KR101428122B1 - 젤라틴-트랜스글루타미나아제 지혈 드레싱 및 실란트 - Google Patents

젤라틴-트랜스글루타미나아제 지혈 드레싱 및 실란트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 젤라틴 및 트랜스글루타미나아제와 같은 무독성 교차 결합 물질을 포함하는 의료용 접착 물질에 관한 것이다. 본 발명의 다른 실시예는 트랜스글루타미나아제 층이 제 1의 및 제 2의 젤라틴 층 사이에 샌드위치된 드레싱을 포함한다. 지혈 제품은 상처 조직의 치료에 유용하다.
지혈 드레싱, 젤라틴, 트랜스글루타미나아제, 접착 물질.

Description

젤라틴-트랜스글루타미나아제 지혈 드레싱 및 실란트{GELATIN-TRANSGLUTAMINASE HEMOSTATIC DRESSINGS AND SEALANTS}
본 발명은 흡수성(resorbable) 또는 비흡수성(non-resorbable) 물질 및/또는 응고 단백질을 함유한 지혈 드레싱, 장치 및 제재에 관한 것이다. 상기 지혈 장치는 상처 조직의 치료에 유용하다.
출혈의 억제는 응급 치료 및 현장 외상 치료에서 중요한 단계이다. 불행하게도, 접근 가능한 부위로부터 과도한 출혈 또는 치명적 출혈의 발생은 흔치 않은 것이 아니다(문헌[J.M. Rocko 등 (1982). J. Trauma 22:635]참조). 베트남 전쟁으로부터 대규모의 사망 데이터는 전투 사망의 10%가 억제되지 않은 과다 출혈로 인한 것이라는 것을 나타낸다. 베트남 전쟁 동안에 출혈로 인한 사망의 1/3까지가 효과적인 현장 출혈 억제 방법의 사용에 의해 방지될 수 있었다(문헌[SAS/STAT Ussers Guide, 4th ed.(Cary, N.C.:SAS Institute Inc; 1990)]참조).
민간 외상 사망 통계가 과다 출혈로 병원에 오기 전에 사망한 자의 정확한 수를 제공하지 못한다 하더라도, 경우 및 일화 보고서는 유사한 발생을 나타낸다(문헌[J.M. Rocko 등 (1982). J. Trauma 22:635]참조). 이러한 데이터는 병원에 오기 전에 단순하고 효과적인 출혈 억제 방법을 사용함으로써 생존자의 상당한 증 가에 영향을 미칠 수 있다는 것을 제안한다. 불행하게도, 그러한 방법은 상업적으로 구입가능한 지혈 장치의 사용에 의해 성공적으로 증명되지 않는다.
개별적으로, 수술 상처 봉합은 현시점에서 조직을 잡아당겨 치료를 함께 촉진하는 봉합 및 스테이플(staple)에 의해 달성된다. 그러나, 이들은 체액 누출을 방지하는 데에 필수적인 적절한 봉인을 하지 못한다. 따라서, 스테이플선 및 봉합선을 따라 종종 발생하는 누출을 포함하며, 수술 후의 누출을 방지하기 위한 장치 및 방법에 대한 많은 충족되지 못한 의료적 요구가 있다. 그러한 장치 및 방법은, 말초 혈관 재구성, 경막(dura) 재구성, 흉부, 심혈관, 폐, 신경 및 위장관 수술에서 지혈 또는 다른 체액-정지를 달성하기 위해 봉합 또는 스테이플의 부가물로서 필요로 한다.
현재에 시장에 있는 대부분의 고압 지혈 장치는 모든 경우의 접착제로 명명 된다. 그러한 장치의 좋은 예는 QuikClot® ACSTM (Z-Medica, Wallington, CT) 및 HemConTM 붕대 (HemCon, Portland, OR)가 있으며, 상기 2개의 지혈 장치는 현재 미군 병사들에게 제공된다. QuikClot 스펀지에서 미네랄 제올라이트 결정은 혈액에 있는 물분자의 흡착을 야기하며, 따라서 응고 인자를 응축하고 혈액 응고를 가속화한다. HemCon 붕대를 구성하는 키토산 혼합물은 양전하를 갖고, 음전하를 갖는 적혈구를 유인한다. 상기 적혈구는 드레싱으로 이동하여 상처에 걸쳐서 봉인을 형성하고 상기 상처 표면을 안정화시킨다.
상기에서 언급된 HemCon 붕대 제품은 병원에 오기 전에 지혈 억제를 제공하 는 시도에서 개발되었고, 이미 현장에서 제한된 성공을 나타내었다. 그러나, HemCon 붕대를 구성하는 키토산 망상체(network)는, 심한 출혈 흐름(flood flow)에 직면하는 경우 또는 상처로부터 중간 정도의 출혈 흐름에 있는 때로부터 1시간 내지 2시간 후에는, 혈액으로 포화되고 빠르게 약해진다(문헌[B.S Kheirabadi 등 (2005). J. Trauma. 59:25-35; A.E. Pusateri 등 (2006). J. Trauma. 60:674-682]참조). 또한, 상기 HemCon 붕대 패치는 단지 불규칙적인 상처에 쉽게 맞춰질 수 없는 딱딱한 패치로서 사용가능하며, 나아가 그의 이용에 제한이 있다.
출혈 억제용으로 제안된 다른 다당류-기반의 지혈 장치는 RDMTM(아세틸 글루코사민), TraumaDEXTM(MPH) 및 ChitoskinTM(키토산&젤라틴)이다. 그러나, 이러한 유형의 붕대의 어느 것도, 상당한 혈액이 흐르는 면에서의 지혈을 막는 것을 일관되게 보여줄 수 없었다. 다른 최근에 소개된 지혈 장치는 CeloxTM (키토산 크리스탈) 및 WoundStatTM (TraumaCure Inc., MD)(스멕타이트(smectite) 미네랄 및 슈퍼 흡수성 중합체의 과립 혼합물)을 포함한다. 그러나, 이러한 제품의 둘 모두는 상처 부위를 채우기 위해 빠르게 팽창하여, 특정 유형의 상처에서 혈액 응고를 가속화하는 데에만 적합하고, 주위 혈관에서 혈액 흐름을 감소시키거나 제거하는 위험을 나타낸다.
상기에서 언급된 QuikClot ACSTM은 또한 출혈의 적당한 수준을 지혈하는 데에서 효능을 증명하였다. 그러나, 미네랄 제올라이트의 수분 흡착 메커니즘은 매 우 많은 양의 열을 방출함이 없이 일어날 수 없다. 그러한 바와 같이, QuikClot ACSTM의 적용은 상처 부위에서 고온 및 심한 화상을 일으키고, 이는 주위 조직 영역을 손상시키고 추후 의료적 치료를 더 복잡하게 만든다(문헌[A.E. Pusateri 등 (2006). J. Trauma. 60:674-682]참조). 명백하게, 이러한 중요한 부작용이 없는 지혈 용액이 더 이상적이다. Quikclot이 적용에 대해 더 적은 열을 방출하는 미네랄 혼합물을 발현시킨다 하더라도, 냉각 혼합물의 효능은 심한 외상 치료에 불충분하다. 나아가, 원래의 또는 냉각 미네랄 혼합물은 과다 동맥 출혈을 정지시킬 수 없다.
상기 언급된 모든 제품은 상처 부위로부터 체액 누출을 억제하기 위해 천연의 혈액 응고 캐스케이드에 의존한다. 그러한 바와 같이, 이들 모두는 단지 혈액 흐름을 정지시키는 데에 유용하고, 각각이 특정 장치에 적당한 조건 하에서만 유용하다. 일반적인 상처 부위 특히 비-혈액 체액을 누출하는 상처 부위 실링(sealing)은 이러한 제품의 범위를 넘어서야 한다.
수술 적용, 출혈의 억제 및 상처로부터의 출혈의 억제를 포함하는 광범위한 적용에 사용될 수 있는 무독성의 접착 물질을 갖는 것은 유용할 필요가 있다. 지혈 붕대의 일부분으로서 사용될 수 있는 무독성의 접착 물질을 갖는 것이 또한 유용할 필요가 있다. 수술 실란트(sealant)로서 사용될 수 있는 무독성의 접착 물질을 갖는 것이 또한 유용할 필요가 있다.
본 발명은 교차-결합형 단백질 및 상기 교차-결합형 단백질의 교차 결합을 유도하는 무독성 물질을 포함하는 접착 물질을 제공함으로써 배경 기술의 문제점을 극복한다. 바람직하게는, 상기 교차-결합형 단백질은 젤라틴, 및 본원에서 기술된 바와 같은 임의의 젤라틴 변형체 또는 변형 단백질을 포함한다. 선택적으로 그리고 바람직하게는, 상기 무독성 물질은, 미생물의 트랜스글루타미나아제(mTG)를 선택적으로 포함할 수 있는 트랜스글루타미나아제(TG)를 포함한다. 본 발명의 일부 실시예에 따르면, 상기 접착 물질은 바람직하게는 지혈 붕대로서 사용되기에 적합한 붕대로 제공된다. 다른 실시예에 따르면, 바람직하게는, 수술 실란트로서 사용되기에 적합한 실란트로서 제공된다.
트랜스글루타미나아제에 의해 활성되는 경우에, 단백질 콜라겐의 변성 형태인 젤라틴은 활발한(vibrant) 겔을 형성하기 위해 빠른 교차 결합을 한다. 발생하는 겔화 과정은, 피브린이 인자 Ⅷ 및 칼슘과 접촉하였을 때 반응하는, 천연의 후기 단계 혈액 응고 캐스케이드와 매우 유사하다. 나아가, 생성된 겔은 피브린 아교의 접착력보다 크지는 않지만 매우 유사한 접착력을 증명한다(문헌[M.K. McDermott, Biomacromolecules . 2004 Jul-Aug;5(4):1270-9]참조).
본 발명은 진보된 피브린 드레싱의 최상의 지혈 능력을 모방하기 위해, 상기 피브린 혈액 응고 캐스케이드에 대한 젤라틴-TG 교차-결합의 유사성을 이용한다. 피브린 붕대의 피브린-트롬빈 샌드위치(sandwich)를 젤라틴-TG 샌드위치로 치환하는 것은, 상당한 부작용 없이 출혈을 억제할 수 있는 신규의, 값싸고 안정한 드레싱을 생성한다. 이러한 새로운 붕대는, 상기 붕대와 접촉하지 않는 영역에 TG의 살포를 방지하는 방법으로, 상처 부위에 많은 양의 혼합물의 적용을 조절함으로써, 상기 젤라틴-TG 혼합물의 접착 성질을 최대화한다. 그러한 바와 같이, 이러한 시너지(synergistic) 기술은 진보된 피브린 드레싱의 분야 및 젤라틴-TG 접착의 분야 둘 모두에서 진보성을 나타낸다.
응고된 피브린 망상체와 달리, 젤라틴-TG 망상체는 다른 생리 반응을 하지 않는 특이적인 프로테아제(protease)를 사용하여 용해될 수 있다는 점에서 특히 추가적인 이익을 갖는다(문헌[T. Chen, Biomacromolecules . 2003 Nov-Dec;4(6):1558-63]참조). 따라서, 젤라틴-mTG 지혈 샌드위치 드레싱이 피브린-트롬빈 지혈 샌드위치 드레싱의 능력을 복제할 수 있다 하더라도, 이는 또한 복잡함 없이 원하는 바와 같이 제거될 수 있다.
외상 치료를 위한 지혈 분야 드레싱으로서의 적용 외에도, 본 발명의 젤라틴-TG 지혈 장치는 수술하는 동안에 과다 동맥 출혈, 혈관 내 카테터 삽입 후의 출혈, 또는 상해 또는 수술 후의 다른 신체상 체액의 누출을 억제하는 데에 많은 가능성을 갖는다.
현재까지, 교차-결합된 젤라틴-TG의 겔화 경향 및 젤라틴-TG 교차-결합의 접착력이 개별적으로 연구되었지만, 지혈 또는 조직 실링 조성물을 형성하기 위해 두 가지 특성을 함께 사용하도록 하는 노력을 기울이지 않았다.
젤라틴-TG 화합물의 접착 용도는, 한 방울의 젤라틴-TG 혼합물이 망막 부착에 사용되었던 쥐의 망막 모델의 생체 내에서 증명되었다(문헌[T. Chen, J Biomed Mater Res B Appl Biomater . 2006 May;77(2):416-22]참조).
세포 치료를 위한 스캐폴드(scaffold)로서 젤라틴-TG 겔의 사용은 또한 시험 되었다(미국 특허 제5,834,232호). 또한 문헌[Ito A, J Biosci & Bioeng . 2003; 95(2): 196-99]. 또한 문헌[Broderick EP, J Biomed Mater Res B Appl Biomater . 2005 Jan 15; 72(1):37-42]참조).
이러한 연구가 젤라틴-TG 혼합물의 생리적 사용의 안정성을 강조하더라도, 이들 각각이 단지 젤라틴-TG 교차-결합의 특성만을 사용하였고, 본 발명에서 제시된 지혈 및 조직 실링 진보를 교시하거나 제안하지 못하였다.
지혈 또는 체액-정지를 위한 젤라틴-TG 혼합물의 사용은 또한 독립적으로 외과용 접착제로서 트랜스글루타미나아제 특히 조직 TG를 사용하기 위해, 많은 잘 정리된 시도로부터 상당한 진보를 나타낸다(많은 것들 중의 하나인 미국 특허 제5736132호, 미국 특허 제61908196호). TG에 대한 기질로서 젤라틴을 사용하는 것은, TG활성에 TG를 단독으로 사용하는 경우에 비해 많은 장점을 제공하는 기계적인 스캐폴드를 추가한다. 젤라틴과 함께하는 TG는 TG 단독보다 더 정밀하게 적용될 수 있고, 상처 부위에 정밀하게 합치할 수 있고, 조절된 생체흡수력을 허용한다.
본 발명은 배경 기술의 문제점을 극복한다. 이전에 시도된 해결책은 중간 정도의 지혈에 대해 많은 형태의 변형된 젤라틴 망상체 및 변형되지 않은 젤라틴 망상체를 사용하였다. 그러나, 출혈이 심한 동맥 출혈 또는 다른 중요한 신체상의 체액 누출을 억제할 수 있는 강하게 교차-결합된 젤라틴 망상체를 원위치에서(in situ) 형성하는 방법은 부족하였다. 생체 내에서 강력한 젤라틴 망상체를 형성할 수 있는 젤라틴-TG 교차-결합과 같은 방법은 젤라틴 매트릭스(matrix)의 기계적 강도를 증가시키고, 고압 동맥 출혈 및 다른 신체상의 체액 누출을 억제하는 데에 적합하게 한다. 교차-결합의 개선된 방법 이외에, 본 발명은 존재하는 젤라틴-기반의 지혈 물질에 대해 장점을 제공하는 많은 다른 기술 혁신을 포함한다. 제한이 없는 예시적인 부분적 목록을 하기에서 제공한다:
1) 젤라틴 사슬 및 조직 ECM(세포외 매트릭스)의 내생적 콜라겐 사이의 원위치에서의 교차-결합은 체액에 대해 강한 지혈 장벽을 생성한다;
2) 젤라틴 및 TG는 동결건조된 형태에 적용하고 혈액 또는 다른 체액에 의해 재구성함으로써 지혈 또는 체액-정지에 더 효과적으로 영향을 미칠 수 있다;
3) 동결건조된 형태에 있는 젤라틴-TG 혼합물은 저장 수명을 증가시켰다;
4) 층으로 된, 동결건조된 형태의 젤라틴 및 TG는 고압 체액 흐름 환경을 도와주는 더 빠른 재구성을 제공하였다;
5) 기본적인 젤라틴-TG 혼합물에 기계적 지지체(backing)을 첨가하는 것은 체액을 늦추고, 젤라틴-TG가 교차-결합하고 상기 체액 누출을 막는 시간을 더 많이 허용함으로써, 지혈 또는 혼합물의 체액 억제력을 증가시킨다.
본 발명의 일부 바람직한 실시예에 따르면, 젤라틴-mTG 혼합물은 상처 부위에 적용되기 이전에 또는 동결건조되기 이전에 부분적으로 교차-결합된다. 또 다른 실시예에서, 비 교차-결합된 젤라틴 또는 mTG가 부분적으로 교차-결합된 젤라틴-mTG와 함께 존재한다.
자연적으로 접착력이 있는 지혈 붕대는 당해 기술 분야에서 공지되었으나, 아직 그의 사용에 대해 많은 복잡함과 문제점이 있다. 예를 들어, 피브리노겐 및 트롬빈의 광범위한 지혈 용도는 2차 세계 대전 시절에 일반적이었으나, 간염의 전염 때문에 버려졌다(문헌[D.B. Kendrick, Blood Program in WW Ⅱ(Washington, DC: Office of the Surgeon General, Department of Army; 1989), 363-368]참조).
피브리노겐 드레싱은 그레이 및 그의 동료가 미리중합체화된 피브린 시트(sheet) 및 분말을 만들었을 때인, 제 1 차 세계 전쟁 동안에 외상 외과의사에 의해 최초로 사용되었다. 제 2 차 세계 대전 동안에, 피브린 아교는 미군과 아메리카 적십자사에 의해 피브린의 미리중합체화된 스티로폼-같은 시트 및 피브린 필름으로 생성되었다. 피브린 드레싱은, 대조군과 비교할 경우에, 출혈 시간을 억제하고 혈액 손실을 감소시키는 데에서 중요한 차이를 나타낸다(문헌[Jackson, M. 등 (1996). J. of Surg. Res. 60:15-22]; 그리고 문헌[Jackson, M. 등 (1997). Surg. Forum. XL, Ⅷ: 770-772]참조).
출혈을 억제하는 데에서 피브리노겐 드레싱의 효능에도 불구하고, 상기 드레싱이 정화된 인간의 또는 동물의 피브리노겐, 또는 다른 정화된 혈액 제품을 포함했기 때문에, 간염 및 HIV와 같은 혈액 및 혈청 매개성 질병이 종종 전염되었기 때문에, 피브리노겐 드레싱의 사용은 중단되었다(문헌[Holcomb, J. B. 등 (1997). Surgical Clinics of North America . 77:943-951]참조).
그러나, 지난 몇 년 동안에, 혈장 정화 기술이 혈액 및 혈청 매개성 질병의 위험을 매우 감소시킴에 따라, 피브린 제품에 대한 새로운 관심이 있어 왔다.
지혈 샌드위치 드레싱은 미국 적십자사에 의해 기술되었고, 이는 피브리노겐 층 사이에 샌드위치된 트롬빈 층을 함유한다(예를 들어 PCT/US99/10952, 미국 특허 번호 제6054122호, 제6762336호를 참고함). 지혈 드레싱은 잠재적으로 치명적인 외상 상처를 치료하는 데에 많은 성공을 입증하였다(문헌[E.M. Acheson. (2005). J. Trauma. 59(4):865-74]; discussion 874-5; 문헌[B.S. Kheirabadi. (2005). J. Trauma. 59(l):25-34]; discussion 34-5]; 문헌[A. E. Pusateri. (2004). J. Biomed. Mater. Res. B Appl. Biomater. 15;70(l): l14-21]참조). 사실상, 돼지로 연구한 경우에서, 상기 피브린 샌드위치 드레싱은 잠재적으로 치명적인 외상 상처를 치료하는 데에서 HemCon 및 QuikClot 제품을 매우 능가하였는데, 상기 피브린 샌드위치 드레싱은 표준화된 군대 분야 붕대인, HemCon 붕대 또는 QuikClot 분말이 사용되는 경우의 생존율 0%와 비교하여, 2시간 후에 75% 초과의 생존율을 입증하였다.
그러한 드레싱이 상처 조직을 치료하는 방법에서 사용될 수 있을지라도, 그러한 통상적인 샌드위치 드레싱은 얇은 층으로 갈라질 수 있으며, 상기 드레싱 층의 모서리는 더 이상 서로 부착되지 않는다. 그러한 갈라짐은 출혈을 방지하는 드레싱의 효과를 감소시킴과 함께, 드레싱 구성요소 층의 상호작용을 감소시킬 수 있다.
개선된 피브린 지혈 샌드위치 드레싱은 흡수성 물질 및/또는 응고 단백질을 함유하는 복수의 층을 포함하여 기술되었다. 구체적으로, 상기 드레싱(PCT/US03/28100, 미국 특허 출원 번호 제0060155234호를 참고함)은 피브리노겐의 제 1 층 및 제 2 층 사이에 샌드위치된 트롬빈 층을 포함하며, 상기 트롬빈 층은 피브리노겐의 제 1 층 및/또는 제 2 층과 동일한 공간에 걸치지 않는다.
피브린 상처 드레싱의 진보성에도 불구하고, 이러한 붕대는 많은 문제점을 갖고 있다. 상기 붕대를 제조하는 데에 사용된 동결건조된 피브리노겐은 인간의 혈장으로부터 정화되어야 한다. 이는 비싸고 까다로운 과정이기 때문에, 생성된 피브리노겐 붕대는 제조비용이 매우 비싸고 상온에서 단지 매우 짧은 저장 수명을 갖는다. 후면에 첨가된 피브리노겐이 많으면 많을수록, 상기 붕대는 출혈을 더 잘 정지시킨다. 그러나, 상기 후면에 첨가된 피브리노겐이 많으면 많을수록, 상기 붕대는 더 비싸다. 또한, 상기 붕대 후면에 있는 많은 양의 피브리노겐은 상기 붕대의 취약성에 기여하고, 붕대를 부서지기 쉽게 하고 작업하기에 어렵게 한다. 이러한 제한 때문에, 효능이 있는 피브린 붕대는 상업적으로 구입가능하지 않다.
따라서, 진보된 피브린 드레싱이 상당한 부작용 없이 출혈을 억제하고 활성의 외상 치료 지혈에서 이전에 언급한 결함을 충족시킬 수 있다 하더라도, 가격 및 안정성 제한은 이러한 유형의 드레싱을 사용하는 데에 강한 단점을 나타낸다.
액체 피브린 실란트 또는 아교는 출혈 억제에 대한 수술실 부속물로서 여러 해 동안 사용되어 왔다(문헌[J. L. Garza 등. (1990). J. Trauma. 30:512-513]; 문헌[H. B. Kram 등. (1990). J. Trauma. 30:97-101]; 문헌[M. G. Ochsner 등. (1990). J. Trauma. 30:884-887]; 문헌[T. L. Matthew 등. (1990). Ann. Thorac. Surg. 50:40-44]; 문헌[H. Jakob 등. (1984). J. Vase. Surg. 1 : 171-180]참조). 또한, 단일 공여자(donor) 피브린 실란트는 다양한 수술 상황에서 임상적으로 광범위하게 사용되었다(문헌[W. D. Spotnitz. (1995). Thromb. Haemost. 74:482-485]; 문헌[R. Lerner 등. (1990). J. Surg. Res. 48: 165-181]참조).
많은 흡수성 수술 지혈제가 수술 분야에서 현재 사용된다 하더라도, 존재하는 제품이, 심한 출혈 또는 다른 생체액의 격렬한 흐름을 억제하기 위해 필요한 기계적 및 생물학적 지지를 제공하기에 충분히 강하지 못하다.
콜라겐 상처 드레싱(INSTATTM, Ethicon, Somerville, NJ 및 AVITENETM, CR Bard, Murray Hill, NJ) 또는 건조 피브린 트롬빈 상처 드레싱(TACHOCOMBTM, Hafslund Nycomed Pharma, Linz, Austria)와 같은 현재에 구입가능한 지혈 붕대는 수술 적용에 사용되기에 제한되고, 높은 혈액 흐름에서의 용해에 충분히 저항하지 못한다. 이들은 또한 심한 혈액 흐름의 억제에 임의의 실제적인 목적을 제공하기에 충분한 접착성을 갖지 못한다. 이러한 현재에 구입가능한 수술 지혈 붕대는 또한 약해서, 구부리거나 압력을 주는 경우 손상되기 쉽다. 이들은 또한 출혈성 출혈에서의 용해에 영향을 받기 쉽다. 그러한 용해 및 이러한 붕대의 붕괴는, 상처에 대한 접착력을 감소시키고 출혈이 약해지지 않은 채로 계속될 수 있기 때문에 재앙적일 수 있다.
동맥 출혈은 또한 산화된 셀룰로스(SURGICEL, Ethicon, Somerville, NJ) 또는 젤라틴 스펀지(SURGIFOAM, Ethicon, Somerville, NJ) 흡수성 지혈제의 적용으로 다루기 쉽지 않다. 이러한 제품은 뼈 및 경막외 정맥 분비물로부터 낮은 압력의 출혈을 억제하도록 의도되었다. 젤라틴 스펀지는 출혈 소스와 단단한 결합을 형성하지 못해서 쉽게 제거되기 때문에, 고압, 활발히 흐르는 동맥 출혈에 적당하지 않다. 산화된 셀룰로스는 또한 지혈이 달성될 때에 팽창하고 적용 부위로부터 제거되기 때문에, 동맥 출혈을 억제하는 데에 적당하지 않다. 상기 혈액 흐름이 너무 높은 경우에, 지혈이 달성되기 전에 너무 많은 팽창이 발생한다(문헌[M. Sabel 등 (2004). Eur. Spine J. 13(1):S97-101]참조).
대부분의 광범위하게 사용되는 조직 접착제는, 일반적으로 약한 독성과 이 분야에서 쉽게 제조될 수 없기 때문에, 지혈 장치 또는 내부 체액-정지 장치로서 사용하기에 일반적으로 부적당하다. 이의 좋은 예는 국소 피부 접착제(예를 들어, DermabondTM, IndermilTM, LiquibandTM 등)의 시아노아크릴레이트 그룹이다. 공기에 노출될 때 시아노아크릴레이트의 빠르게 활성화되는 성질은 시아노아크릴레이트 제품이 활성의 지혈 현장 드레싱에 사용되기에 부적당하게 하고, 습식 표면에 결합할 수 없는 성질은 내부 지혈 또는 체액-정지 사용을 부적당하게 한다.
내부 체액-정지 사용을 위해 존재하는 제품은 또한 중요한 문제점을 갖는다. BioGlueTM(Cryolife Inc.)은, 강한 접착제 및 실란트이나, 독성이며 매우 신경 독성 물질인 글루타르알데히드에 의해 교차 결합된 알부민을 함유한다. 이러한 독성은 그의 사용을 매우 제한한다. 또 다른 실란트는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)로 구성된 CoSeal(Baxter)이다. 그것이 무독성이라 할지라도, 단지 약한 접착 세기를 가져서, 그의 적용을 매우 제한한다.
젤라틴은 다양한 상처 드레싱에서 사용되어 왔다. 젤라틴 겔은 비교적 낮은 녹는점을 갖기 때문에, 체온에서 매우 안정적이지 않다. 따라서, 단백질 사슬 사이에 교차 결합을 형성함으로써 이러한 겔을 안정화시키는 것이 필수적이다. 실제로, 이는 상기 젤라틴을 글루타르알데히드 또는 포름알데히드로 처리하여 수득된다. 따라서, 교차 결합된 젤라틴은 출혈 상처에 지혈을 유도하기에 유용한 건조 스펀지로 제조될 수 있다. 그러한 스펀지의 상업적으로 구입가능한 예는 Spongostan(Ferrrosan, Denmark), Gelfoam(Upjohn, USA) 및 Surgifoam(Ethicon. Somerville, NJ)를 포함한다. 이러한 스펀지의 가장 큰 단점은, 사용된 교차 결합제(포름알데히드 또는 글루타르알데히드)가 세포에 독성이 있다는 것이다. 예를 들어, 글루타르알데히드 교차 결합의 부정적인 효과는 deVries 등의 연구결과에 의해 예시된다(문헌[Abstract Book of the Second Annual Meeting of the WHS, Richmond, USA, p51, 1992]참조). 이러한 저자들은 글루타르알데히드 교차 결합된 콜라겐 격자가 세포에 대해 독성이 있다는 것을 보여주며, 비 교차 결합된 변종은 없었다. 따라서, 그의 유리한 지혈성에도 불구하고, 이러한 제품은 문제성 상처의 치료를 위한 상처 드레싱으로서 매우 최적은 아니다. 결과적으로, 다른, 독성이 덜한, 교차 결합 기술을 사용한 젤라틴 상처 드레싱은 매우 바람직할 것이다.
잠재적 독성 이외에, 젤라틴 망상체 단독으로는 심한 출혈을 억제하기 위해 필요한 기계적 성질을 제공하지는 않는다. 이들은 적은 양의 체액 흡수만을 요구하는 상처 관리 적용에 더 적당하다. 하나의 연구에서, 글루타르알데히드 교차 결합된 젤라틴의 시트는 지속된 상처 치료를 위한 드레싱, 특히 장시간을 필요로 하는 이영양성(dystrophic) 조직에 대한 드레싱으로 더 적당하다. 선택적으로, 이들은 세포 부착을 위한 스캐폴드로서 유용할 수 있으며, 원위치에서 연장되어 존재하는 것을 통해 반응성이 좋지 않은 미세환경을 자극할 수 있다(문헌[MG Tucci. (2001). J. Bioactive & Comp. Polymers. 16(2): 145-157]참조).
다당류로 교차 결합된 젤라틴 망상체는 또한 출혈을 억제하는 데에 사용하기 위해 제안되었다. 이러한 지혈 화합물은 글루타르알데히드 교차 결합된 젤라틴 스펀지의 잠재적 독성에 의해 방해받지 않는다. 그러나, 상기 젤라틴-다당류 물질은 일반적으로 기계적 강도가 부족하고, 주로 수술 동안에 적은 양의 분비물 체액을 억제하거나 연장된, 추후-의료적 치료 기간에 걸쳐서 상처 분비물을 제한하고자 함이다.
젤라틴-다당류 화합물의 일 예는 원위치에서 교차 결합된 젤라틴-알기네이트 상처 드레싱이다. 그러한 드레싱은 접착 기능을 갖지 않고, 상처 부위 상의 습기를 억제하는 데에 주로 사용된다. 상기 드레싱은 그의 초기 크기의 90%로 팽창하며, 그의 기계적 강도를 매우 감소시킨다(문헌[B Balakrishnan 등. (2005). Biomaterials. 26(32):6335-42]참조).
또 다른 더 광범위한 예는 교차 결합된 젤라틴-키토산 상처 드레싱(미국 특허 제6,509,039호, 제4,572,906호에서의 예들)이다. 일부가 외상 치료를 위해 그러한 드레싱(Chitoskin)의 사용을 제안하더라도, 이러한 물질의 지혈성은 단지 고압 출혈을 억제하기에 불충분하다. 또한, 상기 물질은 신체상의 체액의 높은 체적에 직면한 때에 상당히 팽창한다. 그러한 드레싱은 만성적인 상처 및 화상을 치료하는 데에 더 적당하다.
또 다른 예는 언급(미국 특허 제6,132,759호)되었고, 용해된 젤라틴은 산화된 덱스트란으로 교차 결합된다. 상기 미국 특허는 높은 흡수력과 치료 물질의 특히 상처에의 전달에 유리한 조절된 방출 성질을 보여주기 때문에, 이러한 물질은 상처를 덮고 장기간의 치료를 위해 제안된다.
현재에, 교차 결합된 젤라틴 망상체 또는 젤라틴으로 교차 결합된 다른 물질의 망상체를 포함하는 물질은 과다 내부 출혈에 트롬빈을 첨가하여 지혈을 독립적으로 제공할 수 없었다. 하나의 연구는 활성의 트롬빈 용액에 침지된 FloSeal 젤라틴 매트릭스(BioSurgery, Fremont, CA) 및 GelFoam 젤라틴 매트릭스의 지혈 능력을 비교하여 수행되었다. 강화된 지혈 장치도 5분 후에 2/3를 초과하는 환자들에서의 특성화된 출혈 흐름을 정지시킬 수 없었다. 박동성 동맥 출혈은 흐름 출혈보다 더 활발하고 가장 확실하게 이러한 트롬빈-침지된 매트릭스에 대해 문제점을 제시할 것이다(문헌[FA Weaver 등 (2002). Ann. Vasc. Surg. 16(3):286-93]참조).
임의의 경우에서, 외상 치료에서 다른 결함이 남아 있고, 상당한 부작용 없이 출혈을 억제할 수 있는 구입가능한 신규의 활성 지혈 현장 드레싱은 없다. 유사하게, 수술 치료에서 다른 결함이 남아 있고, 출혈이 심한을 견딜 수 있고 비-혈액 체액을 누출하는 상처 부위를 봉인할 수 있는 구입가능한 무독성 실란트는 없다.
본 발명의 일부 실시예에 따르면, 젤라틴 및 무독성 교차 결합제를 포함하는 조성물을 조직에 적용하는 것을 포함하는, 상처 조직을 치료하는 방법을 제공한다.
선택적으로, 무독성 교차 결합제는 트랜스글루타미나아제를 포함한다. 바람직하게는, 상기 트랜스글루타미나아제는 트랜스글루타미나아제 조성물의 일부분으로서 포함되고, 젤라틴 대 트랜스글루타미나아제 조성물의 중량비는 약 1:1 내지 약 300:1의 범위에 있다. 더 바람직하게는, 상기 트랜스글루타미나아제 조성물은 약 40 U/gm 이상의 특이적 활성 수준을 갖는다. 가장 바람직하게는, 상기 트랜스글루타미나아제 조성물은 약 800 U/gm 이상의 특이적 활성 수준을 갖는다.
선택적으로 그리고 바람직하게는, 젤라틴-트랜스글루타미나아제 조성물에 있는 트랜스글루타미나아제의 활성은 약 25 U/g(젤라틴) 내지 약 400 U/g(젤라틴)이다. 더 바람직하게는, 상기 활성은 약 40 U/g(젤라틴) 내지 약 200 U/g(젤라틴)이다.
선택적으로, 트랜스글루타미나아제는, 혈액에서 유래된 인자 Ⅷ가 아닌, 식물, 재조합 동물 또는 미생물로부터 유래된 트랜스글루타미나아제를 포함한다. 바람직하게는, 상기 조성물은 약 5 내지 약 8 범위의 pH에 있다.
선택적으로, 젤라틴은 동물 기원(origin), 재조합 기원 또는 그의 조합으로부터 제조된다. 바람직하게는, 상기 동물 기원는 어류 및 포유 동물로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 더 바람직하게는, 상기 포유 동물는 돼지 및 소로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
선택적으로, 젤라틴은 유형 A(산으로 처리됨) 또는 유형 B(알칼리로 처리됨)이다. 더 바람직하게는, 젤라틴은 고분자량의 젤라틴을 포함한다.
선택적으로, 상처 조직은 수술적 절단 조직, 수술적 치료된 조직 및 외상을 입은 조직으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
선택적으로, 상기 방법은 조직으로부터 출혈 또는 다른 체액의 누출을 감소시키기는 단계를 더 포함한다. 선택적으로, 체액은 뇌 척수(cerebral spinal fluid), 장액, 공기, 담즙 및 소변으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 바람직하게는, 상기 방법은 상기 조직에서 지혈 또는 다른 누출 체액의 정지를 유도하는 것을 더 포함한다.
선택적으로, 상처는 출혈 또는 또 다른 체액의 누출이고, 상기 상처 조직을 치료하는 것은 조성물을 상기 상처 부위에 적용하여, 체액 누출 또는 출혈에 대한 장벽을 생성하는, 젤라틴 사슬 및 조직의 세포외 매트릭스의 내생적 콜라겐 사이의 교차 결합을 원위치에서 촉진하는 것을 포함한다.
선택적으로, 상기 방법은 생체모방 응고를 형성하는 단계를 더 포함한다.
선택적으로, 조성물을 적용하는 것은, 젤라틴 및 트랜스글루타미나아제를 혼합하여 혼합물을 형성하고, 상기 혼합물을 조직에 적용하는 것을 포함한다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 포유 동물의 상처에 지혈을 유도하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 젤라틴 및 트랜스글루타미나아제를 포함하는 조성물을 상기 상처에 적용하는 것을 포함한다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 손상된 혈관 부위에 생체모방 응고의 형성을 유도하는 방법을 제공하며, 이는 젤라틴 및 트랜스글루타미나아제를 포함하는 조성물을 상기 상처에 적용하는 것을 포함한다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 젤라틴 및 트랜스글루타미나아제의 혼합물을 포함하는 조성물을 제공하며, 젤라틴의 양 및 트랜스글루타미나아제의 양의 비율은 포유 동물에서 생체모방 응고의 형성을 유도하도록 선택된다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 젤라틴 및 무독성 교차 결합제의 혼합물을 포함하는 조성물을 제공하며, 젤라틴의 양 및 무독성 교차 결합제의 양의 비율은 포유 동물의 상처에서 출혈을 감소시키기에 충분하다.
