JPS6027516B2 - 安定化ウレア−ゼ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は活性低下に対して安定化されたゥレアーゼに関
する。

酵素ゥレアーゼは尿素を分解して炭酸及びアンモニアを
形成する。

これは比較的低度に精製された形で市販されている。精
製されてない状態ではウレアーゼは十分に貯蔵安定であ
り、精製された状態では安定性が著しく減少し、既に約
２５〜１００Ｕ／雌の比活性度で安定性は不満足なもの
となる。特に尿素の臨床測定のためには高度に精製され
た酵素が必要となるが、これは従来不十分な安定性のた
めに安定な市販調製物として発売することができなかっ
た。約１００Ｕ／の９の比活性度を有する市販ゥレアー
ゼは冷却室中に半年間貯蔵した場合に既にその活性度を
約５０％失なう。室温で又は熔解した形で貯蔵すると、
なお著しく迅速な活性損失が起きる。精製された酵素の
安定性を緩衝剤母価、イオン濃度及び緩衝剤の種類（マ
レィン酸塩、クエン酸塩、ＥＤＴＡ、リン酸塩）を変え
るかもしくはＳＨ基含有化合物、例えばシスティン及び
メルカプトェタノールの添加によって高めることは既に
実験されている。

これらの実験は全て不成功に終った。たんに２回結晶さ
れたウシの皿嫌アルブミンを用いただけで、精製された
酵素の半価時間をある程度延長することができたが、不
十分であった（Ｋ．Ｒ．Ｌ肌ｎ著，〃Ｂｉｏｃｈｉｍ．
Ｂｉｏｐｈ侭．Ａｃｔａ〃，第１４母萱（１９６７年）
２１６頁参照）。

本発明の目的は、これらの難点を除去し、高度に精製さ
れた形でも市販するのに十分に貯蔵安定である安定化ウ
レアーゼを得ることである。

この目的は、本発明によれば、安定剤としてグルタチオ
ン、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）及びクエ
ン酸塩の混合物を含有することを特徴とする安定化ウレ
アーゼによって達成される。

驚くべきことに、前記した３つの物質の混合物は、この
混合物の個々の成分が安定化作用を発揮しないことが公
知であるにも拘らず、高度に精製されたウレアーゼを著
しく良好に安定化することができる。

殊に本発明による安定化ウレアーゼは、成分ウレァーゼ
、グルタチオン、ＥＤＴＡ及びクエン酸塩を重量比１：
０．５〜５：０．５〜３：０．５〜３で含有する。

この有利な組成範囲の調製物は、殊に約５０〜３００Ｕ
／の９の有利な活性度範囲内ですぐれた安定性を有し、
例えば凍結乾燥し、３３ｑｏで１２週間貯蔵した後も、
凍結乾燥する前の原活性度の１００％を有する。安定剤
なしでは、凍結乾燥する場合に既に３０〜８０％の間の
活性度損失が生じる。すぐれた範囲外の本発明による安
定化ウレアーゼ調製物を用いても、なお著しく良好な安
定化効果を得ることができる。特に、本発明による安定
化酵素調製物は、安定剤混合物を添加する前に精製する
ためにデキストランで処理されたウレアーゼを含有する
。

このデキストラン処理の場合には、酵素の活性をほぼ倍
加することができる。同時に、不安定な不純物はデキス
トラン処理によって除去されるものと思われるので、予
めデキストラン処理を行なったウレアーゼ調製物は、安
定剤混合物の添加後の特に高い安定性によってすぐれて
いる。デキストランでの処理は、単にデキストランを酵
素溶液に導入することによるかもし〈は力ラムクロマト
グラフイ法に従って行なうことができる。殊に有利に、
デキストランとして分子ふるいの特性を有する架橋生成
物が使用される。それというのもこの場合には同時にウ
レアーゼの脱塩が有害な不純物の濃縮及び除去とともに
達成されるからである。架橋されているか又は架橋され
てない適当なデキストラン調製物が市販されている。特
に、本発明による安定化ウレアーゼは、尿素を検出する
際に使用するのに好適である。

多数のアンモニア系が公知であり、これらはウレアーゼ
による触媒反応又はウレアーゼ自体を妨げる成分を含有
しない限り、尿素検出試薬に使用することができる。

このようなアンモニア検出系は、例えばブロムチモール
ブル−のような、アンモニア生成の際に高まるｐＨ価を
変色等によって指示するｐＨ指示薬物質からなることが
できる。このような系は、例えば血液又は血清中の尿素
を検出する試薬紙ないしは試験フィルムに好適である。
本発明による安定化ウレアーゼは安定であるので、それ
は紙、フィルム及び同様の支持体を含浸するためもしく
はこのような支持体上に結合剤と一緒に反応性層をつく
るのに適している。このような支持体又はこのような層
か付加的にｐＨ指示薬を含有する場合には、簡単な変色
によって尿素が測定できる。尿素検出試薬の範囲内の他
のすぐれたアンモニア測定系は、グルタメートデヒドロ
ゲナーゼ（ＧＩＤＨ）、ＮＡＤＨ及び緩衝剤ならびに場
合によりＧＩＤＨ又は／及びＮＡＤＨの安定剤からなる
。

