JP6155647B2

JP6155647B2 - フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ製剤の製造方法

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Publication number: JP6155647B2
Application number: JP2013002438A
Authority: JP
Inventors: 理恵平尾; 岸本　高英; 高英岸本; 柳谷　周作; 周作柳谷
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 2012-01-13
Filing date: 2013-01-10
Publication date: 2017-07-05
Anticipated expiration: 2033-01-10
Also published as: US20140349327A1; JP2013162784A; US9994827B2; WO2013105588A1

Description

本発明は、フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ（以下ＦＶＨＯとも記載する。）製剤の製造方法、および、当該方法で製造したＦＶＨＯ製剤に関する。本発明は、また、ＦＶＨＯを含有する製剤またはセンサに関する。

ＦＶＨＯは、酸素の存在下でフルクトシルバリルヒスチジンに作用し、グルコノソン、バリルヒスチジンおよび過酸化水素を生成する反応を触媒する。ＦＶＨＯは、従来からヘモグロビンＡ１ｃ測定用試薬の原料酵素としてプロテアーゼと共に使用されている他、本酵素単独で酵素センサにも用いられる。血液中のヘモグロビンＡ１ｃ値は長期血糖コントロールの指標となる。その給源としては、コニオカエタ属、ユーペニシリウム属（特許文献１）、ファエオスフェリア属（特許文献２、非特許文献１）、エメリセラ属（特許文献３）等が知られている。

一般に、試薬やセンサに用いられる原料酵素は、その目的により溶液状態や乾燥状態など種々の製剤形態をとる。例えば、ＦＶＨＯは、ヘモグロビンＡ１ｃ測定用試薬に用いられる場合は、溶液中に存在する形態で保存されることが多い。また、ヘモグロビンＡ１ｃセンサに用いられる場合では、乾燥状態で保存されることが多い。また、試薬やセンサに用いられる酵素は、多くの場合、乾燥状態の製品として流通している。（以下、溶液状態の製剤を溶液製剤または液状試薬とも表す。また、乾燥状態の製剤を乾燥製剤とも表す。）

乾燥状態の製品（乾燥製剤）は、製品が軽く体積が小さいため、保管や輸送といった取り扱いが容易であり、乾燥しているため微生物汚染による腐敗の心配が軽減される。また、酵素の溶解濃度を使用目的に応じて自由に調整でき、溶解するための緩衝液の種類も任意に選定できるため、様々な用途に展開できる。さらに、一般的に乾燥状態である方が、溶液状態であるよりも酵素活性が安定的に長期間保持できる。
一方、溶液状態の製剤（溶液製剤）には、使用時に溶解する必要がないため、操作が煩雑にならず、溶解液の取り違えや汚染の可能性が低減する長所がある。
また、液状試薬では、安定性が悪くとも測定のたびに基準物質を用いてキャリブレーションすれば正しい結果が得られるが、センサではキャリブレーションを行わないため、さらなる保存安定性の向上が必要である。

いずれの使用形態にしても、酵素タンパク質を保護し変性失活を防ぐための安定化剤の添加が不可欠である。酵素製品に添加する安定化剤は、単に製品化時、乾燥による酵素タンパク質の変性失活を防止するだけでなく、保存中や流通過程での活性損失を防止する能力も具備する必要がある。

また、乾燥製剤を製造する場合、酵素を乾燥状態にする手段は様々である。例えば、酵素タンパク質を含む溶液中からアセトンやアルコール等の有機溶媒によって目的酵素を析出させ、これを回収して乾燥粉末とする方法、酵素を含む溶液を噴霧し熱風を当てて乾燥させるスプレードライ法、酵素を含む溶液を凍結させ、減圧して乾燥するフリーズドライ（凍結乾燥）法などがある。
酵素を乾燥させた場合、タンパク質変性による活性の損失や再溶解時の濁質生成等の問題が発生することがある。そのような場合は、酵素タンパク質を保護し変性失活を防ぐための安定化剤が添加されることが多い。

従来、ＦＶＨＯ活性を有する酵素の凍結乾燥製剤を安定化する方法については、エチレンジアミン4酢酸およびグルタミン酸ナトリウム、または、塩化カルシウムおよびトレハロースを該酵素と共存させて凍結乾燥させる技術が知られていた（特許文献４参照）。
また、ＦＶＨＯの溶液製剤を安定化する方法について、エチレンジアミン４酢酸を添加し、さらに硫酸アンモニウム、キシリトール、グリシンより選ばれる１種以上をＦＶＨＯと共存させて凍結乾燥させる技術が知られていた（特許文献５参照）。

