換されたアミノ酸（換言すれば、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｘ＋Ｆ２８２ＹにおけるＸ）を示す。
また、比活性、Ｋｍ評価、基質特異性（Ｆ−Ｋ／Ｆ−ＶＨ、Ｆ−Ｖ／Ｆ−ＶＨ）に関しても、好ましい特性が得られているものもある。
よって、配列番号１に示されるアミノ酸配列における１１０番目のグリシン以外のアミノ酸に対して変異が導入されたものに関しても、更に１１０番目のグリシンを他のアミノ酸に置換することによって熱安定性を向上させることが可能であることが明らかになった。
本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが参考として援用される。
本発明によって、フルクトシルバリルヒスチジンの測定に有用なフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質を新たに創出し、これを提供することが可能となる。また、該タンパク質を利用したフルクトシルバリルヒスチジン等の測定方法、およびフルクトシルバリルヒスチジン等の測定用試薬組成物等を提供することが可能となる。したがって、予防医学に基づく臨床検査の更なる普及に貢献することができる。
また、本発明は、フルクトシルバリルヒスチジンの測定に有用な基質特異性および／または熱安定性に優れたフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼを提供できるので、フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼを利用した測定精度の高いフルクトシルバリルヒスチジンの測定方法およびフルクトシルバリルヒスチジン測定用試薬組成物等を提供できる。したがって、本発明は、予防医学に基づく臨床検査分野、診断医療分野、製薬分野および保健医学分野をはじめ、生命科学分野の産業に広く利用することができる。
Claims (13)
- 以下の（I）または（II）に記載のタンパク質のアミノ末端から１１０番目のグリシンが、グルタミン、メチオニン、グルタミン酸またはトレオニンに置換されている、フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
（I）配列番号１に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（II）配列番号１に記載されるアミノ酸配列のアミノ末端から１１０番目のアミノ酸以外の部位において、１または数個のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列からなり、且つフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質。 - アミノ末端から５８番目のイソロイシンが他のアミノ酸に置換されている請求項１に記載のタンパク質。
- アミノ末端から２８２番目のフェニルアラニンが他のアミノ酸に置換されている請求項２に記載のタンパク質。
- 上記アミノ末端から５８番目のイソロイシンが、メチオニン、トレオニン、アラニン、アスパラギン、セリン、バリン、または、ロイシンに置換されていることを特徴とする請求項２または３に記載のタンパク質。
- 上記アミノ末端から２８２番目のフェニルアラニンが、チロシンに置換されている請求項３に記載のタンパク質。
- 以下の（VI）のポリヌクレオチドからなる、フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（VI）請求項１〜５の何れか１項に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。 - 請求項６に記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
- 請求項７に記載の組換えベクターで宿主を形質転換した形質転換体。
- 請求項８に記載の形質転換体を培養してフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質を生成させ、当該タンパク質を採取する、フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質の製造方法。
- 糖化アミンに対して、請求項１〜５の何れか１項に記載のタンパク質を作用させる工程を含む、糖化タンパク質の測定方法。
- 試料中に含まれる糖化ヘモグロビンを測定する方法であって、
上記試料中の糖化ヘモグロビンから糖化アミンを調製する工程と、次いで、
上記試料に、請求項１〜５の何れか１項に記載のタンパク質を作用させる工程と、を含む、糖化ヘモグロビンの測定方法。 - 請求項１〜５の何れか１項に記載のタンパク質を備える、糖化タンパク質測定キット。
- 請求項１〜５の何れか１項に記載のタンパク質を備える、糖化タンパク質測定センサー。
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