CN112972662B - 一种蛋白酶k的冻干保护剂及制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种蛋白酶K的冻干保护剂及制备方法和应用，其包含β‑丙氨酸0.1‑0.4w/v％、蔗糖0.2‑0.5w/v％、海藻糖0.1‑0.4w/v％、PVP0.05‑0.2w/v％、白蛋白0.05‑0.2w/v％、甘露醇0.1‑0.5w/v％、山梨醇0.04‑0.2w/v％、多糖类0.05‑0.2w/v％、Tween‑800.01‑0.1v/v％、叔丁醇0.5‑1v/v％和余量超纯水，蔗糖与海藻糖、甘露醇与山梨醇的加入质量比为1‑2：1和2‑4：1。含30％左右的本发明的冻干保护剂的蛋白酶K冻干粉的比活性在30U/mg以上，能在4℃下保存2年以上，在37℃热破3个月能维持比活性稳定。

Description

一种蛋白酶K的冻干保护剂及制备方法和应用
技术领域
本发明属于酶的保存技术领域，更具体地，涉及一种蛋白酶K的冻干保护剂及制备方法和应用。
背景技术
蛋白酶K是一种丝氨酸蛋白酶，于1974年首次被发现。蛋白酶K对天然蛋白质有广谱的切割能力，偏好于切割脂肪族氨基酸和芳香族氨基酸，特别是丙氨酸的羧基端肽键。
蛋白酶K在高温(65℃)和宽的pH范围内(7.5-12.0)均有较高的活性，能与变性剂和去污剂(如尿素、SDS、盐酸胍、异硫氰酸胍、Triton和Tween)等兼容，且在一定浓度范围内，这些变性剂和去污剂能使蛋白酶K的活性得以提升；上述特性使蛋白酶K在要求非特异性蛋白降解的生物技术领域中有很好的应用，特别是粗提液中分离核酸(DNA或RNA)应用广泛。在分子诊断中，蛋白酶K作为病毒提取液的组分之一，能降解病毒衣壳蛋白，使核酸提取更安全；还能降解核酸酶，让核酸更稳定。
蛋白酶K在科研和体外诊断领域应用广泛，关于蛋白酶K的重组表达、纯化及冻干工艺的研究有报道；但是，关于其冻干配方研究的目前还没有报道。蛋白酶K的冻干粉一般保存在0-4℃，保存2年甚至以上的时间；而蛋白酶K本身也是一种蛋白，其干粉活性和稳定性受温度、PH值、含水量和保存时间等因素的影响。
蛋白酶K一般有冻干粉和液体两种保存方式，其中，冻干粉有利于蛋白酶K运输，储存时占地面积小，有自身的优势。随着蛋白酶K冻干粉的需求量日益增大，研究开发出一种成本低廉、稳定有效的蛋白酶K冻干配方非常重要。
现有技术中，蛋白酶K冻干粉中蛋白酶K的固含量普遍较低，无法满足高端试剂厂家的需要；此外，由于一般液体蛋白酶K的酶比活性在40U/mg左右，蛋白酶K在冷冻干燥过程中有部分酶活性丧失，如果蛋白酶K固含量低，将很难做到干粉比活性达30U/mg以上。
综上所述，研究开发一种在冻干保护剂添加量少且保护效果优异的蛋白酶K的冻干保护剂，显得尤为重要，是本领域技术人员亟需解决的关键技术问题。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中存在的技术问题，提供一种蛋白酶K的冻干保护剂，在此基础上探讨其制备方法及应用，该冻干保护剂具有添加量少和保护效果优异的优势，实际应用效果优异。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种蛋白酶K的冻干保护剂，包含以下组分：
β-丙氨酸0.1-0.4w/v％，二糖类0.2-1.0w/v％，PVP 0.05-0.2w/v％，白蛋白0.05-0.2w/v％，多元醇0.1-0.8w/v％，多糖类0.05-0.2w/v％，Tween-800.01-0.1v/v％，叔丁醇0.5-1v/v％，其余为超纯水。
具体地，β-丙氨酸与多元醇组合在冻干过程既能起到稳定pH的作用，同时也是良好的填充剂；通过同时加入二糖类和多糖类，可使冻干保护剂的含量占比很低时也能起到保护作用。
在上述技术方案中，所述二糖类为蔗糖和海藻糖的混合物。
优选地，在上述技术方案中，所述蔗糖和所述海藻糖的加入量质量比为1-2：1。
在上述技术方案中，所述多元醇为甘露醇和山梨醇的的混合物。
优选地，在上述技术方案中，所述所述甘露醇和所述山梨醇的加入量质量比为2-4：1。
具体地，在上述技术方案中，所述蛋白酶K的冻干保护剂由以下组分组成：