特許第４２３１６６８号公報国際公開２０１０／０４１４１９号パンフレット国際公開２０１０／０４１７１５号パンフレット特許４５５７５７１号公報特許第４７９８６００号公報

ＢｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．１０６，３５８−３６６（２０１０）

本発明は、安定性の高いＦＶＨＯ製剤を提供することを目的とする。
さらに、本発明者らは、センサ等への適用という観点から、より好ましい状態で、乾燥状態でＦＶＨＯを使用する方法を提供することを目的に、改めて先行技術においてＦＶＨＯ乾燥製剤に添加されている組成物を検討した。

添加物の吸湿性は、センサ性能の劣化につながる。具体的には、グルタミン酸ナトリウムなどのアミノ酸は、アミノ基やカルボキシル基などの親水基を有し、それらの親水基が水を吸着するため吸湿性があると考えられる。また、塩類についても、塩化カルシウムなどの塩類に潮解性があることが知られている。

例えば、センサ表面上に酵素製剤が凍結乾燥で装着され、測定時に、微量の液体試料と酵素製剤が混合され溶解することにより反応が開始するタイプのセンサは、酵素を含む乾燥製剤が吸湿すると、保持された水分によって測定時の酵素濃度が希釈されたり、製剤が粘土状や飴状になり速やかに溶解されなくなって反応初期における試薬成分の不足をまねいたりする。最近のセンサは、コストダウンのため用いる酵素の量が最小限にとどめられている場合があり、このような場合、わずかな試薬成分の不足が、酵素反応速度のばらつきを招き、それが測定精度の低下に結びつく可能性が考えられる。

本発明者らは、上述のような、ＦＶＨＯの乾燥製剤の吸湿性に関する問題点を新たに見出した。このような問題点は今まで指摘されていなかった。また、ＦＶＨＯの乾燥製剤の吸湿性を改善する方法も今まで知られていなかった。

本発明は、かかる課題を背景になされたものである。すなわち、本発明の目的は、吸湿性の低いＦＶＨＯ乾燥製剤を提供することにある。

本発明者らは鋭意検討した結果、以下に示す手段により、上記課題を解決できることを見出し、本発明に到達した。すなわち、本発明は、以下の構成からなる。
［項１］
Ｂｉｃｉｎｅを共存させる工程を含むことを特徴とするＦＶＨＯ乾燥製剤の製造方法。
［項２］
メリビオースを共存させる工程を含む、項１に記載のＦＶＨＯ乾燥製剤の製造方法。
［項３］
以下の（Ａ）から選ばれるいずれか１つ以上を共存させる工程を含むことを特徴とするＦＶＨＯ製剤の製造方法。
（Ａ）リン酸、カゼインペプトン、Ｄ−グルコサミン塩酸塩、メリビオース、ソルボース、ラクトース、フルクトース、メレジトース、グルコノ−１，５−ラクトン、リビトール、ソルボース
［項４］
Ｂｉｃｉｎｅを含有することを特徴とするＦＶＨＯ乾燥製剤。
［項５］
メリビオースを含有する、項３に記載のＦＶＨＯ乾燥製剤。
［項６］
以下の（Ａ）から選ばれるいずれか１つ以上を含有する、ＦＶＨＯ製剤。
（Ａ）リン酸、カゼインペプトン、Ｄ−グルコサミン塩酸塩、メリビオース、ソルボース、ラクトース、フルクトース、メレジトース、グルコノ−１，５−ラクトン、リビトール、ソルボース
［項７］
項４から６のいずれかに記載のＦＶＨＯ乾燥製剤を含む、ヘモグロビンＡ１ｃ測定試薬。
［項８］
項４から６のいずれかに記載のＦＶＨＯ乾燥製剤を含む、ヘモグロビンＡ１ｃセンサ。
［項９］
項７または項８に記載のヘモグロビンＡ１ｃ測定試薬またはヘモグロビンＡ１ｃセンサを用いる、ヘモグロビンＡ１ｃ測定方法。

本発明により、ＦＶＨＯ製剤の安定性を確保し、長期間の保存においても酵素の失活を防止することができる。
また、本発明により、ＦＶＨＯの乾燥製剤の吸湿性を低下させることができる。

