CN102171338A

CN102171338A - 新型的具有果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶活性的蛋白质及其修饰产物以及其应用

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Publication number: CN102171338A
Application number: CN2009801397167A
Authority: CN
Inventors: 平尾理惠; 北林雅夫; 西矢芳昭; 石田博树; 秦洋二
Original assignee: Gekkeikan Sake Co Ltd; Toyo Textile Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 2008-10-10
Filing date: 2009-10-06
Publication date: 2011-08-31
Anticipated expiration: 2029-10-06
Also published as: WO2010041419A1; EP2354224A4; JPWO2010041419A1; EP2354224A1; US8993255B2; EP2354224B1; JP5438020B2; CN102171338B; US20110195444A1

Abstract

本发明提供一种可用于糖化蛋白质(尤其是糖化血红蛋白)测定的具有果糖基氨基酸氧化酶活性的蛋白质及其修饰产物，以及其利用方法。本发明的蛋白质例如为来源于小麦颖枯病(Phaeosphaeria nodorum)菌的果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶，其热稳定性、底物特异性优异，并且对于果糖基缬氨酰基组氨酸的Km值较低。因此，能够提高糖化蛋白质测定试剂的长期保存稳定性，并且能够提高测定精度。

Description

新型的具有果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶活性的蛋白质及其修饰产物以及其应用

技术领域

本发明涉及一种可用于糖化蛋白质、尤其是糖化血红蛋白的测定的具有果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶活性的蛋白质及其修饰产物、编码此蛋白质的基因、以及其应用方法。

背景技术

作为糖尿病患者的血糖控制指标，目前着重采用对血液中所含有的作为糖化蛋白质的血红蛋白A1c(HbA1c)或糖化白蛋白进行测定。由于这些糖化蛋白质是由血液中存在的D-葡萄糖和构成血液蛋白质的氨基酸残基进行非酶反应而生成的，所以良好地反映出血液中的葡萄糖量。

血液蛋白质的主要糖化位点是内部赖氨酸残基的ε-氨基以及氨基末端(N末端)氨基酸的α-氨基。例如，HbA1c是D-葡萄糖结合在作为血红蛋白β链的N末端氨基酸的缬氨酸的α-氨基上所生成的糖化蛋白质。

近年来，开发出了能够简单并且短时间测定血液中的糖化蛋白质的酶测定法(以下称作“酶法”)，并且已经商品化。通过利用酶法，能够以高通量(high throughput)测定糖化蛋白质，在临床化验领域中发挥作用。

酶法首先利用蛋白酶使糖化蛋白质水解，接着，利用果糖基氨基酸氧化酶(FAOD)使水解生成的果糖基缬氨酸、果糖基赖氨酸、果糖基缬氨酰基组氨酸等糖化氨基酸氧化水解。最后，利用过氧化物酶-色原体反应系统对由氧化酶反应生成的过氧化氢进行比色法定量(参照专利文献1至11)。

在利用酶法所进行的糖化蛋白质的测定中，作为主反应酶的果糖基氨基酸氧化酶的底物特异性是重要的因素。例如，在HbA1c的测定中，期望的是对果糖基缬氨酸的底物特异性优异的酶。

而且，为了特异性地测定糖化血红蛋白的β链，期望是对果糖基缬氨酰基组氨酸发挥作用的酶。其原因在于，血红蛋白α链及β链的N末端氨基酸均为缬氨酸，因而为了特异性地测定β链，必须识别N末端氨基酸2残基(即，果糖基缬氨酰基组氨酸)。(参照专利文献12、专利文献13)。

迄今为止，业界一直在筛选可生产氧化酶的菌株，该氧化酶是对果糖基缬氨酰基组氨酸发挥作用的(例如，参照专利文献14)。

另外，关于对果糖基缬氨酰基组氨酸发挥作用的氧化酶，有使用基因重组体来进行此氧化酶的产出、提取及纯化的报导，也分离出了编码此氧化酶的基因(参照专利文献15、专利文献17、非专利文献1、非专利文献2)。

[专利文献1]日本公开专利公报“日本专利特开2004-129531号公报(公开日：平成16年4月30日(2004.4.30))”

[专利文献2]日本公开专利公报“日本专利特开2004-113014号公报(公开日：平成16年4月15日(2004.4.15))”

[专利文献3]国际公开第2003/064683号手册(国际公开日：2003年8月7日(2003.8.7))

[专利文献4]日本公开专利公报“日本专利特开2007-181466号公报(公开日：平成19年7月19日(2007.7.19))”

[专利文献5]日本公开专利公报“日本专利特开2007-289202号公报(公开日：平成19年11月8日(2007.11.8))”

[专利文献6]日本公开专利公报“日本专利特开2005-110657号公报(公开日：平成17年4月28日(2005.4.28))”

[专利文献7]日本公开专利公报“日本专利第4045322号公报(发行日：平成20年2月13日(2008.2.13))”

[专利文献8]日本公开专利公报“日本专利第4014088号公报(发行日：平成19年9月21日(2007.9.21))”

[专利文献9]日本公开专利公报“日本专利第4039664号公报(发行日：平成20年1月30日(2008.1.30))”

[专利文献10]日本公开专利公报“日本专利第4010474号公报(发行日：平成19年11月21日(2007.11.21))”

[专利文献11]日本公开专利公报“日本专利第3971702号公报(发行日：平成19年9月5日(2007.9.5))”

[专利文献12]国际公开2005/049857号手册(国际公开日：2005年6月2日(2005.6.2))

[专利文献13]国际公开2005/049858号手册(国际公开日：2005年6月2日(2005.6.2))

[专利文献14]日本公开专利公报“日本专利特开2004-275013号公报(公开日：平成16年10月7日(2004.10.7))”

[专利文献15]日本公开专利公报“日本专利特开2003-235585号公报(公开日：平成15年8月26日(2003.8.26))”

[专利文献16]国际公开2007/010950号手册(国际公开日：平成19年1月25日(2007.1.25))

[专利文献17]国际公开2004/104203号手册(国际公开日：2004年12月2日(2004.12.2))

[非专利文献1]Arch.Microbiol.，180：227-231(2003)

[非专利文献2]Biochem.Biophys.Res.Commun.，311：104-111(2003)

发明内容

但是，先前的对果糖基缬氨酸发挥作用的果糖基氨基酸氧化酶中，多数对作为更大的底物的果糖基缬氨酰基组氨酸实际上不发挥作用。因此，为了获得对果糖基缬氨酰基组氨酸发挥作用的果糖基氨基酸氧化酶，需要花费大量的劳力、时间、成本来进行筛选。

而且，专利文献15、非专利文献1和2中记载的先前的果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶存在热稳定性差、在液以状的临床诊断药品中无法长期保存的缺点。

另外，在采用酶法时，存在利用蛋白酶所进行的糖化蛋白质的水解步骤中相对大量地生成不希望得到的果糖基赖氨酸的情况，因此期望能有一种对果糖基赖氨酸的反应性低的果糖基氨基酸氧化酶。在专利文献17中，记载了一种与序列号1所记载的氨基酸序列的同源性为85.5％(参照图1)，并且对果糖基赖氨酸的反应性为2.5％的酮胺氧化酶。此酮胺氧化酶会与果糖基缬氨酰基组氨酸反应，所以也可以称作果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶。但是，此果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶的其它酶特性不明确，不知道能否在液体状的临床诊断药品中使用。

也就是说，作为对果糖基缬氨酰基组氨酸发挥作用的氧化酶，还没有发现兼具优异的热稳定性与对果糖基赖氨酸的低反应性的氧化酶，因此，使用公知的氧化酶制成液体状的临床诊断药品的技术，还没有达到能够实际使用的水平。

更具体来说，如果基于某种原因而在试样中混入游离的糖化胺，那么在先前的使用果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶的测定中，测定值会显示出异常高的值。这一问题对于投予了高热量输液用制剂的患者尤其突出，一般认为其原因在于，在通过输液而将高浓度的糖及氨基酸补充到体内的情况下，血中或输液袋中会生成游离的糖化氨基酸或糖化肽。尤其是在测定HbA1c时，FAOD也会与果糖基缬氨酸反应，结果由于混入果糖基缬氨酸而显示出异常高的糖化蛋白质量。

因此，现已开发出一种在测定对象物与FAOD进行氧化还原反应之前，预先利用FAOD清除测定对象物之外的游离糖化胺的系(例如，参照专利文献3、5、7、16)。

但是，由于这些方法在清除反应中使用FAOD，所以存在进行此清除反应时产生过氧化氢的问题。如果此过氧化氢被带入到测定对象物的氧化还原反应中，那么会导致测定值上升。因此，在此方法中，必须在测定对象物与FAOD进行氧化还原反应之前，去除过氧化氢。

因此，包括使用FAOD预先清除游离糖化胺的步骤的糖化胺测定方法，包括以下(1)至(4)的反应。也就是说，

(1)利用FAOD清除游离胺的反应(以下称为“清除反应”)

(2)去除清除反应中产生的过氧化氢的反应(以下称为“去除反应”)

(3)利用蛋白酶将糖化蛋白质片段化成糖化氨基酸或糖化肽的反应(以下称作“片段化反应”)

(4)经片段化而成的糖化氨基酸或糖化肽与FAOD进行氧化还原反应，由此而进行显色的反应(以下称作“显色反应”)。

在所述去除反应中，虽然使例如供氢体与POD(peroxidase，过氧化物酶)的自缩合和/或过氧化氢酶共存，但如果无法完全地去除过氧化氢而将此过氧化氢带入到显色反应中，那么有可能导致测定值的升高。

在这些反应中，至少清除反应与去除反应必须在显色反应之前进行。另外，因为片段化反应中所用的蛋白酶会使酶(FAOD)分解，所以必须选择蛋白酶耐性高的酶，或者将清除反应和显色反应，与片段化反应分开进行。因此，在所述糖化胺测定方法中，存在糖化胺测定试剂的组成、此糖化胺测定试剂的添加时间以及反应顺序受限制的问题。

另外，由于血液样本中含有糖化白蛋白，所以在测定HbA1c时，必须避免此影响。糖化白蛋白，因白蛋白的赖氨酸残基的ε-氨基被糖化，所以如果利用蛋白酶进行酶切所产生的果糖基赖氨酸与FAOD发生反应，那么测定值会成为较高值。为了解决这一问题，期望有一种虽然与果糖基缬氨酰基组氨酸反应，但对果糖基缬氨酸和果糖基赖氨酸的反应性低的FAOD，但目前尚无这样的FAOD的报导。

本发明是鉴于所述问题而完成的，其目的在于新创造出可用于测定糖化蛋白质、尤其是糖化血红蛋白的具有果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶活性的蛋白质及其修饰产物、以及编码此蛋白质的基因。并且，本发明的目的在于提供利用此蛋白质的糖化蛋白质(糖化血红蛋白等)的测定方法、糖化蛋白质(糖化血红蛋白等)测定用试剂组合物、糖化蛋白质(糖化血红蛋白等)测定试剂盒以及糖化蛋白质(糖化血红蛋白等)传感器等。

本发明人等为了实现所述目的而进行了专心研究，结果发现，微生物基因组数据库中存在的功能未知的果糖基氨基酸氧化酶同源基因中，来源于小麦颖枯病菌(Phaeosphaeria nodorum)的基因产物，是对果糖基缬氨酰基组氨酸发挥作用的果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶。将所述果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶的氨基酸序列示于序列号1。

并且本发明人等进一步进行研究的结果，发现了所述果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶的热稳定性、底物特异性以及与底物的亲和性高，从而完成了本发明。

另外，本发明人等进一步反复进行研究的结果，也成功地获得了如下的变异蛋白质(修饰产物)。所述变异蛋白质是可用于测定果糖基缬氨酰基组氨酸的具有果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶活性的蛋白质，并且与野生型蛋白质相比，底物特异性和/或热稳定性得以提高。并且，本发明人等也确认到，通过使此变异蛋白质作用于含有果糖基缬氨酰基组氨酸的样本，并利用过氧化物酶反应测定生成的过氧化氢，能够测定果糖基氨基酸。

也就是说，本发明包括如下构成。

为了解决所述课题，本发明所涉及的蛋白质，其特征在于：其是以下(I)至(III)中任一项所记载的具有果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶活性的蛋白质。(I)由序列号1所记载的氨基酸序列所构成的蛋白质。(II)由在序列号1所记载的氨基酸序列中置换、缺失、插入和/或附加1个或数个氨基酸残基而成的氨基酸序列所构成，并且具有果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶活性的蛋白质。(III)由与序列号1所记载的氨基酸序列具有86.0％以上的同源性的氨基酸序列所构成，并且具有果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶活性的蛋白质。

本发明所涉及的蛋白质优选为是所述(II)或(III)中所记载的蛋白质，并且从氨基末端起第58号异亮氨酸和/或从氨基末端起第110号甘氨酸被置换成了其它的氨基酸。

本发明所涉及的蛋白质优选为是所述(II)或(III)中所记载的蛋白质，并且从氨基末端起第282号苯丙氨酸被置换成了其它氨基酸。

本发明所涉及的蛋白质优选为是所述从氨基末端起第58号异亮氨酸被置换成了蛋氨酸、苏氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、缬氨酸或亮氨酸。

本发明所涉及的蛋白质优选为是所述从氨基末端起第110号甘氨酸被置换成了谷氨酰胺、蛋氨酸、谷氨酸、苏氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、精氨酸、丝氨酸、缬氨酸、亮氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸。