바람직하게는, 무독성 교차 결합제는 트랜스글루타미나아제를 포함한다. 더 바람직하게는, 상기 트랜스글루타미나아제는 트랜스글루타미나아제 조성물의 일부분으로서 첨가되고, 젤라틴 대 트랜스글루타미나아제 조성물의 중량비는 약 1:1 내지 약 300:1의 범위에 있다. 가장 바람직하게는, 상기 비율은 약 1:1 내지 약 100:1의 범위에 있다. 가장 바람직하게는, 상기 트랜스글루타미나아제 조성물은 약 40 U/gm 이상의 특이적 활성 수준을 갖는다. 또한 가장 바람직하게는, 상기 트랜스글루타미나아제 조성물은 약 80 U/gm 이상의 특이적 활성 수준을 갖는다. 또한 가장 바람직하게는, 상기 트랜스글루타미나아제 조성물은 약 200, 400 또는 800 U/gm 이상의 특이적 활성 수준을 갖는다.
선택적으로, 젤라틴-트랜스글루타미나아제 조성물에 있는 트랜스글루타미나아제의 활성은 약 25 U/g(젤라틴) 내지 약 400 U/g(젤라틴)이다. 바람직하게는, 활성은 약 40 U/g(젤라틴) 내지 약 200 U/g(젤라틴)이다.
선택적으로, 트랜스글루타미나아제는, 혈액에서 유래된 인자 Ⅷ가 아닌, 식물, 재조합물, 동물 또는 미생물로부터 유래된 트랜스글루타미나아제를 포함한다. 바람직하게는, 조성물은 안정화제 또는 충진제를 더 포함한다. 또한 바람직하게는, 상기 조성물은 약 5 내지 약 8의 pH 범위를 갖는다.
선택적으로, 젤라틴은 동물 기원, 재조합 기원 또는 그의 조합으로부터 제조된다. 바람직하게는, 상기 동물 기원는 어류 및 포유 동물로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 더 바람직하게는, 상기 포유 동물는 돼지 및 소로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 가장 바람직하게는, 상기 젤라틴은 돼지 피부 또는 돼지 뼈, 또는 그의 조합을 포함한다. 또한 가장 바람직하게는, 상기 젤라틴은 유형 A(산으로 처리됨) 또는 유형 B(알칼리로 처리됨)이다. 또한 가장 바람직하게는, 상기 젤라틴은 고분자량의 젤라틴을 포함한다.
선택적으로, 젤라틴은 약 250 이상의 블룸(bloom)을 갖는다. 바람직하게는, 어류는 한류종의 어류를 포함한다.
선택적으로, 재조합 젤라틴은 박테리아, 효모, 동물, 곤충, 또는 식물 시스템 또는 임의의 유형의 세포 배양을 사용하여 제조된다.
선택적으로, 젤라틴은 염을 제거하여 정화된다.
선택적으로, 젤라틴은 하나 이상의 조절된, 맞춰진 또는 기결정된 특징을 갖는다. 선택적으로, 상기 젤라틴은 열에 의해 가역적인 겔화를 하지 않는다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 젤라틴 및 무독성 교차 결합 제제의 혼합물을 포함하는 지혈제 또는 체액 실링제를 제공한다. 선택적으로, 상기 무독성 교차 결합제는 트랜스글루타미나아제를 포함한다. 바람직하게는, 상기 혼합물은 응집된 젤라틴 및 트랜스글루타미나아제를 포함한다.
본원에서 기술된 바와 같이, 방법 또는 조성물에서의 트랜스글루타미나아제는 스트렙토베르티실리움 발다치(Streptoverticillium Baldaccii), 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 균주 (Streptomyces Hygroscopicus strain) 또는 대장균(Escherichia Coli)로부터 선택적으로 추출될 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 상처 조직에서 지혈을 유도하거나 및/또는 상처 조직을 실링하는 방법을 제공하며, 이는 교차 결합 단백질 기질 및 무독성 교차 결합제를 포함하는 조성물을 상기 조직에 적용하는 것을 포함한다. 선택적으로, 상기 무독성 교차 결합제는 트랜스글루타미나아제를 포함한다. 바람직하게는, 상기 기질은 트랜스글루타미나아제 교차 결합 부위를 특징으로 하는 하나 이상의 합성된 중합체 서열을 포함한다. 더 바람직하게는, 상기 기질은 하나 이상의 트랜스글루타미나아제 교차 결합 부위를 포함하는 변형된 폴리펩티드를 포함한다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 상처를 지혈 및/또는 실링하는 것을 유도하는 조성물을 제공하며, 이는 젤라틴 및 트랜스글루타미나아제의 혼합물을 포함하며, 상기 혼합물은, 표준의 동물 젤라틴에 대한 천연의 졸-겔 전이 온도보다 낮은 온도에서 상기 젤라틴이 트랜스글루타미나아제와 함께 용액을 형성하도록 변형된다.
선택적으로, 젤라틴은 감소된 졸-겔 전이 온도를 갖도록 변형되었다. 바람직하게는, 조성물은 혼합물에서 젤라틴의 용해를 증가시키는 첨가제를 더 포함한다. 더 바람직하게는, 상기 조성물은 상기 젤라틴의 졸-겔 전이 온도를 감소시키는 첨가제를 더 포함한다. 가장 바람직하게는, 상기 조성물은 가소제를 더 포함한다. 선택적으로 그리고 가장 바람직하게는, 상기 가소제는 폴리하이드릭 알콜(polyhydric alcohol), 글리세린, 글리세롤, 자일리톨, 수크로스, 솔비톨, 트리에탄올아민, 레조르신, 티오디글리콜, 톨루엔설폰산의 나트륨 염, 부틸렌 글리콜, 우레아 니트레이트(urea nitrate), 티오우레아, 우레아, 글루탐산, 아스파라긴산, 발린(valine), 글리신(glycine), KSCN, KI 및 LiBr로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
선택적으로, 글리세롤에 대한 농도 비율 범위는, 글리세롤:젤라틴의 중량비가 약 0.5:1 내지 약 5:1이다. 바람직하게는, 상기 농도 비율 범위는, 글리세롤:젤라틴의 중량비가 약 1:1 내지 약 2:1이다. 선택적으로, 솔비톨에 대한 농도 비율 범위는, 솔비톨:젤라틴의 중량비가 약 0.5:1 내지 약 5:1이다. 바람직하게는, 상기 농도 비율 범위는, 솔비톨:젤라틴의 중량비가 약 1:1 내지 약 3:1이다.
선택적으로, 우레아에 대한 농도 비율 범위는, 우레아:젤라틴의 중량비가 약 1:2 내지 약 2:2이다.
선택적으로, 조성물은 pH 조절제 및 이온 농도 조절제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 조절제를 포함한다. 바람직하게는, 상기 pH 조절제는 약 1.5 내지 약 5.0 또는 약 7.0 내지 약 9.0의 pH 범위를 제공한다.
선택적으로, 조성물은 염을 더 포함한다.,
선택적으로, 조성물은 트레할로스(trehalose) 카보하이드레이트, 만니톨 카보하이드레이트, 또는 분사 건조, 동결 건조 또는 다른 단백질 건조의 안정화를 위한 다른 카보하이드레이트를 더 포함한다.
선택적으로, 조성물은 변성제(denaturant)를 더 포함한다. 바람직하게는, 상기 변성제는 구아니딘(Guanidine) 하이드로클로라이드 및 우레아로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 더 바람직하게는, 농도 비율 범위는, GuHCl:젤라틴의 중량비가 약 1:2 내지 약 2:2이다. 또한 더 바람직하게는, 농도 비율 범위는, 우레아:젤라틴의 중량비가 약 0.5:1 내지 약 1:1이다.
선택적으로, 조성물은 환원제(reducing agent)를 더 포함한다. 바람직하게는, 상기 환원제는 염화마그네슘 및 하이드로퀴논으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 더 바람직하게는, 상기 하이드로퀴논은 약 0.2M 내지 약 0.5M의 농도에서, 혼합물의 용액에 존재한다. 가장 바람직하게는, 상기 농도는 약 0.3M 내지 약 0.4M이다.
선택적으로, 염화마그네슘은 약 2M 내지 약 4M의 농도에서, 혼합물의 용액에 존재한다. 바람직하게는 상기 농도는 약 2.5M 내지 약 3.5M이다.
선택적으로, 조성물은 발열제(exothermic agent)를 더 포함한다. 바람직하게는, 상기 발열제는 하나 이상의 염화칼슘, 다른 칼슘 염, 염화마그네슘, 금속 산화물/제올라이트 또는 그의 조합을 포함한다. 더 바람직하게는, 상기 염화칼슘은, 주위 온도를 초과하여 증가되는 온도 각 1℃ 당, 용액 중의 혼합물의 1mL 당 염화칼슘의 약 0.2g 내지 약 0.7g의 양으로 존재한다.
선택적으로, 조성물은 젤라틴 특이적인 프로테아제를 더 포함한다.
선택적으로, 조성물은 프로테아제 억제제를 더 포함한다.
선택적으로, 조성물은 추가적인 지혈제를 더 포함한다. 바람직하게는, 상기 추가적인 지혈제는 하나 이상의 알부민, 콜라겐, 피브린, 트롬빈, 키토산, 페릭 설페이트(ferric sulfate) 또는 다른 금속 설페이트를 더 포함한다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 하기를 포함하는 지혈 또는 실링 드레싱을 제공한다: (ⅰ) 제 1의 젤라틴 층; (ⅱ) 상기 제 1의 젤라틴 층에 인접한 트랜스글루타미나아제 층; 및 (ⅲ) 상기 트랜스글루타미나아제 층에 인접한 제 2의 젤라틴 층, 여기서 상기 트랜스글루타미나아제 층은 상기 제 1의 젤라틴 층 및/또는 상기 제 2의 젤라틴 층과 동일한 공간에 걸치거나 또는 동일한 공간에 걸치지 않는다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 하기를 포함하는 지혈 또는 실링 드레싱을 제공한다: (ⅰ) 흡수성(resorbable) 또는 비흡수성(non-resorbable) 물질 층; (ⅱ) 상기 물질 층에 인접한 제 1의 젤라틴 층; (ⅲ) 상기 제 1의 젤라틴 층에 인접한 트랜스글루타미나아제 층; 및 (ⅳ) 상기 트랜스글루타미나아제 층에 인접한 제 2의 젤라틴 층, 여기서 상기 트랜스글루타미나아제 층은 상기 제 1의 젤라틴 층 및/또는 상기 제 2의 젤라틴 층과 동일한 공간에 걸치거나 또는 동일한 공간에 걸치지 않는다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 하기를 포함하는 지혈 또는 실링 드레싱을 제공한다: (ⅰ) 젤라틴 층; (ⅱ) 상기 젤라틴 층에 인접한 트랜스글루타미나아제 층; 여기서 상기 트랜스글루타미나아제 층은 상기 젤라틴 층과 동일한 공간에 걸치거나 또는 동일한 공간에 걸치지 않는다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 하기를 포함하는 지혈 또는 실링 드레싱을 제공한다: (ⅰ) 흡수성 또는 비흡수성 물질 층; (ⅱ) 상기 물질 층에 인접한 젤라틴 층; (ⅲ) 상기 젤라틴 층에 인접한 트랜스글루타미나아제 층; 여기서 상기 트랜스글루타미나아제 층은 상기 젤라틴 층과 동일한 공간에 걸치거나 또는 동일한 공간에 걸치지 않는다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 하기를 포함하는 지혈 또는 실링 드레싱을 제공한다: (ⅰ) 젤라틴 층; (ⅱ) 상기 제 1의 젤라틴 층에 인접한 흡수성 또는 비흡수성 물질 층; (ⅲ) 상기 물질 층에 인접한 트랜스글루타미나아제 층; 여기서 상기 트랜스글루타미나아제 층은 상기 젤라틴 층과 동일한 공간에 걸치거나 또는 동일한 공간에 걸치지 않는다.
선택적으로, 드레싱은 후면 물질을 더 포함한다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 하기를 포함하는 지혈 또는 실링 장치를 제공한다: (ⅰ) 흡수성 또는 비흡수성 매트릭스; (ⅱ) 젤라틴; (ⅲ) 트랜스글루타미나아제; 여기서 상기 젤라틴 및 트랜스글루타미나아제는 상기 매트릭스 내에서 혼합된다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 하기를 포함하는 지혈 또는 실링 장치를 제공한다: (ⅰ) 다공성의 흡수성 또는 비흡수성 매트릭스; (ⅱ) 젤라틴; (ⅲ) 트랜스글루타미나아제; 여기서 상기 젤라틴 및 트랜스글루타미나아제는 상기 매트릭스에 부착된다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 인간의 신체 또는 하등 포유 동물 내로 삽입하기 위한 의료 장치를 제공하며, 이는 본원에서 설명한 바와 같은 지혈 또는 실링 제재 또는 조성물을 포함한다. 바람직하게는, 상기 장치는 혈관 카테터(catheter)를 포함한다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 인간의 신체 또는 하등 포유 동물 상의 국부적 적용을 위한 의료 장치를 제공하며, 이는 본원에서 설명한 바와 같은 지혈 또는 실링 제재 또는 조성물을 포함한다. 선택적으로, 상기 장치는 가압된 분무기 또는 발포체을 포함한다.
앞의 일반적인 설명과 하기의 상세한 설명은 예시적이고 단지 설명적임이 이해되어야 하고, 청구한 바와 같이 본 발명의 추가적인 설명을 제공하고자 함이다.
달리 정의되지 않는다면, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 평균적 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 같이 동일한 의미를 갖는다. 본원에서 언급된 모든 특허, 특허 출원 및 공개는 본원에서 참고로 인용된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 젤라틴 층과 "동일한 공간에 걸치지 않는다(non-coextensive)"고 언급된 트랜스글루타미나아제 층은, 2차원에서의 트랜스글루타미나아제 층의 공간적 경계가 하나 또는 둘 모두의 젤라틴 층의 공간적 경계보다 작아서, 상기 트랜스글루타미나아제 층이 독립적으로 지혈 드레싱의 제 1의 젤라틴 층의 표면적의 단지 약 5% 내지 약 95%로 동일한 공간에 걸쳐 있거나 그리고/또는 상기 지혈 드레싱의 제 2의 젤라틴 층의 표면층의 단지 약 5% 내지 약 95%로 동일한 공간에 걸쳐 있는 것 중의 하나이다. 예를 들어, 상기 트랜스글루타미나아제 층은 독립적으로 상기 제 1 및 제 2의 젤라틴 층 각각의 표면적에 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 75, 80 또는 90%로 동일한 공간에 걸쳐 있을 수 있다. 젤라틴 층과 "동일한 공간에 걸쳐 있는(coextensive)" 트랜스글루타미나아제 층은, 상기 젤라틴 층의 전체를 덮는 것을 의미하고, 상기 젤라틴 층 표면적의 100%로 동일한 공간에 걸쳐 있다. 트랜스글루타미나아제 층은, 예를 들어 다른 총 표면적 또는 모양을 갖는 젤라틴 층을 사용함으로써, 상기 제 1의 젤라틴 층과 동일한 공간에 걸쳐있지 않을 수 있고, 상기 제 2의 젤라틴 층과 동일한 공간에 걸쳐 있을 수 있거나, 반대로 있을 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "환자"는 의료적 치료 및/또는 치료를 필요로 하는 인간 또는 동물 개개를 말한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "상처"는 순환계로부터 혈액의 손실 또는 생리적 경로로부터 임의의 다른 체액의 손실을 가져오는 환자의 임의의 조직에 대한 임의의 손상을 말한다. 상기 조직은 내부 조직(예를 들어, 기관 또는 혈관) 또는 외부 조직(예를 들어, 피부)일 수 있다. 혈액 또는 체액의 손실은 내부 손실(예를 들어, 파열된 기관) 또는 외부적 손실(예를 들어, 열상(laceration))일 수 있다. 상처는 연조직(예를 들어, 기관) 또는 경조직(예를 들어, 뼈)에 있을 수 있다. 상기 손상은 외상성 손상, 감염 또는 수술적 중재술을 포함하는 임의의 요인 또는 제재에 의해 초래될 수 있었다. 상기 손상은 생명을 위협하거나 생명을 위협하지 않을 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "흡수성 물질(resorbable material)"은, 상처 치료 및/또는 조직 재생에 대해 상당한 방해를 하지 않고 임의의 물질대사 방해를 초래하지 않는 방식에서 소비되거나 제거된 구성요소로, 자발적으로 및/또는 포유 동물에 의해 반응을 일으키는 물질을 말한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "안정성"은 활성 및/또는 기능을 결정하는 물질의 특성을 유지하는 것을 말한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "결합제"는 지혈 드레싱 하나의 층의 다른 하나 이상의 층에 대한 접착력 및/또는 주어진 층의 구성요소의 그 층의 다른 구성요소에 대한 접착력을 개선시키는 화합물 또는 화합물의 혼합물을 말한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "가용화제"는 단백질 또는 (바람직하게는) 수성 용매에 있는 단백질의 용해를 개선시키는 화합물 또는 화합물의 혼합물을 말한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "충진제"는 지혈 드레싱의 하나 이상의 층에 벌크(bulk) 및/또는 다공성을 제공하는 화합물 또는 화합물의 혼합물을 말한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "이형제(release agent)"는 제조하는 주형으로부터 지혈 드레싱의 제거를 촉진하는 화합물 또는 화합물의 혼합물을 말한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "기포제(foaming agent)"는 적당한 조건 하에서 수화될 때, 기체를 생성하는 화합물 또는 화합물의 혼합물을 말한다.
"TG"는 임의의 유형의 트랜스글루타미나아제를 말하며; "mTG"는 또한 미생물의 트랜스글루타미나아제를 말하고, 그리고/또는 상기 문맥에 따라 결정되는 임의의 유형의 트랜스글루타미나아제를 말한다(하기의 특정 실험의 예에서, 상기 용어는 미생물의 트랜스글루타미나아제를 말한다).
"포유 동물"라는 용어는, 특히 치료 방법 및/또는 용도, 또는 장치 및/또는 조성물의 적용에 관하여, 달리 특정되지 않는다면, 인간 및 하등 포유 동물 둘 모두를 말한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "약"은 나타낸 값의 약 ±10%를 의미한다.
본 발명의 다른 특징 및 장점은 하기의 실시예 및 청구항에 의해 명백해질 것이다.
본원에서, 본 발명은 도면을 포함하고, 단지 예를 예시하는 방법에 의해 설명된다. 상세한 도면에 대해 특정된 참고로 나타낸 명세서는, 예를 예시하는 방법 및 단지 본 발명의 바람직한 실시예의 예시적인 논의의 목적을 위한 것임이 강조되고, 본 발명의 원리 및 개념적 양태를 가장 유용하고 쉽게 이해되도록 기술하는 것을 제공하기 위해 제시된다. 이를 고려하여, 본 발명의 기초적인 이해에 필요한 것보다 더 상세하게 본 발명의 구조적인 상세함을 나타내는 시도는 없었고, 상기 설명은 본 발명의 몇몇 형태가 실제로 어떻게 실시될 수 있는지를 당해 기술 분야에서 평균적 지식을 가진 자에게 명백하도록 하는 도면을 포함한다.
상기 도면에서:
도 1은 본 발명에 따른 예시적인 붕대의 구조적 블록도이다;
도 2는 선택적 흡수성 후면 및 선택적 플라스틱 포장으로 덮어진, 본 발명에 따른 예시적인 붕대의 정면도를 나타낸다;
도 3은 다공성 매트릭스를 혼입한, 본 발명에 따른 지혈 장치의 예시적인 구조적 블록도이다;
도 4는 상처 강도에 대한 시험된 젤라틴의 다른 백분율의 효과를 나타내는 그래프이다;
도 5는 트랜스글루타미나아제의 활성에 대한 온도의 효과를 나타낸다(시험된 온도 범위는 32℉ 내지 150℉이었고; 최적 범위는 122℉ 내지 131℉(50℃ 내지 55℃)이었다);
도 6은 조성물 A의 조직 접착제의 예시적인 파열(burst) 압력 측정을 나타낸다;
도 7은 조성물 B의 조직 접착제의 예시적인 파열 압력 측정을 나타낸다;
도 8은 겔의 형성 및 지혈의 유도를 나타내는 사진이다(도 8A는 전체 면적을 나타내고, 반면에 도 8B는 더 상세하게 확대한 일부 영역을 나타낸다);
도 9A는 대조군 용액의 적용 후의 응고 형성의 결여를 나타내고, 반면에 도 9B는 실험 용액의 겔화 및 지혈을 나타낸다;
도 10A 내지 10D는 동맥의 사진을 나타내며, 절단된 사진(10A); 절단된 동맥, 넘치는 출혈(10B); 상기 절단된 동맥에 본 발명의 조성물의 적용(10C); 및 생체모방 응고의 형성을 갖는 지혈(10D);
도 11A 및 11B는 2개의 구성요소 지혈 실란트 적용의 이중 주사 방법의 예를 나타낸다;
도 12A 및 12B는 혈관 삽입 지점 폐쇄의 예를 나타내고, 상기 카테터는 본원에서 기술된 구성요소에 의해 덮어진다.
본 발명은 교차 결합형 단백질 및 상기 교차 결합형 단백질에 교차 결합을 유도하는 무독성 물질을 포함하는 접착 물질에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 교차 결합형 단백질은 젤라틴 및 본원에서 언급된 바와 같은 임의의 젤라틴 변형 또는 변형 단백질을 포함한다. 선택적으로 그리고 바람직하게는, 상기 무독성 물질은 트랜스글루타미나아제(TG)를 포함하며, 이는 임의의 유형의 칼슘 의존적인 트 랜스글루타미나아제(mTG) 또는 칼슘 의존적이지 않은 트랜스글루타미나아제(mTG)(예를 들어, 선택적으로, 미생물의 트랜스글루타미나아제일 수 있다)를 선택적으로 포함한다. 본 발명의 일부 실시예에 따르면, 상기 접착 물질은 붕대로 제공되며, 바람직하게는 지혈 붕대로서의 사용을 위한 붕대로 제공된다. 본 발명의 다양한 실시예는, 임의의 방법으로 제한하는 의도도 없고, 단지 명백함을 위해 제공되는 특정 항목하에, 하기에서 더 상세하게 설명된다.
젤라틴 및 트랜스글루타미나아제
본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 지혈 및 조직 실링을 위한 조성물을 제공하며, 교차 결합 물질은 트랜스글루타미나아제 및 젤라틴을 포함하는 교차 결합형 단백질을 포함한다.
바람직한 실시예에 따르면, 예를 들어 상기 기재된 비율을 선택적으로 조정함으로써, 선택적으로 더 낮은 활성 수준이 또한 사용될 수 있다 하더라도, 트랜스글루타미나아제는 약 100 U/gm 이상의 특이적 활성 수준을 갖는 조성물 중에 존재한다. 선택적으로, 상기 조성물의 그러한 낮은 활성 수준은 바람직하게 약 20 U/gm 이상, 더 바람직하게 약 40 U/gm 이상, 더 바람직하게 약 60 U/gm 이상, 그리고 가장 바람직하게 약 80 U/gm 이상을 포함한다.
트랜스글루타미나아제는, 단독으로 또는 조성물의 일부로서, 바람직하게는, 소정의 양에 있는 젤라틴에 첨가되어, 상기 혼합물에 있는 생성된 트랜스글루타미나아제 활성은 바람직하게 약 25 U/g(젤라틴) 내지 약 100 U/g(젤라틴)이고 더 바람직하게 약 40 U/g(젤라틴) 내지 약 60 U/g(젤라틴)이다.
적당한 젤라틴 및 트랜스글루타미나아제는 당해 기술 분야에서 평균적 지식을 가진자에게 공지되고 입수가능한 임의의 방법에 의해 수득될 수 있다. 선택적으로, 젤라틴은 당해 기술 분야에서 공지된 단백질을 포함하는 임의의 유형의 젤라틴, 바람직하게는, 동물 조직의 부분적 가수분해 및/또는 동물 조직으로부터 수득된 콜라겐의 가수분해에 의해 얻어진 젤라틴을 포함하나 이에 제한되지 않으며, 상기 동물 조직은 동물 피부, 연결 조직(인대, 연골 등을 포함하나 이에 제한되지 않음), 사슴뿔(antler) 또는 녹용 등, 및/또는 뼈, 및/또는 어류 비늘 및/또는 뼈, 또는 다른 구성요소를 포함하나 이에 제한되지 않으며; 그리고/또는 박테리아, 효모, 동물, 곤충 또는 식물 시스템 또는 임의의 유형의 세포 배양을 사용하여 제조되는 재조합 젤라틴을 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 바람직하게 동물 기원으로부터의 젤라틴은 포유 동물 기원으로부터의 젤라틴을 포함하고, 더 바람직하게 하나 이상의 돼지 피부, 돼지 및 소의 뼈, 또는 분리된 소가죽(cattle hide), 또는 임의의 다른 돼지 또는 소 원료를 포함한다. 더 바람직하게는, 그러한 젤라틴은 돼지 젤라틴이 낮은 비율의 과민증을 갖기 때문에 이를 포함한다. 선택적으로, 동물 기원으로부터의 젤라틴은, 유형 A가 바람직할지라도, 유형 A(산으로 처리됨) 또는 유형 B(알칼리로 처리됨)일 수 있다.
바람직하게는, 동물 기원으로부터의 젤라틴은, 일반적으로 낮은 온도(이러한 정확한 온도 범위는 필수적으로 제한되지 않을지라도, 50℃ 내지 60℃)에서 수행된 최초의 추출 동안에 수득된 젤라틴을 포함한다. 이러한 방식으로 제조되는 젤라틴 은 250 내지 300 블룸(bloom)의 범위일 수 있고 약 95 kDa 내지 100 kDa 이상의 고분자량을 갖는다. 바람직하게는, 300 블룸 젤라틴이 사용된다.
그러한 젤라틴 제조자의 제한이 없는 예는 PB Gelatins(Tessenderlo Group, Belgium)이다.
본 발명의 일부 실시예에 따르면, 선택적으로, 동물 기원으로부터의 젤라틴은 어류로부터의 젤라틴을 포함한다. 선택적으로, 임의의 유형의 어류가 사용될 수 있고, 바람직하게 한류종의 어류(예를 들어 잉어(carp), 대구, 또는 창꼬치(pike), 또는 참치)가 사용될 수 있다. 이러한 젤라틴의 pH(10% 용액에서 측정됨)는 바람직하게 4 내지 6의 범위이다.
한류종의 어류 젤라틴은 10℃ 물에서 용액을 형성하고, 따라서 모든 한류종의 어류 젤라틴은 0 블룸으로 간주된다. 본 발명에 대해, 바람직하게는 고분자량 한류종의 어류 젤라틴이 사용되고, 더 바람직하게는약 95 kDa 내지 100 kDa 이상의 분자량을 포함한다. 이는 250 내지 300 블룸 분자량의 동물성 젤라틴과 등가이다. 한류종의 어류 젤라틴은, 프롤린 및 하이드록시프롤린의 낮은 수준의 결과로서, 동물성 젤라틴보다 훨씬 낮은 온도에서 열-가역적인 겔화를 한다. 1000 아미노산 당 존재하는, 동물성 젤라틴에서의 135 내지 145 프롤린 및 90 내지 100 하이드록시프롤린과 비교하여, 한류종의 어류 젤라틴은 100 내지 130 프롤린 및 50 내지 75 하이드록시 프롤린 그룹을 갖는다(문헌[Haug IJ, Draget KI, Smidsrφd O. (2004). Food Hydrocolloids. 18:203-213]참조).
그러한 젤라틴 제조자의 제한이 없는 예는 Norland Products(Cranbury, NJ) 이다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 염을 제거하여 상기 젤라틴을 정화한다. 이는 앞서 설명한 기술에 따라 수행될 수 있다. 그러한 기술 중 하나는 물에서 젤라틴의 20% w/v 용액을 형성하고, 교반하에서 60℃로 가열하는 것을 포함한다. 그런 다음, 상기 혼합물을 밤새도록 둔다. 염을 제거하기 위해 수득된 젤을 탈이온수의 반복된 변화에 대해 투석하고, 교반하고, 50℃로 가열하여 물리적 망상체를 분해한다. 최종 용액을 여과하고 냉동 건조하였다(문헌[Crescenzi V, Francescangeli A, Taglienti A. (2002). Biomacromolecules. 3: 1384-1391]참조). 선택적으로, 상기 젤라틴을 크기 배제 컬럼(size exclusion column)에 의해 탈염화시킬 수 있다.
본 발명의 일부 실시예에 따르면, 재조합 젤라틴을 사용한다. 재조합 젤라틴은 현재 FibroGen(Sanfrancisco, CA)에 의해 상업적으로 제조된다. 현재 바람직한 방법은 Type Ⅰ의 특이 조직, alpha 1 인간 서열 콜라겐을 표현하기 위해 재조합 효모 시스템(Pichia Pastoris)를 사용하는 것이다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 재조합 젤라틴은 인간 또는 임의의 동물로부터 오염되지 않은 구성요소를 함유하는 완전히 합성된 분자이다. "합성"은, 상기 젤라틴이 화학적 합성, 무세포 단백질 합성, 세포 조직 배양, 임의의 유형의 박테리아, 곤충 또는 효모 배양 또는 식물로부터 선택되는 방법에 따라 바람직하게 제조된다는 것을 의미한다. 합성 젤라틴의 사용은 많은 변이들 및 조직-유래된 물질과 관련된 문제점(원하지 않는 면역 반응을 유발하는 것을 포함함)을 제거한다. 예를 들어, 어류 젤라틴은 높은 알레르기성을 나타내고 동물성 젤라틴은 약간의 알레르기성을 나타내는 반면에, 재조합 젤라틴은 제로(zero) 알레르기성을 가질 수 있다. 인간의 안전성 연구에서, 재조합 젤라틴과 관련된 부작용 사례가 발견되지 않았다.
재조합 젤라틴을 생성하는 방법 및 그 용도의 이익은 본원에서 상기의 참고로 전체로서 인용한 미국 특허 제6,413,742호 및 제6,992,172호에서 전체로 개시된다.
재조합 젤라틴을 매우 높은 순도(99%)로 제조할 수 있다. 재조합 젤라틴 제조는, 정의된 분자량, pI(등전점), 보증된 롯트에 따른(lot-to-lot) 재현성을 포함하나 이에 제한되지 않는, 하나 이상의 정의되고 기결정된 특징을 갖는 젤라틴의 선택적 제조를 가능하게 하고, 특정 적용에 적합하도록 상기 분자를 맞출 수 있게 한다.
특정 적용에 적합하도록 상기 분자를 맞추는 예는 앞서서 설명하였고, 젤라틴을 고도의 친수성으로 생성하였다(문헌[Werten MWT, et al. (2001). Protein Engineering. 14 (6): 447-454]참조). 선택적으로 그리고 바람직하게는, 본 발명에 따른 젤라틴은 하나 이상의 조절된, 맞춰진 또는 기결정된 특징을 갖는 젤라틴을 포함한다.
본 발명에 따라 선택적으로 맞춰질 수 있는 다른 유형의 특징의 제한이 없는 예는 열-가역적인 겔화를 하거나 하지 않는 것을 포함한다. 열-가역적인 겔화를 하거나 하지 않고서도 재조합 젤라틴을 생성할 수 있다. 천연의 동물성 젤라틴의 하나 이상의 유리한 특징을 가지나 열-가역적인 겔화를 하지 않는 젤라틴은 정상적으로 열-가역적인 겔화를 하는 온도에서, 다른 수단에 의해 교차 결합 겔화를 가능하게 하는 엄청난 양의 이용을 갖는다. 그러한 겔화는 또한 본 발명의 일부 실시예에 의해 포함된다.
동물성(소, 돼지 및 기타 등등) 젤라틴, 난류성 어류 젤라틴 및 재조합 젤라틴(겔화 유형)은, 35 ℃(degree) 내지 40 ℃ 사이에서 특히 고분자량 및/또는 고농도(>20%), 그리고/또는 변형(들) 및/또는 하나 이상의 추가적인 물질들(하가의 설명을 참고함)로 열-가역적인 겔화를 할 수 있다. 실온에서, 이들은 겔 형태로 있고 mTG와 쉽게 혼합될 수 없다. 본 발명의 일부 실시예에 따른 조성물의 다양한 변형이 실온에서 액체 형태에 있는 젤라틴 용액을 유지하기 위해 하기에서 기술된다.
한류종의 어류 젤라틴 및 재조합 젤라틴(비-겔화 유형)은, 추가적인 변형 및/또는 하나 이상의 추가적인 물질의 존재 없이, 실온에서 열-가역적인 겔을 형성하지 못한다. 이들은 실온 미만에서 전이점을 갖는다. 실온에서, 이들은 용액으로 있고 추가적인 변형 없이 mTG와 반응할 수 있다.
재조합 젤라틴에 관한 본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 적당한 시험관내 배양 시스템을 상기 재조합 젤라틴을 제조하기 위해 사용한다. 재조합 젤라틴의 제조를 위한 재조합 메탄올자화 효모 시스템의 사용 이외에, 다른 유기체를 사용하였다.
E.coli에서 수득된 발현 수준이 오히려 낮고 세포 내에 생성된 단백질의 정 화가 어려울 수 있을지라도, 재조합 젤라틴-같은 단백질을 Escherichia coli로 표현하였다. 젤라틴-같은 단백질의 표현을 위해 Bacillus brevis를 사용하였으며, 서열 확장(sequence stretch)는 천연의 콜라겐 유전자로부터 선택되며 반-합성 젤라틴을 형성하기 위해 중합체화된다(문헌[Werten MWT 등. Secreted production of a custom - designed , highly hydrophilic gelatin in Pichia pastoris . Protein Engineering, Vol. 14, No. 6, 447-454, June 2001]참조).
재조합 젤라틴을 제조하는 데에서 추가적인 성공 노력은 포유 동물 및 곤충 세포를 사용하여 재조합 젤라틴을 제조하는 것을 포함하였다. 콜라겐 및 젤라틴은 또한 형질전환 담배 식물, 형질전환 쥐에서 발현되었다. 형질전환 누에 시스템이 콜라겐 서열을 함유하는 융합 단백질을 제조하기 위해 사용되었다. 이러한 시스템은 프롤릴 하이드록시라아제의 과대 발현에 의해 극복될 수 있는 완전히 수산화된 콜라겐을 제조하기 위한 충분한 내생적 프롤릴 하이드록시라아제 활성이 없다(문헌[Olsen D 등. Recombinant collagen and gelatin for drug delivery . Adv Drug Deliv Rev . 2003 Nov 28;55(12): 1547-67]참조). 선택적으로, 식물에 근거한 시스템이 또한 사용될 수 있다: 예를 들어 아이오와 주립 대학과 파이브로젠(Fibrogen)의 공동 연구는 형질전환 옥수수에서 젤라틴의 발현을 개발하는 것이다.
지혈 드레싱에 사용된 젤라틴은 젤라틴 복합체 또는 임의의 젤라틴, 또는 그의 유도체 또는 대사산물, 또는 단일 공정 또는 복수의 공정에 따라 제조되는 젤라틴일 수 있다. 선택적으로, 예를 들어 상기 젤라틴은 젤라틴 유형 A 또는 젤라틴 유형 B, 또는 그의 조합을 포함할 수 있다.
선택적으로, 트랜스글루타미나아제는, 혈액에서 유래된 인자 Ⅷ가 아닌, 식물, 재조합물, 동물 또는 미생물로부터 유래된 트랜스글루타미나아제를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 스트렙토베르티실리움 모바라엔시스(mobaraensis)로부터 유래된 미생물의 트랜스글루타미나아제가 사용된다.
선택적으로, 트랜스글루타미나아제는 예를 들어 안정화제 또는 충진제와 같은 하나 이상의 물질을 포함하는 조성물로 존재할 수 있다. 그러한 물질의 제한이 없는 예는 말토덱스트린, 가수분해된 스킴(skim) 우유 단백질 또는 임의의 다른 단백질 물질, 염화 나트륨, 홍화유(safflower oil), 트리소듐 포스페이트, 소듐 카세테이트 또는 락토스, 또는 그의 조합을 포함한다.
가공하지 않은 트랜스글루타미나아제 활성의 최적 pH가 6.0일지라도, pH 5.0 내지 pH 8.0의 범위에서 높은 활성으로 또한 작용한다. 따라서, 바람직하게는 지혈을 위한 본 발명에 따른 조성물은 약 5 내지 약 8 범위의 pH 값을 갖는다.
트랜스글루타미나아제는 음의 온도 계수로 특징화된다. 상기 트랜스글루타미나아제 활성의 온도 범위에 걸쳐서, 고온에서는 반응하는 것이 더 짧은 시간이 걸리고, 저온에서는 작용을 시작하기에 더 많은 시간이 걸린다. 하기의 표는, 50℃, pH 6.0에서 10분 후에 일어나는 반응과 동일한 반응 등급과 비교하여, 다른 온도에서 다른 반응 시간을 나타낸다.