β-丙氨酸0.1-0.4w/v％，蔗糖0.2-0.5w/v％，海藻糖0.1-0.4w/v％，PVP 0.05-0.2w/v％，白蛋白0.05-0.2w/v％，甘露醇0.1-0.5w/v％，山梨醇0.04-0.2w/v％，多糖类0.05-0.2w/v％，Tween-800.01-0.1v/v％，叔丁醇0.5-1v/v％，其余为超纯水。
进一步地，在上述技术方案中，所述白蛋白为BSA、HSA和OVA中的一种或多种。
进一步地，在上述技术方案中，所述多糖类为糊精、葡聚糖、壳聚糖和2-羟丙基-β-环糊精中的一种或多种。
在本发明的一个优选实施方式中，所述蛋白酶K的冻干保护剂由以下组分组成：
β-丙氨酸0.2w/v％，蔗糖0.3w/v％，海藻糖0.15w/v％，PVP 0.1w/v％，BSA0.1 w/v％，甘露醇0.2w/v％，山梨醇0.05w/v％，糊精0.1w/v％，Tween-800.01v/v％，叔丁醇0.5v/v％，其余为超纯水。
在本发明的另一个优选实施方式中，所述蛋白酶K的冻干保护剂由以下组分组成：
β-丙氨酸0.1w/v％，蔗糖0.25w/v％，海藻糖0.25w/v％，PVP 0.1w/v％，OVA0.2 w/v％，甘露醇0.1w/v％，山梨醇0.05w/v％，壳聚糖0.15w/v％，Tween-800.05v/v％，叔丁醇1v/v％，其余为超纯水。
本发明另一方面还提供了上述蛋白酶K的冻干保护剂的制备方法，包括：
S1、按配比分别称量二糖类、多元醇、Tween-80和叔丁醇，溶于超纯水中，然后在115℃高温下灭菌20min，得到溶液A，其中，所述超纯水的用量为配方量超纯水质量的40-75％；
S2、按配比分别称量β-丙氨酸、PVP、白蛋白和多糖类，溶于余量的超纯水中，然后用孔径0.22um的滤膜过滤，得到溶液B；
S3、将溶液A和溶液B混合均匀，即得；
其中：步骤S1和步骤S2可交换顺序或同时进行。
本发明又一方面还提供了上述蛋白酶K的冻干保护剂在蛋白酶K保存中的应用。
具体地，上述应用具体为，将所述蛋白酶K的冻干保护剂与蛋白酶K液体按体积比为1-1.5：1的比例混合均匀后，进行分装，冷冻干燥。
详细地，在上述技术方案中，所述冷冻干燥的过程具体包括：
S1、冷冻控制：将隔板温度从5℃到-40℃分阶段下降，每阶段下降5-10℃并维持3-55min，共120-200min；
S2、一次干燥：控制真空度和冷阱温度分别为0.4mbar和-75～-65℃，将隔板温度从-30℃到25℃分阶段上升，每阶段上升5-8℃并维持10-120min，共500-720min；
S3、解析干燥：控制真空度和冷阱温度分别为0.05-0.4mbar和-75～-65℃，将隔板温度从30℃到40℃分阶段上升，每阶段上升0.1-5℃并维持60-600min，共660-1200min。
具体地，在上述技术方案中，所述冷冻控制的程序可按下表所示。
Figure BDA0002920113050000041
具体地，在上述技术方案中，所述一次干燥的程序可按下表所示。
Figure BDA0002920113050000051
具体地，在上述技术方案中，所述解析干燥的程序可按下表所示。
Figure BDA0002920113050000052
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明所提供的蛋白酶K的冻干保护剂的组分简单，成本低廉，且保护剂固含量占比少，冻干保护剂冷冻干燥后固含量占比30％左右，在冷冻干燥保护剂低固含量下也能有效起到保护效果；
(2)利用本发明所提供的蛋白酶K的冻干保护剂所制备的蛋白酶K冻干粉外观颜色洁白、质地蓬松、晶体感强；
(3)利用本发明所提供的蛋白酶K的冻干保护剂所制备的蛋白酶K冻干粉比活性大于30U/mg，满足高端试剂厂家的质控标准，其能在4℃保存2年以上，在37℃热破3个月能维持比活性稳定。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。
以下实施例，仅用于说明本发明，但不止用来限制本发明的范围。
基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。