このような安定剤の例は、有機のＳＨ化合物ないしはＡ
ＤＰである。他の好適な検出系はベルスロー（技ｒｍｅ
ｌｏｔ）によるインドフェノール反応に使用される。

該系は、フェノール又はサリチル酸とニトロプルシッド
ソーダ及び次亜塩素酸ナトリウムよりなる。本発明はさ
らに次の例で詳述する：例１ 約１００Ｕ／の９の比活性度を有する市販ウレアーゼを
水に溶解し、架橋デキストランゲル上に添加し、引続き
凍結乾燥した。

次にこの凍結乾燥された調製物を、３３ｏｏで貯蔵する
安定度試験に付した。第２のバッチにおいて前記の試験
を繰り返したが、架橋デキストランで処理された酵素に
グルタチオン、クエン酸塩及びＥＤＴＡを重量比１：１
：１：１で添加した。

次に、第１の試験のように凍結乾燥及び貯蔵を繰り返し
た。安定剤の添加なしの第１の試験においては、凍結乾
燥後の活性度収率は２０％であった。

３３００で６週間貯蔵した後に測定した残留活性度は１
％よりも小さかった。

本発明による安定剤を用いた第２の試験では活性度は凍
結乾燥後は１００％であり、３３ｏＣで６週間貯蔵した
後も相変らず１００％であった。

記載された条件下での貯蔵を３ケ月に続けた場合でも、
凍結乾燥する前の原活性度の１００％が測定された。例
２約１００Ｕ／の９の比活性度を有する市販ウレアーゼ
を水に熔解し、グルタチオン、クエン酸塩及びＥＤＴＡ
を重量比１：１：１：１で添加し、デキストラン処理な
いこ凍結乾燥した。

凍結乾燥物において、原潜性度の１００％が認められた
。次に該凍結乾燥を３３ｑＣで貯蔵した。６週間の貯蔵
後の活性度はなお出発値の９５％であった。

例３ 市販ゥレアーゼから、数回の結晶化及びデキストランで
の処理によって、約１５００Ｕ／の９の比活性度を有す
るウレアーゼを得た。

この得られた調製物に、ＧＳＨ、クエン酸塩及びＥＤＴ
Ａを重量比１：３：３：３で添加した。３３ｑｏで貯蔵
した場合の安定度は比活性度１００Ｕ／の９のウレアー
ゼに相当した。

参考例 血液ないし血清中の尿素を検出するための試験フイルム
成分：ポリビニルアセテートプロピオネ ート懸濁液（Ｐｒｏｐｉｏｆａｎ７皿） ４５．０９ 水中のアルギン酸ナトリウムの１９ ％溶液 １０．０夕スル
ホコハク酸ジオチルナトリウム ０．５夕安定化ウ
レアーゼ（水１０の‘に熔解） １００００Ｕフロム
チモールフルー（メタノ−ル５の‘十水５地に溶解）
０．２５タリン酸水素二ナトリウム（ＧＳ
Ｈ、クエン酸塩及びＥＤＴＡで 安定化１：１：１：１） ０．９タ該成分
を適当に混合し、１ＭＣＩでＰＨ６．０に調節する。

この混合物を２５０一の層厚でＰＶＣシート上に塗布し
、６０ｑｏで６び分間乾燥する。尿素を含む血液ないし
血清を滴加し、９Ｍ酸後に拭きとると次の反応色が得ら
れる：尿素 ２０の９％ 黄色 尿素 ６０の９％ 黄緑色 尿素 １００の９％ 緑色 尿素 ２００の９％ 階緑色 ６０ｑｏで３日間貯蔵した後に、この試験フィルムは実
際に不変に反応する。

同じ組成及び調製は同じであるが、本発明による安定化
ウレアーゼの代りに同じ活性度の非安定化ウレアーゼを
含む試験フィルムは、最初は実際に同じ反応色を示すが
、６０ｏ０で３日間貯蔵した後にはもはや十分に反応し
ない。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 安定剤としてグルタチオン、エチレンジアミンテト
   ラ酢酸及びクエン酸塩の混合物を含有することを特徴と
   する安定化ウレアーゼ。 ２ ウレアーゼ、グルタチオン、エチレンジアミンテト
   ラ酢酸及びクエン酸塩を重量比１：０．５〜５：０．５
   〜３：０．５〜３で含有する、特許請求の範囲第１項記
   載のウレアーゼ。 ３ 安定剤混合物を添加する前にデキストランで処理さ
   れた、特許請求の範囲第１項又は第２項に記載のウレア
   ーゼ。 ４ 凍結乾燥調製物又はグリセリン／水の混合物中の溶
   液として存在する、特許請求の範囲第１項から第３項ま
   でのいずれか１項に記載のウレアーゼ。 ５ 支持紙又は支持フイルムに含浸して存在する、特許
   請求の範囲第１項記載のウレアーゼ。 ６ 尿素の測定に使用する、特許請求の範囲第１項記載
   のウレアーゼ。