트랜스글루타미나아제의 반응 온도
온도 5℃ 15℃ 20℃ 30℃ 40℃
시간(분) 240 105 70 35 20
상업적으로 구입가능한 트랜스글루타미나아제 제품의 제한이 없는 예는 Ajinomoto Co.(가와사키, 일본)에 의해 제조되는 것들을 포함한다. 이 회사로부터의 그러한 제품의 바람직한 예는 Activa TG-TI(유럽에서:Activa WM)이다-원료: mTG 및 말토덱스트린; 활성: Activa의 81 U/g 내지 135 U/g. 이 회사로부터의 적당한 제품의 다른 제한이 없는 예는 Activa TG-FP(원료: 가수분해된 스킴 우유 단백질, mTG; 활성: Activa TG-FP의 34 U/g 내지 65 U/g); Activa TG-GS(원료: 염화나트륨, 젤라틴, 트리소듐 포스페이트, 말토덱스트린, mTG 및 홍화유(산으로 처리됨); 활성: Activa TG-GS의 47 U/g 내지 82 U/g); Activa TG-RM(유럽에서:Activa EB)-원료:소듐 카세네이트, 말토덱스트린 및 mTG; 활성: Activa의 34 U/g 내지 65 U/g; Activa MP(원료: mTG, 락토스 및 말토덱스트린; 활성 Activa의 78 U/g 내지 126 U/g).
상업적으로 구입가능한 트랜스글루타미나아제 제품의 다른 제한이 없는 예는 Yiming Biological Products Co.(Jiangsu, China)에 의해 제조되는 것들을 포함한다. 이 회사로부터의 그러한 제품의 바람직한 예는 TG-B(원료: 1% mTG, 99% 공동-단백질; 활성: TG-B의 80 U/g 내지 130 U/g)이다. 이 회사로부터의 적당한 제품의 다른 제한이 없는 예는 TG-A(원료: 0.5% mTG, 99.5% 공동-단백질; 활성: TG-A의 40 U/g 내지 65 U/g)를 포함한다.
상기 두 예들에 있어서, 바람직한 트랜스글루타미나아제 제품은, 그들이 적용에 대한 최상의 반응성 및 원하지 않는 부작용에 대한 낮은 가능성을 갖는다고 믿는 바와 같이(하나의 가설에 의해 제한되기를 원하지 않음), 가장 높은 특이적 활성 및 가장 단순한 공동-원료를 갖는 것이다.
또 다른 실시예에서, 선택적으로 낮은 온도(각각이 대략 37℃ 및 37℃ 내지 45℃)에서 선택적으로 작용하는 것을 나타내는 효소 변형을 생성하기 위해, 트랜스글루타미나아제를 스트렙토베르티실리움 발다치 또는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 균주으로부터 추출할 수 있다(문헌[Negus SS. A Novel Microbial Transglutaminase Derived From Streptoverticillium Baldaccii. PhD Thesis. School of Biomolecular and Biomedical Science. Griffith University , Queensland , Australia] 그리고 문헌[Cui L 등. Purification and characterization of transglutaminase from a newly isolated Streptomyces hygroscopicus. 2007: 105(2). p. 612-618]참조). 낮은 온도에서 더 높은 특이적 활성은 주위 조건 하에서 젤라틴의 교차 결합을 더 빠르고 강하게 달성하기 위해 바람직하다.
일부 실시예에 따르면, 트랜스글루타미나아제는 상기에서 설명된 조성물의 임의의 형태로 사용될 수 있으며, 선택적으로 이는 트랜스글루타미나아제를 포함하는 임의의 상업적으로 구입가능한 혼합물을 포함한다.
또 다른 실시예에서, 상기에서의 임의의 트랜스글루타미나아제 혼합물은 그의 운반 단백질 및/또는 탄수화물을 선택적으로 제거하기 위해, 겔 여과, 양이온(cation)-교환 크로마토그래피, 중공사형(hollow fiber) 여과 또는 접선 흐름(tangential flow) 여과의 방법에 의해 정화될 수 있다. 일부 방법은 앞서 설명하였다(문헌[Bertoni F, Barbani N, Giusti P, Ciardelli G. Transglutaminase reactivity with gelatine : perspective applications in tissue engineering Biotechnol Lett (2006) 28:697-702] 및 문헌[Broderick EP 등. Enzymatic Stabilization of Gelatin - Based Scaffolds J Biomed Mater Res 72B: 37-42, 2005]참조). 여과에 사용된 여과기 세공 크기는 바람직하게는 대략 10 kDA이다.
그럼에도 불구하고, 트랜스글루타미나아제의 활성은 바람직하게는 본 발명에 따른 조성물의 사용 및/또는 제조 이전에 트랜스글루타미나아제 반응성 분석으로 측정된다. 선택적으로, 그러한 분석은 하이드록사메이트 방법(Hydroxamate Method), 네슬러 분석(Nessler's Assay), 비색 분석(Colorimetric Assay) 또는 트랜스글루타미나아제 활성의 임의의 다른 분석(예를 들어, 문헌[Folk JE, Cole PW. Transglutaminase: mechanistic features of the active site as determined by kinetic and inhibitor studies. Biochim Biophys Acta. 1966; 122:244-64]; 또는 문헌[the Nessler Assay as described in: Bertoni F, Barbani N, Giusti P, Ciardelli G. Transglutaminase reactivity with gelatine: perspective applications in tissue engineering Biotechnol Lett (2006) 28:697-702]을 참고함)을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
일반적으로, 지혈 조성물에 사용하기 위한 젤라틴 및/또는 트랜스글루타미나아제의 순도 및/또는 질은, 단백질의 효능 및 안정성을 일으키기 위한, 관련 분야에서 평균적 지식을 가진 자에게 공지된 적당한 순도일 것이다.
젤라틴과 다른 교차 결합 기질용 단백질
상기에서 언급한 바와 같이, 바람직하게는 상기 교차 결합형 단백질은 젤라틴을 포함하나, 추가적으로 또는 선택적으로, 또 다른 유형의 단백질을 포함할 수 있다. 본 발명의 일부 실시예에 따르면, 상기 단백질은 또한 트랜스글루타미나아제를 위한 기질이고, 바람직하게는 적당한 트랜스글루타미나아제-특이적인 폴리펩티드 및 중합체 서열을 특징으로 한다. 선택적으로, 이러한 단백질은 생체 접착성을 형성하는 성질을 독립적으로 갖는 합성된 중합체 서열 또는 더 바람직하게 트랜스글루타미나아제에 의해 교차 결합된 물질의 능력을 강화시키는 트랜스글루타미나아제-특이적인 기질로 변형된 중합체를을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 이러한 유형의 물질의 각각의 제한이 없는 예는 하기에서 설명된다.
합성된 폴리펩티드 및 교차 결합을 위한 적당한 트랜스글루타미나아제 표적을 갖는 중합체 서열은 바람직하게 약 20℃ 내지 약 40℃의 전이점을 갖도록 개발되었다. 원하는 물리적 특징은 조직을 결합하는 능력 및 섬유(fiber)를 형성하는 능력을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 겔화 유형의 젤라틴과 같이(상기에서 설명함), 선택적으로 이러한 폴리펩티드는 그의 전이점보다 낮은 하나 이상의 물질을 특징으로 하는 조성물에서 사용될 수 있다.
그러한 펩티드의 제한이 없는 예는 미국 특허 제5,428,014호 및 제5,939,385호에 설명되었으며, 둘 모두는 ZymoGenetics Inc에 의해 출원되었고, 둘 모두는 본원에서 참고로 전체가 인용되었다. 미국 특허 제5,428,014호는 생체 적합성, 생체 접착성, 트랜스글루타미나아제 교차 결합형 폴리펩티드를 설명하였고, 트랜스글루타미나아제는 ε-(γ-글루타밀)리신 이소펩티드 결합을 형성하는, 단백질-결합된 글루타미닐 잔기(residue)의 γ-카르복스아미드 그룹 및 리신(Lys) 잔기의 ε-아미노 그룹사이의 아실-전이 반응을 촉진하는 것으로 공지되어 있다.
예를 들어, 13 내지 120 아미노산 잔기를 갖는 폴리펩티드는 식 S1-Y-S2의 부분을 포함하는 것으로 설명되며, 여기서 S1은 Thr-Ile-Gly-Glu-Gly-Gln이고, Y는 1 내지 7 아미노산의 스페이서(spacer) 펩티드 또는 존재하지 않으며, 그리고 S2는 Xaa-Lys-Xaa-Ala-Gly-Asp-Val이다. 선택적으로, 상기 스페이서 펩티드 Y는 Gln-His-His-Leu-Gly, Gln-His-His-Leu-Gly-Gly 또는 His-His-Leu-Gly-Gly이다. 또한 선택적으로, S2의 Xaa, 아미노산 1은 Ala 또는 Ser이다. 선택적으로, 상기 스페이서 펩티드는 His-His-Leu-Gly를 포함한다. 선택적으로 그리고 바람직하게는, Y 및 S2의 하나 이상은 Gln 잔기가 없는 것이다. 선택적으로, 상기 폴리펩티드의 카르복실 말단 아미노산 잔기는 Pro 또는 Gly이다. 상기 폴리펩티드의 특정 제한이 없는 예는 하기를 포함한다: Thr-Ile-Gly-Glu-Gly-Gln-Gln-His-His-Leu-Gly-Gly-Ala-Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val, Thr-Ile-Gly-Glu-Gly-Gln-Gln-His-His-Leu-Gly-Ala-Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val, Thr-Ile-Gly-Glu-Gly-Gln-His-His-Leu-Gly-Gly-Ala-Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val 또는 Leu-Ser-Gln-Ser-Lys-Val-Gly. 상기 특허는 또한, 이러한 펩티드를 포함하는, 고분자량, 생체 적합성, 생체 접착성, 트랜스글루타미나아제-교차 결합형 공중합체 및 단일 중합체를 또한 설명한다.
미국 특허 제5,939,385호는 생체 적합성, 생체 접착성 트랜스글루타미나아제 교차 결합형 폴리펩티드를 설명한다. 바람직하게는, 이러한 폴리펩티드는 식 S1-Y-S2의 부분을 포함하는 9 내지 120의 아미노산 잔기를 갖는다: S1은 Ile-Gly-Glu-Gly-Gln, Gly-Glu-Gly-Gln, Glu-Gly-Gln 및 Gly-Gln으로 이루어진 그룹으로부터 선택되며; Y는 His-His-Leu-Gly-Gly 또는 His-His-Leu-Gly이며; 및 S2는 Ala-Lys-Gln-Ala-Gly-Asp, Ala-Lys-Gln-Ala-Gly, Ala-Lys-Gln-Ala, Ala-Lys-Gln, Ala-Lys-Ala-Gly-Asp-Val, Ala-Lys-Ala 및 Ala-Lys로 이루어진 그룹으로부터 선택되며, 상기 폴리펩티드는 아미노-말단 및 카르복시-말단을 갖고 트랜스글루타미나아제에 의해 교차 결합된다. 바람직한 폴리펩티드는 Gly-Gln-His-His-Leu-Gly-Gly-Ala-Lys-Gln이다. 또한 바람직하게는, 상기 폴리펩티드는 탄성 폴리펩티드에 의해 상기 아미노-말단 및 상기 카르복시-말단 중 하나 또는 둘 모두의 측면에 위치한다. 이는 탄성 폴리펩티드를 더 제공하며, 상기 탄성 폴리펩티드는 펜타펩티드 또는 테트라펩티드, 특히 측면에 위치한 폴리펩티드이며, 상기 측면에 위치한 탄성 폴리펩티드는 Val-Pro-Gly-Val-Gly, Ala-Pro-Gly-Val-Gly, Gly-Val-Gly-Val-Pro, Val-Pro-Gly-Gly 또는 그의 임의의 부분이고, 바람직하게는 상기 측면에 위치한 폴리펩티드의 아미노-말단은 Val이고 상기 측면에 위치한 폴리펩티드의 카르복시-말단은 Gly이다. 상기 특허는 또한 이러한 펩티드를 포함하는 고분자량, 생체 적합성 생체 접착성, 트랜스글루타미나아제-교차 결합형 공중합체 및 단일중합체를 설명한다.
이러한 특허는 상처 봉합 및 다양한 다른 의료적 적용에서, 조직 접착제로서의 사용을 위한 설명된 펩티드 및 중합체의 유용함을 인식한다. 그러나, 둘 모두의 특허는 이러한 펩티드 및 중합체의 원하는 전이점이 20℃ 내지 40℃이라고 기록하고, 더 낮은 전이점이 필요하다고 인식하여, 상기 펩티드/중합체는 상처 부위에서 트랜스글루타미나아제와 반응할 수 있을 것이다. 상기 두 특허는 아래와 같이 기재되어 있다: 상기 중합체의 전이 온도는 트랜스글루타미나아제에 의해 교차 결합될 수 있는 폴리펩티드 단량체인 폴리펩티드의 수에 의해 조절될 수 있다. 당해 기술 분야의 평균적 지식을 가진 자에 의해 이해될 바와 같이, 임상적 적용에 대해, 상기 적용 시간에서 전이 온도의 감소는 상기 상처 부위에서 매트릭스의 빠른 고형화를 촉진할 것이다.
자연적으로, 생체 접착제로서 사용하기 위한 교차 결합된 중합체의 응집 및 접착 세기를 최대로 하기 위해서, 교차 결합형 단량체를 제거하는 것은 종종 가능하지 않는다. 사실은, 그러한 접착제의 응집 및 접착 세기를 최대화하기 위해, 교차 결합형 단량체 기질을 더 첨가하는 것은 일반적으로 바람직하다. 따라서, 이러한 특허에서 설명된 중합체의 생체 접착성 잠재력은 상기 중합체 용액의 전이 온도에 의해 상당히 제한된다.
본 발명의 바람직한 실시예는 지혈, 조직 부착 및 조직 실란트 적용에의 사용을 위한 이러한 폴리펩티드 또는 중합체의 이용을 상당히 진보시켰다. 예를 들어, 다른 실시예는 실온에서 겔화되는 중합체의 전이점을 낮추기 위해 하기에서 설명된다. 이러한 계획은 이러한 특허에서 설명된 펩티드 서열 및 중합체의 전이점을 낮추는 데에 이용될 수 있다.
또한 하기에서 더 상세하게 설명된 바와 같이, 바람직하게는 상기 특허(본 발명의 본원에서 설명된 임의의 사용을 교시 또는 제안하지 않음)에서 설명된 원래의 사용과 대조적으로, 이러한 중합체의 양은 본 발명의 실시예에 따르면 다르다. 예를 들어, 조직 접착제 키트(kit)에서의 사용을 위한 이러한 특허에서 교시된 중합체 농도 범위는 5 mg/ml 내지 100 mg/ml이고, 바람직하게는 35 mg/ml 내지 50 mg/ml이다. 본 발명의 일부 실시예는 더 높은 중합체 농도, 예를 들어 150 mg/ml 내지 250 mg/ml의 범위를 포함한다. 더 높은 트랜스글루타미나아제 농도는 또한 본 발명의 일부 실시예에 대해 바람직하다.
다른 합성 기질은 또한 본 발명의 일부 실시예에 따르면 제공될 수 있다. 바람직하게는, 짧은 트랜스글루타미나아제 기질이 합성된 후 연결되고, 그리고/또는 큰 중합체 분자에 결합된다. 상기 트랜스글루타미나아제 기질은 일반적으로 매우 짧다(< 20 아미노산 잔기). 그러한 기질의 용해점 및 전이점은 상기 기질이 부착된 중합체에 따라 결정된다. 예를 들어, 상기 기질이 겔화 젤라틴에 부착된다면,이러한 새로운 합성 분자의 용액은 실온에서 액체 형태을 유지하기 위해 또 다른 물질의 첨가를 요구할 것이다.
이러한 유형의 물질의 제한이 없는 예는 미국 특허 제7,207,171호에서 설명되고, 이는 본원에서 참고로 전체 개시물이 인용되며, 트랜스글루타미나아제 기질 펩티드의 합리적 고안을 설명한다. 상기 고안 계획은 트랜스글루타미나아제 교차 결합에 대해 구입가능한 아실 공여체(donor) 글루타미닐-펩티드 기질 및 아실 수용체(acceptor) 리신-펩티드 기질의 수를 최대화하는 것에 근거하였다. 이외에, 상기 Lys 및 Glu 기질 펩티드는 트랜스글루타미나아제의 공지된 생체거대분자 및 합성 펩티드 기질의 기본적인 특징을 갖도록 고안되었다. 예를 들어, 상기 Glu 기질 펩티드는 2 내지 5의 연속하는 Glu 잔기를 함유하였는데, 이는 펩티드가 Glu 반복의 길이를 증가시킴으로써 더 우수한 트랜스글루타미나아제 기질이 된다는 증거 및(문헌[Gorman, J. J.; Folk, J. E. J. Biol. Chem. 1980, 255, 419-427. & Kahlem, P.; Terre, C; Green, H.; Djian, P. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1996, 93, 14580-14585]참조), 2개 이상의 인접한 Glu 잔기를 함유하는 단백질은 우수한 기질로 공지되었다는 증거에 근거하였다(문헌[Etoh, Y.; Simon, M.; Green, H. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1986, 136, 51-56. & Hohenadl, C; Mann, K.; Mayer, U.; Timpl, R.; Paulsson, R.; Aeschlimann, D. J. Biol. Chem. 1995, 270, 23415-23420]참조). Leu 잔기는 몇몇 펩티드에 있는 C-말단 근처의 Glu에 인접하여 위치되었고, 이는 Glu 특이성에서 상당한 증가를 가져온다는 것을 나타내었기 때문이다(문헌[Gross, M.; Whetzel, N. K.; Folk, J. E. J. Biol. Chem. 1975, 250, 4648-4655]참조). Lys 기질 펩티드를 고려하여, 상기 조성물 및 펩티드 및 단백질 기질에 있는 리신 잔기에 인접한 아미노산의 서열은 아민 특이성에 대한 효과를 가질 수 있다(문헌[Groenen, P.; Smulders, R.; Peters, R. F. R.; Grootjans, J. J.; Vandenijssel, P.; Bloemendal, H.; Dejong, W. W. Eur. J. Biochem. 1994, 220, 795-799. & Grootjans, J. J.; Groenen, P.; Dejong, W. W. J. Biol. Chem. 1995, 270, 22855-22858]참조). 최종적으로, 모든 펩티드에서, Gly 잔기는 C-말단 측면에 첨가되어 상기 펩티드-중합체 컨쥬게이트(conjugate)에 있는 펩티드와 중합체 사이에서 스페이서로 작용하며, 상기 컨쥬게이트에 있는 펩티드는 효소에 더 접근가능할 수 있다.
본 특허에서 설명된 펩티드의 트랜스글루타미나아제 특이성 분석은 이들이 높은 트랜스글루타미나아제 결합 특이성을 갖는 아실 수용체 및 아실 공여체 기질을 성공적으로 생성하였다는 것을 입증하였다. 이러한 기질이 PEG, 덴드리머, 키토산, 젤라틴, 가용성 콜라겐, 히알루론산, 알기네이트 및 알부민에 공유적으로 컨쥬게이트될 수 있다는 것을 본 특허에서 제안하였다. 본 특허는 용액 또는 액체 형태에 있는 그러한 중합체-펩티드 컨쥬게이트가 수술 실란트 및/또는 의료적 접착제로 사용될 수 있다는 것을 제안한다.
본 특허가 매우 특이적인 트랜스글루타미나아제-교차 결합형 펩티드 기질을 설명하더라도, 본 발명의 일부로서 설명된 진보된 적용 방법 또는 물질 변형을 교시하거나 제안하지는 않으며, 본 발명의 조성물을 교시 또는 제안하는 것도 아니다. 그러나, 본 특허의 교시된 기질은 트랜스글루타미나아제 교차 결합을 통해 생성된 생체 접착성을 강화시키는 데에 또는 다른 비-트랜스글루타미나아제-특이적인 중합체로부터 그러한 생체 접착성을 생성하는 데에 유용할 수 있다. 이러한 기질은 본 발명에 유용하기 위해, 본원에서 기술된 바와 같은 하나 이상의 다른 단백질 또는 스캐폴드와 결합을 필요로 할 수 있다.
트랜스글루타미나아제 이외의 교차 결합 물질
상기에서 언급된 바와 같이, 바람직하게는 교차 결합 물질은 트랜스글루타미나아제를 포함하나, 또한 추가적으로 또는 선택적으로, 또 다른 유형의 교차 결합 물질을 포함할 수 있다.
그러한 교차 결합제의 제한이 없는 예는 카보디이미드(예를 들어, N,N-(3-(디메틸아미노)프로필)-N-에틸 카보디이미드(EDC), EDC를 갖는 N-하이드록시석신이미드(NHS)가 있음) 또는 폴리(L-글루탐산)(PLGA) 및 폴리아크릴산과 함께 사용된 카보디이미드를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 그러한 교차 결합제는 티로시나제(Tyrosinase) 또는 키토산을 갖는 티로시나제를 포함할 수 있다. 또 다른 실시예에서, 교차 결합(중합체화)은 자외선 또는 γ-광선으로 광-개시된다. 또 다른 실시예에서, 교차 결합제는 알킬렌, 시트르산(탄산) 또는 나노-하이드록시아파타이트(Nano-hydroxyapataite)(n-HA)+폴리(비닐 알콜)(PVA)를 포함할 수 있다.
또 다른 실시예에서, 교차 결합제는 식물-유래된 폴리페놀(즉, 카페인산(3,4-디하이드록시신나민산)과 같은 수산화된 신나민산)(예를 들어, 클로로겐산(그의 퀸산 에스테르), 카프타르산(caftaric acid)(그의 타르타르산 에스테르) 및 플라보노이드(즉 케르세틴 및 루틴과 같음)이다. 또 다른 실시예에서, 상기 추가적인 교차 결합제는 산화된 단당류 또는 이당류, 옥소-락토스 또는 당류 부분에 근거한 디알데히드(갈락토-헥소디알도스)(GALA)이다. 또 다른 실시예에서, 게니핀(Genipin) 또는 다른 이리도이드(iridoid) 글루코시드 유도체, 또는 세코이리도이드(Secoiridoid), 바람직하게 올러유러핀(oleuropein)은 상기 교차 결합제를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 상기 교차 결합제는 티올-반응성 폴리(에틸렌 글리콜)이다. 또 다른 실시예에서, 상기 교차 결합제는 덱스트란, 산화된 덱스트란, 덱스트란 디알데히드이다. 또 다른 실시예에서, 상기 교차 결합제는 라카아제 또는 빌리루빈 산화효소와 같은 다중-구리(multi-copper) 산화효소이다.
예시적인 조성물
선택적으로, 상기에서 설명된 교차 결합 기질 및 교차 결합 물질은 본 발명에 따른 다양한 조성물을 형성하기 위해 하나 이상의 추가적인 물질과 혼합될 수 있다. 일부 실시예에 따르면, 선택적으로 그리고 바람직하게는 접착 물질은 (ⅰ) 젤라틴, (ⅱ) 트랜스글루타미나아제를 포함하며, 상기 젤라틴 및 트랜스글루타미나아제는 개별적으로 또는 함께 입자로 형성된다. 더 바람직하게는, 상기 젤라틴 및 트랜스글루타미나아제는 실링, 지혈 제재로서 이용되는 데에 충분한 양으로 제공된다.
각각의 다양한 양 및 그의 비율은 앞서 설명되었다. 트랜스글루타미나아제 함유량은 반응속도를 증가시키기 위해 증가되거나, 또는 안정성을 향상시키기 위해 감소될 수 있다. 본 발명의 일부 실시예에 따르면, 바람직하게는 젤라틴의 15% 내지 30% 용액이 적용된 후 트랜스글루타미나아제의 15% 내지 30% 용액이 적용된다.
또한, 하나 이상의 보충제가 또한 지혈 제품(예를 들어, 성장 인자와 같은 약제, 폴리클론성 및 모노클론성 항체 및 다른 화합물)에 함유될 수 있다. 그러한 보충제의 예시적인 예는 하기를 포함하나 이에 제한되지 않는다: 항생물질(예를 들어, 테트라시클린tetracycline) 및 시프로플록사신(ciprofloxacin), 아목시실린(amoxicillin) 및 메트로니다졸(metronidazole)); 항응고제(예를 들어, 활성화된 단백질 C(activated protein C), 헤파린, 프로스트라시클린(prostracyclin)(PGI2), 프로스타글란딘(prostaglandins), 류코트리엔(leukotrienes), 항 트렌스글루타미나아제 Ⅲ(antitransglutaminase Ⅲ), ADPase 및 플라스미노젠 활성제(plasminogen activator)); 스테로이드(예를 들어, 덱사메타손(dexamethasone), 프로스타시클린의 억제제, 프로스타글란딘(prostaglandins), 류코트리엔(leukotrienes) 및/또는 염증을 억제하는 키닌(kinins)); 심혈관계 약제(cardiovascular drugs)(예를 들어, 칼슘 채널 차단제(calcium channel blockers), 혈관확장제(vasodilators) 및 혈관수축제(vasoconstrictors)); 화학유인물질(chemoattractants); 국부 마취제(local anesthetics)(예를 들어, 부피바카인(bupivacaine); 및 항증식성/항종양성 약제(예를 들어, 5-플루오로우라실(5-fluorouracil)(5-FU), 택솔(taxol) 및/또는 택소텔(taxotere)); 항바이러스제(예를 들어, 강시클로버(gangcyclovir), 지도부딘(zidovudine), 아만티딘(amantidine), 비다라빈(vidarabine), 리바라빈(ribaravin), 트리플루이딘(trifluridine), 아시클로버(acyclovir), 디데옥시우리딘(dideoxyuridine) 및 바이러스 구성요소 또는 유전자 제품에 대한 항체); 사이토카인(cytokines)(예를 들어, 알파- 또는 베타- 또는 감마-인터페론, 알파- 또는 베타 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor) 및 인터루킨(interleukins)); 콜로니 자극 인자(colony stimulating factors); 에리스로포이에틴(erythropoietin); 항진균제(예를 들어, 디플루칸(diflucan), 케타코니졸(ketaconizole) 및 니스타틴(nystatin); 구충제(antiparasitic agents)(예를 들어, 펜타미딘(pentamidine)); 항염증제(anti-inflammatory agents)(예를 들어, 알파-1-안티-트립신(alpha-1-anti-trypsin) 및 알파-1-안티키모트립신(alpha-1-antichymotrypsin)); 마취제(예를 들어, 부피바카인(bupivacaine); 진통제(analgesics); 방부제(antiseptics); 및 호르몬. 다른 예시적인 보충제는 하기를 포함하나 이에 제한되지 않는다: 비타민 및 다른 영양 보충제; 당단백질(glycoproteins); 피브로넥틴(fibronectin); 펩티드 및 단백질; 탄수화물(단일 및/또는 복합); 프로테오글리칸(proteoglycans); 안티엔지오제닌(antiangiogenins); 안티젠(antigens); 지질(lipids) 또는 리포솜(liposomes); 및 올리고뉴클레오티드(oligonucleotides)(센스 및/또는 안티센스 DNA 및/또는 RNA).
본 발명의 일부 바람직한 실시예에 따르면, 열-가역적인 교차 결합을 하는 젤라틴(상기에서 설명된 바와 같이, 모든 유형의 젤라틴은 아니지만 일부 젤라틴은, 변형 및/또는 하나 이상의 추가적인 물질의 사용 없이 열-가역적인 교차 결합을 한다)을 특징으로 하는 조성물을 제공한다. 동물성 젤라틴의 열-가역적인 겔화는, 젤라틴 용액이 대략 37℃인 체온 아래로 냉각될 때 일어난다. 실온에서의 젤라틴-mTG 혼합물에서는, 이러한 겔화는 상기 mTG를 열-가역적인 겔로 잡아두고, 젤라틴과 반응하지 못하게 하여 비가역적 실링 겔을 형성한다. 작동하는 실온이 일반적으로 22℃로 유지되기 때문에, 젤라틴 용액의 열-가역적인 겔화는, 계속해서 가열되지 않는다면 임상 설정(clinical setting)에서 더 빠르게 일어날 것이다. 상기 젤라틴 용액이 mTG와 혼합되기 이전에 가열되기 때문에, 지혈을 위한 젤라틴-mTG 혼합물의 적용에 문제점이 있다. 가열 요소가, 예를 들어: 수술실 밖의 응급 상황 및/또는 긴급한 의료적 치료 상황과 같은 민감한 수술실 환경의 요소일 수 있기 때문에, 적용 이전에 상기 젤라틴을 즉시 가열하는 것은 논리적(logiscal) 관점 및 안전성 관점에서 바람직하지 않으며, 그러한 가열의 요구는 더 문제성이 있다.
조직 부착 및 지혈에 대한 젤라틴의 방해는 별론으로 하고, 젤라틴이 실온에서 용액을 형성할 수 없고 미생물성 트랜스글루타미나아제와 혼합될 수 없다는 것은, 또한 상기 젤라틴-mTG 혼합물을 다른 가능한 적용이 어렵다는 것을 나타낸다. 예를 들어, 젤라틴-mTG 겔은 조직 공학에서 세포 캡슐화를 위한 스캐폴드로서 사용되는 동안에, 극도의 주의를 기울여 상기 젤라틴 용액이 상기 세포의 캡슐화 이전에 충분히 냉각되었다는 것이 보증되도록 한다. 나아가, 상기 젤라틴의 열-가역적인 겔화는 상기 젤라틴-mTG 혼합물이 신체에서 안전하게 이식되기 전에 일어나기 때문에, 캡슐화된 세포의 이식은 상당히 복잡하다. 국부적 약제 전달에 관하여 유사한 문제점이 존재하며, 특정 약제의 효능은 가열된 젤라틴과 접촉함으로써 해롭게 될 수 있고, 특정 약제를 포함하는 젤라틴-mTG 겔의 이식은 젤라틴의 열-가역적인 겔화에 의해 방해될 수 있다.
다행히, mTG에 의한 젤라틴의 교차 결합은 Lys 및 Gln 아미노 그룹을 연결함으로써 일어나며(문헌[Chen 등. Biomacromolecules, Vol. 4, No. 6, 2003]참조), 열-가역적인 겔화를 초래하는 젤라틴에 있는 아미노 그룹은 Pro & Hyp이다(문헌[Haug 등. Food Hydrocolloids 18 (2004) 203-213]참조). 따라서, mTG 교차 결합을 통해 교차 결합된 겔을 형성하는 능력을 손상시키지 않으면서, 열-가역적인 겔화에 대한 젤라틴의 경향을 감소시킬 수 있는 가능성이 존재한다. 달리 말하면, 젤라틴-mTG 혼합물에 사용된 젤라틴의 용해도는 증가될 수 있고 젤라틴의 녹는점은 형성되는 교차 결합된 젤라틴-mTG 겔에 부정적인 영향을 주지 않으면서 mTG와 실온 용액을 형성할 수 있도록 낮춰진다.
본 발명의 일부 실시예에 따르면, 젤라틴-mTG 혼합물의 물질의 조성물을 제공하며, 상기 혼합물은 표준의 동물 젤라틴의 천연의 녹는점보다 낮은 온도에서 상기 젤라틴의 용해도를 증가시키고, 상기 젤라틴이 mTG와 용액을 형성하도록, 많은 방법 중 하나에 의해 변형된다. 이러한 조성물은 (ⅰ) 그의 녹는점을 감소시키도록 변형된 표준의 젤라틴을 사용하여 제조되는 젤라틴-mTG 혼합물; (ⅱ) 상기 젤라틴-mTG 용액 자체에서 젤라틴의 용해도를 증가시키는 첨가제를 포함하는 젤라틴-mTG 혼합물; (ⅲ) 더 낮은 전이 온도를 갖도록 처리된 상업적으로 구입가능한 젤라틴 제품을 사용하여 제조되는 젤라틴-mTG 혼합물; 및 (ⅳ) 상기 젤라틴의 녹는점을 낮추는 특정의, 세심하게 조절된 환경 조건(온도, pH, 이온 농도 등)하에서 용액을 형성하는 젤라틴-mTG 혼합물을 포함한다.
이러한 신규의 조성물은 젤라틴-mTG 겔의 유용성을 상당히 증가시키고, 실온에서 mTG에 젤라틴을 혼합함으로써 형성될 수 있는 젤라틴-mTG 겔을 이용할 수 있는, 특히 의료 분야에서 광범위한 적용을 가능하게 한다. 또한, 많은 경우에서, 상기 젤라틴 및 더 낮은 녹는점의 젤라틴을 함유하는 젤라틴 용액을 사용하여 형성된 젤라틴-mTG 용액은, 용액의 초기 점도를 낮추는 추가적인 장점을 가져서 상기 젤라틴-mTG 반응이 일어나는 곳에서 상기 mTG의 이동을 더 자유롭게 하고 속도를 증가시킨다.
본 발명의 일부 실시예에 따르면, 젤라틴-mTG 제품의 성질을 개선시키는 가능성을 갖는 젤라틴-mTG 혼합물에 추가적인 개선을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 또한 그의 저장 수명을 증가시키기 위해 젤라틴-mTG 혼합물에서 mTG를 더 안정화시키는 방법을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 가소제는 상기 젤라틴-mTG 용액에 혼입될 수 있다. 가소제는 젤라틴의 녹는점을 낮추며, 열-가역적인 겔화를 하지 않고 낮은 온도에서 용액을 형성하도록 한다. 바람직하게는, 하나 이상의 가소제가 젤라틴 과립(granule) 및 젤라틴 용액에 첨가되어 mTG, 또는 mTG 용액과 상기 젤라틴 용액이 혼합되기 이전에 그의 녹는점을 낮춘다. 상기 젤라틴 및 mTG 용액이 동결 건조되는 상황에서, 하나 이상의 가소제는 그의 동결 건조 전에 상기 젤라틴 용액에 첨가된다. 다른 실시예에서, 상기에서 설명한 바와 같이, 하나 이상의 가소제는 상기 젤라틴 용액에 첨가되어, mTG가 매우 반응성이 없는 낮은 온도에서 mTG를 첨가할 수 있게 한다. 상기 젤라틴-mTG-가소제 용액은 동결 건조되거나, 이미 혼합된 형태에서 건조된다.
바람직한 실시예에서, 폴리하이드릭 알콜(polyhydric alchohol) 또는 폴리올은 가소제로서 사용된다. 그러한 폴리올은 글리세린, 글리세롤, 자일리톨, 수크로스 및 솔비톨을 포함한다. 솔비톨은 젤라틴-mTG 겔을 더 탄성있고 점착성 있게 한다. 글리세롤은 젤라틴-mTG 겔을 더 딱딱하게 하고, 젤라틴의 mTG 교차 결합을 촉진한다. 글리세롤의 바람직한 농도 비율 범위는, 바람직하게는 글리세롤:젤라틴의 중량비로 약 0.5:1 내지 약 5:1이고, 더 바람직하게는 글리세롤:젤라틴의 중량비로 약 1:1 내지 약 2:1이다. 솔비톨의 바람직한 농도 비율 범위는, 바람직하게는 솔비톨:젤라틴의 중량비로 약 0.5:1 내지 약 5:1이고, 더 바람직하게는 솔비톨:젤라틴의 중량비로 약 1:1 내지 약 3:1이다.
폴리하이드릭 알콜은 유사한 크기의 모노하이드릭 알콜과 비교하여 더 높은 끓는점을 갖는다. 폴리하이드릭 알콜의 물에 대한 용해도는 유사한 크기의 모노하이드릭 알콜과 비교하여 더 높으며, 이는 물분자에 대해 유인된 하이드록실 그룹이 드 많기 때문이다. 식품 산업에서, 본원에서 참고로 전체로서 인용된 미국 특허 제2,558,065호에서 개시된 바와 같이, 글리세린과 같은 폴리하이드릭 알콜은 젤라틴의 물에 대한 용해도를 증가시키는 데에 사용되고, 글리세린과 같은 폴리하이드릭 알콜은 젤라틴 과립에 걸쳐서 붓고, 그리고 본원에서 참고로 전체로서 인용된 미국 특허 제3,939,001호에서, 젤라틴은 팽창되지만 용해되기 이전에 젤라틴 과립을 위한 충분한 시간 기간 동안에 폴리하이드릭 알콜을 흡수하도록 한다. 이들 특허에 설명된 이러한 기술 및 이러한 기술의 변형은 본 발명의 부분으로서 설명된 폴리올 용법의 우선의 실시예로 고려된다.