本发明所涉及的蛋白质优选为是所述从氨基末端起第282号苯丙氨酸被置换成了酪氨酸。

为了解决所述课题，本发明所涉及的多核苷酸，其特征在于：是选自以下项目(IV)至(VII)并且用以编码具有果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶活性的蛋白质的多核苷酸，(IV)由序列号2所记载的碱基序列构成的多核苷酸。(V)由在序列号2所记载的碱基序列中置换、缺失、插入和/或附加1个以上30个以下的碱基而成的碱基序列所构成，并且编码具有果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶活性的蛋白质的多核苷酸。(VI)编码本发明的任一种蛋白质的多核苷酸。(VII)与所述(IV)至(VI)所示的多核苷酸互补的碱基序列所构成的多核苷酸在严格的条件下进行杂交，并且编码具有果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶活性的蛋白质的多核苷酸。

另外，在所述(II)中置换、缺失、插入和/或附加的碱基个数，优选1～20个。

本发明还提供含有本发明的多核苷酸中的任一种多核苷酸的重组载体，以及利用此重组载体对宿主进行了转化的转化体。

为了解决所述课题，本发明所涉及的蛋白质的制造方法，其特征在于：对所述转化体进行培养而生成具有果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶活性的蛋白质，并提取此蛋白质。

为了解决所述课题，本发明所涉及的糖化蛋白质的测定方法，其特征在于：包括使本发明的蛋白质中的任一种蛋白质作用于糖化胺的步骤。

为了解决所述课题，本发明所涉及的糖化血红蛋白的测定方法，其特征在于包括：由试样中的糖化血红蛋白制备糖化胺的步骤；然后使本发明的任一种蛋白质对此试样发挥作用的步骤。根据所述测定方法，可测定所述试样中有无糖化血红蛋白，以及糖化血红蛋白的量。

另外，制备所述糖化胺的步骤，可以通过将糖化血红蛋白分解成适当长度的肽片段或氨基酸来进行。另外，所制备的糖化胺优选包含果糖基缬氨酸、果糖基缬氨酰基组氨酸以及末端含有果糖基缬氨酰基组氨酰基的糖化肽中的至少一种糖化胺，为了能够进行区分血红蛋白的α链与β链而进行测定，更优选包含果糖基缬氨酰基组氨酸和/或末端含有果糖基缬氨酰基组氨酰基的糖化肽的糖化胺。

本发明还提供一种具备本发明的蛋白质中的任一种蛋白质的糖化蛋白质测定试剂盒以及糖化蛋白质测定传感器。

本发明人等针对小麦颖枯病菌的基因组信息(参照http://genamics.com/cgi-bin/genamics/genomes/genomesearch.cgi？field＝ID&query＝1666)反复进行专心研究，确认此菌有可能产生果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶。基于这一见解，进一步反复进行研究的结果，成功地由此菌的基因表达出了对果糖基缬氨酰基组氨酸发挥作用的果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶(序列号1中显示了其氨基酸序列)。

根据已被发现的基因组序列的同源性检索，能够在一定程度上预测到：具有序列号1所示的氨基酸序列的蛋白质(适当称作“序列号1的蛋白质”)有可能产生果糖基氨基酸氧化酶；但根据基因组信息或氨基酸序列信息无法确定此蛋白质是对果糖基缬氨酰基组氨酸发挥作用的果糖基氨基酸氧化酶(即“果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶”)。另外，目前无法弄清楚果糖基氨基酸氧化酶的立体结构，也不可能根据立体结构信息推测酶活性。此外，目前得到报导的多数例子，是即便克隆出由同源性检索而选择的基因并使其表达，也无法纯化蛋白质，或者不具有所预计的酶活性。

根据本发明，能够提供一种可用于测定糖化蛋白质、尤其是糖化血红蛋白的果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶剂以及其应用方法。另外，本发明可提供一种热稳定性、底物特异性以及与底物的亲和性高的并且具有果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶活性的蛋白质以及其利用方法。

另外，根据本发明，能够起到可提供底物特异性和/或热稳定性更加优异的果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶修饰产物的效果。更具体来说，通过将由序列号1所记载的氨基酸序列所构成的蛋白质的从氨基末端起第58号异亮氨酸置换成其它氨基酸，可进一步提高此蛋白质对果糖基缬氨酰基组氨酸的底物特异性，通过将从氨基末端起第110号甘氨酸置换成其它氨基酸，可进一步提升此蛋白质的热稳定性。结果发挥出能够更加准确地对糖化蛋白质的量进行测定的效果。

附图说明

图1是比较来源于小麦颖枯病菌的果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶的氨基酸序列与来源于棒状弯孢(Curvularia claveta)的果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶的氨基酸序列的同源性的图。

具体实施方式

如对本发明的实施方式进行详细说明则为如下所述，但本发明并不限定于这些。另外，本说明书中记载的非专利文献和专利文献，全部作为参考引用到本说明书中。另外，本说明书中的“～”表示“以上、以下”，例如如果在说明书中记载为“★～☆”，那么表示“★以上、☆以下”。另外，本说明书中的“和/或”表示任意一者或两者。

<1.本发明所涉及的蛋白质>

本发明所涉及的蛋白质是以下(I)至(III)中任一项所记载的具有果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶活性的蛋白质。即，

(I)由序列号1所记载的氨基酸序列所构成的蛋白质；

(II)由在序列号1所记载的氨基酸序列中置换、缺失、插入和/或附加1个或数个氨基酸残基而成的氨基酸序列所构成，并且具有果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶活性的蛋白质；

(III)由与序列号1所记载的氨基酸序列具有86.0％以上的同源性的氨基酸序列所构成，并且具有果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶活性的蛋白质。

所述序列号1所示的氨基酸序列是基于小麦颖枯病菌的基因组数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi？db＝nucleotide&val＝NZ_AAGI00000000)来进行搜索的，是经分离的果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶的氨基酸序列。

另外，本发明也包含由在上文所述的本发明的蛋白质的氨基酸序列中置换、缺失、插入和/或附加1个或数个氨基酸而成的氨基酸序列所构成，并且具有果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶活性的蛋白质，只要置换、缺失、插入和/或附加后的蛋白质具有果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶活性，则置换、缺失、插入和/或附加1个或数个氨基酸的位点可以是此氨基酸序列中的任意位点。在此，所谓“1个或数个氨基酸残基”，具体来说是指10个以内的范围的氨基酸残基个数，优选6个以内的范围的氨基酸残基。

另外，本发明包含如下蛋白质：即，上文所述的本发明的蛋白质的氨基酸序列(序列号1所示)，由与此氨基酸序列具有86.0％以上、优选90.0％以上、更优选95.0％以上的同源性的氨基酸序列所构成，并且具有果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶活性。

另外，氨基酸序列的同源性可利用公知的方法求得。具体来说，可根据此商品的说明书使用GENETYX-WIN(GENETYX股份公司制造的商品名)，通过序列号1所示的氨基酸序列与比较对象的氨基酸序列的同源性检索(homology search)而达到一致的氨基酸序列的比例(％)的形式，来计算同源性。同源性可以通过在比较对象的序列的整个区域中比较比对成最佳状态的2个序列来确定。在此，为了将比较对象的碱基序列或氨基酸序列比对成最佳状态，也允许附加或缺失(例如，间隙(gap)等)。

上述“由在序列号1所记载的氨基酸序列中置换、缺失、插入和/或附加1个或数个氨基酸残基而成的氨基酸序列所构成，并且具有果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶活性的蛋白质”或“由与序列号1所记载的氨基酸序列具有86.0％以上的同源性的氨基酸序列所构成，并且具有果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶活性的蛋白质”中，优选在序列号1所记载的氨基酸序列中，从氨基末端起第58号异亮氨酸和/或从氨基末端起第110号甘氨酸被置换成其它氨基酸。

所述蛋白质中，所述从氨基末端起第58号异亮氨酸和/或从氨基末端起第110号甘氨酸被置换成其它氨基酸。所述其它氨基酸没有特别限定，可置换成适当的公知的氨基酸。进行置换的氨基酸例如可举出：作为天然蛋白质的构成成分的基本氨基酸、受到某种化学修饰的修饰氨基酸、由基本氨基酸衍生的特殊氨基酸等，但不限定于这些氨基酸。

通过将从氨基末端起第58号异亮氨酸置换成其它氨基酸，能够进一步提高所述蛋白质对果糖基缬氨酰基组氨酸的底物特异性，通过将从氨基末端起第110号甘氨酸置换成其它氨基酸，能够进一步提高所述蛋白质的热稳定性。

以下，首先对从氨基末端起第58号异亮氨酸被置换成其它氨基酸情况进行具体说明。

所述从氨基末端起第58号异亮氨酸优选被置换成例如蛋氨酸、苏氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、缬氨酸或亮氨酸。如果是所述构成，那么可进一步提高果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶的底物特异性(对果糖基缬氨酰基组氨酸的反应性)。

从进一步提高对果糖基缬氨酰基组氨酸的底物特异性(换言之，大幅度降低对果糖基缬氨酸以及果糖基赖氨酸这两种底物的反应性)的观点来看，所述从氨基末端起第58号异亮氨酸，更优选被置换成苏氨酸、丝氨酸、缬氨酸或丙氨酸。

另一方面，从不仅提升底物特异性而且提升热稳定性的观点来看，所述从氨基末端起第58号异亮氨酸，更优选被置换成蛋氨酸、丝氨酸或丙氨酸。

因此，从进一步提升底物特异性的同时也提升热稳定性的观点来看，所述从氨基末端起第58号异亮氨酸，最优选被置换成丝氨酸或丙氨酸。

在从氨基末端起第58号异亮氨酸被置换成其它氨基酸的情况下，从氨基末端起第58号以外的位点，也可以置换、缺失、插入和/或附加氨基酸。此时，从氨基末端起第58号以外产生置换、缺失、插入和/或附加的位点没有特别限定。

其次，对从氨基末端起第110号甘氨酸被置换成其它氨基酸的情况进行具体说明。

所述从氨基末端起第110号甘氨酸，优选被置换成例如色氨酸和脯氨酸以外的氨基酸。更具体来说，所述从氨基末端起第110号甘氨酸优选被置换成谷氨酰胺、蛋氨酸、谷氨酸、苏氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、精氨酸、丝氨酸、缬氨酸、亮氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸。如果是所述构成，那么可提升果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶的热稳定性。

从不仅提升热稳定性而且也提升比活性的观点来看，所述从氨基末端起第110号甘氨酸，更优选被置换成谷氨酸(E)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)或酪氨酸(Y)。

从不仅使热稳定性更加良好而且也使Km评价更加良好的观点来看，所述从氨基末端起第110号甘氨酸，更优选被置换成组氨酸(H)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、酪氨酸(Y)或苯丙氨酸(F)。

从不仅提升热稳定性而且也提升底物特异性的观点来看，所述从氨基末端起第110号甘氨酸，更优选被置换成谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)。

在从氨基末端起第110号甘氨酸被置换成其它氨基酸情况下，从氨基末端起第110号以外的位点也可以置换、缺失、插入和/或附加氨基酸。此时，对从氨基末端起第110号以外产生置换、缺失、插入和/或附加的位点，没有特别限定。

在序列号1所示的氨基酸序列中，优选从氨基末端起第58号氨基酸与从氨基末端起第110号氨基酸两者被置换成其它氨基酸。根据所述构成，显示出提高果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶的热稳定性的倾向，并且显示出降低对果糖基赖氨酸的反应性的倾向。另外，如上所述，置换所述从氨基末端起第110号甘氨酸的具体氨基酸没有特别限定，例如优选谷氨酰胺。如果是所述构成，那么可进一步降低对果糖基缬氨酸和果糖基赖氨酸的反应性。

所述“由在序列号1所记载的氨基酸序列中置换、缺失、插入和/或附加1个或数个氨基酸残基而成的氨基酸序列所构成，并且具有果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶活性的蛋白质”或“由与序列号1所记载的氨基酸序列具有86.0％以上的同源性的氨基酸序列所构成，并且具有果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶活性的蛋白质”中，优选除了序列号1所记载的氨基酸序列中的从氨基末端起第58号、第110号氨基酸以外，从氨基末端起第282号苯丙氨酸被置换成其它氨基酸。根据所述构成，可提高果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶的热稳定性。

置换所述从氨基末端起第282号苯丙氨酸的具体氨基酸没有特别限定，例如优选酪氨酸。如果是所述构成，那么可进一步提高果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶的热稳定性。

本发明中的果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶活性是利用后述实施例中的“活性测定法”的项中所说明的方法来测定的。在测定果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶活性的情况下，使用果糖基缬氨酰基组氨酸作为底物即可。另外，本发明的说明中，所谓“具有果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶活性”，表示至少具有以果糖基缬氨酰基组氨酸作为底物的氧化酶活性即可，优选0.1U/mg-protein以上，更优选1.0U/mg-protein以上。另外，本发明所涉及的蛋白质，除了所述果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶活性以外，还可以具有其它酶活性(没有限定，例如对果糖基缬氨酸的氧化酶活性)。

所述本发明所涉及的蛋白质，例如可使用产生从自然界分离出来的此蛋白质的生物(例如，细菌、酵母、昆虫、线虫、斑马鱼、哺乳类等)来生产。即，本发明的蛋白质包括来源于各种生物种的蛋白质。另外，本发明的蛋白质既可以使用基因重组技术来生产，或者也可以使用氨基酸合成仪等进行化学合成。在基因重组技术中，适于使用的各种重组蛋白质表达系统例如可使用大肠杆菌表达系统、昆虫细胞表达系统、哺乳类细胞表达系统以及无细胞表达系统，但并不限定于这些表达系统。对本发明的蛋白质等的制造方法在后文中加以叙述。

另外，本发明所涉及的蛋白质等包括例如实施了分子间交联和/或分子内交联(例如，双硫键等)的蛋白质、实施了化学修饰(例如，糖链、磷酸或其它官能团等)的蛋白质、赋予了标记(例如，组氨酸标签、Myc标签、或Flag标签等)的蛋白质、或赋予了融合蛋白质(例如，抗生蛋白链菌素、细胞色素、谷胱甘肽转移酶(GST)或绿色荧光蛋白(GFP)等)的蛋白质等，但没有特别限定于这些蛋白质。而且，本发明的蛋白质只要实际上维持果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶活性，则也可以包括将多种蛋白质的片段组合而构成的嵌合蛋白质。