在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品。
在本发明实施例中，若无特殊说明，所用技术手段均为本领域技术人员熟知的常规技术手段。
在本发明实施例中，所用的原料信息如下表所示。
Figure BDA0002920113050000061
Figure BDA0002920113050000071
在本发明实施例中，所用的超纯水为自制18.2Ω超纯水。
实施例1
本发明实施例提供了一种蛋白酶K的冻干保护剂及其制备方法。
(1)原料组分
Figure BDA0002920113050000072
Figure BDA0002920113050000081
(2)制备方法
S1、按配比分别称量蔗糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇、Tween-80和叔丁醇，溶于4L的超纯水中，然后在115℃高温下灭菌20min，得到溶液A；
S2、按配比分别称量β-丙氨酸、PVP、人血清白蛋白(HSA)、糊精和葡聚糖，溶于2.5L的超纯水中，然后用孔径0.22um的滤膜过滤，得到溶液B；
S3、将溶液A和溶液B混合，定容至8.5L，搅拌均匀，即得；
其中：步骤S1和步骤S2可交换顺序或同时进行。
实施例2
本发明实施例提供了一种蛋白酶K的冻干保护剂及其制备方法。
(1)原料组分
Figure BDA0002920113050000082
(2)制备方法
S1、按配比分别称量蔗糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇、Tween-80和叔丁醇，溶于4L的超纯水中，然后在115℃高温下灭菌20min，得到溶液A；
S2、按配比分别称量β-丙氨酸、PVP、牛血清白蛋白(BSA)和糊精，溶于2.5L的超纯水中，然后用孔径0.22um的滤膜过滤，得到溶液B；
S3、将溶液A和溶液B混合，定容至8.5L，搅拌均匀，即得；
其中：步骤S1和步骤S2可交换顺序或同时进行。
实施例3
本发明实施例提供了一种蛋白酶K的冻干保护剂及其制备方法。
(1)原料组分
Figure BDA0002920113050000091
(2)制备方法
S1、按配比分别称量蔗糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇、Tween-80和叔丁醇，溶于4L的超纯水中，然后在115℃高温下灭菌20min，得到溶液A；
S2、按配比分别称量β-丙氨酸、PVP、鸡卵白蛋白(OVA)和壳聚糖，溶于2.5L的超纯水中，然后用孔径0.22um的滤膜过滤，得到溶液B；
S3、将溶液A和溶液B混合，定容至8.5L，搅拌均匀，即得；
其中：步骤S1和步骤S2可交换顺序或同时进行。
实施例4
本发明对比例提供了一种蛋白酶K的冻干保护剂及其制备方法。
(1)原料组分
Figure BDA0002920113050000101
(2)制备方法
S1、按配比分别称量蔗糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇、Tween-80和叔丁醇，溶于4L的超纯水中，然后在115℃高温下灭菌20min，得到溶液A；
S2、按配比分别称量β-丙氨酸、PVP、牛血清白蛋白(BSA)和糊精，溶于2.5L的超纯水中，然后用孔径0.22um的滤膜过滤，得到溶液B；
S3、将溶液A和溶液B混合，定容至8.5L，搅拌均匀，即得；
其中：步骤S1和步骤S2可交换顺序或同时进行。
实施例5
本发明对比例提供了一种蛋白酶K的冻干保护剂及其制备方法。
(1)原料组分
Figure BDA0002920113050000111
(2)制备方法
S1、按配比分别称量蔗糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇、Tween-80和叔丁醇，溶于4L的超纯水中，然后在115℃高温下灭菌20min，得到溶液A；
S2、按配比分别称量β-丙氨酸、PVP、鸡卵白蛋白(OVA)和壳聚糖，溶于2.5L的超纯水中，然后用孔径0.22um的滤膜过滤，得到溶液B；
S3、将溶液A和溶液B混合，定容至8.5L，搅拌均匀，即得；
