WO2005061701A1 - タンパク質のポリマー複合体の製造方法 - Google Patents

タンパク質のポリマー複合体の製造方法 Download PDF

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WO2005061701A1
WO2005061701A1 PCT/JP2004/019294 JP2004019294W WO2005061701A1 WO 2005061701 A1 WO2005061701 A1 WO 2005061701A1 JP 2004019294 W JP2004019294 W JP 2004019294W WO 2005061701 A1 WO2005061701 A1 WO 2005061701A1
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protein
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dtt
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Tomoaki Takakura
Yoshihide Notsu
Akio Takimoto
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Shionogi & Co., Ltd.
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Definitions

  • the present invention relates to a method for removing a polymer ester-bonded to a mercapto group of a cysteine residue of a protein, and a method for producing a protein-polymer complex using the method. More specifically, a method for producing a protein-polymer complex, comprising a step of reacting a compound having a mercapto group with a protein to which a polymer is bound, and removing a polymer ester-bound to a mercapto group of a cysteine residue of the protein. About.
  • Patent Document 1 In order to solve the above-mentioned problems, it has been known that by binding a polymer such as polyethylene glycol to a protein, the blood half-life can be increased, the antigenicity can be reduced, and the storage stability can be improved.
  • Mechioninaze (L Mechionin ⁇ lyase) is your on tumor cell growth, reducing the amount of Mechionin essential Te, can be selectively inhibit the growth of tumor cells Nag harming healthy tissue, antitumor effect (Patent Document 2). Also, a recombinant methioninase (Patent Document 3), a methionase to which polyethylene glycol is bound (Patent Document 4), and a methioninase whose function is modified by amino acid substitution are known.
  • Patent Document 1 U.S. Pat.No. 4,179,337
  • Patent Document 2 Patent No. 2930723
  • Patent Document 3 Patent No. 3375834
  • Patent Document 4 Special Table 2002—531050
  • a protein to which a polymer such as polyethylene glycol is bound is a protein before binding. It is often unsuitable for use as a drug because its function is greatly reduced compared to protein. Under these circumstances, there has been a need for a method for producing a protein-polymer complex that does not significantly reduce the function of a protein.
  • the present inventors studied a method for producing a methioninase-polymer complex using methioninase as an example of a protein, and found that (1) the activity was significantly reduced when polyethylene glycol was bound to methioninase. (2) that the decrease in activity is due to the ester bond of the polymer to the mercapto group of the cysteine residue in methioninase; and (3) that the ester bond can be selectively cleaved with dithiothreitol or the like.
  • polymer complex is a polyethylene glycol complex of methioninase, papain, or transdaltaminase.
  • An antitumor agent comprising the methioninase polymer complex according to (13) or (14).
  • a method for removing a polymer ester-bonded to a mercapto group of a cysteine residue of a protein comprising reacting a compound having a mercapto group with the protein to which the polymer is bonded.
  • a polymer having an ester bond to a mercapto group of a cysteine residue of a protein to which the polymer has been bonded can be eliminated. Further, by using the present invention, a protein-polymer complex that does not significantly reduce the function of the protein can be produced.
  • the polymer conjugate of the protein obtained by using the present invention has a long half-life in blood, has reduced antigenicity, has improved storage stability, and is useful as a drug having high pharmacological activity. It is.
  • FIG. 1 Dithiothreitol (DTT) -untreated PEG-rMETase using MALDI-TOF / MS and FIG. 4 is a view showing the results of measuring the molecular mass at the subunit level of PEG-rMETase treated with DTT.
  • DTT Dithiothreitol
  • FIG. 2 is a graph showing the time course of plasma methionine concentration after DTT-treated PEG-rMETase ( ⁇ ) or DTT-untreated PEG-rMETase (mouth) was injected into the tail vein of a mouse.
  • FIG. 3 Plasma methionine concentration after injection of a pump containing a pyridoxal phosphate (PLP) solution into mice subcutaneously and administration of DTT-treated PEG-rMETase (see) or DTT-untreated PEG-rMETase (country). It is a figure which shows a temporal change.