可由本发明所涉及的蛋白质与血清蛋白、有机酸或以葡聚糖为代表的赋形剂等构成果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶剂。所述果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶剂中，可含有公知的物品作为酶剂的构成物品。

<2.本发明所涉及的多核苷酸>

本发明所涉及的多核苷酸，其特征在于：是编码本发明所涉及的蛋白质的多核苷酸。

也就是说，本发明所涉及的多核苷酸是，选自以下项目(IV)至(VII)并且用以编码具有果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶活性的蛋白质的多核苷酸。

(IV)由序列表的序列号2所记载的碱基序列构成的多核苷酸；

(V)由在序列号2所记载的碱基序列中置换、缺失、插入和/或附加1个以上30个以下的碱基而成的碱基序列所构成，并且编码具有果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶活性的蛋白质的多核苷酸；

(VI)编码本发明所涉及的蛋白质的多核苷酸；

(VII)由与所述(IV)至(VI)所示的多核苷酸互补的碱基序列所构成的多核苷酸在以严格条件下进行杂交，并且编码具有果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶活性的蛋白质的多核苷酸。

用在本说明书中时，术语“多核苷酸”可以与“基因”、“核酸”或“核酸分子”交换使用，表示核苷酸的聚合物。在这里，多核苷酸能够以DNA的形态(例如，cDNA或基因组DNA)或RNA(例如，mRNA)的形态存在。DNA或RNA既可以是双链，也可以是单链。单链DNA或RNA，既可以是编码链(有义链)，也可以是非编码链(反义链)。

另外，本发明的多核苷酸可用化学方法合成，为了提高所编码的蛋白质的表达，也可以改变密码子使用频率(Codon usage)。当然，编码同一氨基酸的密码子彼此间也可以置换。

本发明所涉及的多核苷酸的制作方法没有特别限制，可以利用适当的公知的方法来进行制作。例如，可以通过根据需要对编码野生型的果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶的多核苷酸(序列号2)导入适当的变异来进行制作。另外，也能够通过化学合成法来进行制作。

作为制作本发明所涉及的多核苷酸的方法，可以使用通常进行的多核苷酸修饰方法。也就是说，可以通过置换、缺失、插入和/或附加具有蛋白质的遗传信息的多核苷酸的特定碱基，来制作具有所需重组蛋白质的遗传信息的多核苷酸。作为转换多核苷酸的碱基的具体方法，例如可以举出：使用市场上出售的试剂盒(KOD-Plus定点突变试剂盒(KOD-Plus Site-Directed Mutagenesis Kit)；东洋纺织制造，Transformer定点突变试剂盒(Transformer Site-Directed Mutagenesis Kit)；Clonetech制造，QuickChange定点突变试剂盒(QuickChange Site Directed Mutagenesis Kit)；Stratagene制造等)；或利用聚合酶链反应法(Polymerase Chain Reaction，PCR)。这些方法对于本领域技术人员而言是公知的。

本发明所涉及的多核苷酸，只要编码所述本发明所涉及的蛋白质即可，其碱基序列没有特别限制。因此由对应于本发明的蛋白质的氨基酸序列的碱基序列所构成的所有多核苷酸都包含在本发明中。

在本发明的一个实施方式中，本发明所涉及的多核苷酸，也可以是构成此多核苷酸的碱基的一部分是被化学合成的碱基(包括所谓的非天然型碱基)置换了的多核苷酸。另外，置换本发明所涉及的多核苷酸的位点没有特别限定，只要置换后的碱基序列表达的蛋白质具有比较好的性质即可。

本发明所涉及的多核苷酸，既可以仅由编码本发明的蛋白质的多核苷酸构成，也可以附加其它碱基序列。所附加的碱基序列没有限定，可以举出：编码标记(例如，组氨酸标签、Myc标签或FLAG标签等)、融合蛋白质(例如，抗生蛋白链菌素、细胞色素、GST、GFP或髓鞘碱性蛋白(MBP)等)、启动子序列(例如，来源于酵母的启动子序列、来源于噬菌体的启动子序列或来源于大肠杆菌的启动子序列等)以及信号序列(例如，内质网(endoplasmic reticulum)转移信号序列以及分泌序列等)的碱基序列等。附加这些碱基序列的位点没有特别限定，例如，既可以是转译的蛋白质的N末端，也可以是C末端。

另外，本发明所涉及的多核苷酸，也包括编码所述本发明所涉及的蛋白质的多核苷酸(例如，具有序列号2所示的碱基序列的多核苷酸)或在严格条件下与由与其互补的碱基序列所构成的多核苷酸进行杂交的多核苷酸。

在此，所谓“严格的条件”，是指在自同源性高的核酸彼此、例如完全匹配的杂种的解链温度(Tm值)起至比其低15℃、优选为10℃、更优选为5℃的温度的范围内的温度下进行杂交的条件。例如，是指在一般的杂交用缓冲液中以68℃、20小时的条件进行杂交。更具体来说，所述杂交可以利用Sambrook等人、《分子克隆：实验指南》第二版，冷泉港实验室(Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2d Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory)(1989)中记载的众所周知的方法来进行。

本发明所涉及的多核苷酸的碱基序列，可以利用Science，214：1205(1981)中记载的双脱氧法来确定。

以下更详细地说明本发明所涉及的多核苷酸的一例，但本发明不限定于此例。另外，本发明的多核苷酸包含利用以下记载的置换的所有组合所生成的多核苷酸。

首先，对本发明的一例、亦即编码如下氨基酸序列的多核苷酸加以说明，此氨基酸序列是在序列号1所示的氨基酸序列中从氨基末端起第58号异亮氨酸被置换成其它氨基酸的氨基酸序列。

作为本发明所涉及的多核苷酸，例如，优选编码在序列号1所示的氨基酸序列中从氨基末端起第58号异亮氨酸被置换成其它氨基酸的氨基酸序列的多核苷酸。更具体来说，优选在序列号2所示的多核苷酸中“att(第172号～第174号)”被置换成编码异亮氨酸以外的氨基酸的密码子的多核苷酸。

所述置换“att”的具体密码子没有特别限定，例如优选编码蛋氨酸、苏氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、缬氨酸或亮氨酸的密码子。更具体来说，所述“att”优选被置换成“atg(编码蛋氨酸的密码子)”、“acc(编码苏氨酸的密码子)”、“gct(编码丙氨酸的密码子)”、“aac(编码天冬酰胺的密码子)”、“tcg(编码丝氨酸的密码子)”、“gtc(编码缬氨酸的密码子)”或“ctc(编码亮氨酸的密码子)”，但不限定于这些。当然也可以置换成编码所述氨基酸的其它密码子。

而且，本发明所涉及的多核苷酸优选编码如下氨基酸序列的多核苷酸，此氨基酸序列是除了所述置换以外，序列号1所示的氨基酸序列中的氨基末端起第282号苯丙氨酸也被置换成其它氨基酸的氨基酸序列。更具体来说，优选在序列号2所示的多核苷酸中“ttc(第844号～第846号)”被置换成编码苯丙氨酸以外的氨基酸的密码子的多核苷酸。

置换所述“ttc”的具体密码子没有特别限定，例如优选编码酪氨酸的密码子。更具体来说，所述“ttc”优选被置换成“tat(编码酪氨酸的密码子)”，但不限定于此。当然也可以将所述“ttc”置换成编码酪氨酸的其它密码子。

而且，本发明所涉及的多核苷酸，优选编码如下氨基酸序列的多核苷酸，此氨基酸序列除了所述置换以外，序列号1所示的氨基酸序列中的氨基末端起第110号甘氨酸也被置换成其它氨基酸。更具体来说，优选在序列号2所示的多核苷酸中“gga(第328号～第330号)”被置换成编码甘氨酸以外的氨基酸的密码子的多核苷酸。

置换所述“gga”的具体密码子没有特别限定，例如优选编码谷氨酰胺的密码子。更具体来说，所述“gga”优选被置换成“cag(编码谷氨酰胺的密码子)”，但不限定于此。当然也可以将所述“gga”置换成编码谷氨酰胺的其它密码子。

其次，对本发明的一例、亦即编码如下氨基酸序列的多核苷酸加以说明，此氨基酸序列是在序列号1所示的氨基酸序列中从氨基末端起第110号甘氨酸被置换成其它氨基酸的氨基酸序列。

作为本发明所涉及的多核苷酸，例如优选编码在序列号1所示的氨基酸序列中从氨基末端起第110号甘氨酸被置换成其它氨基酸的氨基酸序列的多核苷酸。更具体来说，优选在序列号2所示的多核苷酸中“gga(第328号～第330号)”被置换成编码甘氨酸以外的氨基酸的密码子的多核苷酸。

置换所述“gga”的具体密码子没有特别限定，例如优选编码色氨酸及脯氨酸以外的氨基酸的密码子。更具体来说，优选编码谷氨酰胺、蛋氨酸、谷氨酸、苏氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、精氨酸、丝氨酸、缬氨酸、亮氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸的密码子。更具体来说，所述“gga”优选被置换成“acg(编码苏氨酸的密码子)”、“gcg(编码丙氨酸的密码子)”、“gtg(编码缬氨酸的密码子)”、“ctg(编码亮氨酸的密码子)”、“att(编码异亮氨酸的密码子)”、“atg(编码蛋氨酸的密码子)”、“ttc(编码苯丙氨酸的密码子)”、“tcc(编码丝氨酸的密码子)”、“cag(编码谷氨酰胺的密码子)”、“tgt(编码半胱氨酸的密码子)”、“tac(编码酪氨酸的密码子)”、“aac(编码天冬酰胺的密码子)”、“aag(编码赖氨酸的密码子)”、“cac(编码组氨酸的密码子)”、“agg(编码精氨酸的密码子)”、“gac(编码天冬氨酸的密码子)”、或“gag(编码谷氨酸的密码子)”，但不限定于这些。当然也可以置换成编码所述氨基酸(置换后的氨基酸)的其它密码子。

<3.本发明所涉及的重组载体、转化体>

本发明所涉及的载体，含有所述本发明所涉及的多核苷酸。只要是含有所述本发明所涉及的多核苷酸的载体，则其它构成没有特别限定。

成为构成本发明所涉及的载体的基础的载体，可以适当选择对于宿主比较合适的载体。例如，成为基础的载体可以使用质粒、噬菌体、粘性质粒、腺病毒、或逆转录病毒等，但不限定于这些载体。

在使用质粒载体作为本发明所涉及的载体的情况下，例如可以使用pBluescript(注册商标)、pUC18等。在此情况下，导入载体的宿主例如可以使用酵母、大肠杆菌(大肠杆菌W3110(Escherichia coli W3110)、大肠杆菌C600(Escherichia coli C600)、大肠杆菌JM109(Escherichia coli JM109)、大肠杆菌(Escherichia coli DH5α))、昆虫细胞、哺乳类细胞等。

而且，具体来说，所述宿主可以使用大肠杆菌(例如，大肠杆菌(Escherichia coli)等)等细菌、酵母(例如，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)等)、昆虫细胞、线虫(例如，秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)等)、非洲爪蟾(例如，有爪蟾(Xenopus laevis)等)的卵母细胞、哺乳类细胞(例如，CHO细胞、COS细胞以及Bowes黑色素瘤细胞)或各种人培养细胞等，但不限定于这些。另外，用在本说明书中时，术语“转化体”不仅包括细胞、组织或器官，而且也包括生物个体。

本发明所涉及的载体，取决于被导入的宿主，可以含有表达控制区域(例如，启动子、终止子、和/或复制起点等)。作为启动子，可以举出病毒性启动子(例如，SV40初期启动子、SV40后期启动子等)等，但不限定于此。

所述载体优选含有至少1个选择标记(Marker)。作为这样的标记，可以举出：氨比西林、二氢叶酸还原酶、新霉素耐性基因等。只要使用所述选择标记，就可以确认本发明的多核苷酸是否导入到宿主中，而且确认是否在宿主中确实得到表达。

向所述宿主中导入本发明的载体的方法没有特别限制，例如可以比较好地使用电穿孔法、磷酸钙法、脂质体法、DEAE葡聚糖法等先前公知的方法。更具体来说，在向属于埃希菌属的宿主微生物中导入载体的情况下，可以使用在存在钙离子的条件下导入重组DNA的方法、或使用电穿孔法的方法。此外，也可以使用市场上出售的感受态细胞(例如，Competent high JM109、Competent high DH5α；东洋纺织公司制造)进行基因导入。

为了构筑本发明所涉及的载体，可以使在分离及纯化本发明所涉及的多核苷酸(基因)后，将利用限制酶处理等进行酶切所得的此多核苷酸片段、与利用限制酶对成为基础的载体进行酶切所得的直链多核苷酸进行结合封闭而构筑。结合封闭时，可以根据载体及此多核苷酸的性质而使用DNA连接酶等。将本发明的载体导入到能够复制的载体中后，以载体的标记和酶活性的表达为指标进行筛选，可以获得含有本发明的多核苷酸(基因)的转化体。因此，优选本发明的载体中含有耐药性基因等标记基因。

另外，本发明包含利用所述本发明的载体而转化的转化体。利用本发明的载体进行转化的宿主没有特别限定，如上所述可以举出酵母、大肠杆菌、昆虫细胞以及哺乳类细胞等。

<4.本发明所涉及的蛋白质的制造方法>

本发明所涉及的蛋白质的制造方法的特征在于，包括对所述本发明所涉及的转化体进行培养的步骤(称作“培养步骤”)。本发明所涉及的蛋白质的制造方法除了所述培养步骤以外，还可以包括利用转化体的蛋白质生产中可以包含的其它步骤。作为其它步骤，例如可以举出：在培养步骤后，回收本发明所涉及的转化体所生产的蛋白质的步骤以及纯化此蛋白质的步骤。