以下、本発明を詳述する。本発明に用いられるＦＶＨＯは、酸素存在下でフルクトシルペプチドに作用し、バリルヒスチジン、グルコノソン、過酸化水素を生成するオキシダーゼであり、この作用を有する酵素であれば、如何なるオキシダーゼも含まれる。本発明に用いられるＦＶＨＯの起源は如何なるものであってもよく、遺伝子組み換え体によって製造されたものでもよい。

本発明において、ＦＶＨＯ製剤とは、上記ＦＶＨＯ含む製剤をいう。典型的には乾燥製剤または溶液製剤（液状試薬）である。

本発明において、ＦＶＨＯ乾燥製剤とは、上記ＦＶＨＯを含む組成物を凍結乾燥や風乾など当業者が通常用いうる乾燥手段を用いて乾燥する工程を経て得られた製剤をいう。乾燥手段は特に限定されないが、例えば、酵素タンパク質を含む溶液中からアセトンやアルコール等の有機溶媒によって目的酵素を析出させ、これを回収して乾燥粉末とする方法、酵素を含む溶液を噴霧し熱風を当てて乾燥させるスプレードライ法、酵素を含む溶液を凍結させ、減圧して乾燥するフリーズドライ（凍結乾燥）法などがある。
凍結乾燥は酵素の失活を極力防止する観点から好ましい。また、風乾の場合は乾燥温度と時間を適宜コントロールすることで酵素の失活を防止することが可能であり好ましい。

（実施形態１）
本発明のＦＶＨＯ製剤の製造方法においては、ＦＶＨＯ製剤の製造にあたり、以下の（Ａ）から選ばれるいずれか１つ以上の試薬を共存させる工程を含むことを特徴とする。
（Ａ）リン酸、カゼインペプトン、Ｄ−グルコサミン塩酸塩、メリビオース、ソルボース、ラクトース、フルクトース、メレジトース、グルコノ−１，５−ラクトン、リビトール、ソルボース
これらは、種々の市販の試薬を用いることができる。

上記（Ａ）で挙げられた試薬の添加目的は、ＦＶＨＯ製剤の安定性を向上させることであるから、その目的を達成し得る範囲で適宜添加量を設定できる。したがって上記（Ａ）で挙げられた試薬の濃度は特に限定されるものではないが、乾燥製剤においては、好ましい下限はＦＶＨＯ：上記（Ａ）に記載の各試薬の重量比で２：１、更に好ましくは１：１である。夾雑物の持込の危険性から、好ましい上限はＦＶＨＯ：（Ａ）の重量比で１：２である。溶液製剤においては、夾雑物の持込の危険性などから、好ましい上限は２００ｍＭ以下、更に好ましくは１００ｍＭ以下、更に好ましくは５０ｍＭ以下、更に好ましくは３０ｍＭ以下、更に好ましくは２０ｍＭ未満である。好ましい下限は安定性向上の観点から１ｍＭ以上、更に好ましくは５ｍＭ以上である。

製剤中の上記（Ａ）で挙げられた試薬の含有量は、溶液製剤の場合はそのまま、乾燥製剤の場合は当該製剤を適当な量の水などの溶液で溶解した溶液に対して、ＨＰＬＣなどの各種クロマトグラフィーや、過塩素酸・キレート試薬などを用いる滴定などの分析を行うことなどにより、高い精度で推定することができる。

本発明のＦＶＨＯ製剤には、上記のほかに必要に応じて任意の成分を含有させることができ、その組成は特に限定されない。
緩衝液としては、組成は特に限定しないが、好ましくはｐＨ４〜９の範囲で緩衝能を有するものであればよく例えばホウ酸、トリス塩酸、リン酸カリウム等の緩衝剤や、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、Ｂｉｃｉｎｅ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ，ＣＨＥＳ、ＥＰＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＰＳＯ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＰＩＰＥＳ、ＰＯＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＴＡＰＳＯ、ＴＥＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅといったグッド緩衝剤が挙げられる。また、フタル酸、マレイン酸、グルタル酸などのような、ジカルボン酸をベースとした緩衝剤も挙げることができる。これらのうち１種のみを適用してもよいし、２種以上を用いてもよい。更には上記以外を含む１種以上の複合組成であってもよい。

また、必要に応じて緩衝液中にＥＤＴＡ等のキレート剤、および、または、界面活性剤を含んでいてもよい。また、これらの添加濃度としては、緩衝能を持つ範囲であれば特に限定されないが、好ましい上限は１００ｍＭ以下、より好ましくは５０ｍＭ以下である。好ましい下限は５ｍＭ以上である。乾燥粉末あるいは凍結乾燥物などの中においては緩衝剤の含有量は、特に限定されるものではないが、好ましくは０．１％（重量比）以上、特に好ましくは０．１〜８０％（重量比）の範囲で使用される。
これらは、種々の市販の試薬を用いることができる。