其中：步骤S1和步骤S2可交换顺序或同时进行。
试验结果
1、蛋白酶K的比活性定量测定：
将实施例1-5所制备的蛋白酶K的冻干保护剂样品与蛋白酶K液体按体积比为1：1的比例混合均匀后，进行分装，冷冻干燥制得蛋白酶K冻干粉1-5。
具体地，冷冻干燥依次包括冷冻控制、一次干燥和解析干燥三步。
详细地，冷冻控制工艺的程序可按下表所示。
Figure BDA0002920113050000121
详细地，一次干燥工艺的程序可按下表所示。
Figure BDA0002920113050000122
Figure BDA0002920113050000131
详细地，解析干燥工艺的程序可按下表所示。
Figure BDA0002920113050000132
将分别制得的蛋白酶K冻干粉1-5与市售蛋白酶K冻干粉对照品A(江苏金普诺安)和市售蛋白酶K冻干粉对照品B(Sigma)分别溶解至20mg/ml，用10mM的醋酸钠+5mM的醋酸钙溶液(pH7.5)稀释至活性为0.05-0.5U/ml备用。
用50mM的磷酸钾配制0.65w/v％酪蛋白底物溶液(pH7.5)，测量酶活性前，将其加热至37℃备用。
试验例1-5分别依次加入5.00ml的0.65w/v％酪蛋白底物溶液和1.00ml的稀释后的蛋白酶K冻干粉1-5的蛋白酶K溶液(活性为0.05-0.5U/ml)；
对照例1-2分别依次加入5.00ml的0.65w/v％酪蛋白底物溶液和1.00ml的稀释后的市售蛋白酶K冻干粉对照品A与B的蛋白酶K溶液(活性为0.05-0.5U/ml)；
空白对照例依次加入5.00ml的0.65w/v％酪蛋白底物溶液和1.00ml的10mM的醋酸钠+5mM的醋酸钙溶液(pH7.5)
试验例1-5、对照例1-2和空白对照例在混合均匀后，在37℃的水浴锅中反应10min后，分别加入5w/v％的TCA溶液终止反应，在加入5w/v％的TCA溶液并混匀后，在37℃的水浴锅中放置30min，最后用0.45μm的微孔滤膜过滤收集滤液。
随后，分别取2.00ml的试验例1-5、对照例1-2和空白对照例的滤液，依次与5.00ml的0.5M的碳酸钠溶液和1.00ml的0.5M的福林酚试剂混匀。
此外，用1.1mM L-酪氨酸(L-Tyrosine)溶液制备标准曲线，反应体系如下：
Figure BDA0002920113050000141
将其混合均匀后，在37℃水浴锅放置30min.反应，取出试管，冷却到室温，随后用0.45μm的滤膜过滤，收集滤液。
用A660波长的分光光度计测量上述样本。绘制标准曲线，计算测试样本的活性、比活性。
标准曲线：
Δ660标准品＝A660标准品-A660标准品空白对照
用Δ660标准品为纵坐标，L-酪氨酸的量(umol)为横坐标绘制标准曲线图，得到的标准曲线为y＝1.5083x-0.0041(R2＝0.9979)。
样品测定：
Δ660测试样本＝A660测试样本-A600空白
利用标准曲线计算出释放的L-酪氨酸的量(umol)。
活性单位定义：在37℃和pH7.5的条件下，每分钟释放1μM酪氨酸所需要的蛋白酶K量定义为1个活性单位。
酶活性(U/ml)＝(释放的L-酪氨酸的量umol)*V(ml)/(A*t*2*N)。
其中：V＝反应终止时的总体积(ml)；
A＝反应时酶试剂体积(ml)；
t＝反应时间；
2＝比色时所用反应液体积；
N＝蛋白酶k稀释倍数百分比。
酶比活性(U/mg)＝酶活性(U/ml)/酶浓度(mg/ml)。
干粉比活性(U/mg)＝酶活性(U/ml)/干粉浓度(mg/ml)。
测试得到的比活性(U/mg)结果如下表所示：
Figure BDA0002920113050000151
从上表的结果看出，本发明制备得到的蛋白酶K冻干粉酶活性与市面上在售的对照品基本一致，但从干粉活性来看，本发明蛋白冻干粉1-3的干粉比活性与市面上的高端试剂厂家认可的A厂家的产品(相当，干粉比活性大于30U/mg，非优选配比制备的蛋白冻干粉4-5与B厂家的产品干粉比活性相当。本发明制备得到的蛋白酶K冻干粉中的冻干粉保护剂固含量为30％左右，与对照品A相当，低于市面上的对照品B，B厂家的蛋白酶K冻干粉保护剂固含量在50％左右。
2、蛋白酶K冻干粉的稳定性测试