젤라틴의 전이점을 낮추는 가소제들(글리세롤, 자일리톨, 솔비톨, 수크로스 및 트레할로스)의 다른 농도의 효과는 문헌에 의해 충분히 입증되었다(문헌[D'Cruz NM, Bell LN. Thermal Unfolding of Gelatin in Solids as Affected by the Glass Transition. J Food Science 2005: 70(2)], 문헌[Kozlov PV, Burdygina GI. The structure and properties of solid gelatin and the principles of their modification. Polymer, 1983 (24): p. 651-666]참조).
젤라틴의 녹는점에 대한 폴리하이드릭 알콜의 효과는 문헌에 의해 충분히 입증된 반면, 본 발명 이전에는, 폴리하이드릭 알콜은 mTG 또는 젤라틴-mTG 용액과 혼합되기 전에, 젤라틴 또는 젤라틴 용액과 함께 사용된 적이 없었다.
폴리올 가소제 첨가의 실시예에서, 가소제 대 젤라틴의 바람직한 중량비 범위는 바람직하게는 가소제:젤라틴의 중량비가 약 0.5:1 내지 약 1:1이다.
용액에서 젤라틴의 녹는점을 낮추기 위해 젤라틴 가소제를 사용하는 또 다른 실시예에서, 사용된 가소제의 유형은 트리에탄올아민, 레조르신, 티오디글리콜, 톨루엔설포산(toluenesulphoacid)의 나트륨 염, 부틸렌 글리콜, 우레아 니트레이트, 티오우레아, 우레아, 글루탐산, 아스파라긴산(aspargic acid), 발린(valine), 글리신, KSCN, KI 및 LiBr을 포함할 수 있다.
젤라틴 용액에 우레아를 첨가하는 것은 이전에 연구되었고, 25℃에서 고분자량의 젤라틴(99 kDa)이 열-가역적인 겔을 형성하지 못하는 것을 설명하였다(문헌[Otani Y, Tabata Y, Ikada Y. Effect of additives on gelation and tissue adhesion of gelatin - poly (L- glutamic acid ) mixture. Biomaterials 19 (1998) 2167-2173]참조).
젤라틴의 천연의 녹는점 미만의 온도에서 젤라틴 또는 젤라틴-mTG 용액에서 열-가역적인 겔화를 방해하기 위해 우레아를 사용하는 바람직한 실시예에서, 우레아는, 우레아:젤라틴의 중량비가 0.25 내지 2.0의 범위에서 상기 용액에 첨가된다. 더 바람직하게는, 우레아는, 우레아:젤라틴의 중량비가 약 1:2 내지 약 2:2 범위로 상기 용액에 첨가된다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 수성 용매의 pH 수준 및 이온 농도는 상기 용매에서 용해된 젤라틴의 용해도를 증가시키기 위해 변형된다. 상기 생성물의 pH가 등이온점 pH에 있을수록 상기 젤라틴의 용해도는 더 좋을 것이다. 이러한 기술에 사용된 바람직한 수성 용매는 인산 완충 식염수(phosphate buffered saline, PBS)이다. 다른 적당한 완충제는 보레이트(borate), 포스페이트, HEPES (N-[2-하이드로시에틸]피페라진-N'-[2-에탄설폰산]) 및 기타 등을 포함한다.
일반적으로, 생명체 내에 사용되는 조성물에서, pH 5.5 내지 9.0 및 적당한 이온 강도(약 1 내지 1000 mM NaCl과 등가임, 바람직하게는 100 내지 150 mM NaCl임)보다 낮은 완충된 수성 용매에서 젤라틴을 용해하는 것은 바람직하다. 더 바람직하게는, 상기 용액의 pH는 약 6.0 내지 8.0이고, 더 바람직하게는 약 7.4이다. 젤라틴이 이러한 pH 및 이온 농도에서 용해된다면, 그의 용해도는 용액 pH 및 젤라틴의 등이온점 pH 사이의 차이를 증가시킴으로써 증가될 수 있다.
하나 이상의 염은 또한 젤라틴의 전이 온도를 낮추기 위해 첨가될 수 있다. 바람직하게는, 상기 염은 상기 전이 온도를 감소시키기 위해, 더 바람직하게는 실온 미만으로 감소시키기 위해, 적당한 농도 범위에서 첨가된다. 예를 들어, 나타낸 농도 범위에 있는 하기의 염은 실온 미만에서 젤라틴의 전이점을 감소시킨다고 발견되었다: 소듐 브로마이드(Sodium Bromide)(1M 내지 2M), 소듐 니트레이트(Sodium Nitrate)(lM 내지 2M), 소듐 티오시아네이트(Sodium Thiocyanate)(0.5M 내지 1.5M), 소듐 요오드(Sodium Iodide)(0.5M 내지 1.5M), 소듐 벤젠설포네이트(Sodium Benzenesulfonate)(0.5M 내지 1.5 M), 소듐 살리실레이트(Sodium Salicylate)(0.25M 내지 lM), 소듐 디클로로아세테이트(Sodium Dichloroacetate)(1M 내지 2M), 소듐 트리클로로아세테이트(Sodium Trichloroacetate)(0.5M 내지 1.5M), 소듐 디브로모아세테이트(Sodium Dibromoacetate)(0.5M 내지 1.5M), 소듐 트리브로모아세테이트(Sodium Tribromoacetate)(0.25M 내지 1M), 소듐 디아이오도아세테이트(Sodium Diiodoacetate) (0.5M 내지 1.5M), 소듐 아세틸트립토판(Sodium Acetyltryptophan)(0.5M 내지 1.5M), 소듐 아세틸렌디카르복시레이트(Sodium Acetylenedicarboxylate)(1M 내지 2M), 리튬 살리실레이트(Lithium Salicylate)(lM 내지 2M), 리튬 디아이도도살리실레이트(Lithium Diidodosalicylate)(0.2M 내지 1M)(예를 들어, 문헌[Bello J, Riese HCA, Vinograd JR. Mechanism of Gelation of Gelatin. Influence of Certain Electrolytes on the Melting Points of Gels of Gelatin and Chemically Modified Gelatins. Am Chem Soc. Sept 1956 (60). P. 1299- 1306]을 참고함).
선택적으로 그리고 바람직하게는, 하나 이상의 산성 물질이 pH를 감소시키기 위해 조성물에 첨가된다. 젤라틴 용액의 pH를 낮추는 것은 그의 전이점을 감소시킨다. 일반적으로, 상기 젤라틴 전이점을 감소시키는 것은 37℃인 신체에서 상기 젤라틴을 재구성하는 데에 유용하다. 본원에서 사용된 일부 바람직한 유형의 젤라틴에 대해, 예를 들어 포유 동물 소스(source)로부터의 젤라틴과 같이, 상기 pH를 낮추는 것은 상기 젤라틴 전이점에 대한 더 좋은 결과를 제공한다. 그러나, 젤라틴의 일부 유형에 대해, pH를 올리는 것이 선택적으로 더 좋은 결과를 제공할 수도 있다.
젤라틴 용액 및 젤라틴의 등이온점 사이의 pH 차이를 증가시키는 또 다른 실시예에서, 상기 젤라틴 그 자체는 변형된다. 이는 본원에서 참고로 전체로서 인용된 미국 특허 제6,863,783호에서와 같이 정전기적으로 대전된 젤라틴을 생성하는 용액에 젤라틴을 용해하기 전에 처리함으로써, 또는 본원에서 참고로 전체로서 인용된 미국 특허 제2,398,004호에서와 같이 젤라틴의 등이온점을 조절함으로써 수행될 수 있다.
젤라틴 용액의 pH가 낮아지지 않고 올라간다면, 상기 용액의 pH는 젤라틴의 등이온점에 근접하게 될 것이고, 상기 전이점은 올라갈 것이다. 이러한 변형은 신체에 이식 후에 열-가역적인 겔로서 비-교차 결합된 젤라틴을 유지하는 데에 선택적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 젤라틴, mTG 또는 둘 모두의 물질은, 활성 형태로 단백질 또는 효소를 안정화시키기 위해, 트레할로스 탄수화물 또는 다른 탄수화물과 혼합된 후에 건조되었고, 이에 의해 젤라틴을 용이하게 재구성할 수 있게 된다. 건조의 다양한 실시예는 동결 건조, 분사 건조, 드럼 건조, 공기 건조, 가열 건조, 진공 건조, 또는 젤라틴-트레할로스 또는 젤라틴-mTG-트레할로스 용액을 건조하는 임의의 다른 방법이다.
공기 건조 및 냉동 건조에서 트레할로스의 최상의 안정화 능력은 문헌에 의해 충분히 입증되었다. 트레할로스가 특정 물질 또는 용액에 첨가된 후에 건조가 수행될 때 건조된 물질은 더 빨리 재구성된다는 것을 나타낸다(문헌[Crowe LM, Reid DS, Crowe JH. Is Trehalose Special for Preserving Dry Biomaterials ? Biophysical Journal 1996 (71): 2087-2093]참조).
주위 온도 및 대기압에서 트레할로스를 포함하는 단백질 용액의 건조는 미국 특허 제4,891,319호에서 전체적으로 개시되었다. 상기 특허에서 개시된 예에서, 건조된 단백질의 기능은 보존되었다.
젤라틴의 특정 경우에서, 상기 젤라틴 용액으로 트레할로스의 혼입은 젤라틴 겔의 강도를 증가시키는 추가적인 이익을 갖는다(문헌[Norie N, Kazuhiro M, Masami N, Yusuke O, Takashi O, Keiko N. Factors Affecting the Gelation of a Gelatin Solution in the Presence of Sugar . Journal of Home Economics of Japan. 55(2): p. 159-166 (2004)]참조).
나아가, 젤라틴-mTG 교차 결합 반응은 천연의 혈액 인자의 교차 결합 반응과 많은 유사점을 갖는다. 혈액 인자를 안정화시키기 위한 트레할로스 건조는 최근에 설명되었고(미국 특허 제6,649,386호 및 제7,220,836호), 쉽게 재구성될 수 있는 혈액 단백질을 갖는 제품(ProFibrixTM, Leiderdorp)을 상업적으로 제조하는 데에 사용되는 공정에 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 젤라틴은 당(sugar)의 존재하에서 건조된다. 이는 당, 말토덱스트린 또는 전분과 같은 다른 지지체 상에 젤라틴의 분사-아토마이징(spray-atominzing)을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에서, PB Gelatins(Tessenderlo Group, Belgium)에 의해 제조되는 CryogelTM 이라 불리는 상업적인 젤라틴 제품이 사용된다. Cryogel은 비처리 젤라틴보다 5℃ 내지 6℃ 낮은 온도에서 용해될 수 있다. Cryogel의 제조에서 사용된 상세한 처리 과정은 독점적이다.
본 발명의 다른 실시예에서, 조성물은 하나 이상의 추가적인 물질을 선택적으로 특징으로 할 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물은 하나 이상의 구아니딘 하이드로클로라이드(Guanidine Hydrochloride) 또는 우레아를 포함하나 이에 제한되지 않은 변성제를 포함할 수 있다. 상기 조성물은 또한, 선택적으로 또는 추가적으로, 하나 이상의 염화마그네슘 또는 하이드로퀴논을 포함하나 이에 제한되지 않은 환원제를 포함할 수 있다. 상기 조성물은 또한, 선택적으로 또는 추가적으로, 수소 결합 형성을 증가시키는 이소프로판올과 같은 물질을 포함할 수 있다. 상기 조성물은 또한, 선택적으로 또는 추가적으로, DMSO(디메틸설폭사이드)와 같이, 구조적으로 단백질과 상호작용할 수 있고 젤라틴에서 헬릭스(helix) 형성을 방해하는 양성자성(protic) 극성 용매를 포함할 수 있다. 상기 조성물은 또한, 선택적으로 또는 추가적으로, 예를 들어 염화칼슘과 같이, 들어가는 용액에 대해 발열성인 건조제를 포함할 수 있다.
일부 실시예에 따르면, 본 발명은, 또한 젤라틴 분자 가닥을 빠르게 붕괴시킬 수 있으나, 역으로 천연의 피브린에 근거한 응고 망상체에 영향을 주지 않는 효소 또는 효소 혼합물을 포함하는 젤라틴 특이적인 프로테아제를 특징으로 한다.
선택적으로, 젤라틴-특이적인 프로테아제는 천연의 내생의 피브린 응고를 손상시키지 않고 재출혈을 초래하지 않으면서, 상처 부위로부터 붕대/드레싱/흡수성 지혈제/실란트를 제거하는 데에 사용될 수 있다. 이러한 특징은 존재하는 제품과 비교할 때 본 발명의 추가적인 이익이며, 상처 부위에 잘 달라붙도록 충분한 접착성이 있고 출혈을 정지시키는 지혈 드레싱이 상기 피브린 응고를 제거하지 않거나 붕괴하지 않으면서 제거될 수 없다는 기술적인 문제를 해결한다. 본 발명에 따른 적어도 일부 실시예의 붕대가 재흡수성이 있다 할지라도, 의사가 상처 부위를 수술하거나 다른 부위에 붕대를 놓고 싶다면, 상처로부터 붕대를 제거하는 것이 필요할 것이다.
예시적인 제한이 없는 프로테아제는 프로테이나아제 K이다(문헌[Chen 등. Biomacromolecules 2003, 4, 1558-1563]참조). 그러나, 다른 프로테아제, 특히 더 빠른 활성 효소가 선택적으로 사용될 수 있다.
다른 실시예에 따르면, 선택적으로, 하나 이상의 프로테아제 억제제가 첨가되며, 이는 아프로티닌(aprotinin), 트랜스엑사믹산(transexamic acid), 알파-2 플라스민 억제제, 알파-1 항트립신, 또는 알파-1-항 트립신의 피츠버그 돌연변이(Pittsburgh mutant)를 포함하나 이에 제한되지 않는다(Arg-358 알파-1-항트립신; 문헌[Owen 등. N. Engl. J. Med. 309: 694-698, 1983] 및 본원에서 참고로 전체로서 인용된 미국 특허 번호 제4,711,848호를 참고함). 바람직한 실시예에서, 아프로티닌은 1500 내지 20,000 KIU/mL의 최종 반응 농도를 제공하기에 충분한 양으로 포함된다.
다른 실시예에 따르면, 본 발명의 지혈 물질은 젤라틴 및 TG에 더하여 추가적인 지혈 물질을 더 포함할 수 있다. 그러한 물질은 본래 생물학적 물질이거나 합성 물질일 수 있고, 하나 이상의 공지된 지혈제(예를 들어, 알부민, 콜라겐, 피브린, 트롬빈, 키토산, 페릭 설페이트 또는 다른 금속 설페이트)을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
다른 실시예에 따르면, 본 발명의 지혈 물질은, 예를 들어 트랜스글루타미나아제와 같은 교차 결합 물질과, 젤라틴을 혼합하는 경우 교차 결합 속도를 촉진하는 촉진제(accelerant)를 더 포함할 수 있다. 그러한 촉진제는 예를 들어 칼슘을 선택적으로 포함할 수 있다.
칼슘은 트랜스글루타미나아제/젤라틴 교차 결합 반응의 바람직한 구성요소이다. 다양한 연구는 칼슘 농도를 다양화하거나 그리고/또는 칼슘-이동(calcium-mobilizing) 약제(마이토톡신(MTX)을 포함하나 이에 제한되지 않음)의 첨가가 상기 트랜스글루타미나아제 응고 반응을 가속화할 수 있다는 것을 증명했다. 따라서, 다르게는, 칼슘 및/또는 칼슘 이동 약제가 사용되지 않는다 할지라도, 본 발명의 실시예에 따르면, 칼슘 및/또는 칼슘-이동 약제는 포함된다. 칼슘을 사용하는 이러한 변형은 칼슘-의존형 트랜스글루타미나아제에는 유용하나 칼슘-의존하지 않은 트랜스글루타미나아제에는 유용하지 않는다.
다른 실시예에 따르면, 본 발명의 지혈 물질은, 트랜스글루타미나아제와 같은 같은 교차 결합 물질과 젤라틴을 혼합하는 경우, 발열 반응을 유도하는 물질을 더 포함할 수 있다. 선택적으로 그리고 바람직하게는, 발열 반응의 유도는 주위 환경의 조건 하에서도 교차 결합을 지지할 수 있으며, 여기서 "주위"는 약 30℃ 미만의 온도를 갖는 임의의 환경으로서 정의될 수 있다. 그러한 발열제는 하나 이상의 칼슘, 분자를 함유하는 염소(예를 들어, 염화 칼슘 또는 염화 마그네슘) 또는 금속 산화물/제올라이트, 또는 그의 조합을 선택적으로 포함할 수 있다.
조성물 제조
본원에서 설명된 바와 같은 조성물은 본 발명의 다양한 실시예의 하나 이상의 다른 방법에 따라 선택적으로 제조될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 젤라틴-mTG 혼합물에 있는 젤라틴에 대해, 상기 mTG와 혼합되기 이전에 열의 사용을 포함하는 매우 특정한 건조 방법을 수행한다. 이러한 건조 방법은 젤라틴의 녹는점을 낮춤으로써, 바람직하게는 작동하는 실온 미만으로 낮춤으로써, 젤라틴의 용해도를 증가시킨다. 상기 건조 방법은, 젤라틴 또는 젤라틴-mTG 용액의 형성하에서, 임의의 첨가제 없이 그리고 주위 조건을 변경하지 않고 젤라틴의 용해도를 증가시킬 수 있다. 그럼에도 불구하고, 젤라틴 또는 젤라틴-mTG 혼합물에 특정 첨가제(예를 들어, 가소제 또는 안정화제)를 첨가 또는 특정 주위 인자(예를 들어, 상기 젤라틴 또는 젤라틴-mTG 용액의 온도, 이온 농도 및 삼투압)의 조작은, 젤라틴의 녹는점을 감소시키는 기술을 사용하여 건조된 젤라틴을 혼입한 젤라틴-mTG 혼합물의 성질을 더 향상시키는 데에 사용될 수 있다.
감소된 온도에서 mTG와 용액을 형성할 수 있는 젤라틴을 제조하기 위한 열-의존형 젤라틴 건조의 바람직한 실시예에서, 35% 이상의 수분 함량을 갖는 순수한 젤라틴 용액은, 8% 미만의 수분을 함유하는 초과량의 미세하게 분쇄된 고체 젤라틴 입자상에 겔화 및 고체화를 초과하는 온도에서 분사된다. 상기 입자는 유체층(fluid bed)에서 8% 내지 13%의 수분 함량으로 건조된다. 이러한 과정 뿐만 아니라 본 발명의 범위 내에 포함되는 이러한 과정의 변이는 본원에서 참고로 전체로서 인용된 미국 특허 제4,889,920호에서 상세하게 설명된다.
감소된 온도에서 mTG와 용액을 형성할 수 있는 젤라틴을 제조하기 위한 열-의존형 젤라틴 건조의 바람직한 실시예에서, 젤라틴 및 수분의 총중량에 근거한 중량으로 8% 초과의 수분 함량을 갖는 젤라틴은, 젤라틴 및 수분의 총중량에 근거한 중량으로 16%를 초과하지 않는 수분 함량을 갖는 처리된 젤라틴을 수득하도록, 상기 수분 함량의 35% 이상을 제거하기 위해 마이크로파 가열을 필요로 한다. 이러한 과정 뿐만 아니라 본 발명의 일부분으로 간주되는 이러한 과정의 변이는 본원에서 참고로 전체로서 인용된 미국 특허 제4,224,348호에서 상세하게 설명된다.
감소된 온도에서 mTG와 용액을 형성할 수 있는 젤라틴을 제조하기 위한 열-의존형 젤라틴 건조의 또 다른 실시예에서, 본원에서 참고로 전체로서 인용된 미국 특허 제2,803,548호에서 설명된 바와 같이, 젤라틴은 감압하에서 100℃에서 건조된다. 이러한 과정은 젤라틴 가닥을 변형시켜서, 상기 젤라틴이 열-가역적인 겔화가 될 수 없도록 한다. 젤라틴의 mTG 교차 결합이 열-가역적인 겔을 형성하는 젤라틴의 능력에 의존하지 않는다 하더라도, 이러한 건조 과정은 상기 젤라틴 가닥을 약하게 하고, 따라서 젤라틴-mTG 교차 결합에서 그러한 젤라틴을 사용하여 생성된 임의의 겔을 약하게 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 젤라틴-mTG 혼합물에 있는 젤라틴은 상기 mTG와 혼합되기 이전에 동결 건조의 사용을 포함한 매우 특정한 건조 방법을 수행한다. 이러한 건조 방법은 젤라틴의 녹는점을 낮춤으로써, 바람직하게는 작동하는 실온 미만으로 낮춤으로써, 젤라틴의 용해도를 증가시킨다. 상기 건조 방법은, 젤라틴 또는 젤라틴-mTG 용액의 형성하에, 임의의 첨가제 없이 그리고 주위 조건을 변경하지 않고 젤라틴의 용해도를 증가시킬 수 있다. 그럼에도 불구하고, 젤라틴 또는 젤라틴-mTG 혼합물에 특정 첨가제(예를 들어, 가소제 또는 안정화제)를 첨가 또는 특정 주위 인자(예를 들어, 상기 젤라틴 또는 젤라틴-mTG 용액의 온도, 이온 농도 및 삼투압)의 조작은, 젤라틴의 녹는점을 감소시키는 동결 건조 기술을 사용하여 건조된 젤라틴을 혼입한 젤라틴-mTG 혼합물의 성질을 더 향상시키는 데에 사용될 수 있다.
감소된 온도에서 mTG와 용액을 형성할 수 있는 젤라틴을 제조하기 위한 동결 건조 젤라틴 건조의 바람직한 실시예에서, 0.1 중량% 내지 2 중량%의 농도로 물에서 용해된 젤라틴은 감압하에서 냉동-건조된다. 이러한 과정 뿐만 아니라 본 발명의 일부분으로 간주되는 이러한 과정의 변이는 본원에서 참고로 전체로서 인용된 미국 특허 제2,166,074호에서 상세하게 설명된다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 젤라틴 및 mTG가 용액으로 이미 혼합되어 있다면, 젤라틴-mTG 혼합물에 대해 동결 건조를 수행한다. 이는 균일하게 혼합되고, 동결 건조된 젤라틴-mTG 혼합물(건조 형태의 젤라틴은 건조 형태의 mTG와 접촉함)을 생성하는 동시에, 젤라틴의 녹는점을 낮춘다. 이러한 실시예에서, 상기 젤라틴 및 mTG는 동결 건조된 상태로부터 동시에 재구성되고, 재구성 부위에서 즉시 용액을 형성한다. 상기 mTG의 활성이 낮은 온도(약 37℃ 미만)에서 잠재적으로 감소하기 때문에, 이러한 기술은 바람직하게는 표준의 젤라틴보다 낮은 녹는점을 갖는 젤라틴 또는 젤라틴 혼합물과 함께 사용될 수 있다.
따라서, 감소된 녹는점의 젤라틴 및 mTG로 이루어진 용액은, 빠른 교차 결합 및 겔화의 발생 없이, 낮은 온도에서 형성될 수 있다. 그런 다음, 이러한 용액은 동결 건조될 수 있고, 이로써 균일하게 분배된 젤라틴 및 mTG의 건조된 혼합물을 생성한다. 그러한 혼합물은 온열(warmer) 용매와 접촉하는 경우, 겔을 형성하기 위해 빠르게 재구성될 수 있다. 바람직하게는, 그러한 기술은 상처 드레싱으로 사용될 수 있고, 37℃의 온도에 있는 체액은 상기 젤라틴 및 mTG를 재구성할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 일부 실시예에 따르면, 지혈 또는 조직 실란트 목적을 위한 젤라틴-mTG 입자 혼합물을 제공하며, 상기 젤라틴 및 mTG는 지혈 또는 조직 실란트 적용에 적당한 농도로 젤라틴 및 mTG를 함유하는 잘 분산된 분말을 생성하기 위해 함께 분사 건조된다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 젤라틴-mTG 혼합물의 일부분으로 사용된 젤라틴은 가수분해되거나, 부분적으로 가수분해되고, 또는 젤라틴 혼합물의 일부 백분율은 그의 용해도를 증가시키기 위해 가수분해되거나 부분적으로 가수분해된다. 그러한 기술의 예는 가수분해된 젤라틴의 필름으로 표준의 젤라틴 과립을 코팅하는 것을 포함하는 과정에서 성공적으로 증명되었다(본원에서 참고로 전체로서 인용된 미국 특허 제4,729,897호). 이러한 실시예는 가소제(이는 폴리하이드릭 알콜, 탄수화물 또는 상기에서 설명된 다른 가소제를 포함할 수 있다)의 존재하에 가수분해되거나 부분적으로 가수분해된 젤라틴의 사용을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 사전-혼합된 mTG 및 젤라틴을 함유하는 용액, 또는 다른 단백질 가수분해물은 상기 화합물의 안정성을 증가시키기 위해 냉동 건조된다. 식품 처리를 위해 사용된 조성물을 제조하는 데에 사용된 이러한 기술은 본원에서 참고로 전체로서 인용된 미국 특허 제6,030,821호에서 설명된다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 젤라틴-mTG 혼합물의 일부분으로서 사용된 젤라틴은 희석된 산성 젤라틴 용액을 형성하기 위해 산과 혼합된 후에 분사 건조되며, 상기 산은 젤라틴 수준의 5% 내지 20%로 유지되어, 미세 액적이 향상된 건조를 위해 형성할 수 있다. 이러한 과정은 본원에서 참고로 전체로서 인용된 캐나다 특허 제896,965호에서 설명된다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 젤라틴 및 mTG를 함유하는 생성물을 향상시키는 상기에서 설명된 기술의 하나 이상은 동시에 또는 연속적으로 사용된다. 바람직하게는, 이는 젤라틴 또는 젤라틴-mTG에서 2개 이상의 가소제들과 함께 사용되고, 설명된 건조 방법 중 하나를 사용하여 건조하기 이전에 젤라틴 또는 젤라틴-mTG에서 1개 이상의 가소제들을 사용하는 것을 포함할 수 있다. 이는 또한 하나의 건조 기술을 사용하여 상기 젤라틴 또는 젤라틴-mTG를 건조하고, 건조된 젤라틴 또는 젤라틴-mTG를 용액에 용해시키고, 그런 다음 상기 젤라틴 또는 젤라틴-mTG를 재건조하는 것을 포함할 수 있다.
선택적으로, 이러한 방법은 또한 열-가역적인 겔화를 하는 조성물을 위해 사용될 수 있고, 바람직하게는 비-젤라틴 단백질의 다양한 조합을 포함하는 조성물, 그리고 선택적으로는 다른 교차-결합자(트랜스글루타미나아제 이외의 것)를 포함할 수 있다.
붕대
본 발명의 예시적인 실시예는, 예를 들어 환자의 상처 조직을 치료하기 위한, 바람직하게는 젤라틴 및 트랜스글루타미나아제(젤라틴과 트랜스글루타미나아제의 상호작용이 붕대의 활성이 요구되거나 원하여질 때까지 젤라틴 및 트랜스글루타미나아제는 분리됨)를 포함하는 지혈 드레싱에 관한 것이다. 선택적으로, 상기 붕대는 플라스틱 후면과 같은 비-흡수성 후면을 특징으로 할 수 있다. 선택적으로, 상기 붕대는 또한 흡수성 물질층을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예는, 선택적으로 그리고 바람직하게는 하기를 포함하는 환자의 상처 조직을 치료하기 위한 지혈 드레싱에 관한 것이다: (ⅰ) 젤라틴 층; 및 (ⅱ) 상기 젤라틴 층에 인접한 트랜스글루타미나아제층; 여기서 상기 트랜스글루타미나아제층은 상기 젤라틴 층과 동일한 공간에 걸쳐 있거나 동일한 공간에 걸쳐있지 않다.
본 발명의 또 다른 실시예는, 선택적으로 그리고 바람직하게는 하기를 포함하는 환자의 상처 조직을 치료하기 위한 지혈 드레싱에 관한 것이다: (ⅰ) 흡수성 또는 비-흡수성 물질층; (ⅱ) 상기 물질층에 인접한 젤라틴 층; 및 (ⅲ) 상기 젤라틴 층에 인접한 트랜스글루타미나아제 층; 여기서 상기 트랜스글루타미나아제층은 상기 젤라틴 층과 동일한 공간에 걸쳐 있거나 동일한 공간에 걸쳐있지 않다.
본 발명의 또 다른 실시예는, 선택적으로 그리고 바람직하게는 하기를 포함하는 환자의 상처 조직을 치료하기 위한 지혈 드레싱에 관한 것이다: (ⅰ) 제 1의 젤라틴 층; (ⅱ) 상기 제 1의 젤라틴 층에 인접한 흡수성 물질층; (ⅲ) 상기 흡수성 물질층에 인접한 트랜스글루타미나아제 층; 및 (ⅳ) 상기 트랜스글루타미나아제 층에 인접한 제 2의 젤라틴 층, 여기서 상기 트랜스글루타미나아제 층은 상기 제 1의 및/또는 제 2의 젤라틴 층과 동일한 공간에 걸쳐 있지 않다.
일부 실시예에 따르면, 본 발명은 제 1의 젤라틴 및 제 2의 젤라틴 사이에 샌드위치된 트랜스글루타미나아제 층을 포함하는 지혈 드레싱(예를 들어, 붕대)을 제공하며, 상기 트랜스글루타미나아제 층은 상기 제 1의 및/또는 제 2의 젤라틴 층과 동일한 공간에 걸쳐 있거나 동일한 공간에 걸쳐 있지 않을 수 있다. 그러한 지혈 드레싱은 상처를 치료하는 데에 유용하다. 상기 동일한 공간에 걸쳐 있지 않은 모델은, 상기 트랜스글루타미나아제 층이 제 1의 및 제 2의 젤라틴 층의 전체와 동일한 공간에 걸쳐 있는 드레싱과 비교하여, 층의 박리를 억제하는 장점을 제공한다. 그러나, 동일한 공간에 걸쳐 있는 모델의 지혈 능력은 동일한 공간에 걸쳐 있지 않은 모델의 능력보다 우수할 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 선택적으로 그리고 바람직하게는 하기를 포함하는 본 발명의 드레싱을 제공한다: (ⅰ) 흡수성 또는 비-흡수성 매트릭스; (ⅱ) 젤라틴; 및 (ⅲ) 트랜스글루타미나아제; 여기서 상기 젤라틴 및 트랜스글루타미나아제는 상기 매트릭스 내에 혼입된다.
또 다른 실시예에서, 지혈 장치는 하기를 포함한다: (ⅰ) 다공성의 흡수성 또는 비-흡수성 매트릭스; (ⅱ) 젤라틴; 및 (ⅲ) 트랜스글루타미나아제; 여기서 상기 젤라틴 및 트랜스글루타미나아제는 상기 매트릭스에 부착된다.
다양한 실시예에서, 트랜스글루타미나아제 층은 임의의 다양한 모양 및 패턴(pattern)으로 형성될 수 있다. 예를 들어, 제한하지 않고, 상기 트랜스글루타미나아제 층은 트랜스글루타미나아제를 포함하는 스팟(spot)의 배열 또는 트랜스글루타미나아제를 포함하는 단일의 스팟으로 형성될 수 있다. 선택적으로, 상기 트랜스글루타미나아제 층은 트랜스글루타미나아제를 포함하는 복수의 라인으로 형성될 수 있다.
지혈 드레싱의 각각의 층은 또한 하나 이상의 적당한 충진제, 결합제 및/또는 가용화제를 선택적으로 함유할 수 있다. 또한, 각각의 지혈 드레싱은 이형제 및/또는 후면 물질을 함유하는 이형층을 선택적으로 더 포함할 수 있다.
바람직한 실시예에 따르면, 지혈 드레싱의 각각의 층은 수크로스(sucrose)와 같은 하나 이상의 적당한 충진제를 선택적으로 함유할 수 있다. 상기 지혈 드레싱의 각각의 층은 또한 수크로스와 같은 하나 이상의 적당한 결합제를 선택적으로 함유할 수 있다. 각각의 지혈 드레싱은 또한 이형제를 함유하는 이형층을 선택적으로 더 포함할 수 있다. 예시적인 이형제는 수크로스이다. 상기 지혈 드레싱의 각각의 층은 또한 수크로스와 같은 하나 이상의 적당한 가용화제를 선택적으로 함유할 수 있다.
하나의 이론에 의해 제한되도록 의도되지 않으면서, 선택적으로, 본 발명의 일부분으로서 수크로스의 성질은 첨가된 양에 의해 적어도 부분적으로 결정될 수 있다. 비교적 높은 농도(20% 내지 30% 수크로스 용액)에서, 부착된 또 다른 용액(예를 들어, 젤라틴 또는 mTG 용액)의 적용에 대한 표면을 제조하기 위해 표면(예를 들어, 붕대)상에 분사될 수 있다. 더 낮은 농도(예를 들어, 약 2%)에서, 상기 수크로스는 그러한 용액이 표면(예를 들어, 붕대)에 부착되도록 하기 위해 상기 젤라틴 또는 mTG 용액에 첨가될 수 있다.
지혈 드레싱의 각각의 층은 또한 하나 이상의 적당한 기포제(예를 들어, 시트르산(citric acid) 및 중탄산 나트륨(sodium bicarbonate)의 혼합물)를 선택적으로 함유할 수 있다.
또한, 각각의 지혈 드레싱은, 상기 드레싱이 사용될 때 상처와 마주보는 면의 반대쪽인 상기 드레싱의 측면 상에 후면 물질을 더 포함할 수 있다. 상기 후면 물질은 생리적-허용가능한 접착제로 부착될 수 있거나, 자가-부착(예를 들어, 표면 정전기를 갖음으로써)될 수 있다. 상기 후면 물질은 흡수성 물질 또는 비-흡수성 물질(예를 들어, 실리콘 패치(patch) 또는 플라스틱 패치)일 수 있고, 그리고/또는 혈관 카테터(catheter)와 같은 장치 및/또는 선택적으로 신체로 삽입될 수 있는 다른 유형의 의료 장치일 수 있다.
트랜스글루타미나아제 층은 제 1의 젤라틴 층에 적용될 수 있어서, 상기 제 1의 젤라틴 층과 동일한 공간에 걸쳐 있지 않거나, 그리고/또는 제 2의 젤라틴 층의 적용에 대한 상기 제 2의 젤라틴 층과 동일한 공간에 걸쳐 있지 않을 것이다. 예를 들어, 상기 트랜스글루타미나아제 층은 상기 제 1의 젤라틴 층 표면적의 약 5% 내지 약 95%를 차지할 수 있거나, 그리고/또는 상기 제 2의 젤라틴 층의 표면적의 약 5% 내지 약 95%를 차지할 수 있다. 상기 트랜스글루타미나아제는 단일 스팟 또는 상기 젤라틴 층 상의 연속된 스팟으로 상기 젤라틴 층에 적용될 수 있어서, 상기 트랜스글루타미나아제 스팟의 총 표면적은 상기 제 1의 젤라틴 층의 표면적의 약 5% 내지 약 95%를 차지할 수 있거나, 그리고/또는 상기 제 2의 젤라틴 층의 표면적의 약 5% 내지 약 95%를 차지할 수 있다.
그러한 스팟 또는 트랜스글루타미나아제의 스팟은 임의의 기하학적 모양(예를 들어, 채워진 원 또는 채워지지 않은 원, 직사각형, 삼각형, 선(line), 무정형 모양 또는 그의 조합)을 가질 수 있다. 그러한 스팟은 정돈된 또는 임의의 패턴으로 상기 제 1의 젤라틴 층에 적용될 수 있다. 복수의 스팟은 임의의 다양한 모양 및 패턴(예를 들어, 배열(array), 격자(grid), 연속된 동심(concentric) 스팟(예를 들어, 동심원 또는 정사각형), 오버래핑된(overlapping) 연속의 스팟(예를 들어, 오버래핑된 원), 축으로부터 발산된 스포크(spoke) 또는 임의의 다른 형태)을 형성할 수 있고, 이는 상기 트랜스글루타미나아제의 총 표면적이 상기 제 1의 젤라틴 층 표면적의 약 5% 내지 약 95%이거나, 그리고/또는 상기 제 2의 젤라틴 층의 표면적의 약 5% 내지 약 95%임을 제공한다. 일반적으로, 다수의 작은 스팟이 적은 수의 큰 스팟보다 선호된다. 예를 들어, 일반적으로 20×20 배열의 스팟이 동일한 총 표면적을 차지하는 10×10 배열의 스팟보다 선호된다. 그러나, 상기 스팟은 임의의 크기일 수 있고, 이는 상기 트랜스글루타미나아제의 총 표면적이 상기 제 1의 젤라틴 층 표면적의 약 5% 내지 약 95%이거나, 그리고/또는 상기 제 2의 젤라틴 층의 표면적의 약 5% 내지 약 95%임을 제공한다. 예를 들어, 상기 드레싱의 전체 크기에 따라, 상기 스팟은 이에 제한되지 않지만, 직경, 폭 또는 길이에서 약 0.01, 0.1, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 mm 이상 또는 초과일 수 있다. 일 실시예에서, 예를 들어, 각각 2 mm 내지 3 mm 직경을 갖는 4개의 원형 스팟은 드레싱의 면적(제곱 센티미터)을 차지할 수 있다. 다양한 다른 형태가 본 발명의 범위 내에 있고, 당해 기술 분야에서 평균적 지식을 가진 자에 의해 쉽게 이용될 수 있다.