乾燥製剤を作製する場合、乾燥工程に供する酵素液は、好ましくはタンパク質濃度として５ｇ／Ｌ以上、より好ましくは１０ｇ／Ｌ以上、更に好ましくは２０ｇ／Ｌ以上であるように濃度を調整する。乾燥工程に供する酵素があまりに希薄な場合、乾燥工程で回収率が低下することが多く、得られた乾燥製品が取り扱いにくい形状となることが多い。また、過度に高濃度である場合、乾燥に時間がかかることがある。

本発明の他の実施形態の一つは、上記のＦＶＨＯ製剤を含むヘモグロビンＡ１ｃ測定試薬である。あるいは、該製剤を含むヘモグロビンＡ１ｃセンサである。また、本発明の他の実施形態の一つは、そのようなヘモグロビンＡ１ｃ測定試薬またはヘモグロビンＡ１ｃセンサを用いるヘモグロビンＡ１ｃ測定方法である。
これらは、上記で説明した方法により作製したＦＶＨＯ製剤を、種々の公知の方法で試薬またはセンサに含ませることで製造できる。そして、そのような試薬またはセンサを用いて、公知の方法により、ヘモグロビンＡ１ｃを測定することができる。

本発明でいう安定性の向上とは、ＦＶＨＯを３７℃で１週間保存した後、維持されているＦＶＨＯの残存率（％）が安定化剤を何も添加しない場合に比して増大するか、もしくは少なくとも維持されることを意味する。

具体的に、安定性が向上しているかどうかの判断は、次のように行った。
後述のＦＶＨＯ酵素活性の測定方法に記載の活性測定法において、乾燥化を行った後の乾燥品重量あたりのＦＶＨＯオキシダーゼ活性値（ａ）と、一定温度で一定期間保存した後の乾燥品重量あたりのＦＶＨＯオキシダーゼ活性値（ｂ）を測定し、測定値（ａ）を１００とした場合に対する相対値（（ｂ）／（ａ）×１００）を求めた。この相対値を残存率とした。そして、該化合物の添加の有無を比較して、添加により残存率が増大した場合、安定性が向上したと判断した。

（実施形態２）
本発明のＦＶＨＯ乾燥製剤の製造方法においては、ＦＶＨＯ乾燥製剤の製造にあたり、Ｂｉｃｉｎｅを共存させる工程を含むことを特徴とする。Ｂｉｃｉｎｅはグッド緩衝剤の一つであって生化学分野で広く使用されている代表的な緩衝剤であり、市販品を容易に入手することができる。

Ｂｉｃｉｎｅの添加目的は、ＦＶＨＯ乾燥製剤の吸湿性を抑えることであるから、その目的を達成し得る範囲で適宜添加量を設定できる。したがってＢｉｃｉｎｅの濃度は特に限定されるものではないが、好ましい下限はＦＶＨＯ：Ｂｉｃｉｎｅの重量比で２：１、更に好ましくは１：１である。夾雑物の持込の危険性から、好ましい上限はＦＶＨＯ：Ｂｉｃｉｎｅの重量比で１：２である。

乾燥製剤中のＢｉｃｉｎｅの含有量は、当該製剤を適当な量の水などの溶液で溶解し、過塩素酸滴定や、Ｂｉｃｉｎｅの持つキレート作用を利用した滴定などを行うことなどにより、高い精度で推定することができる。

本発明のＦＶＨＯ乾燥製剤の製造方法においては、ＦＶＨＯ製剤の安定化などの目的で、さらに、ほかの物質を共存させる工程を含んでいてもよい。そのような物質は特に限定されないが、カゼインペプトン、Ｄ−グルコサミン塩酸塩、メリビオース、ソルボース、ラクトース、フルクトース、メレジトース、グルコノ−１，５−ラクトン、リビトール、ソルボース、リビトールなどを例示できる。中でも好ましくはメリビオース、Ｄ−グルコサミン塩酸塩、ソルボースである。さらに好ましくはメリビオースである。これらは、種々の市販の試薬を用いることができる。