(4-1)培养步骤

所述培养步骤通过利用营养培养基等对本发明所涉及的转化体进行培养，能够稳定地生产大量的重组蛋白质。转化体的培养形态(培养方法、培养条件等)考虑到宿主的营养生理性质来选择即可，多数情况下是通过液体培养来进行。工业上比较有利的是进行通气搅拌培养。

培养步骤中使用的营养培养基的营养源，可以广泛使用培养中通常使用的营养源。碳源只要是能够同化(assimilation)的碳化合物即可，例如可使用葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、乳糖、糖浆、或丙酮酸等。另外，氮源只要是能够同化的氮化合物即可，例如可使用蛋白胨、肉膏、酵母膏、酪蛋白水解物、或大豆粕碱提取物等。除此以外，也可以根据需要在培养基中添加磷酸盐、碳酸盐、硫酸盐、镁、钙、钾、铁、锰、锌等的盐类、特定的氨基酸、特定的维生素等。

关于本发明的转化体的培养温度，只要是在此转化体能够生产本发明所涉及的蛋白质的范围内，则可以适当地改变，例如，在利用大肠杆菌(Escherichia coli)作为宿主的情况下，优选20～42℃左右，更优选20～30℃。只要在此温度范围内，则可以大量生产具有活性的蛋白质。

关于培养时间，在本发明所涉及的蛋白质达到最高产量的适当时期结束培养即可，通常为6～48小时左右。培养基的pH值可以在本发明的转化体能够比较好地发育、并且能够生产本发明的蛋白质的范围内适当改变，但优选pH值为6.0～9.0左右的范围。

(4-2)回收步骤

在回收步骤中回收所述培养步骤中利用转化体生产的本发明所涉及的蛋白质。

在本发明所涉及的转化体将蛋白质分泌到细胞外的情况下，此培养物中包含本发明的蛋白质。因此可以直接利用培养物作为本发明的所涉及的蛋白质。此时可通过例如过滤或离心分离等将培养液与本发明所涉及的转化体进行分离。

另外，在本发明所涉及的蛋白质存在于转化体内的情况下，利用过滤或离心分离等方法从对转化体进行培养而获得的培养物中采集转化体，利用机械方法或溶菌酶等酶法破坏此转化体后，回收目标蛋白质即可。另外，也可以根据需要添加螯合剂(例如，EDTA等)和表面活性剂(例如，Triton-X100等)，使本发明所涉及的蛋白质可溶化，将此蛋白质制成水溶液而分离采集。

(4-3)纯化步骤

纯化步骤，是纯化在所述回收步骤中所得的蛋白质的步骤。

纯化步骤的具体方法没有特别限定，例如，可以将含有本发明所涉及的蛋白质的溶液供至减压浓缩、膜浓缩、盐析处理(例如使用硫酸铵或硫酸钠等)、或利用亲水性有机溶剂(例如甲醇、乙醇、丙酮等)所进行的分级沉淀法。通过所述操作，可以使作为目标的本发明所涉及的蛋白质沉淀而纯化。

另外，在所述纯化步骤中，也可以使用加热处理、等电点处理、凝胶过滤、吸附色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法、逆相色谱法或这些方法的组合来进行纯化。

优选将含有利用所述方法获得的目标蛋白质的纯化酶，纯化到如果进行电泳(SDS-PAGE)则显示出单一条的程度。

所述纯化酶可以使用例如冷冻干燥、真空干燥或喷雾干燥等进行粉末化后使其流通。另外，在使用纯化酶时，可以根据其用途以溶解在适当的缓冲液中的状态下使用。缓冲液根据目标蛋白质的性质和/或实验条件或环境而适当地选择例如硼酸缓冲液、磷酸缓冲液、Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷盐酸)缓冲液以及GOOD缓冲液等即可。而且，通过将氨基酸(例如谷氨酸、谷氨酰胺或赖氨酸等)以及血清白蛋白等添加到纯化酶中，能够使蛋白质稳定化。

<5.本发明所涉及的糖化蛋白质的测定方法>

本发明所涉及的糖化蛋白质的测定方法(以下称作“本发明的测定方法”)的特征在于，使本发明的蛋白质(或果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶剂)至少对糖化胺发挥作用。以下表示本发明的测定方法的一个实施方式，但本发明不限定于此。另外，本项说明中“本发明所涉及的蛋白质”可以替换成“本发明所涉及的果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶剂”。

本发明所涉及的测定方法的一个实施方式，是包括以下步骤的用以测定糖化蛋白质的方法：

(1)使试样和蛋白酶进行反应，使试样中的糖化蛋白质分解，制备来源于试样中的糖化蛋白质的糖化胺的步骤(方便起见，称作“第1步骤”)；

(2)使本发明的蛋白质对利用所述(1)的步骤所获得的来源于试样中的糖化蛋白质的糖化胺发挥作用的步骤(方便起见，称作“第2步骤”)；以及

(3)测定所述(2)的步骤中产生的过氧化氢的量或所消耗的氧的量的步骤(方便起见，称作“第3步骤”)。

此实施方式中的一个具体例可以举出酶法。在酶法中，使用酶(例如，蛋白酶)将试样中的糖化蛋白质片段化成氨基酸或肽的水平(第1步骤)。接着，在生成的糖化氨基酸和/或糖化肽中加入FAOD，通过氧化还原反应来生成过氧化氢(第2步骤)。在此试样中添加过氧化物酶(POD)和通过氧化而显色的还原剂，以POD作为催化剂，使过氧化氢和还原剂之间产生氧化还原反应(第3步骤)。通过氧化还原反应使还原剂显色，通过测定此显色强度可测定过氧化氢量(第3步骤)。

以下对各步骤加以说明。

(5-1)第1步骤

第1步骤是使试样中的糖化蛋白质分解而制备来源于试样中的糖化蛋白质的糖化胺的步骤。

所述“糖化蛋白质”是指在构成蛋白质的氨基酸残基的一部分或全部上结合有糖(糖化)的蛋白质。糖化蛋白质没有特别限定，例如可以举出蛋白质的氨基末端氨基酸的α-氨基被糖化的蛋白质(例如HbA1c)等。另外，上文示例的HbA1c是作为糖尿病的诊断等临床诊断指标来使用的。另外，所述糖化蛋白质也可以是糖化的蛋白质与其它任意物质相结合而成的蛋白质复合体。

所述蛋白酶，只要是能够将试样中含有的糖化蛋白质分解成糖化氨基酸或糖化肽的蛋白酶即可，没有特别限定。例如可以比较好地使用临床检查中使用的蛋白酶。

另外，所述“试样”只要是可检测有无糖化蛋白质或浓度的对象物，则没有特别限定，例如除了全血、血浆、血清、血球等以外，也可以使用尿、脑脊髓液等生物体试样(即，从生物体采集的试样)，或果汁等的饮料水、酱油、酱料等食品类等试样。由于本发明的方法可以应用在糖尿病诊断中，所以对于所述中的尤其是全血试样、血球试样较为有用。虽然没有特别限定，但在测定红血球内的糖化血红蛋白的情况下，使全血直接溶血，或者使从全血分离出来的红血球溶血，将此溶血试样作为测定用的试样即可。

使试样和蛋白酶进行反应时的具体条件，只要是能够制备所需糖化胺的条件则没有特别限定，可根据试样的浓度或种类、蛋白酶的种类或浓度而研究并采用适当的比较好的条件即可。

能够在本发明的测定方法中比较好地使用的蛋白酶的浓度例如为0.1U～1MU/ml(更优选1U～500KU/ml，最优选5U～100KU/ml)。所述蛋白酶的浓度没有特别限定，可以根据反应条件、试样的种类以及状态、实验者的技术及所使用的试剂种类等适当地决定。

另外，所述“糖化胺”可以举出来源于试样中含有的糖化蛋白质的糖化氨基酸或糖化肽等。糖化肽的长度没有特别限定，可以举出本发明的蛋白质能够发挥作用的长度、例如氨基酸残基个数为2～6的范围的糖化肽。

(5-2)第2步骤

第2步骤是使本发明所涉及的蛋白质对利用所述第1步骤所获得的来源于试样中的糖化蛋白质的糖化胺发挥作用的步骤。

虽然本发明所涉及的蛋白质可具有的果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶活性没有特别限定，但由于果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶活性越高，越能够以高灵敏度检测出糖化胺，并且可以减少果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶蛋白质的使用量，所以优选果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶活性较高。

另外，能够在本发明的测定方法中比较好地使用的果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶蛋白质的浓度，例如为0.1～500U/ml(优选0.5～200U/ml，最优选1.0～100U/ml)。但所述果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶的浓度没有特别限定，可以根据反应条件、试样的种类以及状态、实验者的技术及所使用的试剂种类等适当地决定。

另外，1单位(U)的定义与后述实施例的“活性测定法”中记载的定义相同。

另外，如果本发明的蛋白质对糖化胺发挥作用，则会通过氧化性水解反应而消耗氧，而产生过氧化氢。

(5-3)第3步骤

第3步骤是测定所述第2步骤中产生的过氧化氢的量或所消耗的氧的量的步骤。第3步骤只要是能够测定过氧化氢的量或氧的量的方法，则其具体方法没有特别限定。因此，可以适当使用公知的方法。

第3步骤中使用的方法没有限定，例如可以举出酶法等。在酶法中，使用酶(例如，蛋白酶)将试样中的糖化蛋白质片段化成氨基酸或肽的水平。接着，向生成的糖化氨基酸和/或糖化肽中，加入果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶，通过氧化还原反应来生成过氧化氢。在此试样中添加过氧化物酶(以下省略为POD)及通过氧化而显色的还原剂，以所述POD作为催化剂，使所述过氧化氢和所述还原剂之间发生氧化还原反应。通过所述氧化还原反应使所述还原剂显色，通过测定此显色强度可测定所述过氧化氢的量。

在第3步骤中优选的POD是来源于辣根、微生物等的POD。另外，所述POD的优选使用浓度，为0.01～100单位(U)/mL。

作为在第3步骤中优选的过氧化氢的测定方法，可以采用：通过在POD存在下使偶合剂(4-氨基安替比林(4-AA)以及3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙(MBTH)等)与酚类、苯胺类或甲苯胺类的供氢体(所谓的Trinder试剂)进行氧化缩合反应而生成色素的方法；或使用在POD存在下直接氧化显色的隐色色素(Leuco Dye)的方法。这些方法对于本领域技术人员而言是公知的，通常可以容易地使用。

所述Trinder试剂没有特别限定，例如可以比较好地使用酚及其衍生物。

作为能够在第3步骤中比较好地使用的所述偶合剂，可以举出：4-氨基安替比林、氨基安替比林衍生物、香草醛二胺磺酸、甲基苯并噻唑啉酮腙(MBTH)(更具体来说，3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙)及磺化甲基苯并噻唑啉酮腙(SMBTH)(更具体来说，磺化3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙)等。

能够在第3步骤中比较好地使用的所述隐色色素没有特别限定，例如可以使用三苯基甲烷衍生物、吩噻嗪衍生物、二苯基胺衍生物等。

在第3步骤中的所述过氧化氢量的测定中，除了使用所述POD等的显色方法以外，本领域技术人员通常也知晓使用各种传感器系统的测定方法(没有特别限定，例如参照日本专利特开2001-204494号公报)。具体来说，作为各种传感器系统中使用的电极，可以举出氧电极、碳电极、金电极或铂电极等。在本发明中，可以使用将酶固定化了的这些电极作为作用电极，与对极(例如，铂电极等)及参照电极(例如，Ag/Cl电极等)一起，插入到适于本发明的条件下的缓冲液中，保持在固定的温度，同时对作用电极施加固定的电压，并添加试样，来测定由酶反应的结果所生成的过氧化氢所引起的电流的增加值。

另外，作为使用碳电极、金电极以及铂电极等利用电流测定系统进行测定的方法，有使用固定化电子中介物的系统。例如，作为作用电极，可以使用利用吸附或共价键合法使酶和电子中介物(例如，铁氰化钾、二茂铁、锇衍生物和吩嗪硫酸甲酯等)固定化在高分子矩阵上的电极，与对极(例如，铂电极等)和参照电极(例如，Ag/AgCl电极等)一起，插入到适于本发明的条件下的缓冲液中，保持在固定的温度。接着，对作用电极施加固定的电压，添加试样，并测定由酶反应的结果所产生的过氧化氢引起的电流的增加值。

也可以通过测定第3步骤中所消耗的氧量来测定糖化胺量(没有特别限定，例如参照日本专利特开2001-204494号公报)。具体来说，使用氧电极，使氧固定化在电极表面上，插入到适于本发明的条件下的缓冲液中，保持在固定的温度。向其中添加试样，并测定电流的减少值。

在使用碳电极、金电极、铂电极等利用电流测定系统进行测定的情况下，使用将酶固定化的这些电极作为作用电极，与对极(例如，铂电极等)以及参照电极(例如，Ag/AgCl电极等)一起，测定包含中介物的电流增加量。中介物可以使用铁氰化钾、二茂铁、锇衍生物以及吩嗪硫酸甲酯等。

在本发明的测定法中，为了增加本发明的蛋白质的稳定性，也可以在实施各步骤的系(例如，各反应溶液中)中添加非活性蛋白质。非活性蛋白质优选血清白蛋白类、球蛋白类或纤维性蛋白质类。更优选的蛋白质为牛血清白蛋白，wt/vol的优选浓度为0.05～1％。优选的非活性蛋白质不含引起酶分解的蛋白酶杂质。