  • the present invention can be carried out by reacting a polymer-bound protein with a compound having a mercapto group.
  • the protein used in the present invention means a protein having a mercapto group, for example, a protein containing a cysteine residue in its amino acid sequence.
  • the size of the protein is preferably one having 10 or more amino acid residues, and the molecular weight is preferably 1,000 or more.
  • proteins include, for example, methioninase, papain, chymopapain, cathepsin, transglutaminase, protease, keratin, hemoglobin, albumin, meta-mouth thionine and the like.
  • the protein used in the present invention may be a protein isolated and purified from natural materials, or a protein prepared by a gene recombination technique.
  • an enzyme containing a cysteine residue at a site where the activity is particularly preferred, which is preferred by the enzyme is preferred.
  • the site that influences the activity expression refers to not only a site involved in specific binding 'arrangement of a substrate and a site that expresses a catalytic action but also an allosteric site in an enzyme protein. Examples of such an enzyme include methioninase, papain, chymopapain, cathepsin, transglutaminase and the like.
  • the protein to which the polymer used in the method of the present invention is bound can be obtained, for example, by reacting a protein having a cysteine residue with an activated polymer.
  • Activated polymer is used to bind a polymer to amino groups ⁇ mercapto groups in a protein.
  • a commercially available product may be used, or a commercially available polymer may be used. May be adjusted by activation.
  • a polymer derived from an active ester can be used. When the polymer has a carboxyl group, the carboxyl group may be converted into an active ester. Further, even when the polymer does not have a carboxyl group, a linker having a carboxyl group may be bonded to convert the carboxyl group into an active ester.
  • a commonly used linker is preferably used, and more preferably, a linker having about 11 to 20 carbon atoms, and more preferably about 2 to 5 carbon atoms is used.
  • methoxypolyethylene glycol and the like are available from Union Carbide Corporation. Activating the polymer can be performed using N-hydroxysuccinimide (NHS) or the like.
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • MSPA methoxy polyethylene glycol succinimidyl propionate
  • MEGC methoxy polyethylene glycol succinimidyl glutarate
  • n is an arbitrary integer, preferably an integer of 50 to 1000.
  • the polymer refers to a polymer compound in which the same or several kinds of molecules (monomers) are bonded to form a chain, and it is particularly preferable that the compound be water-soluble.
  • a protein modification polymer and the like can be mentioned.
  • dextran, poly (N-butyl) pyrrolidone, polyalkylene oxide, polyoxyethylene polyol, polyolefin alcohol, polyacrylmorphane and the like are exemplified, and polyalkylene oxide is particularly preferred.
  • polyalkylene oxide examples include an ⁇ -substituted polyalkylene oxide derivative, a polyethylene glycol homopolymer, a polypropylene glycol homopolymer, an anorecoxy polyethylene oxide, a bis polyethylene oxide, and a copolymer of a poly (alkylene oxide), or Examples include block copolymers of poly (alkylene oxide) or its active derivative. In particular, alkoxy polyethylene oxide is preferred.
  • Alkoxypolyalkylene oxides include alkoxy polyethylene glycols (eg, For example, methoxypolyethylene glycol), alkoxypolyethyleneoxide, and alkoxypolypropyleneoxide.
  • a polymer having a preferred average molecular weight of about 200 to about 50,000 daltons may be used as a polymer in which methoxypolyethylene glycol is preferred.
  • the shape of the polymer may be linear, branched or comb.
  • the amount of the activated polymer used varies depending on the type and amount of the protein used, it is necessary to appropriately adjust the amount. This is because it is affected by the number of amino groups ⁇ mercapto groups in the protein and the like.
  • protein cationinase is a tetramer composed of four subunits, each subunit having 10 amino groups (including the N-terminal amino group) and 4 mercapto groups.
  • 30 molar equivalents of the activated polymer are used for methioninase, about 416 polymers are bound to each subunit.