これらの化合物は、安定化の目的を達成し得る範囲で適宜添加量を設定できる。したがってこれらの共存させる各化合物の濃度は特に限定されるものではないが、好ましい下限はＦＶＨＯ：各化合物の重量比で２：１である。夾雑物の持込の危険性から、好ましい上限はＦＶＨＯ：各化合物の重量比で４：３である。

本発明のＦＶＨＯ乾燥製剤の製造方法においては、Ｂｉｃｉｎｅとメリビオースとを添加することにより、吸湿性と安定性の両方について良好な性能を有する乾燥製剤を得ることができる。
好ましくは、Ｂｉｃｉｎｅ濃度がＦＶＨＯ：Ｂｉｃｉｎｅの重量比で２：１〜１：２、かつ、メリビオース濃度がＦＶＨＯ：メリビオースの重量比で２：１〜４：３である。更に好ましくは、Ｂｉｃｉｎｅ濃度がＦＶＨＯ：Ｂｉｃｉｎｅの重量比で１：１〜１：２、かつ、メリビオース濃度がＦＶＨＯ：メリビオースの重量比で２：１〜４：３である。

乾燥製剤中の各化合物の含有量は、当該製剤を適当な量の水などの溶液で溶解し、ＨＰＬＣなどの手段により、高い精度で推定することができる。

本発明のＦＶＨＯ乾燥製剤には、上記のほかに必要に応じて任意の成分を含有させることができ、その組成は特に限定されない。
緩衝液としては、上記のＢｉｃｉｎｅの緩衝能を利用してもよいが、ｐＨ４〜９の範囲で緩衝能を有するものを適宜加えてよく、例えばホウ酸、トリス塩酸、リン酸カリウム等の緩衝剤や、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ，ＣＨＥＳ、ＥＰＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＰＳＯ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＰＩＰＥＳ、ＰＯＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＴＡＰＳＯ、ＴＥＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅといったグッド緩衝剤が挙げられる。また、フタル酸、マレイン酸、グルタル酸などのような、ジカルボン酸をベースとした緩衝剤も挙げることができる。これらのうち１種のみを適用してもよいし、２種以上を用いてもよい。更には上記以外を含む１種以上の複合組成であってもよい。

乾燥工程に供する酵素液は、好ましくはタンパク質濃度として５ｇ／Ｌ以上、より好ましくは１０ｇ／Ｌ以上、更に好ましくは２０ｇ／Ｌ以上であるように濃度を調整する。乾燥工程に供する酵素があまりに希薄な場合、乾燥工程で回収率が低下することが多く、得られた乾燥製品が取り扱いにくい形状となることが多い。また、過度に高濃度である場合、乾燥に時間がかかることがある。

本発明の他の実施形態の一つは、Ｂｉｃｉｎｅを含有することを特徴とするＦＶＨＯ乾燥製剤である。該乾燥製剤は、上記のいずれかに記載の方法により製造することができ、たとえば乾燥粉末や凍結乾燥製剤のような形態をとることができる。

本発明の他の実施形態として、上記乾燥製剤にさらにＦＶＨＯ以外の成分を含有させ、ヘモグロビンＡ１ｃ測定試薬としてもよいし、該乾燥製剤を搭載したヘモグロビンＡ１ｃセンサとしてもよい。

さらには、そのようなヘモグロビンＡ１ｃ測定試薬またはヘモグロビンＡ１ｃセンサを用いるヘモグロビンＡ１ｃ測定方法も、本発明の実施形態の１つである。

本発明により、ＦＶＨＯの乾燥製剤の吸湿性を低下させることができる。
本発明でいう吸湿性の低さとは、ＦＶＨＯ凍結乾燥製剤を湿度７０％、２５℃で７時間保存した後、スパチュラ等で粉末を混ぜたときに、粉末が粘土状になったり、スパチュラに吸着してこないことをいう。

以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。表１に実施例において使用した活性測定試薬の組成を示した。なお、実施例において使用した試薬は特記しない限り、ナカライテスク社より購入したものを用いた。

［実施例におけるＦＶＨＯの活性測定条件］
＜測定原理＞
フルクトシルバリルヒスチジン＋Ｏ_２→Ｌ−バリルヒスチジン＋グルコノソン＋Ｈ_２Ｏ_２
２Ｈ_２Ｏ_２＋４−ＡＡ＋フェノール→Ｑｕｉｎｏｎｅｉｍｉｎｅ色素＋４Ｈ_２Ｏ
ＦＶＨＯの触媒する反応により生成した過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）２分子、４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）、およびフェノールが溶液中に共存するペルオキシダーゼの触媒する反応によって酸化縮合し、Ｑｕｉｎｏｎｅｉｍｉｎｅ色素が生じる。この色素の存在は、５００ｎｍにおける分光光度法により測定した。