果糖基缬氨酰基组氨酸浓度的测定，是利用试样的特定体积和试剂的特定体积来进行的。关于吸光度测定，为了测定空白试样，而在混合此试样与试剂之后、并且在产生由果糖基缬氨酰基组氨酸引起的明显吸光度变化之前尽可能迅速地进行。0.5～5秒后进行第1吸光度测定比较适合。第2吸光度测定是在吸光度稳定后，典型的是在1mg/dL的果糖基缬氨酰基组氨酸浓度下于37℃测定3～5分钟。典型的是，利用具有已知的果糖基缬氨酰基组氨酸浓度的水性或血清溶液将此试剂标准化。

<6.本发明所涉及的糖化蛋白质测定试剂盒>

本发明所涉及的糖化蛋白质测定试剂盒(以下称作“本发明的试剂盒”)的特征在于，至少含有所述本发明所涉及的蛋白质(或果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶剂)。

本发明的试剂盒，例如也可以是糖化血红蛋白测定试剂盒。本发明的试剂盒中所含有的本发明所涉及的蛋白质(或果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶剂)的形态没有特别限定，例如可以采用水溶液、悬浮液或冷冻干燥粉末等形态。所述冷冻干燥粉末可以根据常规方法来制作。

本发明的试剂盒可以具备各种添加物，此添加物的调配方法没有特别限制。例如，可以举出：在含有本发明所涉及的蛋白质的缓冲液中调配添加剂的方法、在含有添加剂的缓冲液中调配本发明所涉及的蛋白质的方法、或将本发明所涉及的蛋白质以及稳定剂同时调配到缓冲液中的方法等。

本发明的试剂盒，可以是由至少具备所述本发明所涉及的蛋白质(或果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶剂)、过氧化物酶以及色原体的试剂组合物所构成的。

在本发明的测定方法中，为了检测由果糖基缬氨酰基组氨酸的氧化所生成的过氧化氢，而利用过氧化物酶反应。因此，所述试剂组合物中，优选使用过氧化物酶和色原体(过氧化氢显色试剂)。所述过氧化物酶和色原体(过氧化氢显色试剂)的具体构成没有任何限定。

用于本发明的色原体(过氧化氢显色试剂)优选为在溶液中稳定并且胆红素干扰比较低的色原体。作为能够在本发明中比较好地使用的色原体(过氧化氢显色试剂)，例如可以举出：将从4-氨基安替比林及3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙(MBTH)中所选择的化合物，与从酚、其衍生物、苯胺及其衍生物中选择的化合物组合而成的试剂。另外，本发明中使用的色原体(过氧化氢显色试剂)也可以是联苯胺类、隐色色素类、4-氨基安替比林、酚类、萘酚类及苯胺衍生物类。

另外，适用于本发明的过氧化物酶优选来源于辣根的过氧化物酶。所述过氧化物酶能够从商业上获得纯度高并且价格低的过氧化物酶。为了迅速且完全地进行反应，酶浓度必须足够高，优选1,000～50,000U/L。

另外，除了所述构成以外，所述试剂组合物中也可以含有缓冲剂(例如，硼酸缓冲液、磷酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液、及GOOD缓冲液等)。而且所述试剂组合物中也可以含有：捕捉妨碍酶反应的离子的螯合试剂(例如，EDTA及邻联茴香胺等)、清除作为妨碍过氧化氢测定的物质的抗坏血酸的抗坏血酸氧化酶、各种表面活性剂(例如，TritonX-100及NP-40等)以及各种抗菌剂和防腐剂(例如，链霉素及叠氮化钠等)等。这些试剂既可以是单一试剂，也可以是2种以上的试剂组合而成的试剂。

所述缓冲剂没有特别限定，可以使用在6～8.5的pH值范围内具有充分缓冲能力的任意的缓冲剂。作为此pH值范围内的缓冲剂，可以举出：磷酸盐、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、1，3-二[三(羟甲基)甲氨基]丙烷(Bis-Tris Propane)、N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸(TES)、2-吗啉基乙磺酸一水合物(MES)、哌嗪-1，4-双(2-乙磺酸)(piperazine-1，4-bis(2-ethanesulfonic acid))(PIPES)、2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸(2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid)(HEPES)、及3-[N-三(羟甲基)甲氨基]-2-羟基丙磺酸(TAPSO)等。特别优选的缓冲剂是MES及PIPES。另外特别优选的浓度范围为20～200mM，优选的pH值范围为pH值6～7。

本发明的试剂盒中例如也可以包含：果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶、缓冲液、蛋白酶、POD、显色试剂、捕捉妨碍酶反应的离子的螯合试剂、清除作为妨碍过氧化氢测定的物质的抗坏血酸的抗坏血酸氧化酶、表面活性剂、稳定剂、赋形剂、抗菌剂、防腐剂、孔板、荧光扫描仪、自动分析仪以及将本发明所涉及的测定方法记载在纸张等记录介质上的操作说明书等。

本发明的测定试剂盒是在本发明的糖化蛋白质的测定方法以及果糖基氨基酸的测定中可以利用的试剂盒，尤其是适合利用于糖化血红蛋白的测定。

<7.本发明所涉及的糖化蛋白质测定传感器>

本发明所涉及的糖化蛋白质测定传感器(以下称作“本发明的传感器”)是用来检测糖化蛋白质的传感器，至少具备本发明所涉及的蛋白质(或果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶剂)。

本发明的传感器在实施本发明的测定方法时使用。尤其是在糖化血红蛋白的测定中可以比较好地利用。因此，本发明的传感器可以由在实施本发明的测定方法时所使用的物品构成。关于所述物品的说明，可以引用本发明的测定方法及本发明的试剂盒的项中的缓冲剂等的说明。

本发明的传感器的一个实施方式，是可以将本发明的蛋白质(或果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶剂)固定在载体上来进行使用。载体是能够将本发明所涉及的蛋白质(或果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶剂)固定化的载体即可，没有特别限定，形状及材质可以根据此蛋白质的性质使用合适的形状及材质。载体的形状，只要是具有本发明所涉及的蛋白质(或果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶剂)能够固定化的充分的面积的形状即可，没有特别限定，例如可以举出：基板、珠粒及膜等。作为载体的材料，例如可以举出：无机类材料、天然高分子以及合成高分子等。

另外，本发明不局限于所述各实施方式，可以在权利要求书所示的范围内进行各种改变，将不同的实施方式中分别揭示的技术方法适当组合而获得的实施方式也包括在本发明的技术范围内。

(实施例)

以下，通过实施例更加具体地说明本发明。

<1.活性测定试剂>

表1中表示了在实施例中使用的活性测定试剂的组成。另外，实施例中使用的试剂只要没有特别说明，则使用从Nacalai Tesque公司购入的试剂。

(表1)

以下表示实施例中的果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶的活性测定条件。

<2.活性测定法>

以下说明下述实施例1～3中的活性测定法。

对于各底物的酶活性，是利用由过氧化物酶反应所产生的色素的吸光度增加来测定的，此过氧化物酶反应追随由酶反应生成的过氧化氢。将3ml活性测定试剂在37℃预热5分钟后，添加0.1ml预先用酶稀释液(50mM磷酸钾缓冲液(pH值7.5))加以稀释的酶溶液，开始反应。

使其在37℃反应5分钟，测定500nm的吸光度变化(ΔOD_实验/min)。在盲测的情况下，添加0.1ml酶稀释液代替酶溶液，与所述同样地进行操作来测定吸光度变化(ΔOD_空白/min)。由所获得的吸光度变化，根据下述算式计算酶活性。另外，将在所述条件下于1分钟内使1微摩尔的底物氧化的酶量设为1单位(U)。

-算式-

活性值(U/ml)＝{ΔOD/min(ΔOD_实验-ΔOD_空白)×3.1(ml)×稀释倍率}/{13×1.0(cm)×0.1(ml)}

3.1(ml)：总液量

13：毫摩尔吸光系数

1.0cm：比色皿的光径长度

0.1(ml)：酶样本液量

<3.实施例1：果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶基因的克隆>

为了进行来源于小麦颖枯病菌的果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶的cDNA克隆，而检索小麦颖枯病菌的基因组数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/genom_table.cgi？organism＝fungi&database＝321614)。

从基因组数据库中选取预测会编码FAD依赖型氧化还原酶(FAD-dependent oxidoreductase)的基因。从有可能编码实际上对果糖基缬氨酸发挥作用的酶的观点考虑，进一步对从检索结果所获得的各种基因进行精选，结果将相当于GenBank no.AAGI01000177 239512bp Phaeosphaeria nodorum SN15 cont1.177，whole genome shotgun Sequence(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi？tool＝portal&db＝nuccore&term＝&query％5Fkey＝11&dopt＝gb&dispmax＝20&page＝1&qty＝1&WebEnv＝0x3fThZQ1ubv2E4QUtcTFzS2yHOV3ljOuR6kUwGyNOVEiqCGdFac8yYAlfzZG％2DvpBxXqNrPNESW3skk％402644558678701720％5F0135SID&WebEnvRq＝1)的75,143bp到76,625bp的序列的基因作为克隆候补基因。

接着，针对所述克隆候补基因的cDNA，通过使用剪接位点(外显子-内含子)的预测工具(http://www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html)、或与已知的其它生物种的果糖基氨基酸氧化酶基因进行比较，而推测出与编码蛋白质的部分对应的cDNA全序列。基于此信息，通过利用基因片段的PCR这种常规方法进行全合成、即通过制备全RNA并提取mRNA再进行逆转录而合成cDNA全序列。对于所述cDNA，使用Blunting high(东洋纺织公司制造)进行末端的平滑化，亚克隆到pUC118的SmaI位点。对cDNA部分进行序列分析，结果获得序列号2所示的碱基序列。序列号2所示的碱基序列中的cDNA的编码区域是第1号碱基到第1314号碱基，起始密码子相当于第1号碱基到第3号碱基，终止密码子TAG相当于第1312号碱基到第1314号碱基。将由序列号2所示的碱基序列所明确的氨基酸序列示于序列号1。

另外，如后述的实施例2和3所示，所获得的cDNA，是编码新型的果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶的cDNA。

<4.实施例2：果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶基因在大肠杆菌中的大量表达与纯化、酶分析>

制作含有具有所述序列号2所示的碱基序列的果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶基因的质粒，尝试在大肠杆菌中大量表达果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶蛋白质。

对除果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶基因的终止密码子以外的全长cDNA区域(序列号2所示的碱基序列的第1号到第1311号碱基)进行PCR扩增。此时，使用序列号3所示的引物P1(5’-GGAATTCCATATGGCGCCCTCCAGAGCAAACACCAGTGTCATT-3’)(所述碱基序列中的“CATATG”为NdeI位点)在氨基酸序列的N末端插入NdeI酶切位点，使用序列号4所示的引物P2(5’-CCGCTCGAGCAAGTTCGCCCTCGGCTTATCATGATTCCAACC-3’)(所述碱基序列中的“CTCGAG”为XhoI位点)在C末端导入XhoI酶切位点。以与T7启动子成正义方向的方式将本DNA片段亚克隆到pET-23b载体(Novagen公司)的NdeI-XhoI位点。所制作的质粒作为果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶表达用质粒而命名为pIE353。

使用所述质粒pIE353使大肠杆菌BL21 CodonPlus(DE3)-RIL(Stratagene公司)转化。然后，选择表现出氨比西林耐性的转化体BL21CodonPlus(DE3)-RIL(pIE353)。

所述转化体培养用的培养基是使用将200ml的TB培养基分注到容积2L的振动烧瓶中并于121℃进行20分钟高压蒸汽灭菌的培养基。将所述培养基放置冷却后，向培养基中添加另外经过无菌过滤的氨比西林，使终浓度达到100μg/ml。在此培养基中接种2ml利用含有100μg/ml的氨比西林的LB培养基预先于30℃培养16小时的BL21 CodonPlus(DE3)-RIL(pIE353)的培养液。

接着，于30℃进行24小时通气搅拌培养。培养结束后，通过离心分离汇集菌体，使其悬浮在50mM磷酸钾缓冲液(pH值7.5)中后，对细胞实施超声波破碎。

接着，对所述悬浮液进行离心分离，以粗酶液的形式获得了上清液。利用含有果糖基缬氨酰基组氨酸作为底物的酶活性测定试剂所测定的粗酶液的果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶活性约为1.0U/ml。使用MagExtractor-His-tag-(东洋纺织制造)，根据规定的操作流程对获得的粗酶液进行纯化，而获得纯化酶样品(IE353)。利用本方法获得的IE353样品，通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳确认了是单一的蛋白质。

使用含有果糖基缬氨酰基组氨酸作为底物的酶活性测定试剂，测定了所述IE353样品的酶活性，确认了其具有果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶活性。

<5.实施例3：各果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶蛋白质的特性评价>

测定了本发明所涉及的果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶(IE353)和先前的酶FPOX-CE及FPOX-EE(均为龟甲万公司(Kikkoman Corporation)制造)的热稳定性、底物特异性和对于果糖基缬氨酰基组氨酸(F-VH)的Km值，将结果示于表2。

热稳定性是以如下方法计算的：即，以使各种酶在50mM磷酸钾缓冲液(pH值7.5)中达到0.1mg/mL的方式进行制备，于50℃进行10分钟热处理，根据下述算式进行了计算。

热稳定性(％)＝(50℃、10分钟热处理后的活性值)÷(未进行热处理的活性值)×100

底物特异性是以如下方法计算的：即，以使各底物达到10mM的方式进行制备，使用前文所述的活性测定法，并根据下述算式进行了计算。另外，在下述算式中，F-K是指作为酶反应的底物的果糖基赖氨酸。另外判定，此算式所定义的底物特异性的值越小，则对F-VH的特异性越优异，更为优选。

底物特异性(F-K/F-VH)＝(以F-K作为底物时的活性值)÷(以F-VH作为底物时的活性值)