  • 60 mole equivalents of the activated polymer When 60 mole equivalents of the activated polymer are used, about 7 to 10 polymers bind to each subunit.
  • a protein-polymer complex is a protein-polymer complex obtained by reacting a polymer-bound protein with a compound having a mercapto group and forming an ester bond with the mercapto group of a cysteine residue of the protein to remove the polymer. Mean body.
  • the polymer is ester-bonded to the mercapto groups of all cysteine residues present in the protein, and the polymer is eliminated. Is also included. Preferably, at least 0.7 to 1.3 of an average of polymers per second is eliminated.
  • a polymer eg, an alkyl polyethylene glycol
  • a polymer having a mercapto group is reacted with the protein to which the polymer is bonded, and the polymer ester-bonded to the mercapto group of the cystine residue of the protein is eliminated.
  • a polymer complex of the target protein can be obtained.
  • the polymer can be manufactured as follows. First, to bind the polymer to the protein, the polymer is reacted with a carboxylating agent to introduce a carboxyl group into the polymer. The carboxyl group-introduced polymer is reacted with the carboxyl group-introduced polymer to produce an active ester of the polymer. Finally, by reacting the protein with the active ester, a protein to which a polymer is bound can be obtained.
  • JP-T-62-501449 and JP-A-10-87815 may be referred to.
  • the number of polymer molecules that bind to a protein varies depending on the number of active groups, for example, reactive groups existing on the protein molecule, for example, amino groups and mercapto groups. It also varies depending on the conditions at the time of reacting the protein with the polymer, for example, temperature, pH, protein concentration and the like.
  • the protein to which the polymer obtained here has the advantage of having a longer half-life and less antigenicity than the protein to which no polymer is bonded. In many cases, it is generally weak.
  • a protein-polymer complex is formed.
  • the compound having a mercapto group that can be produced may be a compound having a free mercapto group, and a low-molecular compound is particularly preferable.
  • dithiothreitol, reduced daltathione, N-acetyl-L-cystine, 2-mercaptoethanol, dithioerythritol and the like are listed, and dithiothreitol and 2-mercaptoethanol are particularly preferable.
  • the amount of the compound having a mercapto group used is preferably about 0.01 to 10% by weight based on the weight of the reaction solution.
  • Methioninase is an enzyme that degrades the substrate methionine and is known to have antitumor activity (for example, Kreis W. and Hession C, Cancer Res., 33, 1862-1865 (1973), Kreis W. and Hession C, Cancer Res., 33, 1866-1869 (1973)) 0 Methioninase is a homotetramer structure composed of four subunits, and each subunit has a molecular weight of about 43 kDa.
  • the amino acid sequence is, for example, The sequence has 10 amino groups (including the N-terminal amino group) and 4 mercapto groups in the sequence.
  • succinic anhydride Preferably, glutaric anhydride is used to perform succinic acid or daltaric acid.
  • activated methoxypolyethylene glycol is obtained, preferably using N-hydroxysuccinimide.
  • the activated methoxypolyethylene glycol is reacted with methioninase.
  • a compound having a mercapto group in an amount of about 1200 molar equivalents is reacted with one molecule of methioninase to which methoxypolyethylene glycol is bound at a temperature of 410 to 50 degrees Celsius, preferably 10 to 40 degrees Celsius.
  • acetonitrile, dimethylformamide, dimethylsulfoxide and the like can be used as the reaction solvent.
  • the reaction time is 10 minutes to 4 hours, preferably 30 minutes to 2 hours.
  • the number of mercapto groups of methioninase before binding the polymer was measured. Theoretically, the measured force with four mercapto groups per subunit averaged about 3.7 Z subunits.
  • the number of mercapto groups of the methioninase after binding the polymer was measured. As a result, the average number of mercapto groups was about 2.7 Z subunits.
  • the number of mercapto groups in methioninase after treatment with a compound having a mercapto group was measured. As a result, the average number of mercapto groups was about 3.7 Z subunits.