선택적으로, 드레싱은 임의의 다양한 크기 및 모양으로 제조될 수 있다. 일반적으로, 상기 드레싱은 당해 기술 분야에서 평균적 지식을 가진 자에 의해 쉽게 취급될 수 있는 크기 및 모양이며, 일반적으로 임의의 면을 따라 12" 길이 미만, 예를 들어, 1"×1", 1"×2", 4"×4" 등일 수 있다. 일반적으로, 상기 드레싱의 수분 수준은 8% 미만(예를 들어, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 미만)이다.
선택적으로, 당해 기술 분야에서 평균적 지식을 가진 자에게 공지된 임의의 다양한 흡수성 물질이 본 발명에 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 흡수성 물질은 딘백질성 물질(예를 들어, 피브린, 케라틴, 콜라겐 및/또는 젤라틴) 또는 탄수화물 물질(예를 들어, 알기네이트, 키틴, 셀룰로스, 프로테오글리칸(예를 들어, 폴리-N-아세틸 글루코사민), 글리콜산(glycolic acid) 중합체, 젖산(lactic acid) 중합체 또는 글리콜산/젖산 공중합체)일 수 있다. 예를 들어, 상기 흡수성 물질은 탄수화물 물질일 수 있다. 흡수성 물질의 예시적인 예는 상호(tradenames) VICRYL.TM. 및 DEXON.TM.하에서 팔리고 있다.
일반적으로, 지혈 드레싱의 다양한 층은 당해 기술 분야에서 평균적 지식을 가진 자에게 공지되고 이용가능한 임의의 수단에 의해 서로 부착될 수 있다. 예를 들어, 선택적으로 그리고 바람직하게는, 젤라틴 층(들) 및/또는 트랜스글루타미나아제 층(들)은 연속적인 빠르게-냉동된 수용액으로 적용된 후에, 예를 들어 각각의 층의 적용 후에 그리고 전체 드레싱의 조립에 대해, 동결 건조 또는 냉동-건조된다. 상기 층은 분사, 피펫팅(pipetting)(예를 들어, 다중-채널 피펫), 살포(sprinkling), 마스크를 사용, 정전기 증착, 마이크로주사기 배열 시스템을 사용 또는 고밀도 배열을 생성하는 포트(port)를 함유하는 분배 매니폴드를 사용하는 분배(dispensing)을 포함한, 임의의 다양한 기술에 의해 적용될 수 있다.
본 발명의 특정 실시예에서, 상기 드레싱은 주형을 사용하여 제조될 때, 수크로스와 같은 이형제는 상기 드레싱의 제 1의 층이 적용되기 전에 상기 주형에 적용된다. 그러한 실시예에서, 상기 지혈 드레싱은 상기 이형제를 함유하는 이형층을 더 포함한다.
선택적으로, 생리적-허용가능한 접착제가 흡수성 물질 및/또는 후면 물질(존재하는 경우)에 적용될 수 있고, 그 후에 젤라틴 층(들) 및/또는 트랜스글루타미나아제 층(들)이 부착된다.
드레싱의 일 실시예에서, 생리적-허용가능한 접착제는 쉬어(sheer) 강도 및/또는 구조를 갖기 때문에, 흡수성 물질 및/또는 후면 물질은 상처 조직에 드레싱의 적용 후에 젤라틴 층으로부터 분리될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 생리적-허용가능한 접착제는 쉬어 강도를 갖기 때문에, 흡수성 물질 및/또는 후면 물질은 상처 조직에 드레싱의 적용 후에 젤라틴 층으로부터 분리되지 않을 수 있다.
상처의 면적 당 젤라틴의 농도는 붕대의 최종 구조, 사용된 물질 및 기타 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 많은 인자에 따라 결정된다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 선택적으로 그리고 바람직하게는, 제 1의 젤라틴 층을 제공하는 단계, 상기 제 1의 젤라틴 층에 트랜스글루타미나아제 층을 적용하는 단계, 그리고 상기 트랜스글루타미나아제 층에 제 2의 젤라틴 층을 적용하는 단계에 의해, 지혈 드레싱을 제조하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 트랜스글루타미나아제 층은 제 1의 젤라틴 층 및/또는 제 2의 젤라틴 층과 동일한 공간에 걸쳐 있지 않다.
유사하게, 본 발명의 다른 실시예는 후면 층에 부착된 제 1의 젤라틴 층을 갖는 흡수성 또는 비흡수성 후면층을 제공하는 단계; 상기 흡수성 또는 비흡수성 후면층이 부착된 면의 반대쪽인 젤라틴 층의 면에 있는 상기 제 1의 젤라틴 층에 트랜스글루타미나아제 층을 적용하는 단계; 및 상기 트랜스글루타미나아제 층에 제 2의 젤라틴 층을 적용하는 단계에 의해, 지혈 드레싱을 제조하는 방법을 포함하며, 여기서 상기 트랜스글루타미나아제 층은 상기 제 1의 젤라틴 층 및/또는 상기 제 2의 젤라틴 층과 동일한 공간에 걸쳐 있지 않다.
지혈 장치
본 발명의 또 다른 예시적인 실시예는, 예를 들어 출혈이 심한 환자의 수술 상황에서 지혈을 위한 지혈 장치에 관한 것이며, 이는 하기를 포함한다: (ⅰ) 다공성의 흡수성 또는 비흡수성 매트릭스; (ⅱ) 분말, 입자 또는 다른 고체 형태에 있는 젤라틴; 및 (ⅲ) 분말, 입자 또는 다른 고체 형태에 있는 트랜스글루타미나아제; 여기서 상기 젤라틴 및 트랜스글루타미나아제는 상기 매트릭스 내에 혼입된다.
본 발명의 또 다른 예시적인 실시예는, 예를 들어 출혈이 심한 환자의 수술 상황에서 지혈을 위한 지혈 장치에 관한 것이며, 이는 하기를 포함한다: (ⅰ) 다공성의 흡수성 또는 비흡수성 매트릭스; (ⅱ) 젤라틴; 및 (ⅲ) 트랜스글루타미나아제; 여기서 상기 젤라틴 및 트랜스글루타미나아제는 상기 매트릭스에 부착된다.
본 발명의 다른 실시예는 실란트 적용의 허용가능한 방법을 통한 지혈/실란트 혼합물의 적용을 포함한다. 그러한 방법은 겔, 발포체(foam) 또는 분사의 일부분으로서 상기 혼합물의 적용을 선택적으로 포함한다. 선택적으로, 이러한 방법을 사용한 지혈/실란트 혼합물의 적용은, 예를 들어 상기 혼합물 구성요소를 분리하여 저장하고 적용 이전에 즉시 혼합함으로써; 및/또는 선택적으로, 예를 들어 상기 구성요소를 비활성화된 형태에서 함께 저장하고 적용 이전에 즉시 활성화함으로써 수행될 수 있다. 선택적으로, 상기 실란트 구성요소의 비활성화된 형태는 하나 이상의 냉동된 용액, 재구성을 필요로 하는 동결 건조된 분말, 재구성을 필요로 하는 분사 건조된 분말 및/또는 비활성화된 실란트 혼합물의 임의의 다른 형태로서 제공될 수 있다.
지혈 장치 제조
본 발명의 일부 실시예에 따르면, 선택적으로, 냉동 건조 및/또는 동결 건조 기술은, 임의의 카테터, 투관침(trocar) 또는 임플란트, 또는 임의의 다른 의료 장치 상에 본 발명에 따른 실란트 조성물을 부착하거나 고정시키는 데에 적용될 수 있다. 선택적으로, 이는 좌상(penetration wound) 및 예를 들어 동맥 카테터/장치에 이용될 수 있는 봉합에서 지혈을 촉진할 수 있다. 동맥 절차(arterial procedure) 후의 지혈은, 항-응고 약제로 치료받고 출혈 합병증의 경향이 있는 환자에 대해 중요하다. 본 발명의 지혈 조성물은 혈액 응고에 의존하지 않고 과다 출혈을 방지하기 위해 추가적인 도움을 제공한다.
장치, 조성물 또는 붕대의 사용
지혈 드레싱, 장치 또는 제재를 사용하는 동안에, 젤라틴 및 트랜스글루타미나아제는, 상기 드레싱, 장치 또는 입자 혼합물이 출혈 또는 누출 상처로부터 벗어나는 환자의 내생적 유체(예를 들어, 혈액, 공기, 담즙, 장액)에 의해 상처 조직에 적용되는 때에 활성화될 수 있다. 선택적으로, 상처 조직으로부터의 유체 손실이 단백질 층에 적당한 수화를 제공하기에 불충분한 상황에서, 상기 젤라틴 및/또는 상기 트랜스글루타미나아제는 생리적-허용가능한 액체(예를 들어, 물, 완충액, 식염수)의 적용에 의해 활성화될 수 있고, 선택적으로, 이는 상기 지혈 드레싱, 장치 또는 제재를 상기 상처 조직에 적용 전이거나 적용 중에 임의의 필수적인 보조 인자 및/또는 효소를 함유한다.
본 발명의 원리 및 작동은 명세서를 수반하고 도면을 참고하면 더 잘 이해될 수 있다.
도면을 참고하면, 도 1은 본 발명에 따른 예시적인 붕대의 구조적 블록도이다. 나타낸 바와 같이, 바람직하게, 붕대(100)는 하나 이상 및 바람직하게 2개의 그러한 층으로 나타낸 복수의 젤라틴 층(102)을 특징으로 하고, 이는 단지 설명을 위한 것이고 제한하는 의도는 아니다. 바람직하게는, 하나 이상의 트랜스글루타미나아제 층(104)이 또한 제공된다: 이러한 예에서, 트랜스글루타미나아제 층(104)은 복수의 젤라틴 층(102) 사이에서 샌드위치된 채로 나타나며, 이는 단지 예시의 목적이고 제한하는 의도는 아니다. 적당한 후면(106)이 또한 나타나며, 바람직하게는 붕대(100)에 기계적 강도를 제공한다. 선택적으로, 후면(106)은 폴리글리콜산 메시 또는 패치(예를 들어, DexonTM 또는 VicrylTM으로 제공됨)로서 실행될 수 있다.
도 2는 본 발명에 따른 예시적인 붕대의 정면도를 나타내며, 이는 다른 흡수성 후면 및 다른 플라스틱 포장(wrapping)으로 덮어진다.
도 3은 본 발명에 따른 예시적인 지혈 장치의 구조적 블록도이며, 이는 다공성의 매트릭스를 포함한다. 나타낸 바와 같이, 바람직하게는, 지혈 장치(300)는 하나 이상 및 바람직하게는 2개의 그러한 층으로 나타낸 복수의 젤라틴 층(302)을 특징으로 하고, 이는 단지 설명을 위한 것이고 제한하는 의도는 아니다. 바람직하게는, 하나 이상의 트랜스글루타미나아제 층(304)이 또한 제공된다: 이러한 예에서, 트랜스글루타미나아제 층(304)은 복수의 젤라틴 층(302) 사이에서 샌드위치된 채로 나타나며, 이는 단지 예시의 목적이고 제한하는 의도는 아니다. 적당한 후면(306)이 또한 나타나며, 바람직하게는 붕대(300)에 기계적 강도를 제공한다. 선택적으로, 후면(306)은 임의의 유형의 생분해성 물질로서 수행될 수 있다.
하기의 예를 참고하면, 본 발명에 따른 다양한 조성물이 구성되었고, 출혈이 감소하고 지혈이 유도되는 상기 조성물의 능력을 시험하였다. 시험된 조성물은 실험용 동물에서 매우 우수하였고, 출혈을 정지시켰고, 동맥 출혈조차도 정지시키는 것을 발견하였다.
예 1
예시적인 접착제의 제조
이러한 예는 본 발명에 따른 예시적인, 제한이 없는 접착제의 제조에 관한 것이다. 이러한 예에 대해, 칼슘 의존하지 않은 미생물의 트랜스글루타미나아제(Lot No. L-04207, Ajinomoto USA, Chicago, IL)를 100 U/gm의 특이적 활성 수준으로 사용하였다. 또한, 시험된 젤라틴은 Gelatin 유형 A, 돼지 피부로부터의 300 블룸이다(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).
하기의 방법은 예시적인 접착제를 제조하는 데에 사용된다: PBS에 있는 20% w/w 젤라틴(인산 완충 식염수; PBS 80 g 내에 젤라틴 20 g)을 제조하였다. 다음에, 20% w/v mTG 용액을 PBS에서 제조하였다(PBS 5 mL 내에 mTG 1 gm). 그런 다음, 젤라틴 용액 5 g을 mTG 용액 5 mL과 혼합하였다(달리 표현하면, 10:1의 비율).
도 4는 접착제의 접착 강도에 대한 젤라틴의 다른 백분율의 효과를 나타낸다. 제 2의 샘플에 돼지 피부 샘플을 부착하여 상기 접착 강도를 측정하였고, 총중량은 47.5 g이고, 그런 다음 샘플을 물에 120분 동안 즉시 침지시켰다. 상기 침지 기간 후에, 장력(tension)을 5 mm/min로 가하여 최종적인 접착 강도를 측정하였다(문헌[Mcdermott 등. Biomacromolecules 2004, 5, 1270-1279]참조).
도 5에서 설명된 바와 같이, 미생물의 트랜스글루타미나아제의 최적의 반응 수준은 50 ℃ 내지 55 ℃ 범위이다. 생리적 수준인 37 ℃에서, 상기 반응 수준은 단지 최적 수준의 약 60%이다. 그러한 바와 같이, 발열제를 사용하여 반응 온도를 올리는 것은 반응 수준을 올리는 것이고, 따라서 젤라틴 교차 결합의 속도를 증가시키는 것이다. 따라서, 선택적으로 그리고 바람직하게는, 발열제는 본 발명의 일부분이다.
선택적으로, 염화칼슘이 용해는 되지만 조직을 손상시키지 않는 충분한 열을 방출하기 때문에, 칼슘을 그러한 제재의 일부분으로 사용할 수 있다. 또한, 상기에서 언급한 바와 같이, 칼슘은 발열 용해와 관계없이 다른 방법으로 반응을 촉진할 수 있다는 것이 가능하다.
선택적으로, 무독성 발열 물질이 하나 이상의 교차 결합 인자와 함께 붕대에 포함될 수 있다. 선택적으로 또는 추가적으로, 하나 이상의 비흡수성 발열제는, 이전에 언급한 바와 같이, 붕대 후면의 이면에 선택적으로 첨가될 수 있다.
예 2
시험관내 파열(burst) 압력 테스트
이러한 예는 고압의 동맥 혈액 흐름을 견뎌낼 수 있는 능력에 대한 대용(proxy)으로서 파열을 견뎌낼 수 있는 본 발명에 따른 조성물의 능력을 설명한다. 하기에서 설명한 바와 같이, 고압의 혈액 흐름을 모방한 파열 압력 시스템이 개발되었고, 이는 돼지 피부 샘플의 상처 상에 압력을 가하는 혈액의 위치에서 사용된 온열의 PBS를 사용하였다. 2분 동안 200 mmHg의 압력을 견뎌내는 것은, 생리적 혈압이 거의 항상 200 mmHg보다 낮기 때문에 거의 성공적인 평가로 간주된다. 이러한 파열 테스트 결과는 본 발명에 따른 조성물이 고압 동맥 흐름을 포함하는 혈액 흐름의 치료에 적합하다는 것을 증명한다.
대부분의 샘플(8/10)은 2분 동안 200 mmHg의 여압(pressurization)을 견뎌내었다. 통과하지 못한 샘플은 인간 또는 시스템 오차(error)에 관한 것이었다. 평균 파열 압력은 320±50 mmHg이나, 파열되지 않은 샘플이 실험 장치에 의해 측정된 최대 압력과 같은 354 mmHg의 값에 할당되었기 때문에 이러한 숫자는 조심스럽다. 이러한 결과는 정밀한 테스트 조건 하에서도 지혈 목적을 위해 사용되는 본 발명의 일부 실시예에 따른 접착 조성물의 능력을 설명한다.
물질
젤라틴(돼지로부터의 유형 A, 블룸 값 300)을 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO)로부터 수득하였다. 칼슘-의존하지 않은 미생물의 트랜스글루타미나아제(mTG) 혼합물 TG-TI를 Ajinomoto로부터 수득하였고, 추가적인 정제 없이 사용하였다. 이러한 효소는 100 U/gm의 특이적 활성을 갖는 제조자에 의해서 보고되었다. 돼지 피부 조직을 지방 식품점에서 구입하였다.
샘플 제조
돼지 피부를 약 6 cm 내지 6.5 cm의 직경을 갖는 디스크(disk) 모양으로 자르기 전에 1시간 동안 희석된 NaOH으로 처리하였다. 상기 피부상의 지방을 매스로 제거하였다. 상처를 가장하기 위해 상기 피부의 중앙에 2-mm 구멍을 펀치로 뚫었다. 상기 피부를 많은 양의 물 및 PBS 완충액으로 세척하였고, 사용하기까지 피부 수분을 유지하기 위해 약 1 ml PBS 완충액으로 페트리(Petri) 접시에 저장하였다. 본원에서 설명된 모든 실험에 대해, Dulbecco's 인산 완충 식염수를 상기 PBS 완충액에 대해 pH 7.4로 사용하였다.
PBS 완충액에서 젤라틴 용액(25% w/w)을 매일 새롭게 제조하였고, 사용하기 전에 65 ℃에서 저장하였다. PBS 완충액에서 mTG(20% w/w) 스탁(stock) 용액을 제조하였고, 2 ml 유리병에 시료를 채취하고, -18 ℃에서 저장하였다. 효소 용액을 사용하기 전에 실온에서 녹였다.
접착제를 적용하기 전에 피부 표면을 실험실에 있는 화장지로 닦아내고 건조하였다. 접착제를 젤라틴 1 ml 및 mTG 0.5 ml을 혼합하여 2 ml 유리병에서 제조하였다. 2개의 다른 조성물을 제조하였다. 조성물 "A"는 Ajinomoto로부터의 트랜스글루타미나아제를 사용하였고, 반면에 조성물 "B"는 (Yiming Biological Products Co.(Jiangsu, China); 상기에서 설명된 바와 같은 원하는 생성물)로부터의 트랜스글루타미나아제를 사용하였다. 생성물 혼합물 0.6 ml(본 발명에 따른 예시적인 조직 접착 조성물)를 구멍을 통하여 돼지 피부에 적용하였다. 상기 접착제를 적용한 후에, 상기 피부 조직을 30분 동안 37℃에서 배양하였다. 배양 후에 즉시 파열 테스트를 수행하였다.
파열 테스트
조립하기 전에, 내장용 장치를 온열의 완충액(~44 ℃)에서 평형을 유지하였다. 상기 장치 내에서 배양된 피부를 빠르게 조립한 후에, 42 ℃ PBS 완충액의 약 50 ml를 상기 피부 조직의 상부의 장치 내로 붓는다. 압력을 증가시키기 위해 질소 스트림(stream)을 수동으로 조절하였다. 상기 파열 테스트의 전 과정은 하기와 같다:
단계 1 - 압력을 200 mmHg로 증가시키고 2분 동안 유지한다;
단계 2 - 압력을 300 mmHg로 증가시키고 2분 동안 유지한다;
단계 3 - 압력을 354 mmHg(측정할 수 있는 최대 압력) 초과로 증가시킨다.
조절한 바와 같이, 순수한 젤라틴 용액을 피부에 적용하였고, 물리적인 젤을 형성함으로써 30분 동안 실온에서 겔화(즉, 세트(set))시켰다. 젤라틴-온열(gelatin-warm)은 상기 물리적인 젤라틴 겔을 녹일 수 있는 42 ℃ 완충액의 사용을 말한다.
결과
도 6은 조성물 A의 조직 접착제의 예시적인 파열 압력 측정을 나타낸다. 도 6에서 샘플 #4 및 #5에 대한 데이터를 나타낸다. 조성물 A에 대한 파열 테스트 결과의 요약은 표 2에서 나타낸고, 샘플 전체의 목록은 표 3에서 나타낸다.
조성물 A에 대한 파열 테스트 결과의 요약
테스트된 총 샘플의 수 10




파열 없음 5
단계 #2 후의 파열 1
단계 #1 후의 파열 2
단계 #1 동안의 파열 2
평균 파열 압력* 320±50 mmHg
* 354 mmHg(측정할 수 있는 최대 압력)의 값은 "파열 없음" 샘플에 대해 적용하였다.
조성물 A 샘플의 파열 테스트 결과
샘플 번호(#) 200 mmHg 300 mmHg 파열 압력 (mmHg) 파열 유형 비고
1 2분 - 325 점착성 있음
2 2분 2분 >354
3 2분 2분 >354
4 2분 2분 >354
5a 30초 - 232 점착성 있음 장치누출(device leak)
6 2분 2분 >354
7 2분 2분 348 점착성 있음
8 2분 - 250 점착성 있음 44 ℃ PBS
9 2분 2분 >354
10 10초 - 245 점착성 있음 44 ℃ PBS
대조군:
젤라틴-온열
13 - - 181 녹음 42 ℃ PBS
14 - - 45 녹음 37 ℃ PBS
15 - - 93 녹음
16 - - 105 녹음
17 - - 84 녹음
18 - - 45 녹음
19 - - 15 녹음
20 - - 140 녹음
a ~200 mmHg 장치가 누출하기 시작하였다. 상기 장치를 팽팽하게 하여 압력을 증가시켰으나, 또한 상기 피부를 비틀 수 있었으며, 232 mmHg에서 점착성이 없었다.
도 7은 조성물 B의 조직 접착의 예시적인 파열 압력 측정을 나타낸다. 도 7에서 샘플 #4 및 #5에 대한 데이터를 나타낸다. 샘플의 전체 목록에 대한 결과를 표 4에서 나타낸다.
조성물 B 샘플의 파열 테스트 결과
샘플 번호(#) 200 mmHg 300 mmHg 파열 압력
(mmHg)		 파열 유형 비고
1* 2분 최대
2 2분 2분 최대
3* 최대, 2분
4 2분 - 315 점착성 있음 44 ℃PBS
5 2분 2분 최대
* 상기 압력은 수동으로 조절되고 압력 방출 밸브가 없기 때문에, 이러한 샘플의 압력은 부주의로 200 mmHg를 초과하였다.
예 3
쥐 모델에서의 지혈
이러한 예는 살아있는 동물에서 지혈을 달성하기 위해, 본 발명에 따른 젤라틴-mTG 조성물의 초기 생체내 설명을 제공한다. 쥐는 암컷 어른의 시리아(Syrian) 쥐이다.
물질
PBS에서 25% w/w 젤라틴(돼지, 유형 A, Sigma-Aldrich로부터 300 블룸(St. Louis, MO))으로 특징되는 젤라틴 용액을 사용하였다. 상기 용액을 주걱을 사용하여 수동으로 교반한 것과 같이, 젤라틴 분말 내에 가열된(50 ℃) PBS를 혼합함으로써 상기 용액을 혼합하였다. 적용하기 이전에, 젤라틴 용액을 액상으로 유지하기 위해, 50 ℃ 수조에 침지된 뚜껑이 있는 5 mL 주사기에 저장하였다.
트랜스글루타미나아제(mTG) 용액은 PBS에서 20% w/w 미생물의 트랜스글루타미나아제(Activa WM, AjinomotoTM)을 특징으로 한다. 상기 mTG 용액을 실온에서 유지하였다. 적용 이전에, 1 mL 젤라틴 용액을 2 mL 에펜도르프(eppendorf) 튜브에서 0.5 mL mTG 용액에 첨가하였다. 상기 용액을 혼합하기 위해 상기 튜브를 2회 내지 3회 거꾸로 놓았고, 그런 다음 1 mL 피펫 팁을 사용하여 상처 부위에 상기 용액을 적용하였다. 이는 실험군 용액이었다.
대조군 용액에 대해, mTG 용액을 첨가하지 않고 젤라틴을 단독으로 투여하여, 프로토콜(protocol)을 반복하였다.
실험군 및 대조군 적용 둘 모두에 대해, 개구부를 확장하고 점성이 있는 젤라틴-mTG 용액을 통과시키기 위해 피펫 팁을 말단으로부터 약 1/2 cm 절단하였다.
간 상처
실험군 및 대조군 적용 둘 모두에 대해, 부리-꼬리(rostral-to-caudal) 방향에서 왼쪽 간엽을 매스를 사용하여 절단하였고, 1 cm 길이, 1/2 cm 깊이의 화살 모양의 절단을 생성하였다. 약 10초간의 출혈 후에, 젤라틴(대조군) 또는 젤라틴-mTG(실험군) 용액 중 하나의 적용 이전에, 축적된 혈액을 즉시 제거하기 위해 면 거즈(cottom gauze)를 사용하였다.
먼저, 실험군 용액을 절단된 왼쪽 간엽에 적용하였다. 겔은 적용 후 약 2분에 형성되었고, 출혈은 적용 후 약 2.5분 미만에서 정지하였다. 5분 후에, 조직을 강하게 흔들고, 포셉(forcep)을 사용하여 상처 부위에 걸쳐서 장력을 적용하며, 상기 겔은 손상되지 않은 채로 있고 상기 상처는 봉합되었다. 도 8은 겔의 형성 및 지혈의 유도를 나타내는 사진이다(도 8A는 전체 면적을 나타내는 반면에, 도 8B는 더 상세하게 확대한 면적의 일부분을 나타낸다).
그 후에, 대조군 용액을 절단된 오른쪽 간엽에 적용하였다. 겔은 형성되지 않았고, 상기 용액은 대부분 혈액 흐름에 의해 상처 부위 밖으로 씻겨져 나갔다. 6분 내지 7분 후에도, 응고는 형성되지 않았고 간은 출혈을 계속하였다(도 9A).
대조군 용액을 제거하고, 실험군 용액을 축적된 혈액을 제거하지 않고 상기 상처 부위에 적용하였다. 상기 축적된 혈액이 상기 간에 실험군 용액의 접착을 방해한다 하더라도, 겔은 약 1분 후에 혈액 흐름을 매우 늦추면서 여전히 형성되고, 4.5분 후에는 출혈을 완전히 정지시켰다(도 9B). 이는 본 발명의 조성물이 혈액 흐름을 늦출 수 있고, 축적된 혈액의 존재하에서도 지혈을 유도할 수 있다는 것을 증명한다.
대퇴 동맥 절단
매스를 사용하여 쥐의 왼쪽 대퇴 동맥을 제공하였다. 과다 출혈의 약 10초 후에, 젤라틴-mTG(실험군) 용액의 적용 이전에 축적된 혈액을 즉시 제거하기 위해 면 거즈를 사용하였다. 상기 용액을 적용한 때에, 혈액은 겔화를 하는 것과 같이 실험군 겔과 혼합되었다. 이러한 정밀한 조건 하에서, 상기 겔은 3분 미만에서 출혈을 완전히 정지시켰다. 5분 후에, 포셉을 사용하여 상기 겔을 수동으로 테스트하였다. 겔은 혈액과 과다하게 혼합된 경우에 주목할만하게 덜 딱딱해 졌고 덜 접착성이 있게 되었으나, 심한 동맥 부위에 걸쳐서 여전히 강한 응고를 형성하였다. 도 10A 내지 도 10D는 절단(10A); 절단된 동맥, 과다 출혈(10B); 상기 절단된 동맥에 본 발명의 조성물의 적용(10C); 및 생체모방 응고를 형성하는 지혈(10D)과 같은 동맥의 사진을 나타낸다.
그런 다음, 매스를 사용하여 쥐의 오른쪽 대퇴 동맥을 제공하였다. 출혈의 약 10초 후에, 젤라틴-mTG(실험군) 용액의 적용 이전에 축적된 혈액을 즉시 제거하기 위해 면 거즈를 사용하였다. 과다 출혈이 관찰되었으나, 상기 겔에 의해 거의 완전히 정지하였고 출혈은 1분 미만에서 완전히 정지하였다. 상기 겔은 매우 강하게 유지되었고, 겔에 의해 정제된 혈갱이 쉽게 관찰되었다. 5분 후에, 포셉을 사용하여 상기 겔을 수동으로 테스트하였다. 형성된 겔에서 정지된 혈액의 존재에도 불구하고, 상기 동맥에 부분에 있는 조직에 매우 강하게 부착되었다.
따라서, 본 발명에 따른 조성물은 출혈 속도를 명백히 늦출 수 있고, 축적된 혈액 및/또는 과다 출혈(예를 들어, 간, 위, 신장, 심장, 폐 및/또는 피부를 포함하나 이에 제한되지 않은 혈관이 지나가는 기관 및/또는 동맥으로부터임)의 존재에서도, 생체내 모델에서 지혈을 유도할 수 있다.
예 4
돼지 모델에서의 지혈
이러한 예는 대형 동물 모델에서 지혈을 달성하기 위한 본 발명에 따른 젤라틴-mTG 조성물의 초기 생체내 설명을 제공한다. 대형 동물 모델에서 지혈 유용성에 대한 가능성을 명백히 증명하였다.
물질
젤라틴 용액은 PBS에서(pH 7.4)에서 25% w/w 젤라틴(돼지, 유형 A, Sigma-Aldrich(St. Louis, MO)로부터의 300 블룸)을 특징으로 하고, 본원에서 설명된 바와 같이 제조되었다. 젤라틴 분말을 점진적으로 첨가하는 동안에, PBS를 핫 플레이트(hot plate) 자석 교반기를 사용하여 60 ℃에서 연속적으로 교반하였다. 분말의 용해 속도를 증가시키고 균일한 용액을 형성하기 위해 가끔 유리 막대를 사용한 수동적 교반을 하였다. 전체 실험을 통해, 젤라틴 용액을 액상을 유지하고 열-가역적인 겔의 형성을 방지하기 위해 ~50 ℃로 맞춰진 열조(thermal bath)에 저장하였다.
20% w/w 미생물의 트랜스글루타미나아제(Activa WM, AjinomotoTM)을 특징으로 하는 mTG 용액을 PBS(pH 7.4)에 용해시켰다. 하기와 같이 제조하였다. 실온(RT) PBS 용액을 자석 교반기를 사용하여 교반하였고 mTG 분말을 점진적으로 첨가하였다. 전체 실험을 통하여, 사용할 때를 제외하고, 상기 mTG 용액을 ~30 ℃로 맞춰진 열조에서 보관하였다.
실험을 시작하기 전에, 45 kg 중량의 암컷 어른 돼지를 마취하였다. 실험을 통하여 상기 돼지에 산소를 공급하고 생명 징후를 모니터하였다.
하기에서 설명된 바와 같이 상처 부위에의 적용 이전에, 본 발명에 따른 젤라틴-mTG 용액을 제조하였고, 상처 부위에 실란트를 놓기 위해 도구(applicator)를 사용하였다. 붕대의 보조 물질로서 몇몇 다른 도구들을 시험하였다. 달리 언급되지 않는다면, 상처 부위에 즉각적인 적용 전에, 6 mL의 신규의 수술 실란트 용액을 상기 도구에 분사하였고 실온에서 1분 동안 냉각한 채로 두었다. 이러한 실란트-함유 패드를 "붕대 견본(prototpye)"이라 한다. "대조군 붕대"에 대해, 유사한 프로토콜은 하기와 같으나, 상기 도구에 걸쳐서 분사된 대조군 용액을 갖는다.
신규의 수술 실란트 용액-젤라틴 대 mTG의 비율이 2:1인 혼합물을 제조하였다. 달리 언급되지 않는다면, 15 mL 튜브에 2 mL mTG 용액을 4 mL 젤라틴 용액에 첨가함으로써 상기 혼합물을 제조하였고, 상기 용액을 혼합하기 위해 상기 튜브를 5회 거꾸로 하였다.
대조군 용액-대조군 용액에 대해, mTG 용액 대신에 PBS를 단독으로 사용한 것을 제외하고는, 신규의 수술 실란트 제조에 대해 설명한 과정을 반복하였다. 따라서, 젤라틴을 PBS 용액(pH 7.4)으로 2:1의 비율로 희석하였고, ~30 ℃ 열조에서 침지시켰다. 달리 언급되지 않는다면, 15 mL 튜브에 2 mL PBS 용액을 4 mL 젤라틴 용액에 첨가함으로써 상기 혼합물을 제조하였고, 상기 용액을 혼합하기 위해 상기 튜브를 5회 거꾸로 하였다.
도구를 하기와 같이 사용하였다:
1. 4 cm × 4 cm 면 거즈 패드;
2. 4 cm × 4 cm 일회용 플라스틱 후면 흡수성 패드. 상기 용액은 상기 패드의 플라스틱, 비흡수성 면에 퍼져 있다;
3. 실리콘 주형;
4. 실리콘 주형 내부에 놓여진 4 cm × 4 cm 일회용 플라스틱 후면 흡수성 패드. 상기 용액은 상기 패드의 플라스틱, 비흡수성 면에 퍼져 있다;
5. 높은 마진(margin)을 갖는 투명한 유연성 플라스틱 주형;
6. 주사기를 사용하거나 또는 15 mL 튜브로부터 유출함으로써 상처 부위에 실란트의 직접적인 적용.
이러한 연구에서 신규의 수술 실란트의 적용은 다른 도구를 사용하여 상처 부위에 상기 실란트를 수동으로 놓는 의사에 의해 성취될 수 있다. 필요하다면, 적용 이전에 축적된 혈액을 즉시 제거하기 위해 면 거즈를 사용하였다. 3분 동안 지혈 압력을 붕대의 반대쪽 면에 적용하였다. 3분 후에 의사는 압력을 완하하였고, 상처 부위가 지혈되는지 관찰하였다. 완전한 지혈이 발생하지 않는다면, 상기 상처 부위를 허용가능한 수술 지혈 기술에 의해 봉합하였다. 대조군 용액의 적용은 대조군 붕대를 제거한 후에 지혈이 관찰되지 않는다면 즉시 적용된 허용가능한 지혈 기술과 함께, 동일한 기술을 따랐다.
둔부 근육 상처
동물을 엎드린 위치로 놓고 둔부 근육 상의 피부를 제거하였다. 전체적으로, 7회 실험을 수행하였고, 지혈 및 조직 접착을 시험하였다. 달리 언급되지 않는다면, 각각의 시험에서 #15 매스를 사용하여 3 cm × 3 cm 사각형의 근육을 근육 내의 2 cm 깊이로 절단하였다. 필요한 경우에 과다 혈액을 상기 상처 부위로부터 제거하였고, 신규의 수술 실란트 용액 또는 대조군 용액을 이전에 설명한 바와 같이 적용하였다.
표 5 및 표 6은 실험 과정 및 각각의 실험 결과를 요약하고 설명한다. 표 5는 지혈에 관한 것인 반면에, 표 6은 조직 접착 성질에 관한 것이다.
먼저 지혈에 관하여, 면 거즈 패드를 사용하여 대조군 용액을 상처 부위에 적용하였다(표 5, 대조군 #1). 상기 대조군 용액을 면 거즈 상에 적용하였고 즉각적인 적용 이전에 1분 20초 동안 냉각한 채로 두었다. 상기 상처 부위는 매우 약하게 출혈되었고, 완전한 지혈이 상기 대조군 밴드의 적용 후 2분에 관찰되었다. 생체모방 응고가 상기 상처 부위에서 관찰되지 않았다 하더라도, 상기 상처 부위에 적용된 지혈 압력은 지혈을 촉진하기에 충분하였다.
실험을 다른 상처 부위에서 반복하였고, 차이점은 사용된 도구가 일회용 플라스틱 후면 흡수성 패드이고, 대조군을 그의 적용 이전에 30초 동안 남겨두었다는 것이다(표 5, 대조군 #2). 상기 상처 부위는 매우 약한 출혈을 나타내었고, 상기 대조군 붕대를 적용한 후 2분에 완전한 지혈이 관찰되었다. 이전의 경우에서와 같이, 이는 아마도 상기 붕대를 적용하는 동안에 지혈 압력이 상처 부위에 적용되었기 때문이다. 상기 상처 부위에서 생체모방 응고는 관찰되지 않았다.