对于F-VH的Km值是以如下方法计算的：以使F-VH浓度达到1.75mM、0.88mM、0.58mM、0.35mM、0.25mM、0.18mM的方式制备试剂，使用各试剂实施前文所述的活性测定，利用双倒数作图(Lineweaver-Burk Plot)来进行了计算。

(表2)

由表2的结果可知，IE353和FPOX-CE及FPOX-EE相比，热稳定性较高，底物特异性较优异，并且Km值也较低。Km值低表示和底物的亲和性高，也就是说即使在比较低的底物浓度下，反应性也良好。因此，可以减少糖化蛋白质测定试剂中的果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶的添加量。

<6.活性测定方法>

将以下的实施例4～7、参考例1中的FAOD的活性测定方法示于以下。

FAOD对各底物的酶活性是通过测定由过氧化物酶反应所产生的色素的吸光度增加来求得的，此过氧化物酶反应利用了由酶反应所生成的过氧化氢。

首先，将3ml活性测定试剂在37℃加热5分钟后，向此活性测定试剂中添加预先用酶稀释液(含有0.1％TritonX100的50mM磷酸钾缓冲液(pH值6.5))加以稀释的酶溶液0.1ml，开始反应。

使其于37℃反应5分钟后，测定单位时间内的500nm的吸光度变化(ΔOD_实验/min)。作为盲测，是使用0.1ml酶稀释液代替酶溶液，进行同样的操作，测定了吸光度的变化(ΔOD_空白/min)。

根据下述算式，由所得吸光度变化计算了酶活性。另外，将在所述条件下于1分钟内使1微摩尔的底物氧化的酶量规定为1单位(U)。

-算式-

活性值(U/ml)＝{((ΔOD_实验/min)-(ΔOD_空白/min))×3.1ml×稀释倍率}/(13×1.0cm×0.1ml)

另外，在所述算式中，“3.1ml”表示总液量，“13”表示毫摩尔吸光系数，“1.0cm”表示比色皿的光径长度，“0.1ml”表示酶样本液量。

<7.底物特异性评价方法>

以下说明以下的实施例4～7、参考例1中的FAOD的底物特异性评价方法。

以各底物(F-K：果糖基赖氨酸、F-V：果糖基缬氨酸、F-VH：果糖基缬氨酰基组氨酸)的浓度达到2mM的方式制备活性测定试剂，根据上述活性测定法，利用下述算式计算了活性值比(底物特异性)。

(F-V/F-VH)＝(以F-V作为底物时的活性值)÷(以F-VH作为底物时的活性值)

(F-K/F-VH)＝(以F-K作为底物时的活性值)÷(以F-VH作为底物时的活性值)

另外判定，由此算式定义的活性值比的值越小，则对F-VH待特异性越优异，越优选。

<8.热稳定性评价方法>

以下说明以下的实施例4～7、参考例1中的FAOD的热稳定性评价方法。

将纯化酶样品溶解到50mM磷酸钾缓冲液(pH值6.5)中，并使其浓度达到0.1mg/ml，于50℃实施10分钟加热处理。另外，在后述三重变异蛋白质时，加热温度设为55℃。然后，根据以下算式计算纯化酶样品的热稳定性(％)。

热稳定性(％)＝[(50℃、10分钟加热处理后的活性值)/(加热处理前的活性值)]×100

<9.实施例4：果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶基因、蛋白质的修饰>

为了将序列号1所示的氨基酸序列的第58号异亮氨酸随机地置换成其它氨基酸，而合成引物R1和引物R2。

·引物R1：5’-cttattgaggtcattgcctgcagattgcgatgaagg-3’(序列号5)

·引物R2：5’-nnsatgggcgttagcttgcgaaacccagtggac-3’(序列号6)

使用所述pIE353、引物R1、引物R2和KOD-Plus定点突变试剂盒(东洋纺织制造)，制作对所述第58号异亮氨酸导入变异的重组质粒。使用此重组质粒使BL21 CodonPlus(DE3)-RIL转化后，挑取100个表现出氨比西林耐性的菌落。确认导入到100个菌落中的100个重组质粒的碱基序列，结果成功地获得了序列号1所示的氨基酸序列的第58号异亮氨酸被置换成19种氨基酸中的各种氨基酸的质粒。

具体来说，成功地获得了编码序列号1所示的氨基酸序列的第58号的碱基序列(att)被置换成编码苏氨酸(T)的碱基序列(acc)的质粒(pIE353-I58T)。并且，将由此质粒获得的纯化酶样品称作IE353-I58T。

另外，成功地获得了编码序列号1所示的氨基酸序列的第58号的碱基序列(att)被置换成编码丙氨酸(A)的碱基序列(gct)的质粒(pIE353-I58A)。并且，将由此质粒获得的纯化酶样品称作IE353-I58A。

另外，成功地获得了编码序列号1所示的氨基酸序列的第58号的碱基序列(att)被置换成编码缬氨酸(V)的碱基序列(gtc)的质粒(pIE353-I58V)。并且，将由此质粒获得的纯化酶样品称作IE353-I58V。

另外，成功地获得了编码序列号1所示的氨基酸序列的第58号的碱基序列(att)被置换成编码亮氨酸(L)的碱基序列(ctc)的质粒(pIE353-I58L)。并且，将由此质粒获得的纯化酶样品称作IE353-I58L。

另外，成功地获得了编码序列号1所示的氨基酸序列的第58号的碱基序列(att)被置换成编码蛋氨酸(M)的碱基序列(atg)的质粒(pIE353-I58M)。并且，将由此质粒获得的纯化酶样品称作IE353-I58M。

另外，成功地获得了编码序列号1所示的氨基酸序列的第58号的碱基序列(att)被置换成编码苯丙氨酸(F)的碱基序列(ttc)的质粒(pIE353-I58F)。并且，将由此质粒获得的纯化酶样品称作IE353-I58F。

另外，成功地获得了编码序列号1所示的氨基酸序列的第58号的碱基序列(att)被置换成编码丝氨酸(S)的碱基序列(tcg)的质粒(pIE353-I58S)。并且，将由此质粒获得的纯化酶样品称作IE353-I58S。

另外，成功地获得了编码序列号1所示的氨基酸序列的第58号的碱基序列(att)被置换成编码谷氨酰胺(Q)的碱基序列(caa)的质粒(pIE353-I58Q)。并且，将由此质粒获得的纯化酶样品称作IE353-I58Q。

另外，成功地获得了编码序列号1所示的氨基酸序列的第58号的碱基序列(att)被置换成编码半胱氨酸(C)的碱基序列(tgc)的质粒(pIE353-I58C)。并且，将由此质粒获得的纯化酶样品称作IE353-I58C。

另外，成功地获得了编码序列号1所示的氨基酸序列的第58号的碱基序列(att)被置换成编码酪氨酸(Y)的碱基序列(tac)的质粒(pIE353-I58Y)。并且，将由此质粒获得的纯化酶样品称作IE353-I58Y。

另外，成功地获得了编码序列号1所示的氨基酸序列的第58号的碱基序列(att)被置换成编码天冬酰胺(N)的碱基序列(aac)的质粒(pIE353-I58N)。并且，将由此质粒获得的纯化酶样品称作IE353-I58N。

另外，成功地获得了编码序列号1所示的氨基酸序列的第58号的碱基序列(att)被置换成编码赖氨酸(K)的碱基序列(aag)的质粒(pIE353-I58K)。并且，将由此质粒获得的纯化酶样品称作IE353-I58K。

另外，成功地获得了编码序列号1所示的氨基酸序列的第58号的碱基序列(att)被置换成编码组氨酸(H)的碱基序列(cac)的质粒(pIE353-I58H)。并且，将由此质粒获得的纯化酶样品称作IE353-I58H。

另外，成功地获得了编码序列号1所示的氨基酸序列的第58号的碱基序列(att)被置换成编码精氨酸(R)的碱基序列(cgc)的质粒(pIE353-I58R)。并且，将由此质粒获得的纯化酶样品称作IE353-I58R。

另外，成功地获得了编码序列号1所示的氨基酸序列的第58号的碱基序列(att)被置换成编码天冬氨酸(D)的碱基序列(gac)的质粒(pIE353-I58D)。并且，将由此质粒获得的纯化酶样品称作IE353-I58D。

另外，成功地获得了编码序列号1所示的氨基酸序列的第58号的碱基序列(att)被置换成编码谷氨酸(E)的碱基序列(gaa)的质粒(pIE353-I58E)。并且，将由此质粒获得的纯化酶样品称作IE353-I58E。

另外，成功地获得了编码序列号1所示的氨基酸序列的第58号的碱基序列(att)被置换成编码色氨酸(W)的碱基序列(tgg)的质粒(pIE353-I58W)。并且，将由此质粒获得的纯化酶样品称作IE353-I58W。

另外，成功地获得了编码序列号1所示的氨基酸序列的第58号的碱基序列(att)被置换成编码脯氨酸(P)的碱基序列(ccc)的质粒(pIE353-I58P)。并且，将由此质粒获得的纯化酶样品称作IE353-I58P。

另外，成功地获得了编码序列号1所示的氨基酸序列的第58号的碱基序列(att)被置换成编码甘氨酸(G)的碱基序列(gtt)的质粒(pIE353-I58G)。并且，将由此质粒获得的纯化酶样品称作IE353-I58G。

使用所取得的各质粒使BL21 CodonPlus(DE3)-RIL转化后，分别挑选出表现氨比西林耐性的转化体。

通过与所述IE353的情况同样地培养各转化体，并对所得的粗酶液进行纯化，而获得各纯化酶样品(IE353-I58T、IE353-I58A、IE353-I58V、IE353-I58L、IE353-I58G、IE353-I58M、IE353-I58F、IE353-I58S、IE353-I58Q、IE353-I58C、IE353-I58Y、IE353-I58N、IE353-I58K、IE353-I58H、IE353-I58R、IE353-I58D、IE353-I58E、IE353-I58W、IE353-I58P)。利用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析各纯化酶样品，确认了各纯化酶样品为单一的蛋白质。

<10.实施例5：果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶变异蛋白质的特性评价>

首先，根据所述活性测定方法测定野生型果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶(IE353)和19种纯化酶样品(IE353-I58T、IE353-I58A、IE353-I58V、IE353-I58L、IE353-I58G、IE353-I58M、IE353-I58F、IE353-I58S、IE353-I58Q、IE353-I58C、IE353-I58Y、IE353-I58N、IE353-I58K、IE353-I58H、IE353-I58R、IE353-I58D、IE353-I58E、IE353-I58W、IE353-I58P)的酶活性。

所述纯化酶样品中具有果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶活性的纯化酶样品是IE353、IE353-I58T、IE353-I58M、IE353-I58S、IE353-I58V、IE353-I58A、IE353-I58N和IE353-I58L。

对于这些纯化酶样品，根据所述底物特异性评价方法和热稳定性评价方法进一步评价底物特异性和热稳定性。将其结果示于表3中。

(表3)

关于热稳定性(％)，基于将野生型设为1.00的比值来进行评价，将数值上升到高于1.00的纯化酶样品评价为“热稳定性提高”。由此可以更加客观地评价热稳定性。

如表3所示，可知将序列号1所示的氨基酸序列的第58号异亮氨酸置换成其它氨基酸(T、M、S、V、A，N、或L)的变异蛋白质与野生型果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶蛋白质相比，F-K/F-VH、F-V/F-VH降低，亦即底物特异性提高。而且可知，将第58号异亮氨酸置换成蛋氨酸(M)、丙氨酸(A)或丝氨酸(S)的变异蛋白质与野生型的蛋白质相比，热稳定性也提高。

<11.实施例6：进一步含有其它氨基酸置换的果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶变异蛋白质(二重变异蛋白质)和此变异蛋白质的特性评价>

研究在除了置换序列号1所示的氨基酸序列的第58号异亮氨酸以外，也置换其它氨基酸的情况下，此变异蛋白质的特性是如何变化的。

首先，制作序列号1所示的氨基酸序列的第282号苯丙氨酸被置换成酪氨酸的变异蛋白质的表达质粒。以下说明此表达质粒的制作方法。

为了将序列号1所示的氨基酸序列的第282号苯丙氨酸置换成酪氨酸，而合成引物Y1和引物Y2。

·引物Y1：5’-tatacgcgcttcaagatgcatcaaccctttggcg-3’(序列号7)

·引物Y2：5’-gccaggaaactcgtcgcagactttgatcacg-3’(序列号8)

使用所述pIE353、引物Y1、引物Y2和KOD-Plus定点突变试剂盒(东洋纺织制造)，制作所述第282号苯丙氨酸被置换成酪氨酸的重组质粒。更详细来说，成功地获得了编码序列号1所示的氨基酸序列的第282号苯丙氨酸的碱基序列(ttc)被置换成编码酪氨酸(Y)的碱基序列(tat)的重组质粒(pIE353-F282Y)。另外，如后述表4所示，由pIE353-F282Y获得的纯化酶样品(IE353-F282Y)与野生型的果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶相比，热稳定性提高。

使用所述pIE353-F282Y、引物R1、引物R2和KOD-Plus定点突变试剂盒(东洋纺织制造)，制作除了将作为第282号氨基酸的苯丙氨酸置换成酪氨酸以外，还将第58号异亮氨酸置换成其它氨基酸的变异蛋白质的表达质粒。另外，因为此表达质粒的制作方法与仅置换第58号异亮氨酸时基本相同，所以这里省略其详细说明。

使用如上制作的表达质粒，利用与表3所示的纯化酶样品相同的方法取得各纯化酶样品，评价了这些纯化酶样品的底物特异性和热稳定性。将其结果示于表4中。

(表4)

由表4的结果可知，对于IE353-F282Y进一步将序列号1所示的氨基酸序列的第58号异亮氨酸置换成其它氨基酸的变异蛋白质与修饰前的果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶蛋白质(IE353-F282Y)相比，F-K/F-VH、F-V/F-VH也降低，亦即底物特异性也提高。