  • the polymer is not bound to the mercapto group in the polymer complex of methioninase obtained by the method of the present invention.
  • the polymer complex of methioninase obtained by the present method was measured by, for example, the Ellman method (Ellman G., Arch. Biochem. Biophys., 82, 70-77 (1959)), the average per subunit was found. 2. It has eight or more, preferably an average of 3.1 or more, more preferably an average of 3.5 or more free mercapto groups.
  • methioninase comparison was made before and after polymer binding, and before and after treatment with a compound having a mercapto group.
  • the activity of the methioninase to which poly (ethylene glycol) is bound after treatment with dithiothreitol or the like is about 1.5 times lower than that before treatment with dithiothreitol or the like. — 4 times higher.
  • the increased activity of the enzyme was also confirmed in, for example, a polymer complex of papain having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and a polymer complex of transdaltaminase having, for example, an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3.
  • the present method improves the function of the protein as compared to the protein to which the polymer before the reaction of the compound having a mercapto group is reacted.
  • the function of the protein means enzyme activity, receptor activity and the like.
  • cysteine residue at position 116 in the amino acid sequence is active.
  • methioninase the cysteine residue at position 116 in the amino acid sequence is active.
  • the polymer complex of methioninase obtained by the method of the present invention is highly likely to be a composition having a polymer complex of methionase in which the 116th amino acid is a free mercapto group.
  • the polymer complex of methioninase obtained by the method of the present invention can effectively suppress the growth of tumor cells, and can be used for colon, breast, prostate, ovary, kidney, pharynx, melanoma, sarcoma, It is useful for treating and preventing cancer such as lung, brain, stomach, and bladder. That is, the antitumor agent containing the polymer complex of methioninase obtained by using the present invention not only has low antigenicity but also retains high activity and is useful as a medicine.
  • the protein-polymer complex obtained by the present invention When the protein-polymer complex obtained by the present invention is administered as a medicine, it can be administered either orally or parenterally. Oral administration may be carried out according to a conventional method, prepared and administered in a commonly used form such as tablets, granules, powders, capsules, pills, solutions, syrups, nocals and sublinguals.
  • any commonly used dosage form such as injections such as intramuscular administration and intravenous administration, suppositories, transdermal absorbents, and inhalants, can be suitably administered.
  • the polymer complex of methioninase obtained by the method of the present invention can be used for intravenous drip infusion and the like.
  • various pharmaceutical additives such as excipients, binders, wetting agents, disintegrants, lubricants, and diluents suitable for the dosage form. Can be mixed as necessary to obtain a pharmaceutical preparation. In the case of injections, the preparation should be sterilized together with a suitable carrier to give a preparation.
  • lactose sucrose, glucose, starch, calcium carbonate or crystalline cellulose, etc.
  • a binder methyl cellulose, carboxymethyl cellulose, hydroxypropyl cellulose, gelatin, polybutylpyrrolidone, etc.
  • Magnesium stearate or macrogol As a suppository base, cocoa butter, macrogol, methyl cellulose, or the like can be used.
  • solubilizing agents When preparing a liquid formulation or an emulsion or suspension injection, commonly used solubilizing agents, suspending agents, emulsifiers, stabilizers, preservatives, isotonic agents, etc. are added as appropriate.
  • a flavoring agent In the case of oral administration, a flavoring agent, a fragrance and the like may be added.
  • the polymer complex of methioninase obtained by the method of the present invention may be used after freeze-drying.
  • the dose of the polymer complex of the protein obtained by the present invention as a medicament is desirably set in consideration of the patient's age, body weight, type and degree of disease, administration route and the like.
  • the dose is usually 0.05 to 200 mgZkgZ days, and preferably 0.1 to 100 mgZkgZ days.
  • significantly different force s route of administration is usually 0. 005- 20mgZkgZ ⁇ , preferably in the range of 0. 01-10mg / k gZ day. It may be administered by injection or infusion once a day in several divided doses. These dosages differ depending on the type of protein. Therefore, it can be used outside the above-mentioned dosage range.