＜単位の定義＞
１単位は、以下に記載の条件下で１分間にＨ_２Ｏ_２を１マイクロモル生成させるＦＶＨＯの酵素量をいう。

＜方法＞
試薬の調製
Ａ．０．５％（ｗ／ｖ）４−ＡＡ溶液
Ｂ．１．５％（ｗ／ｖ）フェノール溶液
Ｃ．５００Ｕ／ｍＬペルオキシダーゼ（東洋紡績製、製品コード：ＰＥＯ−３０１）溶液
Ｄ．５０ｍＭＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）
Ｅ．１．０ｍｇ／ｍＬフルクトシルバリルヒスチジン水溶液（用時調製）
Ｆ．酵素希釈液：０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）
Ｇ．粉末溶解液：５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）

手順
１．遮光瓶に以下の反応混合物を調製し、氷上で貯蔵した（用時調製）。
０．４ｍＬ１．５％フェノール水溶液（Ａ）
０．６ｍＬ０．５％４−ＡＡ溶液（Ｂ）
０．３ｍＬ５００Ｕ／ｍＬペルオキシダーゼ溶液（Ｃ）
３．７ｍＬ５０ｍＭＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）（Ｄ）
・反応混合物２．５ｍＬと０．５ｍＬ（Ｅ）を試験管に入れ、３７℃で約５分間予備加温した。
・０．１ｍＬの酵素溶液を加え、穏やかに混合した。
・３７℃に維持しながら５００ｎｍでの吸光度（水対照）の増加を２．５分間記録し、１分から２．５分までの１分間当たりのΔＯＤを計算した（ΔＯＤｔｅｓｔ）。
同時に、酵素溶液に代えて酵素希釈液（Ｆ）を加えることを除いては同一の方法を繰り返し、ブランク（ΔＯＤｂｌａｎｋ）を測定した。
アッセイの直前に氷冷した粉末溶解液（Ｇ）で酵素粉末を溶解し、酵素希釈液（Ｆ）で０．５−０．１Ｕ／ｍＬに希釈した。

＜計算＞
活性は以下の式を用いて計算する：
Ｕ／ｍＬ＝｛ΔＯＤ／ｍｉｎ（ΔＯＤｔｅｓｔ−ΔＯＤｂｌａｎｋ）×Ｖｔ×ｄｆ｝／（１３．３×１／２×１．０×Ｖｓ）
Ｕ／ｍｇ＝（Ｕ／ｍＬ）×１／Ｃ
Ｖｔ：総体積（３．１ｍＬ）
Ｖｓ：サンプル体積（０．１ｍＬ）
１３．３：上記測定条件でのＱｕｉｎｏｎｅｉｍｉｎｅ色素のミリモル分子吸光係数（ｃｍ^２／マイクロモル）
１／２：酵素反応で生成したＨ_２Ｏ_２の１分子から形成するＱｕｉｎｏｎｅｉｍｉｎｅ色素は１／２分子であることによる係数
１．０：光路長（ｃｍ）
ｄｆ：希釈係数
Ｃ：溶解時の酵素濃度（ｃｍｇ／ｍＬ）

［実施例１］各種添加剤の検討（１）
＜乾燥製剤の調製＞
まず、５０ｍＭ、ｐＨ６．５のリン酸緩衝液をベースに、ＦＶＯＨおよび各種添加剤を含有する溶液を作製した。
ＦＶＨＯは、東洋紡績製：製品コードＦＰＯ−３０１を使用し、Ａ２８０（２８０ｎｍにおける吸光度）＝４０になるように調整した。
各種添加剤の濃度は酵素濃度（Ａ２８０＝１を１ｍｇ／ｍＬとする）に対する割合で計算した。各種添加剤は酵素濃度の５０％濃度（重量比）で添加した。具体的には、酵素濃度のＡ２８０＝４０なので、終濃度２０ｍｇ／ｍＬになるように各種添加剤を添加した。（この場合、乾燥製剤における酵素量と添加剤量の重量比は２：１となる。）
ＦＶＯＨおよび各種添加剤を添加後、フィルターろ過（ポアサイズ；０．２μｍ）し、これらを正確に２ｍＬずつ、バイアルに分取した。また、コントロールには何も添加剤を加えていないものを用意した。これを凍結真空乾燥（ＦＤＲ）して、水分を完全に蒸発させた後、スパチュラで粉砕して粉末化した。
＜吸湿性試験＞
その後、約１０ｍｇの粉末をスピッツロールに正確に計量して入れ、湿度７０％、２５度、７時間保存した後、スパチュラで混ぜ、以下の基準で判定した。
＋＋；吸湿前と変わらない形状
＋；吸着前と同じではないが、粘土状にならず、スパチュラにも吸着しない
−；粘土状になるまたは、スパチュラに吸着する
＜安定性試験＞
約１０ｍｇの粉末をスピッツロールに正確に計量し、（１）直ちにＦＶＨＯ活性測定（このときの活性値を（ａ）とする。）、（２）３７℃で１週間保存してからＦＶＨＯ活性測定（この時の活性値を（ｂ）とする。）、を行い粉末重量あたりの活性を計算した。活性残存率は、測定値（ａ）を１００％とした場合に対する相対値（（ｂ）／（ａ）×１００）を求め、この相対値を残存率とした。