먼저의 2개의 대조군 실험 동안에 관찰된 작은 양의 출혈 때문에, 더 깊은 4 cm 깊이의 절단을 만든 것을 제외하고는 상기 실험을 반복하였다(표 5, 대조군 #3). 결과적으로, 과다 출혈은 관찰되었다. 상기 대조군 용액을 흡수성 패드에 걸쳐 적용하였고 50초 동안 남겨두었다. 의사는 상기 상처 부위로부터 과다 출혈을 제거하고 대조군 붕대를 적용하였다. 3분 후에 출혈은 감소하였으나 완전한 지혈은 관찰되지 않았다.
대조군 용액을 면 거즈 패드를 사용한 이전의 실험에서 생성된 상처 부위로부터 제거하였다. 출혈은 여전히 관찰되었다. 지혈을 달성하기 위해 신규의 수술 실란트를 상기 상처 부위에 적용하였다(표 5, 실란트 #1). 실란트 용액을 흡수성 패드에 걸쳐서 놓고, 1분 동안 남겨두었고 상기 상처 부위에 걸쳐 적용하였다. 3분 후에 완전한 지혈이 관찰되었다. 상기 실란트는 상기 상처 부위에 걸쳐서 생체모방 응고를 형성하였다. 상기 겔을 포셉을 사용하여 흔들었고 상기 조직에 강한 접착이 관찰되었다. 일부 힘을 적용한 후에 상기 겔을 제거하였고 막(film)으로 나타났다. 따라서, 이러한 결과는 본 발명에 따른 조성물의 지혈 성질을 증명하였다.
둔부 근육
실험 RT(℃) 심박수 적용기술 설명 지혈시간(분) 결과
대조군 #1 21 99 면 거즈 패드 상처 부위는 절단 후에 약간의 출혈을 나타냈다. 적용 이전에 대조군 용액을 도구에 걸쳐서 놓았고 1분 20초 동안 냉각한 채고 두었다. 2 절단 후에 상기 상처 부위로부터 약각의 출혈이 관찰되었다. 지혈은 상기 상처 부위에 압력을 적용함으로써 달성되었다.
대조군 #2 21 98 일회용 플라스틱 후면 흡수성 패드 상처 부위는 절단 후에 약간의 출혈을 나타냈다. 대조군 용액을 도구에 걸쳐서 놓았고 상기 상처 부위 상에 적용 이전에 30초 동안 냉각한 채로 두었다. 2 절단 후에, 상기 상처 부위로부터 약간의 출혈이 관찰되었다. 지혈은 상기 상처 부위에 걸쳐 압력을 적용함으로써 달성되었다.
대조군 #3 22 98 일회용 플라스틱 후면 흡수성 패드 4 cm 깊이의 절단을 하였다. 과다 출혈이 관찰되었다. 대조군 붕대를 50초 동안 냉각한 채로 두었다. 상기 상처 부위에 걸친 그의 적용 이전에 과다 혈액을 제거하였다. - 의사는 상기 과다 출혈 때문에 지혈 압력을 적용하였다. 3분 후에 출혈이 감소하였으나 정지하지는 않았다.
실란트 #1 22 99 일회용 플라스틱 후면 흡수성 패드 대조군 #3에 대해 수행된 상처로부터 대조군 용액을 제거하였다. 과다 출혈을 제거하였다. 상기 실란트를 출혈 상처 부위에 놓았다. 3 강한 생체모방 응고를 상기 상처 부위에 걸쳐 형성하였다. 완전한 지혈 및 상기 실란트의 강한 접착이 관찰되었다.
둔부 근육 모델에서 상기 실란트의 지혈 능력을 증명한 후에, 조직 접착을 시험하였다(표 6). 상처 부위를 개방한 근육 부분으로부터 조직의 조각을 제공하기 위해 수술적 절단을 하였다.
제 1의 접착 실험(표 6, 실란트 #2)에서, 실란트를 상처 부위에 걸쳐서 직접적으로 적용하였고, 의사는 3분 동안 조직의 상부에 강하고 즉각적인 압력을 적용하였으며, 상기 상처 부위로부터 모든 실란트를 교체하였고 접착이 없었다.
하기의 실란트 적용을 제외하고 상기 실험을 반복 하였고, 의사는 단지 적당한 압력을 적용하였다(표 6, 실란트 #3). 3분 후에 접착된 조직이 나타났다. 상기 조직의 상부를 흔들었을 때, 적당한 양의 저항이 그의 완전한 제거에 대해 관찰되었다.
압력의 적용에 대해 상처 부위로부터 상기 실란트를 교체하지 않은 특별한 치료로 상기 실험을 반복하였다(표 6, 실란트 #4). 다른 상처 부위에, 조직의 양쪽 부분에 상기 실란트를 적용하였고 10초 동안 남겨두었다. 그런 다음, 상기 조직의 상부를 교체하고, 적당한 압력을 적용하였다. 3분 후에, 강한 조직 접착을 관찰하였다. 그런 다음, 접착된 조직을 분리하는 데에 상당한 양의 힘을 필요로 했다.
조직 접착
실험 RT
(℃)		 심박수 적용
기술		 설명 조직
접착		 결과
실란트
#2		 23 99 튜브로부터직접적인 적용 과다 출혈을 면 거즈 패드를 사용하여 제거하였다. 상기 실란트를 상처부위에 놓고 의사는 즉각적인 교체 압력을 적용하였다. N/A 상처 부위에 남아 있는 실란트가 없다.
실란트
#3		 23 94 튜브로부터직접적인 적용 과다 출혈을 면 거즈 패드를 사용하여 제거하였다. 상기 실란트를 상처부위에 놓고 의사는 적당한 압력을 적용하였다. + 접착은 약간의 저항이 관찰되었다.
실란트
#4		 24 95 튜브로부터직접적인 적용 실란트 용액을 조직의 양쪽 면에 상처 부위에 걸쳐서 놓고 10초 동안 남겨두었다. 그런 다음 상기 조직의 상부를 교체하고 매우 낮은 압력을 적용하였다. + 강한 접착이 관찰되었다.단지 강한 힘을 적용한 후에 사기 조직을 제거하였다.
간에서의 지혈
돼지를 눕혀 놓고 중심선 개복술을 통해 돼지의 간을 노출시켰다. 간의 점진적으로 더 깊은 생체 조직을 제거하기 위해 연속적으로 절단하였고, 결과적으로 많은 혈관을 노출하였다. 전체적으로, 5개의 생체 조직 검사를 수행하였다. 필요한 경우에, 본 발명에 따른 조성물의 적용 이전에 축적된 혈액을 즉시 제거하기 위해 면 거즈를 사용하였다.
제 1의 연속적인 생체 조직 검사에 대해, 3분 동안 붕대의 반대쪽 면에 지혈과 함께 대조군 붕대를 적용하였다. 3분 후에, 의사는 압력을 완화하였고 상기 상처 부위는 지혈이 관찰되었다. 완전한 지혈이 발생하지 않은 경우에, 더 깊은 생체 검사를 수행한 후 신규의 수술 실란트를 적용하였다. 다시, 3분 동안 붕대의 반대쪽 면에 지혈 압력과 함께 실란트를 적용하였고, 그런 다음 지혈을 시험하였다. 완전한 지혈이 관찰될 때, 더 깊은 간 생체 조직을 제거하였고 상기 실험을 상기 실란트로 반복하였다. 이는 높은 혈압에 대한 상기 실란트의 지혈 능력을 입증하였다. 표 7은 상기 실험 과정 및 각각의 실험 결과를 요약한다.
4 cm 깊이의 생체 조직을 왼쪽 간엽으로부터 제거하였다(표 7, 대조군 #1). 실리콘 주형에 놓여진 흡수성 패드에 걸쳐서 대조군 용액을 적용하였고 1분 동안 남겨 두었다. 지혈 압력과 함께 대조군 붕대를 상처 부위에 적용하였다. 3분 후에, 압력을 제거하였고 지혈은 관찰되지 않았다.
상기 대조군 붕대의 적용에 의해 지혈이 달성되지 않은 후에, 1 cm 더 깊은 생체 조직을 제거하였고 30초 동안 출혈된 상태로 남겨 두었다. 그런 다음 신규의 실란트로 상기 실험을 반복하였다(표 7, 실란트 #1). 실리콘 주형에 패드 상에 신규의 실란트를 놓고 1분 후에 지혈 압력과 함께 상처 부위에 적용하였다. 3분 후에, 상기 압력을 완화하였고, 견본 붕대를 벗겨내었고, 지혈을 시험하였다. 상기 실란트는 육안의 생체모방의 막을 생성하였다. 지혈을 달성하였으나, 상기 실란트가 상처 전체를 덮고 있지 않았기 때문에 완전히 지혈되지는 않았다. 상기 실란트로 덮어진 부분은 출혈이 정지되었다는 것을 관찰하였다. 몇분 후에 생체모방의 막을 제거한 때, 출혈이 다시 시작되었다.
다음에, 1 cm 더 깊은 생체 조직을 제거하여 과다 출혈되었다. 도구로서 실리콘 주형을 사용한 것을 제외하고는 상기 실험을 반복하였고 적용 이전에 과다 출혈을 제거하였다(표 7, 실란트 #2). 그런 다음 의사는 3분 동안 상처 부위에 압력을 적용하였다. 의사가 압력을 적용하지 않았을 때, 생체모방 응고가 상기 상처 부위에 걸쳐서 관찰되었다. 생체모방 응고에 대한 혈압은 식별할 수 있었고 몇 분 후에, 혈액은 생체모방의 실란트의 가장자리로부터 돌파하였다. 상기 돌파는 실란트에 의해 덮어지지 않은 상처 부위의 측면을 통과하였다. 이는,이러한 단계에서 상기 실란트의 지혈 능력은 상처 부위 전체를 덮느냐에 따라 결정된다는 것을 나타낸다.
돌파를 회피하기 위해, 많은 양의 실란트를 상기 상처 부위에 적용한 것을 제외하고는 이전의 실험을 반복하였다(표 7, 실란트 #3). 0.5 cm 더 깊은 생체 조직을 간엽으로부터 제거하였다. 9 mL 실란트를 압력과 함께 상기 상처 부위에 걸쳐서 적용하였다. 불행하게도, 적용 동안에 거의 모든 실란트가 상기 상처 부위에 점적(drip off)되었고, 의사가 압력을 적용한 후에 상기 상처 부위 상에 식별할 수 없는 실란트를 남겼다.
상기 실험을 반복하였다(표 7, 실란트 #4). 또 다른 1 cm 생체 조직을 제거하였고 과다 출혈이 관찰되었다. 이 때에, 그 위치에서 상기 실란트를 유지하기 위해 높은 마진(margin)을 갖는 투명한 플라스틱 주형을 사용하여, 15 mL의 실란트를 상기 상처 부위에 걸쳐서 적용하였다. 상기 실란트를 도구 상에 놓고 1분 20초 동안 냉각한 채로 두었다. 상기 실란트를 상기 상처 부위에 적용하였고 4분 후에, 더 두꺼운 층의 생체모방 응고가 관찰되었고 완전한 지혈이 달성되었다. 50분 후에 조직을 재시험하였고 지혈은 여전히 관찰되었다. 이는, 충분한 실란트가 상처 부위에 적용되고 그 위치에서 유지되는 경우에 상기 실란트의 강한 지혈 능력을 나타낸다. 형성된 생체모방의 막은 조직 표면에 강하게 부착되어 있기 때문에 제거하기가 어렵고, 막의 제거는 작은 양의 출혈을 생성한다.
왼쪽 간엽에서의 지혈
실험 RT
(℃)		 심박수 적용
기술		 설명 지혈
시간
(min)		 결과
대조군 #1 25 87 실리콘 주형에서 일회용 플라스틱 후면 흡수성 패드 4 cm 생체 조직을 제거하였다. 대조군 용액을 도구 상에 놓고 1분 동안 두었고, 3분 동안 상기 상처 부위에 지혈 압력을 적용하였다. - 적용 후 과다 출혈. 지혈이 없거나 생체모방의 막이 관찰되었다.
실란트 #1 24 86 실리콘 주형에서 일회용 플라스틱 후면 흡수성 패드 또 다른 1 cm 생체 조직을 제거하였고 30초 동안 출혈된 채로 두었다. 3 신규의 실란트가 생체모방의 막을 생성함으로써 과다 출혈을 정지시켰다.
실란트 #2 24 86 실리콘 주형 또 다른 1 cm 생체 조직을 제거하였고 과다 출혈을 제거하였다. 상기 실란트를 지혈 압력과 함께 적용하였다. 3 실란트가 상처 부위 전체를 덮지 않았고, 지혈은 상기 실란트가 존재하는 곳에서 달성되었다.
실란트 #3 24 84 실리콘 주형 또 다른 0.5 cm 생체 조직을 제거하였고 상기 실란트의 적용이전에 과다 출혈이 제거되었다. 9 mL의 실란트를 적용하였다. - 적용 과정 동안에모든 실란트를 교체하였다.
실란트 #4 24 80 높은 마진을 갖는 투명한 유연성 플라스틱 주형 또 다른 1 cm 생체 조직을 제거하였다. 15 mL 실란트를 도구에 걸쳐 적용하였고 냉각하기 위해 1분 20초 동안 두었고, 그런 다음 상기 상처 부위에 걸쳐서 놓았다. 4 두꺼운 층의 생체모방 응고가 형성되었다. 완전한 지혈이 달성되었다. 50분 후에 조직을 재시험하였고 지혈은 여전히 관찰되었다. 형성된 막은 제거하기에 단단하였고 제거 후에 일부 출혈이 계속되었다.
대퇴 동맥에서의 지혈
다음에, 상처에서 또는 동맥(특히 대퇴 동맥)에 대한 외상에서 지혈을 유도하기 위한 본 발명의 조성물의 능력을 시험하였다. 동물의 오른쪽 대퇴 동맥을 노출하였다. 그런 다음, 수술용 칼을 사용하여 원형의 2 mm 길이를 절단하였다. 과다 출혈이 관찰되었고 따라서 지혈기를 사용하였다. 실란트의 적용 이전에 면 거즈 패드를 사용하여 과다 출혈을 즉시 제거하였다. 약 9 mL 신규의 수술 실란트를 제조하였고 상처 부위에 걸쳐 주사기를 사용하여 적용하였다. 4분 후에, 상기 지혈기를 서서히 제거하였고 상기 실란트를 통한 지혈을 시험하였다. 생체모방 응고가 관찰되었고 완전한 지혈에 도달하였다. 표 9는 상기 실험 과정 및 이러한 실험의 결과를 요약한다.
대퇴 동맥에서의 지혈
실험 RT
(℃)		 심박수 적용
기술		 설명 지혈
시간
(min)		 결과
실란트#1 24 96 주사기 2 mm 구멍을 뚫고 과다 출혈을 정지시키기 위해 지혈기를 사용하였다. 9 mL의 실란트 용액을 주사기를 사용하여 상기 상처 부위에 적용하였다. 4분 후에 지혈기를 제거하였다. 4 지혈기를 제거한 후에 완전한 지혈이 관찰되었다. 상기 실란트는 상처 부위에 걸쳐 과다 출혈을 막는 생체모방 응고를 생성하였다.
예 5
프로토콜- 겔화 및 교차 결합 상의 구아니딘 하이드로클로라이드의 효능
이러한 예는 본 발명의 일부 실시예에 따른 조성물 상에서, 예시적인 변성제인 구아니딘 하이드로클로라이드(본원에서 "GuCl"로 설명됨)의 효능에 관한 것이다. 바람직한 농도 범위는 하기와 같다: GuHCl:젤라틴의 중량비가 약 1:2 내지 약 2:2이다.
용액 제조
1) 실온에서(RT) 10 g의 GuCl(Fluka, St. Louis, MO)을 30 mL의 Dulbecco's PBS(생물 산업)에서 용해시켰다. 10 g의 유형 A, 300 블룸 돼지 젤라틴 분말(Sigma, St. Louis, MO)을 개별적으로 중량을 측정하였다. 그런 다음, 젤라틴 및 GuCl 용액을 균일한 용액을 형성하기 위해 적당한 교반 하에 혼합하였다. 생성된 용액은 젤라틴:GuCl의 비(w:w)가 1:1이었다.
GuCl의 분자량(MW)은 95.53이다. 따라서, 이러한 용액에서 GuCl의 최종 농도는 3.489 M이었다. 최종 용액은 20% 젤라틴이었으나, 체적에 따라 PBS에서 25% w/w 젤라틴 용액과 등가이다.
2) 실온에서(RT) 2 g의 GuCl을 30 mL의 PBS에서 용해시켰다. 10 g의 유형 A, 300 블룸 돼지 젤라틴 분말을 개별적으로 중량을 측정하였다. 그런 다음, 젤라틴 및 GuCl 용액을 균일한 용액을 형성하기 위해 적당한 교반 하에 혼합하였다. 생성된 용액은 젤라틴:GuCl의 비(w:w)가 5:1이었다. GuCl의 최종 농도는 698 mM이었다. 최종 용액은 23.8% 젤라틴 w/w이었으나, 체적에 따라 PBS에서 25% w/w 젤라틴 용액과 등가이다.
3) 실온에서(RT) 6 g의 GuCl을 30 mL의 PBS에서 용해시켰다. 10 g의 유형 A, 300 블룸 돼지 젤라틴 분말을 개별적으로 중량을 측정하였다. 그런 다음, 젤라틴 및 GuCl 용액을 균일한 용액을 형성하기 위해 적당한 교반 하에 혼합하였다. 생성된 용액은 젤라틴:GuCl의 비(w:w)가 5:3이었다. GuCl의 최종 농도는 2.09 M이었다. 최종 용액은 21.7% 젤라틴 w/w이었으나, 체적에 따라 PBS에서 25% w/w 젤라틴 용액과 등가이다.
4) 실온에서(RT) 4 g의 GuCl을 30 mL의 PBS에서 용해시켰다. 10 g의 유형 A, 300 블룸 돼지 젤라틴 분말을 개별적으로 중량을 측정하였다. 그런 다음, 젤라틴 및 GuCl 용액을 균일한 용액을 형성하기 위해 적당한 교반 하에 혼합하였다. 생성된 용액은 젤라틴:GuCl의 비(w:w)가 5:2이었다. GuCl의 최종 농도는 1.40 M이었다. 최종 용액은 22.7% 젤라틴 w/w이었으나, 체적에 따라 PBS에서 25% w/w 젤라틴 용액과 등가이다.
5) 실온에서(RT) 8 g의 GuCl을 30 mL의 PBS에서 용해시켰다. 10 g의 유형 A, 300 블룸 돼지 젤라틴 분말을 개별적으로 중량을 측정하였다. 그런 다음, 젤라틴 및 GuCl 용액을 균일한 용액을 형성하기 위해 적당한 교반 하에 혼합하였다. 생성된 용액은 젤라틴:GuCl의 비(w:w)가 5:1이었다. GuCl의 최종 농도는 2.79 M이었다. 최종 용액은 20.8% 젤라틴 w/w이었으나, 체적에 따라 PBS에서 25% w/w 젤라틴 용액과 등가이다.
mTG 의 첨가
PBS에서 1% 미생물의 트랜스글루타미나아제(mTG) 분말(Ajinomoto Activa TI-WM, Japan)의 20% w/w 용액을 제조하였다.
A) 2 mL의 각각의 젤라틴-GuCl 용액을 투명한 4 mL 플라스틱 튜브에서 1 mL의 mTG 용액과 혼합하였다. mTG 용액을 상기 젤라틴-GuCl용액에 주사하였다. 각각의 튜브를 몇번 거꾸로 한 후 세웠다.
B) 2 mL의 각각의 젤라틴-GuCl 용액을 플라스틱 중량 접시에서 1 mL의 mTG 용액과 혼합하였다. 혼합물을 피펫 팁으로 수동으로 혼합하였다.
C) 젤라틴-GuCl 용액을 43 ℃까지 가열하였고, 그런 다음 2 mL 시료의 젤라틴-GuCl 용액을 플라스틱 중량 접시에서 1 mL의 mTG 용액과 혼합하였다. 혼합물을 피펫 팁으로 수동으로 혼합하였다.
D) 젤라틴-GuCl 용액 1(10 g의 GuCl) 및 5(8 g의 GuCl)을 43 ℃까지 가열하였고, 그런 다음 2 mL 시료의 젤라틴-GuCl 용액을 플라스틱 중량 접시에서 2 mL의 mTG 용액과 혼합하였다. 혼합물을 피펫 팁으로 수동으로 혼합하였다.
결과
1) 1:1의 젤라틴:GuCl 용액은 실온에서 2분 이내에 균일한 용액을 형성하였다. 형성 후에 즉시, 용액은 많은 버블(bubble)을 함유하였다. 실온에서 세워둔 지 2시간 후에, 거의 모든 공기 버블이 상기 용액을 빠져나갔다. 상기 용액은 액체 형태로 남아있고, 표준의 젤라틴 용액과 같이 연노란색(yellow tint)으로 분명히 나타났다. 24시간 후에 용액 성질은 변하지 않았고 더 이상의 버블도 관찰되지 않았다.
2) 5:1의 젤라틴:GuCl은 실온에서 균일한 용액을 형성하지 않았다. 젤라틴 과립을 팽창하였으나 용해되지 않았고, 이는 실온에서 PBS에서 젤라틴과 함께 정상적으로 일어난다. 용액을 형성할 때까지 42℃까지 가열하였다. 실온으로 냉각한 경우에, 약 32℃에서 겔을 형성하였다.
3) 5:3의 젤라틴:GuCl 용액은 실온에서 강한 교반의 5분 내지 6분 후에 균일한 용액을 형성하였다. 형성 후에 즉시, 용액은 많은 버블(bubble)을 함유하였다. 실온에서 세워둔 지 2시간 후에, 거의 모든 공기 버블이 상기 용액을 빠져나갔다. 상기 용액은 액체 형태로 남아있고, 표준의 젤라틴 용액과 같이 연노란색(yellow tint)으로 분명히 나타났다. 용액은 액체 형태이나 1:1의 젤라틴:GuCl 용액보다 더 점성이 있었다. 그러나, 어려움 없이 여전히 피펫으로 옮겨졌다. 24시간 후에 용액 성질은 변하지 않았고 더 이상의 버블도 관찰되지 않았다.
4) 5:2의 젤라틴:GuCl 용액은 실온에서 강한 교반의 10분 후에 약간 낟알 모양의 용액을 형성하였다. 형성 후에 즉시, 용액은 많은 버블(bubble)을 함유하였다. 형성 후에 즉시, 용액은 매우 점성을 나타내었으나, 여전히 액체 형태이다. 그러나, 실온에서 세워둔 지 2시간 후에, 많은 공기 버블이 여전히 상기 용액에서 관찰되었고 상기 용액은 젤라틴 모양으로 되었다. 상기 용액은 쉽게 피펫으로 옮겨지지 않았고, 다른 용액과 혼합하기에는 너무 점성이 컸다. 24시간 후에 많은 공기 버블이 상기 용액에 남아있고, 상기 용액은 열-가역적인 겔을 형성하였다.
5) 1:1의 젤라틴:GuCl 용액은 실온에서 2분 이내에 균일한 용액을 형성하였다. 형성 후에 즉시, 용액은 많은 버블(bubble)을 함유하였다. 실온에서 세워둔 지 2시간 후에, 거의 모든 공기 버블이 상기 용액을 빠져나갔다. 상기 용액은 액체 형태로 남아있고, 표준의 젤라틴 용액과 같이 연노란색(yellow tint)으로 분명히 나타났다. 24시간 후에 용액 성질은 변하지 않았고 더 이상의 버블도 관찰되지 않았다.
5) 5:4의 젤라틴:GuCl 용액은 실온에서 교반의 2분 내지 3분 후에 균일한 용액을 형성하였다. 형성 후에 즉시, 용액은 많은 버블(bubble)을 함유하였다. 실온에서 세워둔 지 2시간 후에, 거의 모든 공기 버블이 상기 용액을 빠져나갔다. 상기 용액은 액체 형태로 남아있고, 표준의 젤라틴 용액과 같이 연노란색(yellow tint)으로 분명히 나타났다. 상기 용액은 액체 형태에 있고 1:1의 젤라틴:GuCl 용액보다 더 점성이 있으나 5:3의 젤라틴:GuCl 용액보다는 점성이 덜 있었고, 어려움 없이 피펫으로 옮길 수 있었다. 24시간 후에 용액 성질은 변하지 않았고 더 이상의 버블도 관찰되지 않았다.
mTG 결과
A) 4 mL 튜브 실온에서, 2 mL 젤라틴:GuCl 용액, 1 mL mTG 용액
1) 1:1의 젤라틴:GuCl 용액에 대해, 4분 후에 튜브의 상부 근처에서 작은 젤라틴 모양의 덩어리(clump)가 형성되었다. 상기 덩어리를 제거하였고, 추가적인 1 mL의 mTG 용액을 첨가하였다. 35분 후에 연질-중간(soft-medium) 겔이 형성되었다. 마이크로파 가열에 의해 확인된 바와 같이 상기 덩어리는 열-가역적이 아니다. 그러나, 교차-결합된 겔이 있는 바와 같이, 강한 점착성이 있는 것도 아니었다. 열적으로 비가역적이며, 마이크로파 가열을 사용하여 연질-중간 겔이 확인되었다.
2) 5:1의 젤라틴:GuCl 용액은 mTG와 혼합하기에는 매우 점성이 있었다.
3) 5:3의 젤라틴:GuCl 용액에 대해, 4분 후에 튜브의 상부 근처에서 작은 젤라틴 모양의 덩어리가 형성되었다. 상기 덩어리는 제거되었다. 20분 후에, 중간 겔이 상기 용액을 통하여 형성되었다. 상기 덩어리는 상기 겔의 나머지와 분명히 다른 경도(consistency)였다. 상기에서와 같이, 마이크로파 가열에 의해 확인된 바와 같이 상기 덩어리가 열-가역적이 아니라 하더라도, 점착성이 있지도 않고 손으로 만졌을 경우에 쉽게 부서졌다. 형성된 중간 겔은 마이크로파에서 가열된 경우에 약간 더 부드러웠으나, 열적으로 비가역적이다.
4) 5:2의 젤라틴:GuCl 용액에 대한 결과는, 열-가역적인 겔화의 결과로서 mTG 첨가 후에 최초 몇분 동안에 상기 용액이 매우 점성이 있었다는 점(mTG가 첨가되지 않은 대조군 용액에 의해 확인됨)에서, 균질하지 않다. 15분 후에 적당히 굳은 겔이 형성되었으나 부분적으로 열-가역적이었고 가열시에 더 부드럽게 되었다.
5) 5:4의 젤라틴:GuCl 용액에 대해, 4분 후에 튜브의 상부 근처에서 작은 젤라틴 모양의 덩어리가 형성되었다. 상기 덩어리는 제거되었다. 30분 후에, 중간 겔이 상기 용액을 통하여 형성되었다. 상기 덩어리는 상기 겔의 나머지와 분명히 다른 경도(consistency)였다. 상기에서와 같이, 마이크로파 가열에 의해 확인된 바와 같이 상기 덩어리가 열-가역적이 아니라 하더라도, 점착성이 있지도 않고 손으로 만졌을 경우에 쉽게 부서졌다. 형성된 중간 겔은 마이크로파에서 가열된 경우에 약간 더 부드러웠으나, 열적으로 비가역적이다.
B) 플라스틱 접시 실온에서 2 mL 젤라틴-GuCl 용액, 1 mL mTG 용액
플리스틱 접시에서 혼합된 용액에 대한 겔화 시간 결과는 4 mL 플라스틱 튜브에서 혼합된 용액에서 알아낸 결과와 거의 동일하였다: 1:1의 젤라틴:GuCl은 35분 후에 연질-중간 겔을 형성하였고, 5:3의 젤라틴:GuCl은 20분 후에 중간 겔을 형성하였고 5:4의 젤라틴:GuCl은 30분 후에 중간 겔을 형성하였다.
그러나, mTG가 상기 젤라틴:GuCl 용액에 주사될 때 관찰된 젤라틴 모양의 덩어리는 이러한 실험에서 관찰되지 않았다.
C) 43℃에서 2 mL 젤라틴-GuCl 용액, 플라스틱 접시에 있는 1 mL mTG 용액-결과는 하기와 같다: 1:1의 젤라틴:GuCl 용액에 대해, 35분 후에 겔이 형성되지 않았다; 5:3의 젤라틴:GuCl 용액에 대해, 17분 후에 중간 겔이 형성되었다; 5:4의 젤라틴:GuCl 용액에 대해, 25분 후에 중간 겔이 형성되었다.
D) 43℃에서 2 mL 젤라틴-GuCl 용액, 플라스틱 접시에 있는 2 mL mTG 용액-결과는 하기와 같다: 1:1의 젤라틴:GuCl 용액에 대해, 25분 후에 겔이 형성되지 않았다; 5:4의 젤라틴:GuCl 용액에 대해, 9분 후에 중간 겔이 형성되었다.
상기의 결과로부터, GuCl은 PBS에서 젤라틴의 용해도를 상당히 개선시킨다는 것을 발견하였다. PBS에서 25% w/w 젤라틴의 농도에 대해, 젤라틴:GuCl의 5:4 및 1:1의 비율에서 GuCl의 첨가는 실온에서 PBS에서 거의 즉시 젤라틴을 용해한다. 이러한 효능은 5:3의 젤라틴:GuCl의 비율에서는 상당히 감소한다. PBS에서 25% w/w 젤라틴의 농도에 대해, 젤라틴:GuCl의 5:3, 5:4 및 1:1의 비율에서 GuCl의 첨가는 상기 젤라틴:GuCl 용액을 액체 형태로 불명확하게 유지할 수 있다. 5:2의 젤라틴:GuCl의 비율에서, 상기 용액은 지연된 열-가역적인 겔화를 하고 2시간 후에 완전한 겔을 형성한다. 2:1의 젤라틴-GuCl 용액:mTG 용액의 비율에서, 젤라틴:GuCl 용액 비가 1:1이면 겔은 형성되지 않았다 더 낮은 GuCl 농도에서, 교차 결합된 겔은 형성되었다. 겔화 시간은 GuCl 농도에 의존하여 나타난다.
mTG와 혼합되기 이전에 상기 젤라틴-GuCl 용액을 43℃로 가열하는 것은 상기 젤라틴:GuCl 비가 5:4 및 5:3인 경우에 교차 결합 과정을 촉진한다. 이는 mTG 활성이 반응 온도가 55℃까지 증가함에 따라 증가함에 따라 증가하는 경우에 기대되었다. mTG 활성이 증가한다면, 젤라틴:GuCl 용액이 mTG에 의해 더 빠르게 교차 결합될 것이라는 경향이 있다.
1:1의 젤라틴-GuCl 용액:mTG 용액의 비율에서, 젤라틴:GuCl 용액 비율이 1:1인 경우에도 교차 결합된 겔은 형성되었다. mTG 양에서의 증가는, 2:1의 젤라틴:GuCl 용액: mTG 용액에서 겔을 형성한 겔의 겔화 시간을 매우 감소시켰다. 겔화 시간은 GuCl 농도에 의존한다는 것이 관찰되었다. 이는 기대될 뿐만 아니라 GuCl이 mTG의 양을 변성시킨다. 상기의 양으로 첨가된 mTG는 교차 결합 젤라틴과 유리되어 있다.
단일 가정에 제한되지 않고, 더 많은 mTG 효소가 첨가된다면 젤라틴:GuCl 용액이 mTG에 의해 훨씬 더 빠르게 교차 결합되는 것이 가능하다. 이는, 예를 들어 mTG 분말로부터 담체(carrier)를 제거하고 효소 자체의 농축된 용액을 형성함으로써 달성될 수 있다.
예 6
프로토콜 : 겔화 및 교차 결합 상의 젤라틴-효능에 대한 MgCl 2 의 첨가
이러한 예는 본 발명의 일부 실시예에 따른 조성물 상에서 예시적인 환원제, 염화마그네슘의 효능에 관한 것이다. 염화마그네슘-PBS 용액에 젤라틴을 용해시키기 위하여, 바람직한 농도 범위는 바람직하게 약 2 M 내지 약 4 M이고, 더 바람직하게는 약 2.5 M 내지 약 3.5 M이다.
물질 및 방법
물질
유형 A 300 블룸 돼지 젤라틴 및 MgCl2 분말, -325 메쉬를 Sigma-Aldrich 회사(St. Louis, MO)로부터 구매하였다. Activata TI-WM 미생물의 트랜스글루타미나아제(mTG)는 Ajinomoto(일본)에 의해 제공되었다. Dulbecco's PBS(pH 7.4)를 생물 산업(Kibbutz Beit Haemek, 이스라엘)로부터 구매하였다.
mTG 용액 제조:
새로운 Activata TI-WM(Ajinomoto, 일본) 미생물의 트랜스글루타미나아제(mTG) 혼합물을 20% w/w 용액을 형성하기 위해 Dulbecco's PBS에서 용해시킴으로써 제조하였다. 상기 용액을 실험 과정에 걸쳐서 실온(RT)에서 유지하였다.
젤라틴- MgCl 2 용액 제조:
젤라틴을 하기와 같은 다른 농도의 MgCl2 용액에 용해시켰다.
용액 A - 3.5 M의 최종 농도를 위해 5 gr의 MgCl2를 15 mL의 Dulbecco's PBS에서 용해시켰다. MgCl2의 용해 반응은 발열 반응이고 90℃까지 도달한다. 상기 용액을 실온까지 냉각한 채로 남겨두었다. 실온에서 25% 젤라틴 시료(w/w)를, 15 gr의 3.5 M MgCl2 용액에 5 gr의 젤라틴을 용해시키고 교반함으로써 제조하였다.
용액 B - 1.75 M의 최종 농도를 위해 2.5 gr의 MgCl2를 15 mL의 Dulbecco's PBS에서 용해시켰다. MgCl2의 용해 반응은 발열 반응이고 63℃까지 도달한다. 상기 용액을 실온까지 냉각한 채로 남겨두었다. 63℃에서 25% 젤라틴 시료(w/w)를 15 gr의 1.75 M MgCl2 용액에 5 gr의 젤라틴을 용해시키고 교반함으로써 제조하였다.
젤라틴의 겔화 상에 MgCl 2 의 효능
다른 농도의 MgCl2 용액에서 용해된 젤라틴을 실온까지 냉각한 채로 두었다. 온도계는 각각의 용액의 온도를 측정하는 데에 사용되었다. 상기 젤라틴-MgCl2 용액의 외관 및 점도를 관찰 및 유리 막대로 상기 용액을 만져봄으로써 온도의 감소에 따라 평가하였다.
mTG 를 사용한 화학적 교차 결합된 젤라틴 용액상의 MgCl 2 효능
mTG를 사용한 화학적 교차 결합에 대한 젤라틴-MgCl2 "용액 A"을 테스트 하였다. 4 mL 테크니콘(technicon) 튜브에서 1 mL 또는 2 mL의 20% w/w mTG 용액을 2 mL의 젤라틴-MgCl2 용액과 혼합하였다. 상기 젤라틴-MgCl2 용액을 실온 또는 수조를 사용하여 50℃로 사전가열된 온도에서 첨가하였다. 상기 용액을 피펫 팁으로 서서히 교반하고 상기 튜브를 4회 거꾸로 함으로써 혼합하였고, 겔화 시간을 측정하였다. mTG와의 혼합 후에 상기 젤라틴-MgCl2 용액의 외관 및 점도를 관찰 및 유리 막대로 상기 용액을 만져봄으로써 평가하였다. 겔이 형성된 때, 수조를 사용하여 50℃로 상기 겔을 가열함으로써 열적 가역성을 테스트하였다.
결과
젤라틴의 겔화 상에 MgCl 2 의 효능
용액 A - 3.5 M MgCl2 용액은 젤라틴의 전이점을 감소시켰다. 젤라틴-MgCl2 용액은 실온에서 점성이 있었다. 상기 용액은 더 불투명하고 작은 검은색 입자로 이루어졌다. 이러한 입자들은 아마도 산화된 마그네슘 입자들이다. 용액 B - 1.75 M 젤라틴-MgCl2 용액은 실온에서 겔화되었다. 전이점은 29℃였다. 상기 겔은 불투명하였고, 아마도 Mg의 산화에 의해 형성된 거의 없는 검은색 입자로 이루어졌다.
mTG 를 사용한 화학적 교차 결합된 젤라틴 용액상의 MgCl 2 효능
교차 결합 상의 MgCl2 효능을 하기와 같이 용액 A로 테스트하였다. 실온에서 2 mL의 용액 A를 1 mL의 mTG 용액과 혼합하였다 - 90분 후에 비가역적 겔이 제조되었다. 상기 겔은 매우 점성이 있고 약간 부드럽다. 50℃로 가열된 2 mL의 용액 A를 1 mL의 mTG 용액과 혼합하였다 - 70분 후에 비가역적 겔이 제조되었다. 50℃로 가열된 2 mL의 용액 A를 2 mL의 mTG 용액과 혼합하였다 - 25분 후에 비가역적 겔이 제조되었다. 상기 겔은 더 약해졌다. 상기 겔의 점도는 50℃ 수조에서 가열한 후에 더 증가하였다.