将制备得到蛋白酶K冻干粉2放置于37℃、相对湿度50％的恒温恒湿箱中，放置100天，不定期取样测量其比活性，结果如下表所示：
Figure BDA0002920113050000161
从上表可以看出，本发明实施例中所提供的冻干保护剂所制备的蛋白酶K冻干粉在37℃热破3个月能维持干粉比活性稳定。
最后，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种蛋白酶K的冻干保护剂，其特征在于，
由以下组分组成：
β-丙氨酸0.1-0.4w/v％，二糖类0.2-1.0w/v％，PVP 0.05-0.2w/v％，白蛋白0.05-0.2w/v％，多元醇0.1-0.8w/v％，多糖类0.05-0.2w/v％，Tween-80 0.01-0.1v/v％，叔丁醇0.5-1v/v％，其余为超纯水；
其中，所述二糖类为蔗糖和海藻糖的混合物，所述多元醇为甘露醇和山梨醇的混合物，所述白蛋白为BSA、HSA和OVA中的一种或多种，所述多糖类为糊精、葡聚糖、壳聚糖和2-羟丙基-β-环糊精中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的蛋白酶K的冻干保护剂，其特征在于，
所述蔗糖和所述海藻糖的加入量质量比为1-2：1。
3.根据权利要求1所述的蛋白酶K的冻干保护剂，其特征在于，
所述甘露醇和所述山梨醇的加入量质量比为2-4：1。
4.根据权利要求1-3任一项所述的蛋白酶K的冻干保护剂，其特征在于，
由以下组分组成：
β-丙氨酸0.1-0.4w/v％，蔗糖0.2-0.5w/v％，海藻糖0.1-0.4w/v％，PVP 0.05-0.2w/v％，白蛋白0.05-0.2w/v％，甘露醇0.1-0.5w/v％，山梨醇0.04-0.2w/v％，多糖类0.05-0.2w/v％，Tween-80 0.01-0.1v/v％，叔丁醇0.5-1v/v％，其余为超纯水。
5.根据权利要求4所述的蛋白酶K的冻干保护剂，其特征在于，
由以下组分组成：
β-丙氨酸0.2w/v％，蔗糖0.3w/v％，海藻糖0.15w/v％，PVP 0.1w/v％，BSA 0.1w/v％，甘露醇0.2w/v％，山梨醇0.05w/v％，糊精0.1w/v％，Tween-80 0.01v/v％，叔丁醇0.5v/v％，其余为超纯水；
或，β-丙氨酸0.1w/v％，蔗糖0.25w/v％，海藻糖0.25w/v％，PVP 0.1w/v％，OVA 0.2w/v％，甘露醇0.1w/v％，山梨醇0.05w/v％，壳聚糖0.15w/v％，Tween-80 0.05v/v％，叔丁醇1v/v％，其余为超纯水。
6.权利要求1-5任一项所述的蛋白酶K的冻干保护剂的制备方法，其特征在于，
包括：
按配比分别称量二糖类、多元醇、Tween-80和叔丁醇，溶于超纯水中，然后在115℃高温下灭菌20min，得到溶液A，其中，所述超纯水的用量为配方量超纯水质量的40-75％；
按配比分别称量β-丙氨酸、PVP、白蛋白和多糖类，溶于余量的超纯水中，然后用孔径0.22um的滤膜过滤，得到溶液B；
将溶液A和溶液B混合均匀，即得。
7.权利要求1-5任一项所述的蛋白酶K的冻干保护剂在蛋白酶K保存中的应用。
8.根据权利要求7所述的蛋白酶K的冻干保护剂的应用，其特征在于，
将权利要求1-5任一项所述的蛋白酶K的冻干保护剂与蛋白酶K液体按体积比为1-1.5：1的比例混合均匀后，进行分装，冷冻干燥。
9.根据权利要求8所述的蛋白酶K的冻干保护剂的应用，其特征在于，
所述冷冻干燥的过程具体包括：
S1、冷冻控制：将隔板温度从5℃到-40℃分阶段下降，每阶段下降5-10℃并维持3-55min，共120-200min；
S2、一次干燥：控制真空度和冷阱温度分别为0.4mbar和-75～-65℃，将隔板温度从-30℃到25℃分阶段上升，每阶段上升5-8℃并维持10-120min，共500-720min；
S3、解析干燥：控制真空度和冷阱温度分别为0.05-0.4mbar和-75～-65℃，将隔板温度从30℃到40℃分阶段上升，每阶段上升0.1-5℃并维持60-600min，共660-1200min。
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