結果を表２に示す。安定性に関しては、何も添加しないものに比べてカゼインペプトン、Ｄ−グルコサミン塩酸塩、メリビオース、ソルボース、ラクトース、フルクトース、メレジトース、グルコノ−１，５−ラクトン、リビトール、ソルボースを添加すると残存活性率が向上した。中でも、メリビオースが最も残存活性率が高かった。一方、吸湿性試験の結果は、上記のほとんどの添加剤で形状の悪化が見られた。

［実施例２］各種緩衝液の検討
緩衝液組成の変更を検討した。組成および方法は実施例１に準じ、各緩衝液は５０ｍＭ、ｐＨ６．５のものを用いた。その結果、リン酸以外の各緩衝液を用いた場合、リン酸緩衝液に比べて安定性が低下した（表３）。このことは、意外にも、リン酸に安定化効果があったことを示している。

［実施例３］血液試料と混合時に濁質が生じるリン酸濃度の検討
実施例２で安定化効果があることが判明したリン酸緩衝液は、緩衝域も広く、安価で容易に入手できるが、リン酸とカルシウムが共存するとリン酸カルシウムが形成され、濁りが生じることが一般的に知られている。血液中にはカルシウムが含まれるため、粉末にリン酸を含むと、濁りが生じて正しく吸光度が測定できない恐れがある。そこで、リン酸緩衝液とカルシウムとの混合濃度を検討し、濁質が生じるか否かを検証した。
組成および方法は実施例１に準じた。血液中のカルシウム濃度は最大１０ｍｇ／ｄＬであり、これと各濃度のリン酸緩衝液を含む溶液を混合して濁度を測定した。具体的には、（１）２０ｍｇ／ｄＬの塩化カルシウム水溶液と（２）６０、５０、４０、３０、２０、１０ｍＭのリン酸カリウム水溶液ｐＨ６．５を含む溶液を用意した。次に、（１）と（２）をそれぞれ１対１で混合し、濁度（ＯＤ６６０ｎｍ）を測定した。

その結果、リン酸の終濃度２０ｍＭ未満であれば、濁度は検出限界以下であった（表４）。よって、粉末を溶解したときにリン酸緩衝液終濃度が２０ｍＭ未満になるように添加すれば問題ない。ＦＶＨＯを含むヘモグロビンＡ１ｃ測定液状試薬の場合は、実用上、汎用の自動分析機に適用するケース等においては、試料は十倍から数十倍程度に希釈されるため、実質的には、リン酸の添加量が上限２００ｍＭ程度、好ましくは１００ｍＭ程度、さらに好ましくは５０ｍＭ程度であっても問題ない。つまり、液状試薬では通常好ましくないとされているリン酸を用いることによって、本発明のＦＶＨＯ溶液製剤は、意外にも濁りの発生などの問題点がなく、しかも、安定性が向上することがわかった。
なお、センサであれば電流値を直接検出するので、多少の濁り発生は差し支えない。

［実施例４］リン酸緩衝液以外の緩衝液を用いた安定化剤効果の確認
次に、表２で示した安定化剤はリン酸緩衝液と共存して初めて効果があるのか、それとも緩衝液組成を問わず効果があるのかを検証した。方法は実施例２に準じる。使用した緩衝液は実施例２４で残存活性率が最も高かったＢｉｃｉｎｅと最も低かったクエン酸を用いている。
その結果、リン酸緩衝液以外でも同様に実施例２で示した添加剤に安定性向上効果が見られた（表５）。