상기로부터, 젤라틴 용액에 염화마그네슘을 첨가하는 것은 젤라틴의 전이점을 상당히 감소시킨다는 것을 나타낸다. 상기 전이점이 염화마그네슘 농도와 반비례 관계에 있다는 것을 나타낸다. 3.5 M의 염화마그네슘의 첨가에 의해 상기 전이점은 실온 미만으로 감소되었다. 1.75 M의 염화마그네슘에서, 상기 젤라틴 용액의 전이점은 실온보다 약간 높다. 젤라틴에 염화마그네슘의 첨가는 젤라틴의 전이점을 실온 미만으로 감소시키는 최소한의 농도를 발견하는 데에 최적화되어야 한다.
염화마그네슘의 존재에서 mTG를 사용하여 젤라틴의 교차 결합이 가능하다는 것을 또한 나타낸다. 염화마그네슘은 젤라틴의 교차 결합 비율에 불리한 효능을 갖는다. 선택적으로, mTG의 양을 더 첨가하는 것이 이러한 효능을 극복하는 데에 수행될 수 있다.
50℃에서의 mTG 활성은 실온에서의 mTG 활성보다 훨씬 더 크다. 이는 이론적인 테이터로 확인되고, 실온보다 높은 반응 온도를 확보하기 위해 젤라틴-mTG 혼합물에 발열성 성분을 첨가하는 유용성을 나타낸다.
선택적으로, 상기 데이터로부터, 염화마그네슘의 발열성 용해는 젤라틴을 액화하고 mTG의 활성을 증가시키기 위해 사용될 수 있다.
예 7
프로토콜 : 겔화 및 교차 결합 상의 젤라틴-효능에 대한 하이드로퀴논의 첨가
이러한 예는 본 발명의 일부 실시예에 따른 조성물 상에서 예시적인 환원제, 하이드로퀴논의 효능에 관한 것이다. 하이드로퀴논은 자연적으로 발생하는 수용성 환원제이다. 환원제는 젤라틴의 용해도를 증가시킬 수 있고, 실온(RT)에서 젤라틴을 액체로 유지할 수 있다. 하이드로퀴논-PBS 용액에 젤라틴을 용해시키기 위하여, 바람직한 농도 범위는 바람직하게 약 0.2 M 내지 약 0.5 M의 농도에서 결정되었고, 더 바람직하게는 약 0.3 M 내지 약 0.4 M이다.
물질 및 방법
물질
유형 A 300 블룸 돼지 젤라틴 및 하이드로퀴논(ReagentPlus TM, ≥99%)을 Sigma-Aldrich 회사(St. Louis, MO)로부터 구매하였다. Activata TI-WM 미생물의 트랜스글루타미나아제(mTG)는 Ajinomoto(일본)에 의해 제공되었다. Dulbecco's PBS(pH 7.4)를 생물 산업(Kibbutz Beit Haemek, 이스라엘)로부터 구매하였다.
mTG 용액 제조:
새로운 Activa TI-WM(Ajinomoto, 일본) 미생물의 트랜스글루타미나아제(mTG) 혼합물을 20% w/w 용액을 형성하기 위해 Dulbecco's PBS에서 용해시킴으로써 제조하였다. 상기 용액을 실험 과정에 걸쳐서 실온(RT)에서 유지하였다.
젤라틴- 하이드로퀴논 용액 제조:
젤라틴을 하기와 같은 다른 농도의 하이드로퀴논 용액에 용해시켰다.
용액 A - 0.5 M의 최종 농도를 위해 2.75 gr의 하이드로퀴논을 Dulbecco's PBS에서 용해시켰다. 실험을 통하여, 상기 용액을 봉인된 비이커에서 보관하였고, 공기에의 노출을 피하기 위해 알루미늄 호일(foil)로 덮어두었고, 0.5 M 하이드로퀴논 용액에서 경량의 25% 젤라틴 시료(w/w)를, 15 gr의 0.5 M 하이드로퀴논 용액과 5 gr의 젤라틴을 혼합하고 교반함으로써 제조하였다.
용액 B - 0.4 M의 최종 농도를 위해 1.32 gr의 하이드로퀴논을 Dulbecco's PBS에서 용해시켰다. 실험을 통하여, 상기 용액을 봉인된 비이커에서 보관하였고, 공기에의 노출을 피하기 위해 알루미늄 호일(foil)로 덮어두었고, 0.4 M 하이드로퀴논 용액에서 경량의 25% 젤라틴 시료(w/w)를, 15 gr의 0.4 M 하이드로퀴논 용액과 5 gr의 젤라틴을 혼합함으로써 제조하였다. 상기 혼합물을 교반하였고, 그런 다음 50℃ 수조에서 가열하였다.
젤라틴의 겔화 상에 하이드로퀴논의 효능
다른 농도의 하이드로퀴논에서 용해된 젤라틴의 용액을 실온에서 보관하거나 또는 50℃ 수조에서 가열시킨 후 실온까지 냉각한 채로 두었다. 온도계는 각각의 용액의 온도를 측정하는 데에 사용되었다. 상기 젤라틴-하이드로퀴논 용액의 외관 및 점도를 관찰 및 유리 막대로 상기 용액을 만져봄으로써 온도의 감소에 따라 평가하였다.
mTG 를 사용한 화학적 교차 결합된 젤라틴 용액상의 하이드로퀴논 효능
mTG를 사용한 화학적 교차 결합에 대해 젤라틴-하이드로퀴논 "용액 B"를 테스트 하였다. 4 mL 테크니콘(technicon) 튜브에서 50℃로 가열된 온도에서, 1 mL의 20% w/w mTG 용액을 2 mL의 젤라틴-하이드로퀴논 용액과 혼합하였다. 상기 용액을 피펫 팁으로 서서히 교반하고 상기 튜브를 4회 거꾸로 함으로써 혼합하였고, 겔화 시간을 측정하였다. mTG와의 혼합 후에 상기 젤라틴-하이드로퀴논 용액의 외관 및 점도를 관찰 및 유리 막대로 상기 용액을 만져봄으로써 평가하였다. 겔이 형성된 때, 수조를 사용하여 50℃로 상기 겔을 가열함으로써 열적 가역성을 테스트하였다.
결과
젤라틴의 겔화 상에 하이드로퀴논의 효능
용액 A - 0.5 M 하이드로퀴논 용액은 실온에서 젤라틴을 용해시키지 않았다. 젤라틴 분말을 하이드로퀴논 용액에 침지시켰고, 낟알 모양의 갈색의 비균일한 용액을 생성하였다. 용액 B - 0.4 M 젤라틴-하이드로퀴논 용액은 젤라틴의 전이점을 감소시키기 쉽다. 하이드로퀴논 용액은 실온에서 젤라틴을 용해시키지 않았다. 50℃ 수조에서 상기 혼합물을 가열한 후에, 용해된 젤라틴 및 균일한 용액을 수득하였다. 상기 용액을 실온까지 냉각하였다. 28℃에서 젤라틴은 가용성으로 남아있으나, 매우 점성이 있디. 실온까지 냉각한 때에 겔은 형성되었다. 상기 겔은 갈색이었다.
mTG 를 사용한 화학적 교차 결합된 젤라틴 용액상의 하이드로퀴논 효능
교차 결합 상의 효능을 용액 B로 테스트하였다. 50℃로 가열된 2 mL의 용액 B를 1 mL의 mTG 용액과 혼합하였다. 4분 후에 비가역적 겔이 형성되었다. 상기 겔은 강하고, 25% (w/w)의 젤라틴과 20% (w/w)의 mTG의 혼합물에 의해 형성된 교차결합된 겔과 유사하다.
상기로부터, 젤라틴 용액에 하이드로퀴논을 첨가하는 것은 젤라틴의 전이점을 감소시킨다는 것을 나타낸다. 0.4 M의 하이드로퀴논에서, 상기 젤라틴 용액의 전이점은 실온(28℃)을 약간 초과한다.
젤라틴의 전이점을 감소시키는 방법으로 테스트된 다른 물질과 대조적으로, 하이드로퀴논은 mTG와 젤라틴의 교차 결합 상에 상당한 억제 효능을 갖지 않는다.
선택적으로, 상기 데이터를 설명한 바와 같이, 하이드로퀴논은 젤라틴의 mTG 교차 결합에 부정적인 영향을 주지 않고 젤라틴의 졸-겔 전이 온도를 감소시키는 데에 사용될 수 있다. 이전에 설명한 바와 같이, 이는 본 발명의 많은 실시예에 대해 매우 바람직하다.
예 8
프로토콜 : 겔화 및 교차 결합 상의 젤라틴-효능에 대한 CaCl 2 의 첨가
이러한 예는 본 발명의 일부 실시예에 따른 조성물 상에, 예시적인 건조제, 염화칼슘의 효능에 관한 것이다. 젤라틴의 전이점을 감소시키기 위해, 염화칼슘-PBS 용액에 젤라틴을 용해시키는 것에 관한 바람직한 농도 범위는 바람직하게 약 1 M 내지 약 2 M의 범위이다. 젤라틴 용해를 촉진하거나 mTG 활성을 증가시킬 수 있는 발열 반응을 생성하기 위해, 정확한 양은 몇몇 인자에 의존한다 하더라도, 선택적으로 그리고 바람직하게는 주위 온도를 초과하여 증가되는 온도 각 1℃ 당, 용액 중의 혼합물의 1mL 당 약 0.2 g 내지 0.7 g의 염화칼슘을 첨가하였다.
DPBS에서 젤라틴-염화칼슘 용액을 하기와 같이 제조하였다: 44.396 g의 CaCl2(97%, MW=110.99, Alfa Aesar, Lancaster)를 100 mL의 Dulbecco's PBS(생물 산업, 이스라엘)에서 교반하에 용해시킴으로써, 4 M CaCl2 스탁 용액을 제조하였다. 용해 후에, CaCl2의 발열성 용해 반응의 결과로서 상기 용액은 80℃의 정점(peak) 온도에 도달하였다.
용액 1을 하기와 같이 제조하였다. 5 g의 유형 A, 300 블룸 돼지 젤라틴 분말(Sigma, St. Louis, MO)의 중량을 측정하였다. 5 g의 젤라틴에 15 g의 다른 농도의 PBS CaCl2 용액을 첨가함으로써, PBS-CaCl2에서 25% w/w 젤라틴 용액을 형성하였다. 덩어리를 분산시키기 위해 교반 막대 뿐만 아니라 경우에 따라 수동 교반으로 젤라틴-CaCl2를 혼합하였다. 테스트된 CaCl2농도는 하기와 같다:
a. PBS에서 2 M CaCl2 용액;
b. PBS에서 2 M CaCl2 용액;
c. PBS에서 1 M CaCl2 용액.
a & b 둘 모두에 대해, 4 mL 플라스틱 튜브에서 각각, 2 mL의 젤라틴-CaCl2 용액을 1 mL의 20% w/w 미생물의 트랜스글루타미나아제(mTG) 분말 용액과 혼합하였다. 사용된 mTG 제품(Activa TI-WM, Ajinomoto, 일본)은 약 100 U/g의 mTG 제품 분말의 특이적 활성을 갖는다.
용액 2를 하기와 같이 제조하였다. mTG의 20% w/w 베이스(base) 용액은 40 mL의 PBS에 10 g의 mTG 분말을 용해시킴으로써 형성되었다.
a. 젤라틴-PBS 혼합물을 5초 후 그리고 15초 동안 마이크로파로 가열시킴으로써 15 mL의 PBS에 5 g의 젤라틴을 용해시킴으로써 25% w/w 젤라틴 용액을 제조하였다. 각각의 마이크로파 가열 기간 후에 용액을 즉시 교반하였다. 제 2의 가열 후의 온도는 72℃였다. 그런 다음 2 M CaCl2 용액을 형성하기 위해 3.325 g의 CaCl2를 첨가하였다. 상기 CaCl2 첨가 후의 온도는 74℃였다. CaCl2가 용해된 후에 즉시 온도를 측정하였고, 4 mL 플라스틱 튜브에서 2 mL의 젤라틴-CaCl2 용액을 1 mL의 20% w/w 미생물의 트랜스글루타미나아제(mTG) 분말 용액과 혼합하였다.
b. 5 g의 젤라틴 분말을 3.33 g의 CaCl2 분말과 혼합하였다. 그런 다음, 용액을 형성하기 위해 30 mL의 PBS를 이러한 혼합물에서 교반하였다. 용해에 대한 용액 온도는 42℃에 도달하였다. 균일한 용액이 형성된 후에, 4 mL 플라스틱 튜브에서 2 mL의 젤라틴-CaCl2 용액을 1 mL의 20% w/w 미생물의 트랜스글루타미나아제(mTG) 분말 용액과 혼합하였다.
용액 3을 하기와 같이 제조하였다. 2 M CaCl2-PBS(1a, 상기)에서 25% 젤라틴 용액을 2시간 동안 침전시켰다. 그런 다음, 4 mL 플라스틱 튜브에서 2 mL의 젤라틴-CaCl2 용액을 2 mL의 20% w/w mTG 용액과 혼합하였다.
용액 4를 하기와 같이 제조하였다. 2시간 동안 침전시킨 후에, 2 M CaCl2-PBS(1b, 상기)에서 25% 젤라틴 용액을 43℃로 가열하였다. 그런 다음, 각각의 4 mL 플라스틱 튜브에서, 2 mL의 젤라틴-CaCl2 용액을 a. 1 mL의 20% w/w mTG 용액과 혼합하였고; b. 2 mL의 20% w/w mTG 용액과 혼합하였다.
결과
CaCl2의 모든 농도에서 용액을 형성하였다. 2 M CaCl2 용액을 사용하여(1a), 균일한 용액을 형성하였고 액체 형태로 남아있다. 상기 용액은 적당히 점성이 있었고 많은 공기 버블을 함유하였다. mTG 용액과의 혼합 이전에, 젤라틴-CaCl2 용액은 버블을 분산시키기 위해 30분 동안 침전시켰다.
제 2의 2 M 용액(1b)은, 형성된 젤라틴 덩어리를 분산시키기 위해 더 많은 수동의 교반을 필요로 하는 것을 제외하고는 제 1의 용액과 동일하였다.
1 M CaCl2(1c) 용액을 사용하여, 균일한 용액을 형성하였으나, 몇분 후에 겔이 형성되기 시작하였다. 2시간 후에, 완전한 열-가역적인 겔이 형성되었다. 그러나, 이러한 겔은 실온에서 젤라틴에 의해 정상적으로 형성된 열-가역적인 겔보다 더 부드러웠다. 상기 용액은 30분 후에 mTG 용액과 혼합하기에는 너무 점성이 있었다.
2 M 젤라틴-CaCl2 용액에 mTG 용액을 첨가한 후에, 상기 용액은 20분의 기간에 걸쳐 점진적으로 더 점성이 있게 되었으나 점착성 겔을 형성하지는 않았다.
젤라틴-CaCl2 용액의 가열은 mTG의 겔화 효능을 증가시켰다. 마이크로파로 가열된 용액은 점진적으로 더 점성이 있게 되었다. 20분 후에, 매우 부드럽고 가역적(50℃로 가열되어 확인됨) 겔이 형성되었다. CaCl2 가열된 용액은 점진적으로 더 점성이 있게 되었다. 20분 후에, 매우 부드럽고 가역적(50℃로 가열되어 확인됨) 겔이 형성되었다.
젤라틴-CaCl2 (2 M)을 2 mL의 20% w/w mTG 용액과 혼합한 경우에 대해, 10분 후에 부드러운 겔이 형성되었다. 20분 후에, 중간 강도 겔이 형성되었다. 35분 후에, 중간-굳기 강도 겔이 형성되었다.
43℃로 가열된 젤라틴-CaCl2 (2 M) 용액에 대해, 1 mL의 20% w/w mTG 용액과 혼합한 후에, 10분 후에 부드러운 겔이 형성되었고, 20분 후에 부드러운-중간 강도 겔이 형성되었다. 그러나, 2 mL의 20% w/w mTG 용액과 혼합한 후에, 10분 후에 중간 강도 겔이 형성되었고 20분 후에 중간-굳기 강도 겔이 형성되었다.
예 9
프로토콜 : 겔화 및 교차 결합 상의 젤라틴-효능의 마이크로파 건조
이러한 예는 용해도에 대한 마이크로파로 건조된 젤라틴의 효능을 시험한다. 증가된 용해도가 관찰되었다. 선택적이지만 바람직한 마이크로파의 에너지 범위는 바람직하게 약 1 mW/㎤ 내지 약 100 mW/㎤의 전체 특정 흡수 비율(SAR)을 특징으로 하며, 더 바람직하게는 약 30 mW/㎤ 내지 약 60 mW/㎤의 범위이다. 상기 방법은 하기와 같이 수행된다.
젤라틴 제조 및 건조
유형 A의 10 gr 부분, 300 블룸 돼지 젤라틴 분말(Sigma, St. Louis, MO)을 50 mL 또는 250 mL 비이커 중 하나로 중량을 측정하였다. 그런 다음, 상기 젤라틴을 하기와 같은 시간으로 700 W 및 2,450 MHz의 마이크로파(Kennedy model KN-949, 중국)로 가열하였다:
샘플 A : 30초, 50 mL 비이커;
샘플 B : 60초, 250 mL 비이커;
샘플 C : 120초, 250 mL 비이커;
샘플 D : 180초, 50 mL 비이커;
대조군 : 마이크로파 가열을 하지 않는 젤라틴.
가열 후에, 37℃에서 30 mL의 Dulbecco's PBS(생물 산업, 이스라엘)를 상기 젤라틴에 첨가하였고 상기 혼합물을 37℃에서 교반하였다. 샘플 A에 대해, 상기 젤라틴이 상기 마이크로파로부터 제거된 후에 상기 PBS를 즉시 첨가하였다. 상기 샘플의 나머지에 대해, PBS의 적용 이전에 상기 젤라틴을 실온(RT)까지 냉각하였다.
샘플 C에 대해, 젤라틴을 상기 PBS와 혼합한 후에, 상기 혼합물의 일부분을 분리하였고, 50℃로 가열한 후, 2:1의 젤라틴 용액:mTG 용액의 비율에 따라 20% w/w 미생물의 트랜스글루타미나아제(mTG)(Ajinomoto Activa TI-WM, 일본)과 혼합하였다.
젤라틴/ PBS 혼합물의 마이크로파 가열
샘플 F에서, 젤라틴을 분말 형태에서 가열하지 않았다. 오히려, 상기 젤라틴을 50 mL 비이커에 있는 30 mL의 실온(RT) PBS로 직접적으로 부은 후, 상기 혼합물을 15초 동안 가열 기간 사이에 5초 간 정지하고 연속적으로 2회 마이크로파로 가열하였다. 상기 가열 후에, 수동으로 교반하였다. 그런 다음, 2:1의 젤라틴 용액:mTG 용액 비율에 따라 상기 젤라틴 용액을 20% w/w mTG 용액과 혼합하였다.
mTG 의 가열
20% w/w mTG 용액을 15초 동안 가열 기간 사이에 5초 간 정지하고 연속적으로 2회 마이크로파로 가열하였다. 그런 다음, 1:2의 mTG:젤라틴 용액 비율에서 상기 mTG를 25% w/w 젤라틴 용액에 첨가하였다.
결과
샘플 A : 상기 젤라틴은 상기 PBS에 쉽게 용해되어 점성이 있는 용액을 형성하였다. 실온까지 냉각한 때, 상기 젤라틴 용액은 실온에서 표준의 젤라틴 용액에 의해 형성된 열적-가역적 겔과 비교하여, 굳은 열적-가역적 겔을 형성하였다.
대조군 : 상기 젤라틴은 상기 PBS에 완전히 용해되지는 않았다. 젤라틴이 PBS에 완전히 침지되었다 하더라도, 상기 젤라틴은 매우 낟알 모양으로 남겨졌다.
샘플 B : 상기 젤라틴은 상기 PBS에 완전히 용해되지는 않았다. 젤라틴이 PBS에 완전히 침지되었다 하더라도, 상기 젤라틴은 매우 낟알 모양으로 남겨졌다.
샘플 C : 상기 젤라틴은 상기 PBS에 완전히 용해되지는 않았다. 젤라틴이 PBS에 완전히 침지되었다 하더라도, 상기 젤라틴은 매우 낟알 모양으로 남겨졌다. 그런 다음, 상기 낟알 모양의 젤라틴-PBS 혼합물을 30초 동안 마이크로파로 가열하였다. 마이크로파로부터 제거될 때의 온도는 76℃였다. 그런 다음, 균일한 용액을 형성하기 위해 상기 혼합물을 수동으로 교반하였다. 상기 용액을 실온까지 냉각하였고, 실온에서 표준의 젤라틴 용액에 의해 형성된 열적-가역적 겔과 비교하여, 열적-가역적 겔을 형성하였다.
상기 용액이 50℃로 가열되고 mTG와 혼합한 경우에, 3분 후에 굳은 그리고 점착성이 있는 겔이 형성되었다. 이러한 겔은 그의 비가역성을 확인하기 위해 마이크로파로 10초 동안 가열되었다. 마이크로파로부터 빠져 나간 경우에, 상기 겔은 더 점착성이 있으나, 강해졌다. 약하게 건조된 것으로 나타났다.
샘플 D : 가열 동안에, 상기 젤라틴은 탄화된 버블을 형성하였다. 상기 버블은 젤라틴을 태움으로써 상기 젤라틴 분말 내부에 형성되었다. 강한 태움(burning)은 이러한 현상을 동반하여 냄새가 난다.
가열된 젤라틴/PBS 혼합물 : 상기 젤라틴/PBS 혼합물을 마이크로파로 가열함으로써 액체 용액을 형성하였다. 상기 용액에 mTG를 첨가하는 것은 굳은 비가역적 겔을 생성하였다.
가열된 mTG : 마이크로파로 가열된 mTG는 젤라틴을 교차 결합하지 않는다.
상기로부터, 젤라틴 분말을 마이크로파로 가열하는 것은 상기 젤라틴의 수분 함량을 감소시킨다는 것을 나타낸고, 상기 젤라틴의 중량에서 상당한 감소를 나타낸다(데이터는 미도시). 젤라틴 분말을 마이크로파로 가열하고 37℃ PBS의 즉각적인 첨가는 상기 젤라틴 용해 시간을 감소시킨다. 그러나, 상기 젤라틴 분말이 실온까지 냉각된다면, 젤라틴 용해 시간에서의 개선은 발생하지 않는다.
마이크로파로 가열된 젤라틴이 PBS와 혼합된 후에 마이크로파로 가열된다면, 형성된 용액은 mTG에 의해 교차 결합될 수 있다. 실온 PBS에서 젤라틴을 용해시키는 것은 가능하고, 마이크로파로 15초 동안 가열한 후 다시 15초 동안 가열함으로써 가열한다. 이러한 방식으로 용해하는 것은 mTG 교차 결합에 부정적인 영향을 주지 않는다.
건조 젤라틴은 2분을 초과하여 마이크로파로 가열된다면 태워질 것이다. 마이크로파로 mTG를 가열하는 것은 그의 활성을 급격하게 감소시킨다.
예 10
겔화 및 젤라틴의 교차 결합 상의 우레아의 효능
이러한 예는 본 발명에 따른 예시적인 조성물의 일부분으로서 우레아의 효능에 관한 것이다. 우레아는 젤라틴 용액의 전이점을 낮춘다. 하기의 데이터는 고농도의 젤라틴 용액의 전이점도 실온 미만으로 충분히 낮추는 것을 확증하고, 상기 용액은 실온에서 여전히 액체 형태에 있다. 트랜스글루타미나아제는 우레아늬 존재에서도 젤라틴을 교차 결합시킬 수 있다.
젤라틴 용액 제조:
유형 A 300 블룸 돼지 젤라틴(Sigma, St. Louis, MO)을 사용하였다. 50℃ 핫 플레이트 상에서 교반하는 동안에, 50 gr 및 30 gr의 젤라틴을 각각 150 mL 및 170 mL의 Dulbecco's PBS(생물 산업, 이스라엘)에 용해시킴으로써 25% 및 15% w/w 젤라틴 용액을 제조하였다. 젤라틴을 PBS에 점진적으로 첨가하였고 유리 막대를 사용하여 수동으로 교반하였다. 젤라틴 용액을 실험 과정에 걸쳐서 50℃ 수조에서 보관하였다.
트랜스글루타미나아제 용액 제조:
20% w/w 용액을 형성하기 위해, Activa TI-WM(Ajinomoto, 일본) 미생물의 트랜스글루타미나아제(mTG) 혼합물을 Dulbecco's PBS에 용해시켰다. 상기 용액을 실험 과정에 걸쳐서 실온(RT)로 유지하였다.
젤라틴- 우레아 용액 제조:
25% 또는 15% w/w 젤라틴 용액의 40 g 시료를 100 mL 비이커로 이동시켰고 50℃에서 교반하였다. 하기의 표에서 설명된 바와 같이, 우레아(98%, Alfa Aesar, Lancaster, UK)를 다른 비율로 이러한 비이커에 첨가하였다:
젤라틴(%) 젤라틴:우레아 비율 첨가된 우레아의 양(gr)
25%
 용액 1 1:0 0(대조군)
용액 2 1:1 10

15%

 용액 3 1:0 0(대조군)
용액 4 1:0.5 2.65
용액 5 1:1 5.3
용액 6 1:1.5 8.025
우레아 첨가 후에, 균일하게 하기 위해 상기 젤라틴-우레아 용액을 50℃에서 5분 동안 교반한 후, 37℃ 수조로 이동시켰다.
젤라틴의 열적-가역적 겔화 상의 우레아의 효능:
37℃ 수조로부터 각각의 젤라틴-우레아 용액을 차례로 제거하였고, 실온까지 냉각한 채로 두었다. 각각의 용액의 온도 감소를 측정하기 위해 온도기를 사용하였다. 젤라틴-우레아 용액의 외관 및 점도를 관찰 및 상기 용액을 유리 막대로 만져봄으로써 감소된 온도에 따라 평가하였다. 이러한 실험의 결과는 하기의 표에서 설명한다:
젤라틴 % (w/w) 젤라틴:우레아 비율 결과
25%
 용액 1 1:0 25℃에서, 상기 젤라틴은 굳은 열적-가역적 겔을 형성하였다.
용액 2 1:1 25℃에서, 상기 용액은 액체 형태로 남아 있다. 약간 점성이 있다 하더라도, 쉽게 피펫으로 옮길 수 있었다.

15%

 용액 3 1:0 25℃에서, 상기 젤라틴은 굳은 열적-가역적 겔을 형성하였다.
용액 4 1:0.5 26℃를 초과하는 온도에서, 상기 용액은 젤라틴 단독 보다 상당히 더 액에로 남아 있었다. 그러나, 실온(23℃ 내지 25℃)에서 용액은 겔을 형성하였다.
용액 5 1:1 25℃에서, 상기 용액은 액체 형태로 남아 있다. 4℃에서 냉각하고 25℃로 회복한 후에, 용액은 액체 형태로 회복하였다
용액 6 1:1.5 25℃에서, 상기 용액은 액체 형태로 남아 있다. 4℃에서 냉각하고 25℃로 회복한 후에, 용액은 액체 형태로 회복하였다
mTG를 사용한 젤라틴-우레아 용액의 교차 결합:
mTG를 사용하여 젤라틴-우레아 용액을 교차 결합시켰다. 플라스틱 접시에서 1 mL 또는 2 mL의 20% w/w mTG 용액을 2 mL의 젤라틴-우레아 용액과 수동으로 혼합하였다. 상기 젤라틴-우레아 용액을 실온에서 또는 50℃로 사전 가열된 온도 중 하나에서 첨가하였다. 일부 테스트에서, mTG와 혼합되어 가열을 필요로 하는 것과 젤라틴 단독의 것의 비교를 촉진하기 위해 50℃로 가열하였다. 상기 용액을 피펫 팁으로 서서히 교반함으로써 혼합하였고 몇분 동안 교차 결합된 채로 두었다. 열적-가역적 겔 형성의 시험에서와 같이, mTG와의 혼합 후에 젤라틴-우레아 용액의 외관 및 점도를 관찰 및 상기 용액을 유리 막대로 만져봄으로써 평가하였다. 상기 결과를 하기의 표에서 요약한다:
젤라틴 %
(w/w)		 젤라틴:우레아 비율 용액의 온도℃ 첨가된 mTG의 양(mL) 결과
25%



 용액 1 1:0 50℃ 1 정상적인 교차 결합:3분 후에 겔화
용액 2


 1:1


 실온
 1 30분 후에도 겔이 형성되지 않았다.
2 30분 후에 부드러운, 점착성의 겔이 형성되었다.
50℃
 1 30분 후에도 겔이 형성되지 않았다.
2 10분 후에 부드러운, 점착성의 겔이 형성되었다. 30분 후에 굳은 약간 부서지기 쉬운 겔이 관찰되었다.
15%

 용액 3 1:0 50℃ 1 정상적인 교차 결합:3분 후에 겔화
용액 4 1:0.5 50℃ 1 6분 후에 겔화가 관찰되었다. 20분 후에 완전한 겔화가 관찰되었다.겔은 50℃조에서 가열되었으나 여전히 굳은 겔로 남아 있다.
용액 5 1:1 실온 1 12분 후에 겔화가 시작되었고, 부드러운 겔을 생성하였다. 30분 후에 상기 겔은 굳어졌다. 상기 겔은 50℃ 주도에서 가열된 후에도 굳은 상태로 남아 있다.
상기의 연구는 젤라틴 용액에 우레아를 첨가하는 것은 젤라틴의 전이점을 상당히 감소시킨다는 것을 나타낸다. 15% 및 25% w/w 젤라틴 용액 둘 모두에 대해, 1:1의 우레아:젤라틴의 비율 이상의 우레아를 첨가함으로써 상기 전이점을 실온 미만으로 감소시켰다. 0.5:1의 우레아:젤라틴 비율에서, 상기 젤라틴 용액의 전이점은 실온을 약간 초과한다. 0.5:1 내지 1:1 사이의 우레아:젤라틴 비율은 젤라틴의 전이점을 실온 미만으로 낮추는 데에 충분할 것이다.
우레아의 존재에서 mTG를 사용하여 젤라틴를 교차 결합시키는 것은 가능하다는 것을 또한 나타낸다. 그러나, 우레아는 mTG 활성에 불리한 효능을 갖는다. 이러한 효능은 우레아의 농도에 상대적이어서, 우레아의 존재에서 mTG 활성은 우레아 농도와 반비례 관계에 있다는 것을 나타낸다.
기대한 바와 같이, 50℃에서 트랜스글루타미나아제 활성은 실온에서 mTG 활성보다 훨씬 크다. 젤라틴에 우레아를 첨가하는 것은 젤라틴의 전이점을 실온 미만으로 감소시키는 최소의 농도를 발견하여 최적화될 수 있다. 충분한 양의 mTG가 첨가된다면, 우레아의 불리한 효능을 극복할 수 있을 것이다.
예 11
젤라틴 전이점에 대한 pH 영향
이러한 예는 젤라틴 용액의 전이점에 대해 젤라틴 용액의 pH를 변경시키는 영향을 설명한다.
용액 제조
2 M의 나트륨 시트레이트의 스탁 용액을 생성하기 위해, 58.82 gr의 99% 나트륨 시트레이트 디하이드레이트(sodium citrate dihydrate)(Alfa Aesar, Lancaster, UK)를 100 mL의 2차 증류수에 용해시켰다. Dulbecco PBS(생물 산업, 이스라엘)에서 25% w/w 젤라틴 용액의 베이스(base) 용액을 유형 A, 300 블룸 돼지 젤라틴(Sigma, St. Louis, MO)를 사용하여 제조하였다. 상기 젤라틴 용액을 계속하여 교반하였고 50℃에서 유지하였다. 2 M의 시트르산의 스탁 용액을 생성하기 위해, 19.21 gr의 시트르산 무수물(Frutarom, 이스라엘)을 50 mL의 2차 증류수에 용해시켰다.
pH 측정
용액의 pH는 유리 전극을 갖는 pH 미터기(Eutech pH510, 싱가폴)를 사용하여 측정되었다. 4.01, 7 및 10.01의 pH 값을 갖는 교정 용액(calibration solution)을 사용하여 실험 이전에 pH 미터기를 교정하였다. pH 측정의 정확성은 실험 과정에 걸쳐서 주기적으로 결정되었다. 2 M 나트륨 시트레이트 용액의 pH는 8.54였다. 2 M 시트르산 용액의 pH는 1.4였다.
나트륨 시트레이트의 첨가
25% w/w 젤라틴 용액의 20 mL 시료를 100 mL 비이커로 분리하였고, 적당한 교반과 함께 50℃로 유지하였다. 상기 젤라틴 용액의 초기 pH는 4.89로 측정되었다. 하기의 용액을 형성하기 위해 2 M 나트륨 시트레이트 용액의 다른 양을 20 mL 젤라틴 용액에 첨가하였다:
용액 1 : pH 5.87 - 2 mL의 나트륨 시트레이트 용액
용액 2 : pH 6.55 - 4 mL의 나트륨 시트레이트 용액
용액 3 : pH 6.7 - 6 mL의 나트륨 시트레이트 용액
각각의 용액은 실온까지 냉각되었다.
시트르산의 첨가
25% w/w 젤라틴 용액의 100 mL 시료를 250 mL 비이커로 분리하였고, 적당한 교반과 함께 50℃로 유지하였다. 상기 젤라틴 용액의 초기 pH는 5.19로 측정되었다.
하기의 용액을 형성하기 위해 2 M 시트르산 용액의 다른 양을 젤라틴 용액에 첨가하였다:
용액 1 : pH 3.99
용액 2 : pH 3.54
용액 3 : pH 2.72
용액 4 : pH 2.35
용액 5 : pH 2.17
용액 6 : pH 2.04
용액 7 : pH 1.7
각각의 용액은 실온까지 냉각되었다.
나트륨 시트레이트 결과
나트륨 시트레이트를 첨가한 때, 상기 첨가로 젤라틴 용액에 흐릿한 백색 덩어리가 형성되었다. 강한 교반으로 상기 덩어리를 더 작은 덩어리로 먼저 분산시켰고, 그런 다음 균일한 용액으로 분산시켰다. 형성된 균일한 용액은 흐릿하고 불투명하였다.
pH 5.87에서, 냉각된 젤라틴 용액 시료는 젤라틴 단독으로 열적-가역적 겔을 형성하는 시간과 대략 동일한 시간에 열적-가역적 겔을 형성하였다.
pH 6.55에서, 냉각된 젤라틴 용액 시료는 몇분 이내에 매우 빠르게 열적-가역적 겔을 형성하였다. 이는 젤라틴 단독으로 형성하는 시간보다 훨씬 빠르다.
pH 6.70에서, 상기 시료는 거의 즉시 열적-가역적 겔을 형성하였다. 젤라틴-나트륨 시트레이트 용액이 몇분 동안 50℃에서 남겨진 후에, 전체 용액은 겔을 형성하였다. 전이점은 50℃ 초과로 증가하였다.
모든 pH 값에서, 상기 겔은 그들 모두가 60℃ 물에서 침지된 후 액체 형태로 되돌아가는 것과 같이 열적-가역적이라고 설명된다.
시트르산 결과
pH 3.54 초과에서, 전이점에서의 명백한 차이가 관찰되지 않았다. pH 3.54에서 상기 젤라틴 용액은 매우 점착성이 있는 겔이 형성되는 지점에서, 50℃부터 약 32℃까지 액체로 남아 있었다.
pH 2.72에서, 전이점은 약 31℃였고 형성된 겔은 다공성이었다: 많은 공기 버블을 갖는 낟알 모양.
pH 2.04에서, 전이점은 29℃로 감소하였다. 형성된 겔은 pH 2.72에서 형성된 겔보다 더 다공성이었다.
pH 1.7에서, 전이점은 27℃ 내지 28℃로 감소하였다. 형성된 겔은 꽤 다공성이었다.
모든 pH 값에서, 상기 겔은 그들 모두가 50℃ 물에서 침지된 후 액체 형태로 되돌아가는 것과 같이 열적-가역적이라고 설명된다.
그러나, 상기 겔이 30분 동안 50℃에서 남겨진 후에, 겔은 액체 형태로 되돌아가지 않도록 형성되었다. 이는 시트르산이 50℃에서 30분 후에 젤라틴의 교차 결합을 생성한다는 것을 나타낸다.