另外，关于热稳定性，获得大量得到优选特性的所述蛋白质。例如，尤其是在进行置换的氨基酸为M、A的情况下，与野生型相比热稳定性大幅度提高。

<12.实施例7：进一步含有其它氨基酸置换的果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶变异蛋白质(三重变异蛋白质)和此变异蛋白质的特性评价>

研究在除了置换序列号1所示的氨基酸序列中的第58号异亮氨酸和第282号苯丙氨酸以外，也置换了其它氨基酸的情况下，此变异蛋白质的特性是如何变化的。

首先，制作将序列号1所示的氨基酸序列的第282号苯丙氨酸置换成酪氨酸，并且将第110号甘氨酸置换成谷氨酰胺的变异蛋白质的表达质粒。以下说明此表达质粒的制作方法。

为了将序列号1所示的氨基酸序列的第282号苯丙氨酸置换成酪氨酸，而合成了引物Q1和引物Q2。

·引物Q1：5’-taccaagctctcgtggacgcgggcttggat-3’(序列号9)

·引物Q2：5’-cagtaccaagctctcgtggacgcgggctt-3’(序列号10)

使用所述pIE353-F282Y、引物Y1、引物Y2和KOD-Plus定点突变试剂盒(东洋纺织制造)，制作所述第282号苯丙氨酸被置换成酪氨酸，并且第110号甘氨酸被置换成谷氨酰胺的重组质粒。更详细来说，成功地获得了编码序列号1所示的氨基酸序列的第282号苯丙氨酸的碱基序列(ttc)被置换成编码酪氨酸(Y)的碱基序列(tat)，并且编码序列号1所示的氨基酸序列的第110号甘氨酸的碱基序列(gga)被置换成谷氨酰胺(Q)的碱基序列(cag)的重组质粒(pIE353-G110Q+F282Y)。

使用所述pIE353-G110Q+F282Y、引物R1、引物R2和KOD-Plus定点突变试剂盒(东洋纺织制造)，制作除了将作为第282号氨基酸的苯丙氨酸置换成酪氨酸且将作为第110号氨基酸的甘氨酸置换成谷氨酰胺以外，还将第58号异亮氨酸置换成其它氨基酸的变异蛋白质的表达质粒。另外，因为此表达质粒的制作方法与仅置换第58号异亮氨酸时基本相同，所以这里省略其详细说明。

使用如上制作的表达质粒，利用与表3所示的纯化酶样品相同的方法取得各纯化酶样品，评价这些纯化酶样品的底物特异性和热稳定性。将其结果示于表5。

(表5)

由表5的结果可知，对于IE353-G110Q+F282Y进一步将序列号1所示的氨基酸序列的第58号异亮氨酸置换成其它氨基酸的变异蛋白质，与修饰前的果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶蛋白质(IE353-F282Y)相比，F-K/F-VH、F-V/F-VH也降低，亦即底物特异性也提高。

另外，可知在进行置换的氨基酸为M、A、S的情况下，热稳定性也提高。因此，可知关于对序列号1所示的氨基酸序列进一步导入其他变异所得的果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶修饰产物，通过将第58号异亮氨酸置换成其它氨基酸，而提高了底物特异性。

<13.参考例1：进一步含有其它氨基酸置换的果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶变异蛋白质(三重变异蛋白质)和此变异蛋白质的特性评价>

在所述实施例10中是将第110号甘氨酸置换成谷氨酰胺，验证在置换成其它氨基酸的情况下是否也有同样的效果。更具体来说，对于IE353-I58T+F282Y，进一步将第110号甘氨酸置换成其它氨基酸，并调查了这些纯化酶样品的底物特异性。

首先，制作序列号1所示的氨基酸序列的第282号苯丙氨酸被置换成酪氨酸，并且第58号异亮氨酸被置换成苏氨酸的变异蛋白质的表达质粒。以下说明此表达质粒的制作方法。

为了将序列号1所示的氨基酸序列的第110号甘氨酸随机地置换成其它氨基酸，而合成引物R3和引物R4。

·引物R3：5’-snnagacttcaggtctgcaatgtctttttc-3’(序列号11)

·引物R4：5’-taccaagctctcgtggacgcgggcttggat-3’(序列号12)

使用实施例9中取得的表达质粒pIE353-I58T+G110Q+F282Y、引物R3、引物R4和KOD-Plus定点突变试剂盒，制作进一步对第110号甘氨酸导入变异的重组质粒。

使用此重组质粒使BL21 CodonPlus(DE3)-RIL转化后，挑取100个表现出氨比西林耐性的菌落。确认导入到100个菌落中的100个重组质粒的碱基序列，结果成功地获得了序列号1所示的氨基酸序列的第110号甘氨酸被置换成19种氨基酸(也包括野生型)中的各种氨基酸的质粒。

具体来说，成功地获得了编码序列号1所示的氨基酸序列的第110号的碱基序列(gga)被置换成编码丙氨酸(A)的碱基序列(gcg)的质粒(pIE353-I58T+G110A+F282Y)。并且，将由此质粒获得的纯化酶样品称作IE353-I58T+G110A+F282Y。

另外，成功地获得了编码序列号1所示的氨基酸序列的第110号的碱基序列(gga)被置换成编码缬氨酸(V)的碱基序列(gtg)的质粒(pIE353-I58T+G110V+F282Y)。并且，将由此质粒获得的纯化酶样品称作IE353-I58T+G110V+F282Y。

另外，成功地获得了编码序列号1所示的氨基酸序列的第110号的碱基序列(gga)被置换成编亮氨酸(L)的碱基序列(ctg)的质粒(pIE353-I58T+G110L+F282Y)。并且，将由此质粒获得的纯化酶样品称作IE353-I58T+G110L+F282Y。

另外，成功地获得了编码序列号1所示的氨基酸序列的第110号的碱基序列(gga)被置换成编蛋氨酸(M)的碱基序列(atg)的质粒(pIE353-I58T+G110M+F282Y)。并且，将由此质粒获得的纯化酶样品称作IE353-I58T+G110M+F282Y。

另外，成功地获得了编码序列号1所示的氨基酸序列的第110号的碱基序列(gga)被置换成编苯丙氨酸(F)的碱基序列(ttc)的质粒(pIE353-I58T+G110F+F282Y)。并且，将由此质粒获得的纯化酶样品称作IE353-I58T+G110F+F282Y。

另外，成功地获得了编码序列号1所示的氨基酸序列的第110号的碱基序列(gga)被置换成编丝氨酸(S)的碱基序列(tcc)的质粒(pIE353-I58T+G110S+F282Y)。并且，将由此质粒获得的纯化酶样品称作IE353-I58T+G110S+F282Y。

另外，成功地获得了编码序列号1所示的氨基酸序列的第110号的碱基序列(gga)被置换成编苏氨酸(T)的碱基序列(acg)的质粒(pIE353-I58T+G110T+F282Y)。并且，将由此质粒获得的纯化酶样品称作IE353-I58T+G110T+F282Y。

另外，成功地获得了编码序列号1所示的氨基酸序列的第110号的碱基序列(gga)被置换成编半胱氨酸(C)的碱基序列(tgt)的质粒(pIE353-I58T+G110C+F282Y)。并且，将由此质粒获得的纯化酶样品称作IE353-I58T+G110C+F282Y。

另外，成功地获得了编码序列号1所示的氨基酸序列的第110号的碱基序列(gga)被置换成编酪氨酸(Y)的碱基序列(tac)的质粒(pIE353-I58T+G110Y+F282Y)。并且，将由此质粒获得的纯化酶样品称作IE353-I58T+G110Y+F282Y。

另外，成功地获得了编码序列号1所示的氨基酸序列的第110号的碱基序列(gga)被置换成编天冬酰胺(N)的碱基序列(aac)的质粒(pIE353-I58T+G110N+F282Y)。并且，将由此质粒获得的纯化酶样品称作IE353-I58T+G110N+F282Y。

另外，成功地获得了编码序列号1所示的氨基酸序列的第110号的碱基序列(gga)被置换成编赖氨酸(K)的碱基序列(aag)的质粒(pIE353-I58T+G110K+F282Y)。并且，将由此质粒获得的纯化酶样品称作IE353-I58T+G110K+F282Y。

另外，成功地获得了编码序列号1所示的氨基酸序列的第110号的碱基序列(gga)被置换成编组氨酸(H)的碱基序列(cac)的质粒(pIE353-I58T+G110H+F282Y)。并且，将由此质粒获得的纯化酶样品称作IE353-I58T+G110H+F282Y。

另外，成功地获得了编码序列号1所示的氨基酸序列的第110号的碱基序列(gga)被置换成编精氨酸(R)的碱基序列(agg)的质粒(pIE353-I58T+G110R+F282Y)。并且，将由此质粒获得的纯化酶样品称作IE353-I58T+G110R+F282Y。

另外，成功地获得了编码序列号1所示的氨基酸序列的第110号的碱基序列(gga)被置换成编天冬氨酸(D)的碱基序列(gac)的质粒(pIE353-I58T+G110D+F282Y)。并且，将由此质粒获得的纯化酶样品称作IE353-I58T+G110D+F282Y。

另外，成功地获得了编码序列号1所示的氨基酸序列的第110号的碱基序列(gga)被置换成编谷氨酸(E)的碱基序列(gag)的质粒(pIE353-I58T+G110E+F282Y)。并且，将由此质粒获得的纯化酶样品称作IE353-I58T+G110E+F282Y。

另外，成功地获得了编码序列号1所示的氨基酸序列的第110号的碱基序列(gga)被置换成编色氨酸(W)的碱基序列(tgg)的质粒(pIE353-I58T+G110W+F282Y)。并且，将由此质粒获得的纯化酶样品称作IE353-I58T+G110W+F282Y。

另外，成功地获得了编码序列号1所示的氨基酸序列的第110号的碱基序列(gga)被置换成编脯氨酸(P)的碱基序列(ccc)的质粒(pIE353-I58T+G110P+F282Y)。并且，将由此质粒获得的纯化酶样品称作IE353-I58T+G110P+F282Y。

另外，成功地获得了编码序列号1所示的氨基酸序列的第110号的碱基序列(gga)被置换成编异亮氨酸(I)的碱基序列(att)的质粒(pIE353-I58T+G110I+F282Y)。并且，将由此质粒获得的纯化酶样品称作IE353-I58T+G110I+F282Y。

所述纯化酶样品中具有果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶活性的纯化酶样品为IE353-I58T+G110Q+F282Y、IE353-I58T+G110V+F282Y、IE353-I58T+G110L+F282Y、IE353-I58T+G110I+F282Y、IE353-I58T+G110M+F282Y、IE353-I58T+G110F+F282Y、IE353-I58T+G110S+F282Y、IE353-I58T+G110T+F282Y、IE353-I58T+G110Y+F282Y、IE353-I58T+G110N+F282Y、IE353-I58T+G110H+F282Y、IE353-I58T+G110R+F282Y、IE353-I58T+G110E+F282Y、IE353-I58T+G110K+F282Y和IE353-I58T+G110D+F282Y。对这些纯化酶样品评价了底物特异性。将其结果示于表6。

(表6)

G110X(-I58T+F282Y)	F-V/F-VH
		Q	0.7
V	0.5
		L	0.5
I	0.5
		M	0.5
F	0.4
		S	0.6
T	0.5
		Y	0.4
N	0.6
		H	0.4
R	0.6
		E	0.4
K	0.4
		D	0.5

由表6的结果可知，对于IE353-I58T+F282Y进一步将序列号1所示的氨基酸序列的第110号甘氨酸置换成其它氨基酸的变异蛋白质与IE353-I58T+G110Q+F282Y同样，F-V/F-VH降低，亦即底物特异性得到了提高。

<14.活性测定方法>

以下表示以下的实施例8～10中的FAOD的活性测定方法。

FAOD对各底物的酶活性是通过测定由过氧化物酶反应所产生的色素的吸光度增加来求得的，此过氧化物酶反应使用了由酶反应生成的过氧化氢。

首先，将3mL活性测定试剂于37℃加热5分钟后，向此活性测定试剂中添加0.1mL预先用酶稀释液(含有0.1％TritonX100的50mM磷酸钾缓冲液(pH值6.5))加以稀释的酶溶液，并开始反应。

使其于37℃反应5分钟后，测定单位时间的500nm的吸光度变化(ΔOD_实验/min)。在盲测的情况下，是使用0.1mL酶稀释液代替酶溶液，进行同样的操作来测定了吸光度变化(ΔOD_空白/min)。

根据下述算式，由所获得的吸光度变化计算酶活性。另外，将在所述条件下于1分钟内使1微摩尔的底物氧化的酶量规定为1单位(U)。

(算式)

另外，于所述算式中，“3.1mL”表示总液量，“13”表示毫摩尔吸光系数，“1.0cm”表示比色皿的光径长度，“0.1mL”表示酶样本液量。

<15.比活性的计算方法>

以下的实施例8～10中的比活性是根据纯化酶样品的活性值(U/mL)和280nm下的吸光度(A280)，利用以下算式进行计算的。

(算式)

比活性(U/A280)＝活性值(U/mL)/A280(Abs)

另外判定，比活性的值越高，则越优选。

<16.Km评价方法>

以下说明以下的实施例8～10中的Km评价方法。

制备将作为底物的果糖基缬氨酰基组氨酸的浓度调整成1.75mM或0.35mM的活性测定试剂。

根据所述活性测定法，求出了使用各活性测定试剂时的纯化酶样品的活性值。其次，基于下述算式进行了Km评价。

(算式)

Km评价＝底物浓度1.75mM下的活性值(U/mL)/底物浓度0.35mM下的活性值(U/mL)