［実施例５］各種添加剤の検討（２）
次に、実施例２で最も残存活性率の高かったメリビオースを共存させた状態での吸湿後形状を改善するために、メリビオースと組み合わせる添加剤を検討した。
乾燥製剤の作製は実施例１と同様に行った。ＦＶＯＨおよび各種添加剤を含有する溶液の作製において、ＦＶＨＯは、東洋紡績製：製品コードＦＰＯ−３０１を使用し、Ａ２８０（２８０ｎｍにおける吸光度）＝４０になるように調整した。メリビオースの濃度は酵素濃度の重量比５０％（終濃度２０ｍｇ／ｍＬ）および重量比２５％（終濃度１０ｍｇ／ｍＬ）の２水準で添加した。（この場合、乾燥製剤における酵素量と添加剤量の重量比はそれぞれ２：１、４：１となる。）また、その他の各種添加剤の濃度は酵素濃度の５０％（終濃度２０ｍｇ／ｍＬ）とした。（この場合、乾燥製剤における酵素量と添加剤量の重量比は２：１となる。）添加後、実施例１と同様の手順で粉末化を行った。

結果を表６に示す。吸湿性に関しては、メリビオース濃度を低下させ、かつ、Ｌ−オルニチン塩酸塩、Ｂｉｃｉｎｅ、グリシルグリシン、カゼインペプトン、ポリビニルピロリドン２５からなる群のうちいずれかを添加した場合に改善効果が見られ、特にＢｉｃｉｎｅを加えると、良好であった。一方、メリビオース濃度を低下させると安定性の低下が見られた。

［実施例６］メリビオース及びＢｉｃｉｎｅ濃度の至適化
次に、メリビオース濃度、Ｂｉｃｉｎｅ濃度の至適化を行った。
乾燥製剤の作製は実施例１と同様に行った。ＦＶＯＨおよび各種添加剤を含有する溶液の作製において、ＦＶＨＯは、東洋紡績製：製品コードＦＰＯ−３０１を使用し、Ａ２８０（２８０ｎｍにおける吸光度）＝４０になるように調整した。メリビオースの濃度は酵素濃度の重量比７５％（終濃度３０ｍｇ／ｍＬ）、重量比５０％（終濃度２０ｍｇ／ｍＬ）および重量比２５％（終濃度１０ｍｇ／ｍＬ）の３水準で添加した。（この場合、乾燥製剤における酵素量と添加剤量の重量比はそれぞれ４：３、４：２（２：１）および４：１となる。）また、Ｂｉｃｉｎｅの濃度は酵素濃度の重量比２００％（終濃度８０ｍｇ／ｍＬ）、重量比１００％（終濃度４０ｍｇ／ｍＬ）および重量比５０％（終濃度２０ｍｇ／ｍＬ）の３水準とした。（この場合、乾燥製剤における酵素量と添加剤量の重量比は１：２、１：１および２：１となる。）添加後、実施例１と同様の手順で粉末化を行った。

結果を表７に示す。メリビオース濃度、Ｂｉｃｉｎｅ濃度を共に向上させると、安定性も確保したまま、吸湿性も改善されることがわかった。
Ｂｉｃｉｎｅの添加量については、ＦＶＨＯ：Ｂｉｃｉｎｅの重量比で２：１〜１：２の範囲で添加した場合、さらに好ましくは１：１〜１：２の範囲で添加した場合、吸湿性が改善されることが確認できた。
このときメリビオースの添加量を、ＦＶＨＯ：メリビオースの重量比で２：１〜４：３の範囲で添加した場合、良好な安定性を確保できることが確認できた。

本発明により、ＦＶＨＯ製剤の安定性を向上させることができる他、ＦＶＨＯ凍結乾燥製剤の吸湿性を低下させ、安定性を向上させることができる。これらの製剤は、電気化学的な原理に基づいた酵素センサの安定化にも用いることができる。したがって、予防医学に基づく臨床検査の更なる普及に貢献することができる。

Claims

フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ乾燥製剤の製造方法であって、乾燥前のフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼを含む溶液として、Ｂｉｃｉｎｅをフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ：Ｂｉｃｉｎｅの重量比で１：１〜１：２で含み、かつ、メリビオースをフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ：メリビオースの重量比で２：１〜４：３で含む溶液を用い、該溶液を凍結真空乾燥する工程を含む、フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ乾燥製剤の製造方法。