상기는, 시트르산의 첨가를 통해 젤라틴 용액의 pH를 낮추는 것이 겔의 전이점을 상당히 감소시킬 수 있다는 것을 나타낸다. 시트르산을 첨가하여 젤라틴 용액의 pH를 pH 2로 감소시키는 것은 상기 젤라틴의 교차 결합을 생성하지 못한다. 시트르산을 더 첨가하여 pH 2 미만으로 낮추는 것은 50℃에서 30분 후에 젤라틴의 교차-결합을 생성할 수 있다.
예 12
겔화 및 젤라틴의 교차 결합에 대한 폴리하이드릭 알콜(polyhydric alcohol)의 영향
이러한 예는 젤라틴 교차 결합에 대한 솔비톨과 같은 폴리하이드릭 알콜의 영향에 관한 것이다.
물질 및 방법
물질
유형 A 300 블룸 돼지 젤라틴 및 97% D-솔비톨을 Sigma-Aldrich 회사(St. Louis, MO)로부터 구매하였다. 글리세롤 99%를 Frutarom(이스라엘)로부터 구매하였다. Activata TI-WM 미생물의 트랜스글루타미나아제(mTG)는 Ajinomoto(일본)에 의해 제공되었다. Dulbecco's PBS(pH 7.4)를 생물 산업(Kibbutz Beit Haemek, 이스라엘)로부터 구매하였다.
mTG 용액 제조:
새로운 Activa TI-WM(Ajinomoto, 일본) 미생물의 트랜스글루타미나아제(mTG) 혼합물을 20% w/w 용액을 형성하기 위해 Dulbecco's PBS에서 용해시킴으로써 제조하였다. 상기 용액을 실험 과정에 걸쳐서 실온(RT)에서 유지하였다.
젤라틴-폴리하이드릭 알콜 용액 제조:
용액 A - 30 mL PBS에서 10 gr의 글리세롤을 용해하였다. 10 gr의 젤라틴을 실온에서 1.5시간 동안 글리세롤 용액에 침지하였다. 1.5시간의 침지 후에, 10 mL의 PBS를 첨가하였고 상기 혼합물을 50℃로 가열하였다. 균일한 액체 용액(1:1의 글리세롤:젤라틴 비율)이 형성되기까지 상기 혼합물을 수동으로 교반하였다.
용액 B - 교반하는 동안에, 20% w/w 젤라틴 용액의 27.5 mL를 50℃로 가열하였다. 11 gr의 글리세롤을 상기 젤라틴 용액(2:1의 글리세롤:젤라틴 비율)에 첨가하였다. 그런 다음, 상기 글리세롤-젤라틴 용액을 냉각하였다. 2:1의 글리세롤:젤라틴 용액을 50℃에서 1.5시간 동안 침지하였다. 그런 다음, 상기 용액을 제거하고, 실온에서 냉각하였다.
용액 C - 2:1의 글리세롤:젤라틴 비율로 글리세롤을 함유하는 20% 젤라틴 용액을 교반하는 동안에 50℃로 가열하였다. 11 gr의 솔비톨을 첨가하여 균일한 용액을 형성하였다(2:2:1의 글리세롤:솔비톨:젤라틴 비율)
용액 D - 12 gr의 솔비톨을 50℃에서 20% w/w 젤라틴 용액의 20 mL에 첨가하여 3:1의 솔비톨:젤라틴 비율을 갖는 균일한 용액을 형성하였다. 그런 다음 상기 용액을 냉각하였다.
용액 E - 25 gr의 실온 글리세롤을 50℃에서 20% w/w 젤라틴 용액의 20 mL를 첨가함으로써 5:1의 글리세롤:젤라틴 용액을 제조하였다. 상기 혼합물을 50℃에서 교반함으로써 혼합하였다.
용액 F - 20 gr의 솔비톨을 20% 젤라틴 용액의 20 mL에 첨가하였고, 5:1의 솔비톨:젤라틴 비율을 생성하였다. 상기 혼합물을 50℃에서 혼합하였다. 그런 다음 상기 혼합물을 실온까지 냉각하였다.
젤라틴의 겔화에 대한 폴리하이드릭 알콜 의 영향:
상기 설명에 관하여 제조되는 바와 같이, 폴리하이드릭 알콜을 갖는 2 mL의 젤라틴 용액(상기의 용액 A 내지 F를 참고함)을 제거하고 실온까지 냉각한 채로 두었다. 각각의 용액의 온도를 결정하는 데에 온도기를 사용하였다. 젤라틴-폴리하이드릭 알콜 용액의 외관 및 점도를 관찰 및 상기 용액을 유리 막대로 만져봄으로써 감소된 온도에 따라 평가하였다.
mTG 를 사용한 젤라틴 용액의 교차 결합에 대한 폴리하이드릭 알콜 의 영향:
mTG를 사용한 화학적 교차 결합에 대해 젤라틴-폴리하이드릭 알콜 용액을 테스트하였다. 작은 플라스틱 접시에서 20% w/w mTG 용액의 1 mL를 2 mL의 젤라틴-폴리하이드릭 알콜 용액을 혼합하였다. 젤라틴-폴리하이드릭 알콜 용액을 실온에서 또는 수조를 사용하여 50℃로 사전가열된 온도 중 하나에서 첨가하였다. 상기 용액을 피펫 팁으로 서서히 교반함으로써 수동으로 혼합하였고 겔화 시간을 측정하였다. mTG와 혼합한 후에 젤라틴-폴리하이드릭 알콜 용액의 외관 및 점도를 관찰 및 상기 용액을 유리 막대로 만져봄으로써 감소된 온도에 따라 평가하였다. 겔이 형성된 때에, 상기 겔을 수조를 사용하여 50℃로 가열함으로써 열적 가역성을 테스트하였다.
결과
젤라틴의 겔화에 대한 폴리하이드릭 알콜 의 영향:
용액 A - 글리세롤에 침지된 후에, 젤라틴 입자는 매우 부서지기 쉬운, 고체, 낟알 모양의 물질을 형성하기 위해 함께 덩어리화 되었다. 글리세롤의 존재는 열-가역적인 젤라틴 겔화를 전혀 늦추는 것 같지 않았다. 열-가역적인 겔은 2분 내지 3분 내에 형성되었고, 이는 글리세롤이 없는 20% w/w 젤라틴 용액의 경우와 같다. 35℃에서, 상기 젤라틴-글리세롤 용액은 겔화의 경계에서 매우 점성이 있었다. 실온까지 냉각한 것과 같이, 젤라틴-글리세롤 상 전이는 젤라틴 단독의 상 전이와 거의 동일하였다.
용액 B - 1:1의 글리세롤:젤라틴 용액과 같이, 2:1의 글리세롤:젤라틴에서의 글리세롤은 젤라틴의 전이 온도를 낮추지 않는다. 상기 용액은 35℃에서 매우 점성이 있고 33℃ 내지 34℃에서 점착성의 겔을 형성하였다. 2:1의 글리세롤:젤라틴 용액을 1.5시간 동안 침지시키는 것은 상기 젤라틴 전이점에 영향이 없다. 열-가역적인 겔은 34℃에서 형성되기 시작하였다.
용액 C - 50℃에서, 젤라틴-글리세롤-솔비톨 용액은 젤라틴-글리세롤 용액 단독으로 보다 더 점성이 있고 훨씬 더 불투명하다. 이러한 혼합물이 냉각될 때에, 겔은 35℃에서 형성되었다. 상기 전이점은 솔비톨 및 글리세롤의 결과로서 모두에서 낮아지지 않았다.
용액 D - 젤라틴-솔비톨 용액은 40℃에서 겔화되기 시작하였고, 이는 고농도의 솔비톨이 실재적으로 상기 젤라틴 전이점을 증가시킨다는 것을 나타내었다. 실온에서, 형성된 열-가역적인 겔은 젤라틴 겔 단독으로 보다 훨씬 더 탄성이 있다.
용액 E - 5:1의 글리세롤:젤라틴 비율의 매우 고농도에서도, 젤라틴의 전이 온도는 감소되지 않았다. 겔라틴 단독으로 형성한 것과 같이 열-가역적인 겔은 형성되었다.
용액 F - 열-가역적인 겔은 40℃에서 형성되었다. 3:1 및 5:1의 솔비톨:젤라틴 용액의 성질 사이에서 매우 작은 차이점이 관찰되었다. 둘 모두의 용액은 젤라틴의 전이점을 약간 증가시키나, 극도로 점착성이 있고 탄성이 있는 열-가역적인 겔을 생성한다.
mTG 를 사용한 젤라틴 용액의 교차 결합에 대한 폴리하이드릭 알콜 의 영향:
용액 A - 젤라틴-글리세롤 용액은 3분 내에 mTG에 의해 굳은 겔로 변하였다. 3분 후에 형성된 겔은 동일한 시간 기간에 걸쳐서 글리세롤 없이 젤라틴 및 mTG에 의해 형성된 겔보다 더 점착성이 있었다. 상기 겔은 수조를 사용하여 50℃로 재가열되었고 고체로 남아 있었고, 이는 mTG 교차 결합이 겔화의 메커니즘이었다는 것을 확인하였다.
용액 B - 3분 후에, 비가역적 겔이 형성되었다. 상기 겔은 수조를 사용하여 50℃로 재가열되었고 고체로 남아 있었고, 이는 mTG 교차 결합이 겔화의 메커니즘이었다는 것을 확인하였다. 1:1의 글리세롤:젤라틴 비율의 용액에서 언급된 바와 같이, 글리세롤의 존재는 3분 후에 더 굳은 겔을 생성하였다. 2:1의 글리세롤:젤라틴 비율 용액에서, 형성된 겔은 젤라틴 단독으로 형성된 겔보다 상당히 더 부서지기 쉽다고 관찰되었고, 또한 1:1의 비율을 갖는 글리세롤:젤라틴 용액으로부터 형성된 겔보다 주목할만하게 더 부서지기 쉽다고 관찰되었다.
용액 C - 3분 후에, 고체, 점착성이 있는, 매우 탄성이 있는 겔이 형성되었다. 이러한 겔은 전혀 부서지지 않고 쉽게 분리되지 않았다. 이는 단지 글리세롤만을 갖는 교차 결합된 젤라틴 겔이 매우 부서지기 쉬운 경우에 매우 중요한 결과로 간주되었다. 상기 솔리비톨은 다른 부서지기 쉬운 물질의 탄성을 매우 증가시켰다. 상기 겔은 수조를 사용하여 50℃로 재가열되었고 고체로 남아 있었고, 이는 mTG 교차 결합이 겔화의 메커니즘이었다는 것을 확인하였다.
용액 E - 결과는 2:1의 글리세롤:젤라틴 비율에서의 글리세롤을 갖는 결과와 매우 유사하였다: 글리세롤의 존재는, 젤라틴 단독으로 형성된 겔 보다 훨씬 더 부서지기 쉬운 겔을 형성하였다. 그러나, mTG의 존재에서 3분 후에 형성된 겔은 mTG를 갖는 젤라틴 단독으로 3분 후에 형성된 겔보다 더 고체였다.
용액 F - 3분 후에, 고체의, 극단적인 탄성이 있고 점착성이 있는 겔은 젤라틴-솔비톨 용액의 mTG 교차 결합에 의해 형성되었다. 상기 솔비톨은 mTG-교차 결합된 젤라틴 겔의 탄성 및 점착성을 매우 증가시키는 것을 제외하고 젤라틴의 mTG 교차 결합에 영향을 주지 않는 것 같다.
상기로부터, 젤라틴에 글리세롤을 첨가하는 것은 젤라틴의 전이점을 전혀 감소시키기 않는 것 같다. 글리세롤에 젤라틴을 침지시키는 것은 열-가역적인 겔을 형성하려는 경향을 상당히 변화시키지 않는 것 같다. 젤라틴 용액이 3분 동안 mTG와 혼합된 후에, 글리세롤의 존재는 더 굳은 겔을 생성하는 것 같다. 이는 젤라틴이 글리세롤의 존재하에 있을 때, 젤라틴의 mTG 교차 결합을 촉진한다는 것을 나나타낼 수 있다.
젤라틴의 mTG 교차 결합 동안에 고농도의 글리세롤의 존재는, 젤라틴 단독의 교차 결합에 의해 형성된 겔보다 더 부서지기 쉬운 교차 결합된 겔을 생성한다는 것을 나타낸다. 글리세롤은 젤라틴의 mTG 교차 결합을 촉진하는 것 같다.
글리세롤과 함께 솔비톨의 첨가는 젤라틴의 전이점을 감소시키지 않는다. 그러나, 솔비톨은 젤라틴 겔의 탄성 및 점착성을 매우 증가시킨다. 솔비톨은 다른 물질의 첨가에 의해 더 부서지기 쉽게 되는 젤라틴 겔의 탄성을 증가시키는 데에 사용될 수 있다. 솔비톨은 젤라틴의 mTG 교차 결합을 억제하지 않는 것 같다. 솔비톨이 젤라틴의 전이점을 약간 증가시킨다 하더라도, 솔비톨은 젤라틴 겔의 탄성 및 점착성을 매우 증가시킨다.
글리세롤:젤라틴 비율을 5:1로 증가시키는 것은, 2:1의 글리세롤:젤라틴 용액을 사용하여 제조한 것보다 교차 결합된 젤라틴 겔을 더 부서지기 쉽게 하나, 젤라틴 전이점에 대한 임의의 추가적인 영향을 주지는 않는다. 약간의 교차 결합을 촉진하는 영향은 더 높은 글리세롤:젤라틴 비율에서도 여전히 발생하나, 1:1 및 2:1의 글리세롤:젤라틴 비율에서의 영향보다 더 나타내는 것은 아니다.
5:1의 솔비톨:젤라틴 비율을 갖는 용액은 젤라틴 전이점을 증가시키나, 3:1의 솔비톨:젤라틴 비율을 갖는 용액에 의해 증가된 것보다 더 크지는 않다. 그러나, 5:1 용액으로 형성된 교차 결합된 젤라틴 겔은 더 탄성이 있고 점착성이 있었다. 이는 솔비톨의 양이 교차 결합된 젤라틴 겔의 탄성을 다양화하기 위해 변경될 수 있다는 것을 추가적으로 제안한다.
예 13
겔화 및 젤라틴의 교차 결합에 대한 분사 건조의 영향
이러한 예는 젤라틴 교차 결합에 대한 분사 건조의 영향에 관한 것이다. 분사 건조를 사용하여 형성된 입자 크기에 대한 바람직한 범위는 바람직하게는 하기와 같다: 약 20 ㎛ 내지 약 140 ㎛이고, 더 바람직하게는 약 60 ㎛ 내지 100 ㎛이다(직경에서).
선택적으로, 입자 형성을 위한 다양한 계획이 고려될 수 있다. 하나의 가능한 계획은 말단에서 특정화된 분사 기술을 이용하거나 또는 첨가제를 포함함으로써 젤라틴 및 mTG의 쉽게 재구성될 수 있는 입자를 개별적으로 형성하는 것이다. 또 다른 가능한 계획은 젤라틴 및 mTG를 함께 혼합하는 쉽게 재구성될 수 있는 입자를 형성하는 것이다. 이러한 입자는 특정화된 분사 기술을 이용하거나 또는 이러한 입자의 재구성능력을 개선하는 첨가제를 포함함으로써 형성될 수 있다. 나아가, 상기 젤라틴 및 mTG가 임의의 교차 결합을 하지 않은 경우 또는 부분적인 교차 결합을 한 후에, 이러한 입자는 생성될 수 있다.
물질 및 방법
물질
유형 A 300 블룸 돼지 젤라틴을 Sigma-Aldrich 회사(St. Louis, MO)로부터 구매하였다. Activata TI-WM 미생물의 트랜스글루타미나아제(mTG)는 Ajinomoto(일본)에 의해 제공되었다. Dulbecco's PBS(pH 7.4)를 생물 산업(Kibbutz Beit Haemek, 이스라엘)로부터 구매하였다. 우레아 98%를 Alfa Aesar(Lancaster, UK)에 의해 구매하였다.
mTG 용액 제조:
4 gr의 mTG를 16 gr의 Dulbecco's PBS와 용해시킴으로써 20% (w/w) 미생물의 트랜스글루타미나아제(mTG) 용액을 제조하였다. 상기 용액을 실험 과정에 걸쳐서 실온(RT)에서 유지하였다.
2.04 gr의 mTG를 50 gr의 Dulbecco's PBS와 용해시킴으로써 4% (w/w) 미생물의 트랜스글루타미나아제(mTG) 용액을 제조하였다. 상기 용액을 실험 과정에 걸쳐서 실온(RT)에서 유지하였다.
젤라틴 용액 제조:
10.52 gr의 젤라틴 분말을 200 gr의 Dulbecco's PBS에서 용해시킴으로써 5% (w/w) 젤라틴 용액을 제조하였다. 상기 혼합물을 50℃로 가열하였고 균일한 용액이 형성될 때까지 교반하였다.
용액 1은 5% 젤라틴 용액의 50 mL를 특징으로 한다.
용액 2 - 1:1 (w/w) 젤라틴 - 2.63 gr의 만니톨을 5% 젤라틴 용액의 20 mL에 첨가함으로써 만니톨 용액을 제조하였다. 상기 용액을 교반하였고 50℃ 수조에서 보관하였다. 실험을 통하여, 열-가역적인 겔화를 방지하기 위해 상기 용액을 ~50℃ 수분 접시(water dish)에 보관하였다.
용액 3 - 1:1 (w/w) 젤라틴 - 교반하고 50℃로 가열하는 동안에, 2.63 gr의 트레할로스를 5% 젤라틴 용액의 50 mL에 용해시킴으로써 트레할로스 용액을 제조하였다. 실험을 통하여, 상기 용액을 50℃에서 보관하였다.
용액 4 - 1:1 (w/w) 젤라틴 - 교반하고 50℃로 가열하는 동안에, 2.63 gr의 우레아를 5% 젤라틴 용액의 50 mL에 용해시킴으로써 우레아 용액을 제조하였다. 실험을 통하여, 상기 용액을 50℃에서 보관하였다.
용액 5 - 5% 젤라틴 용액의 40 gr을 4% mTG 용액의 20 gr과 혼합하였다. 실험을 통하여, 상기 용액을 50℃에서 보관하였다.
젤라틴 용액의 분사 건조
분사 건조된 젤라틴 입자의 제조에 대해, Dulbecco's PBS에서 다른 5% 젤라틴 용액을 제조하였다(용액 1 내지 5). 젤라틴 용액은 BUCHI 마이크로 분사 건조기를 사용하여 분사 건조되었다. 흐름 유형은 노즐 헤드(nozzle head)에서 공기 및 액체의 혼합과 병류 방향이다. 흡입기 속도 및 유입구 온도는 각각 100% 및 100℃로 일정하게 유지하였다. 액체 공급 속도를 하기에서 주어진 바와 같이 유출구 온도에 영향을 주는 공정 조건에 따라 다양하게 하였다.
용액 1 - 5% (w/w) 젤라틴 용액의 50 mL을 가열된 채로 보관하였고, 57℃의 유출구 온도와 함께, 15% 공급 속도로 분사 건조하였다.
용액 2 - 50 mL의 1:1 (w/w) 젤라틴-만니톨 용액을 50℃ 수조에서 가용성 상태로 보관하였다. 상기 액체 공급 속도는 62℃의 유출구 온도와 함께 15%였다.
용액 3 - 50 mL의 1:1 (w/w) 젤라틴-트레할로스 용액을 50℃ 수조에서 가용성 상태로 보관하였다. 상기 액체 공급 속도는 54℃의 유출구 온도와 함께 15%였다.
용액 4 - 50 mL의 1:1 (w/w) 젤라틴-우레아 용액을 50℃ 수조에서 가용성 상태로 보관하였다. 상기 액체 공급 속도는 57℃의 유출구 온도와 함께 15%였다. 실험을 통하여, 상기 액체 공급 속도는 분말의 형성을 가능하게 하기 위해 유출구 온도 54℃와 함께 20% 변화하였다.
용액 5 - 4% mTG 용액과 혼합된 40 mL의 5% (w/w) 젤라틴 용액을 20%의 액체 공급 속도 및 56℃의 유출구 온도에서 분사 건조되었다. 실험을 통하여, 상기 용액은 37℃ 수분 접시에서 보관되었다.
젤라틴 용액의 겔화에 대한 분사 건조의 영향:
분사 건조된 젤라틴 분말을 Dulbecco's PBS를 사용하여 4 mL 유리병에 용해시켰고, 튜브를 4회 거꾸로 함으로써 혼합하였다. 침천 용액을 50℃ 수조에서 가열하였고 용해될 때까지 수동으로 혼합하였다. 그런 다음, 상기 용액을 실온에서 냉각한 채로 두었고, 각각의 용액의 외관 및 점도를 관찰 및 상기 용액을 유리 막대로 만져봄으로써 감소된 온도에 따라 평가하였다.
용액 1 - 최종적으로 25% (w/w) 젤라틴을 형성하기 위해, 5% 분사 건조된 젤라틴 용액의 0.33 gr을 1 mL의 실온 Dulbecco's PBS에서 용해시켰다. 이 때, 또 다른 1 mL의 Dulbecco's PBS를 첨가하였고, 젤라틴 함량을 12.5% (w/w)로 감소시켰다.
용액 2 - 분사 건조된 1:1의 젤라틴-만니톨 용액의 0.33 gr을 1 mL의 실온 Dulbecco's PBS에서 용해시켰다.
용액 3 - 분사 건조된 1:1의 젤라틴-트레할로스 용액의 0.33 gr을 1 mL의 실온 Dulbecco's PBS에서 용해시켰다.
용액 4 - 젤라틴-우레아 분사 건조는 분말을 생성하지 못하였다.
용액 5 - 분사 건조된 1:1의 젤라틴-mTG 용액의 0.25 gr을 0.75 mL의 37℃ Dulbecco's PBS에서 용해시켰다.
mTG 를 사용한 젤라틴 용액의 화학적 교차 결합에 대한 분사 건조의 영향:
분사 건조된 젤라틴 분말을 상기에서 언급한 바와 같이 용해시켰고 50℃ 수조에서 보관하였다. 20%의 실온 mTG 용액을 2:1의 젤라틴 대 mTG 비율에서 첨가하였고, 피펫 팁을 사용하고 튜브를 4회 거꾸로 함으로써 서서히 혼합하였다. 겔화 시간을 측정하였고, mTG와의 혼합 후에 상기 용액의 외관 및 점도를 관찰 및 상기 용액을 유리 막대로 만져봄으로써 평가하였다. 겔이 형성되는 때에, 상기 겔을 수조를 사용하여 50℃로 가열함으로써 열적 가역성을 테스트하였다.
결과:
젤라틴 용액의 분사 건조
젤라틴 용액의 분사 건조는 미세 흰색 분말을 다른 양으로 제공하였다. 용액 1 - 5% 젤라틴 용액의 ~50 mL를 0.78 gr 제공하였다. 용액 2 - 만니톨과 1:1의 비율(w/w)로 혼합된 5% 젤라틴 용액의 ~40 mL를 0.73 gr 제공하였다. 용액 3 - 트레할로스와 1:1의 비율(w/w)로 혼합된 5% 젤라틴 용액의 ~50 mL를 1.135 gr 제공하였다. 용액 4 - 분말을 생성하지 못하였다. 상기 실험은 우레아와 혼합된 젤라틴이 수집될 수 없는 높은 점성의 페이스트(paste)를 제공한 후에 종결되었다. 용액 5 - 4% mTG 용액과 혼합된 5% 젤라틴 용액의 ~40 mL를 1.27 gr 제공하였다.
젤라틴 용액의 겔화에 대한 분사 건조의 영향:
용액 1 - 흰색 불용성 침전물을 형성하는 최종 25% (w/w)의 젤라틴을 형성하기 위해, 젤라틴 분말을 실온 PBS에서 부분적으로 용해시켰다. 50℃ 수조에서 가열시킨 후에, 상기 분말을 용해시켜, 균일한 용액을 생성하였다. 실온까지 냉각한 때에, 상기 용액은 겔화되었고, 젤라틴을 12.5% (w/w)로 감소시키기 위해 또 다른 1 mL의 PBS를 첨가하였다. 상기 12.5% 젤라틴 용액은 26 ℃ 내지 27℃에서 겔화되었다.
용액 2 - 최종 ~12.5% (w/w)의 젤라틴(젤라틴은 생성된 분말의 1/2 양이 기대되며, 젤라틴의 정확한 백분율은 공지되지 않았다)을 형성하기 위해 젤라틴-만니톨 분말을 실온 PBS에서 부분적으로 용해시켰다. 흰색 불용성 침전물을 형성하였다. 50℃ 수조에서 가열시킨 후에, 상기 분말을 용해 시켰고, 균일한 용액을 생성하였다. 실온까지 냉각된 때에, 상기 용액은 28℃ 내지 29℃에서 겔화되었다.
용액 3 - 최종 ~12.5% (w/w)의 젤라틴(젤라틴은 생성된 분말의 1/2 양이 기대되며, 젤라틴의 정확한 백분율은 공지되지 않았다)을 형성하기 위해 젤라틴-트레할로스 분말을 실온 PBS에서 부분적으로 용해시켰다. 흰색 불용성 침전물을 형성하였다. 50℃ 수조에서 가열시킨 후에, 상기 분말을 용해 시켰고, 균일한 용액을 생성하였다. 실온까지 냉각된 때에, 상기 용액은 25℃ 내지 26℃에서 겔화되었다.
용액 4 - 용액은 교차 결합제를 함유하였고 따라서 겔화 보다는 오히려 교차 결합에 대해 시험되었다.
mTG 를 사용한 젤라틴 용액의 화학적 교차 결합에 대한 분사 건조의 영향:
용액 1 - 20% mTG 용액의 500 ul을 12.5% 젤라틴 용액의 2 mL에 첨가하였다. 4분 후에, 강한 흰색 겔이 형성되었다. 상기 겔은 비가역적이었다.
용액 2 - 20% mTG 용액의 250 ul을 12.5% 젤라틴 용액의 1 mL에 만니톨과 함께 첨가하였다. 2.5분 후에, 강한 흰색 겔이 형성되었다. 상기 겔은 비가역적이었다.
용액 3 - 20% mTG 용액의 250 ul을 12.5% 젤라틴 용액의 1 mL에 트레할로스와 함께 첨가하였다. 3분 후에, 강한 흰색 겔이 형성되었다. 상기 겔은 비가역적이었다.
용액 4 - mTG-젤라틴 용액을 37℃로 가열된 1 mL의 Dulbecco's PBS에 용해시켰다. PBS에서 완전한 용해를 방지면서, 흰색, 약한 겔이 즉시 형성되었다. 상기 형성된 겔은 비가역적이었다.
상기로부터, 젤라틴 용액의 분사 건조는 가능하다는 것을 나타낸다. 예를 들어, 5% 젤라틴 용액은 분사 건조될 수 있고, 미세 흰색 분말을 생성하였다. 젤라틴은 1:1(w/w)의 젤라틴 대 만니톨 또는 트레할로스 비율에서 만니톨 및 트레할로스와 함께 분사 건조될 수 있다. 분사 건조된 젤라틴-만니톨 용액은 젤라틴 단독으로 분사 건조된 것과 비교하여 더 높은 전이점을 갖는다. 분사 건조된 젤라틴-트레할로스는 젤라틴 단독으로 분사 건조된 것과 비교하여 더 낮은 전이점을 갖는다.
분사 건조된 젤라틴 용액의 교차 결합은 가능하다. 1:1(w/w)의 젤라틴-만니톨 용액의 분사 건조는 교차 결합을 개선시켰다. 1:1(w/w)의 젤라틴-트레할로스 용액의 분사 건조는 교차 결합에 영향을 주지 않았다.
mTG와 혼합된 젤라틴 용액의 분사 건조는 가능하다. 형성된 입자는 재구성에 대한 겔을 즉시 형성할 수 있다.
예 14
실란트를 적용하는 도구
이러한 예는 본 발명의 일부 실시예에 따른 지혈 실란트를 적용하는 예시적인 도구에 관한 것이다. 도 11A는 2개의 지혈 실란트 구성요소의 각각의 구성요소를 함유하는, 2개의 주사기(1702) 및 (1704)를 특징으로 하는 이중 주사기 도구(1700)의 예를 나타낸다. 선택적으로, 주사기(1702)는 젤라틴 또는 본원에서 설명된 바와 같은 치환체를 포함할 수 잇고, 반면에 선택적으로, 주사기(1704)는 트랜스글루타미나아제 또는 본원에서 설명된 바와 같은 치환체를 포함할 수 있다. 유리병의 체적에서의 차이는 2개의 구성요소 사이에서 혼합된 관계 비율을 반영할 것이다. 2개의 구성요소는 노즐(1705)에서 혼합할 수 있다. 혼합을 개선시키기 위해, 노즐(1705)은 요소(1706)(도 11B에서 상세하게 더 상세하게 도시함)를 생성하는 월풀(whirlpool)을 함유할 수 있다. 주사기 도구(1700)은 노즐(1705)에서 가압된 공기 시스템(1708)에 연결되어 분사 영향을 생성할 수 있다. 선택적으로, 상기 가압된 공기는 바람직한 적용에 따라 노즐(1705)의 근처 또는 먼쪽 말단으로 들어갈 수 있다.
예 15
카테터 및 그의 사용 방법
이러한 예는 본 발명의 일부 실시예에 따른 예시적인 카테터 및 그의 사용 방법에 관한 것이다. 도 12A는 혈관 삽입부 봉합의 예를 나타내며, 바람직하게는 카테터(1200)은 본원에서 설명된 실란트 구성요소를 포함하는 코팅(1202)를 특징으로 한다. 선택적으로 그리고 바람직하게는, 코팅(1202)는 하나 이상의 젤라틴 층(1204)을 특징으로 하며, 2개의 젤라틴 층은 단지 예시의 목적이고 본 발명의 범위를 제한하는 의미는 아니다. 선택적으로 젤라틴 층(1204)은 본원에서 설명된 바와 같은 또 다른 유형의 단백질 기질에 의해 치환될 수 있다. 선택적으로 그리고 바람직하게는, 코팅(1202)는 또한 하나 이상의 트랜스글루타미나아제 층(1206)을 특징으로 하며, 선택적으로 트랜스글루타미나아제 층은 본원에서 설명된 바와 같은 또 다른 교차 결합 물질에 의해 치환될 수 있다. 바람직하게는, 코팅(1202)는 투관침(trocar)이라고 하는 혈관 삽입관(1208) 주위를 덮는다.
선택적으로, 혈관 삽입관(1208)은 도 12B에 도시한 바와 같이, 건조 실란트 구성요소 및 체액 사이에 기계적 장벽을 생성하는 또 다른 외부 삽입관(1209)에 의해 덮어질 수 있다. 외부 삽입관(1209)가 제거되는 즉시, 상기 실란트 구성요소는 체액에 의해 활성화되어 혈관 주위의 유입부 봉합 플러그(plug)를 생성한다.
본 발명은 상기의 상세한 설명 및 바람직한 실시예를 참고하여 설명하였지만, 상기의 설명은 예시를 위한 것이고 본 발명을 제한하는 것은 아니며, 본 발명은 포함된 청구항의 범위에 의해 정의된다. 다른 양태, 장점 및 변형은 본 청구항의 범위 내에 있다.

Claims (102)

  1. 젤라틴, 변성제 및 트랜스글루타미나아제의 조합을 포함하는 조성물에 있어서, 상기 젤라틴 및 트랜스글루타미나아제의 양의 비율은 포유동물의 상처에서의 출혈을 감소시키기에 충분하며, 상기 변성제는 열가역성 겔화를 차단하고, 상기 겔화의 졸-겔 전이 온도를 감소시켜서, 상기 젤라틴이 표준 동물 젤라틴의 천연 졸-겔 전이에 비해 낮은 온도에서 트랜스글루타미나아제와 용액을 형성하도록 하며, 상기 변성제는 구아니딘 히드로클로라이드(GuHCl) 및 우레아(Urea)로 구성된 군으로부터 선택되고, 상기 젤라틴은 동물 기원(origin), 재조합물 기원 또는 그의 조합으로부터 제조되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  2. 삭제
  3. 제 1 항에 있어서,
    트랜스글루타미나아제는 트랜스글루타미나아제 조성물의 일부분으로 첨가되며, 젤라틴 대 트랜스글루타미나아제 조성물의 중량비는 1:1 내지 100:1인 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 트랜스글루타미나아제 조성물은 트랜스글루타미나아제의 200 U/gm 이상의 특이적 활성 수준을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 트랜스글루타미나아제는 혈액에서 유래된 인자 XIII가 아닌 식물, 재조합물, 동물 또는 미생물로부터 유래된 트랜스글루타미나아제를 포함하고, 상기 젤라틴은 250 이상의 블룸(bloom)을 갖는 고 분자량의 젤라틴을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 조성물은 가소제를 더 포함하되, 상기 가소제는 폴리하이드릭 알콜(polyhydric alcohol), 글리세린, 글리세롤, 자일리톨, 수크로스, 솔비톨, 트리에탄올아민, 레조르신, 티오디글리콜, 톨루엔설폰산의 나트륨 염, 부틸렌 글리콜, 우레아 니트레이트(urea nitrate), 티오우레아, 우레아, 글루탐산, 아스파라긴산, 발린(valine), 글리신(glycine), KSCN, KI 및 LiBr로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 삭제
  8. 제 6 항에 있어서,
    상기 가소제는 글리세롤 또는 솔비톨 중 적어도 하나를 포함하며, 글리세롤에 대한 농도비는 글리세롤 대 젤라틴의 중량비로, 0.5:1 내지 5:1이며; 또는
    솔비톨에 대한 농도비는 솔비톨 대 젤라틴의 중량비로, 0.5:1 내지 5:1인 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제 1 항에 있어서,
    상기 조성물은 pH 조절제, 환원제 및 이온 농도 조절제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 조절제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 pH 조절제는 1.5 내지 5.0 또는 7.0 내지 9.0의 pH 범위를 제공하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 조성물은 염; 트레할로스 카보하이드레이트, 만니톨 카보하이드레이트, 또는 분사 건조, 동결 건조 또는 다른 단백질 건조에 대한 안정화를 위한 다른 카보하이드레이트; 또는 그의 조합 중 하나 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  12. 제 1 항에 있어서,
    농도비 범위는 구아니딘 히드로클로라이드(GuHCl) 대 젤라틴의 중량비로, 1:2 내지 2:2이며; 또는
    농도비 범위는 우레아 대 젤라틴의 중량비로, 0.5:1 내지 1:1인 것을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제 9 항에 있어서,
    상기 환원제는 염화마그네슘 및 하이드로퀴논으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
    상기 하이드로퀴논은 혼합물의 용액 중에 0.2 M 내지 0.5 M의 농도로 존재하며; 또는
    상기 염화마그네슘은 혼합물의 용액 중에 2 M 내지 4 M의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  14. 제 1 항에 있어서,
    상기 조성물은 발열제를 더 포함하고, 상기 발열제는 염화칼슘, 다른 칼슘염, 염화마그네슘, 제올라이트 상에 흡착된 금속 산화물, 또는 그의 조합 중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  15. 제 14 항에 있어서,
    상기 염화칼슘은 주위 온도를 초과하여 증가하는 온도 각 1℃ 당, 용액 중의 혼합물의 1 mL 당 염화칼슘이 0.2 g 내지 0.7 g의 양으로 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  16. 제 1 항에 있어서,
    상기 조성물은 젤라틴 특이적인 프로테아제(gelatin specific protease), 프로테아제 억제제 또는 추가적인 지혈제 중 하나 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  17. 제 16 항에 있어서,
    상기 추가적인 지혈제는 알부민, 콜라겐, 피브린, 트롬빈, 키토산, 페릭 설페이트 또는 다른 금속 설페이트 중 하나 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  18. 제 1 항, 제 3 항 내지 제 6 항, 및 제 8 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는 지혈 드레싱 또는 붕대.
  19. 제 1 항, 제 3 항 내지 제 6 항, 및 제 8 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는 인간 또는 하등 포유동물의 신체 내로 삽입하기 위한 의료 장치.
  20. 제 8 항에 있어서,
    상기 글리세롤에 대한 농도비는 글리세롤 대 젤라틴의 중량비로, 1:1 내지 2:1이며;
    솔비톨에 대한 농도비는 솔비톨 대 젤라틴의 중량비로, 1:1 내지 3:1인 것을 특징으로 하는 조성물.
  21. 제 13 항에 있어서,
    상기 하이드로퀴논은 혼합물의 용액 중에 0.3 M 내지 0.4 M의 농도로 존재하며; 또는
    상기 염화마그네슘은 혼합물의 용액 중에 2.5 M 내지 3.5 M의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
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