另外判定，由于此算式所定义的Km评价的值越大，则Km值(米氏(Michaelis)常数)越小(换言之，底物和酶的亲和性提高)，所以优选。

<17.底物特异性评价方法>

以下说明以下的实施例8～10中的FAOD的底物特异性评价方法。

以各底物(F-K：果糖基赖氨酸、F-V：果糖基缬氨酸、F-VH：果糖基缬氨酰基组氨酸)的浓度达到2mM的方式制备活性测定试剂，根据所述活性测定法计算出活性值，根据下述算式计算出活性值比(底物特异性)。即，

(F-V/F-VH)＝(以F-V作为底物时的活性值)/(以F-VH作为底物时的活性值)

(F-K/F-VH)＝(以F-K作为底物时的活性值)/(以F-VH作为底物时的活性值)

另外判定，此算式所定义的活性值比的值越小，则对F-VH的特异性越优异，越优选。

<18.热稳定性评价方法>

以下说明以下的实施例8～10中的FAOD的热稳定性评价方法。

将纯化酶样品溶解到50mM磷酸钾缓冲液(pH值6.5)中，并使其浓度达到0.1mg/mL，于50℃实施10分钟加热处理。并且，根据以下算式了计算纯化酶样品的热稳定性(％)。即，

另外判定，此算式所定义的热稳定性的值越高，则热稳定性越优异，越优选。

<19.实施例8：果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶基因、蛋白质的修饰>

·引物R3：5’-snnagacttcaggtctgcaatgtctttttc-3’(序列号11)

·引物R4：5’-taccaagctctcgtggacgcgggcttggat-3’(序列号12)

使用所述pIE353、引物R3、引物R4和KOD-Plus定点突变试剂盒(东洋纺织制造)，制作对所述第110号甘氨酸导入变异的重组质粒。使用此重组质粒使BL21 CodonPlus(DE3)-RIL转化后，挑取100个表现出氨比西林耐性的菌落。确认导入到100个菌落中的100个重组质粒的碱基序列，结果成功地获得了序列号1所示的氨基酸序列的第110号甘氨酸被置换成19种氨基酸(野生型的甘氨酸除外)中的各种氨基酸的质粒。

具体来说，成功地获得了编码序列号1所示的氨基酸序列的第110号甘氨酸的碱基序列(gga)被置换成编码苏氨酸(T)的碱基序列(acg)的质粒(pIE353-G110T)。并且，将由此质粒获得的纯化酶样品称作IE353-G110T。

另外，成功地获得了编码序列号1所示的氨基酸序列的第110号甘氨酸的碱基序列(gga)被置换成编码丙氨酸(A)的碱基序列(gcg)的质粒(pIE353-G110A)。并且，将由此质粒获得的纯化酶样品称作IE353-G110A。

另外，成功地获得了编码序列号1所示的氨基酸序列的第110号甘氨酸的碱基序列(gga)被置换成编码缬氨酸(V)的碱基序列(gtg)的质粒(pIE353-G110V)。并且，将由此质粒获得的纯化酶样品称作IE353-G110V。

另外，成功地获得了编码序列号1所示的氨基酸序列的第110号甘氨酸的碱基序列(gga)被置换成编码亮氨酸(L)的碱基序列(ctg)的质粒(pIE353-G110L)。并且，将由此质粒获得的纯化酶样品称作IE353-G110L。

另外，成功地获得了编码序列号1所示的氨基酸序列的第110号甘氨酸的碱基序列(gga)被置换成编码异亮氨酸(I)的碱基序列(att)的质粒(pIE353-G110I)。并且，将由此质粒获得的纯化酶样品称作IE353-G110I。

另外，成功地获得了编码序列号1所示的氨基酸序列的第110号甘氨酸的碱基序列(gga)被置换成编码蛋氨酸(M)的碱基序列(atg)的质粒(pIE353-G110M)。并且，将由此质粒获得的纯化酶样品称作IE353-G110M。

另外，成功地获得了编码序列号1所示的氨基酸序列的第110号甘氨酸的碱基序列(gga)被置换成编码苯丙氨酸(F)的碱基序列(ttc)的质粒(pIE353-G110F)。并且，将由此质粒获得的纯化酶样品称作IE353-G110F。

另外，成功地获得了编码序列号1所示的氨基酸序列的第110号甘氨酸的碱基序列(gga)被置换成编码丝氨酸(S)的碱基序列(tcc)的质粒(pIE353-G110S)。并且，将由此质粒获得的纯化酶样品称作IE353-G110S。

另外，成功地获得了编码序列号1所示的氨基酸序列的第110号甘氨酸的碱基序列(gga)被置换成编码谷氨酰胺(Q)的碱基序列(cag)的质粒(pIE353-G110Q)。并且，将由此质粒获得的纯化酶样品称作IE353-G110Q。

另外，成功地获得了编码序列号1所示的氨基酸序列的第110号甘氨酸的碱基序列(gga)被置换成编码半胱氨酸(C)的碱基序列(tgt)的质粒(pIE353-G110C)。并且，将由此质粒获得的纯化酶样品称作IE353-G110C。

另外，成功地获得了编码序列号1所示的氨基酸序列的第110号甘氨酸的碱基序列(gga)被置换成编码酪氨酸(Y)的碱基序列(tac)的质粒(pIE353-G110Y)。并且，将由此质粒获得的纯化酶样品称作IE353-G110Y。

另外，成功地获得了编码序列号1所示的氨基酸序列的第110号甘氨酸的碱基序列(gga)被置换成编码天冬酰胺(N)的碱基序列(aac)的质粒(pIE353-G110N)。并且，将由此质粒获得的纯化酶样品称作IE353-G110N。

另外，成功地获得了编码序列号1所示的氨基酸序列的第110号甘氨酸的碱基序列(gga)被置换成编码赖氨酸(K)的碱基序列(aag)的质粒(pIE353-G110K)。并且，将由此质粒获得的纯化酶样品称作IE353-G110K。

另外，成功地获得了编码序列号1所示的氨基酸序列的第110号甘氨酸的碱基序列(gga)被置换成编码组氨酸(H)的碱基序列(cac)的质粒(pIE353-G110H)。并且，将由此质粒获得的纯化酶样品称作IE353-G110H。

另外，成功地获得了编码序列号1所示的氨基酸序列的第110号甘氨酸的碱基序列(gga)被置换成编码精氨酸(R)的碱基序列(agg)的质粒(pIE353-G110R)。并且，将由此质粒获得的纯化酶样品称作IE353-G110R。

另外，成功地获得了编码序列号1所示的氨基酸序列的第110号甘氨酸的碱基序列(gga)被置换成编码天冬氨酸(D)的碱基序列(gac)的质粒(pIE353-G110D)。并且，将由此质粒获得的纯化酶样品称作IE353-G110D。

另外，成功地获得了编码序列号1所示的氨基酸序列的第110号甘氨酸的碱基序列(gga)被置换成编码谷氨酸(E)的碱基序列(gag)的质粒(pIE353-G110E)。并且，将由此质粒获得的纯化酶样品称作IE353-G110E。

另外，成功地获得了编码序列号1所示的氨基酸序列的第110号甘氨酸的碱基序列(gga)被置换成编码色氨酸(W)的碱基序列(tgg)的质粒(pIE353-G110W)。并且，将由此质粒获得的纯化酶样品称作IE353-G110W。

另外，成功地获得了编码序列号1所示的氨基酸序列的第110号甘氨酸的碱基序列(gga)被置换成编码脯氨酸(P)的碱基序列(ccc)的质粒(pIE353-G110P)。并且，将由此质粒获得的纯化酶样品称作IE353-G110P。

使用所获得的各质粒使BL21 CodonPlus(DE3)-RIL转化后，分别挑选出表现出氨比西林耐性的转化体。

通过与所述IE353的情况同样地培养各转化体，并对所得粗酶液进行纯化，而获得各纯化酶样品(IE353-G110Q、IE353-G110A、IE353-G110V、IE353-G110L、IE353-G110I、IE353-G110M、IE353-G110F、IE353-G110S、IE353-G110T、IE353-G110C、IE353-G110Y、IE353-G110N、IE353-G110K、IE353-G110H、IE353-G110R、IE353-G110D、IE353-G110E、IE353-G110W、IE353-G110P)。

利用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析各纯化酶样品，确认了各纯化酶样品是单一的蛋白质。

<20.实施例9：果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶变异蛋白质的特性评价>

首先，根据所述活性测定方法(底物是使用果糖基缬氨酰基组氨酸)测定野生型果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶(IE353)和19种纯化酶样品(IE353-G110Q、IE353-G110A、IE353-G110V、IE353-G110L、IE353-G110I、IE353-G110M、IE353-G110F、IE353-G110S、IE353-G110T、IE353-G110C、IE353-G110Y、IE353-G110N、IE353-G110K、IE353-G110H、IE353-G110R、IE353-G110D、IE353-G110E、IE353-G110W、IE353-G110P)的酶活性。

由于IE353-G110P没能检测出果糖基缬氨酰基组氨酸活性，所以对于其它纯化酶样品实施关于热稳定性、比活性、Km值和底物特异性的评价。将其结果示于表7。另外，在表7中，“X的氨基酸”表示第110号甘氨酸被置换的氨基酸(换言之，也就是IE353-G110X中的X)。

(表7)

由表7的结果可知，将序列号1所示的氨基酸序列的第110号甘氨酸置换成其它氨基酸的变异体除了IE353-G110W以外，其它与野生型(IE353)相比热稳定性都提高。

另外也可知，关于比活性、Km评价、底物特异性(F-K/F-VH、F-V/F-VH)，也存在具有优选特性的修饰蛋白质。例如，在进行置换的氨基酸是谷氨酸(E)的情况下，比活性约提升2.5倍，底物特异性也提高。因此可知，通过将第110号甘氨酸置换成其它氨基酸，可以获得不仅热稳定性提高，而且其它特性也提高的修饰蛋白质。

<21.实施例10：进一步含有其它氨基酸置换的果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶变异蛋白质(二重变异蛋白质)和此变异蛋白质的特性评价>

研究在除了置换序列号1所示的氨基酸序列的第110号甘氨酸以外，也置换其它氨基酸的情况下，此变异蛋白质的特性是如何变化的。

首先，制作了序列号1所示的氨基酸序列的第282号苯丙氨酸被置换成酪氨酸的变异蛋白质的表达质粒。以下说明此表达质粒的制作方法。

为了将序列号1所示的氨基酸序列的第282号苯丙氨酸置换成酪氨酸，而合成了引物Y1和引物Y2。

·引物Y1：5’-tatacgcgcttcaagatgcatcaaccctttggcg-3’(序列号7)

·引物Y2：5’-gccaggaaactcgtcgcagactttgatcacg-3’(序列号8)

使用所述pIE353、引物Y1、引物Y2和KOD-Plus定点突变试剂盒(东洋纺织制造)，制作所述第282号苯丙氨酸被置换成酪氨酸的重组质粒。更详细来说，成功地获得了编码序列号1所示的氨基酸序列的第282号苯丙氨酸的碱基序列(ttc)被置换成编码酪氨酸(Y)的碱基序列(tat)的重组质粒(pIE353-F282Y)。

利用与所述各种纯化酶样品同样的方法，获得了所需纯化酶样品(IE353-F282Y)。

如下述表8所示，由pIE353-F282Y获得的纯化酶样品(IE353-F282Y)与野生型的果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶(IE353)相比，热稳定性得到了提高。

(表8)

使用所述pIE353-F282Y、引物R3和引物R4和KOD-Plus定点突变试剂盒(东洋纺织制造)，制作除了将作为第282号氨基酸的苯丙氨酸置换成酪氨酸以外，还将第110号甘氨酸置换成其它氨基酸的变异蛋白质的表达质粒。另外，由于此表达质粒的制作方法与仅置换第110号甘氨酸时基本相同，所以这里省略其详细说明。

使用如上制作的表达质粒，利用与表7所示的纯化酶样品相同的方法取得了各纯化酶样品，评价了这些纯化酶样品的特性。另外，因为IE353-G110P+F282Y没能检测出果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶活性，所以针对其它纯化酶样品评价其特性。将其结果示于表9。另外，在表9中，“X的氨基酸”表示第110号甘氨酸被置换的氨基酸(换言之，也就是IE353-G110X+F282Y中的X)。

(表9)

由表9的结果可知，对于IE353-F282Y进一步将第110号甘氨酸置换成其它氨基酸，热稳定性也得到了提高。

另外，关于比活性、Km评价、底物特异性(F-K/F-VH、F-V/F-VH)，也存在获得了优选特性的纯化酶样品。

因此可知，关于对序列号1所示的氨基酸序列中的第110号甘氨酸以外的氨基酸导入变异的纯化酶样品，通过进一步将第110号甘氨酸置换成其它氨基酸，也可使热稳定性提高。

本发明不限定于以上说明的各构成，可以在权利要求书所示的范围内进行各种改变，将不同实施方式或实施例分别揭示的技术方法适当组合而成的实施方式或实施例也包括在本发明的技术范围内。另外，本说明书中记载的文献全部作为参考引用到本文中。

(产业上的可利用性)

通过本发明，能够新创造出并提供对于果糖基缬氨酰基组氨酸的测定较为有用的具有果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶活性的蛋白质。另外，能够提供利用此蛋白质的果糖基缬氨酰基组氨酸等的测定方法、和果糖基缬氨酰基组氨酸等的测定用试剂组合物等。因此，能够对于基于预防医学的临床化验的进一步普及作出贡献。

另外，因为本发明能够提供对于果糖基缬氨酰基组氨酸的测定较为有用的底物特异性和/或热稳定性优异的果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶，所以能够提供利用果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶的测定精度高的果糖基缬氨酰基组氨酸的测定方法和果糖基缬氨酰基组氨酸测定用试剂组合物等。因此，本发明可以广泛利用在以基于预防医学的临床化验领域、诊断医疗领域、制药领域和保健医学领域为代表的生命科学领域的产业中。