  • rMETase recombinant methioninase
  • DTT dithiothreitol
  • PEG-rMETase polyethylene glycol-modified recombinant methioninase
  • rMETase Approximately 170 g of rMETase was mixed with 120 mM sodium borate buffer (pH 9.0) in a double volume. Next, the solution was concentrated to 100 g / L using a membrane having a molecular weight cut off of 10 kDa and 1.8 m 2 . 150 g of concentrated rMETase was used for the PEG modification step.
  • the obtained reaction solution was mixed with 50 mM sodium phosphate buffer pH 7.2 so that the total amount was 36.0 L.
  • Diafiltration was performed using a membrane having a molecular weight cut off of 50 kDa and 2.1 m 2 while adding 42 L of 50 mM sodium phosphate buffer pH 7.2 at a flow rate of 0.7 L / min. Concentration was continued until the volume became about 3 L.
  • the protein in the membrane was recovered using 2 L of 50 mM sodium phosphate buffer, pH 7.2, and mixed with the concentrated solution to obtain a Diafiltration treatment solution.
  • Diafiltration treatment solution is sent at a flow rate of 50 cm / h to a DEAE Sepharose-FF column ( ⁇ 140 x 65 mm, 1 L) equilibrated with 50 mM sodium phosphate buffer pH 7.2, and the pass through fraction is collected. I got it. Eluate to adjust the addition of 50 mM sodium phosphate buffer pH 7.2 12.0 L, and stored at 0.2 mu m, and filtered through a membrane of 0.05 m 2 15 ° C.
  • the ion exchange column chromatography eluate was sent at a flow rate of 11 cm / h to a Sephacryl S200 HR column ( ⁇ 600 ⁇ 600 mm, 170 L) equilibrated with 10 mM sodium phosphate buffer pH 8.0.
  • the active fractions were collected and concentrated using a 30 kDa, 1.2 m 2 membrane.
  • the protein in the membrane was recovered using about one 10 mM sodium phosphate buffer pH 8.0, and 10 mM sodium phosphate buffer was added to adjust the protein concentration to about 40 g / L.
  • the specific activities of PEG-rMETase and rMETase were measured.
  • the activity was measured according to the method of Takakura et al. (Takakura T. et. Al., Anal Biochem., 327, 233-240 (2004).
  • the enzyme activity was reduced by PEG modification as shown in Table 1.
  • the rTTase enzyme activity did not change even after the DTT treatment.
  • DTT treatment are not limited to methioninase, but can be widely applied to other proteins and enzymes, especially proteins and enzymes in which the mercapto group of cysteine residue plays an important role in activity expression. .
  • DTT has a mercapto group and a hydroxyl group as shown below.
  • Enzyme solution was prepared using DTT-free buffer Example 4
  • Methioninase has four mercapto groups per subunit.
  • the change in the number of free mercapto groups present in rMETase following the PEG modification reaction and DTT treatment was determined by denaturing the protein by sodium dodecyl sulfate treatment, followed by the Ellman method (Ellman G ⁇ ., Arch. Biochem. Biophys. , 82, 70-77 (1959)).
  • the molecular mass at the subunit level of DTT-untreated PEG-rMETase and DTT-treated PEG-rMETase was analyzed by MALDI-TOF / MS. As a result, as shown in FIG. 1, it was found that the molecular weight of the DTT-treated PEG-rMETase was reduced by about 5 kDa compared to the DTT-untreated PEG-rMETase! /. The fact that the molecular weight of PEG was about 5 kDa also suggested that 1 PEG / subduct was eliminated by DTT treatment.
  • DTT untreated PEG-rMETase DTT-treated PEG-rMETase bound PEG number was measured (Bullock J., et.al, Anal. Biochem. ,, 254, 254-262 (1997)) 0 Released by alkaline hydrolysis PEG was quantified using HPLC with PEG4120 (Polymer Laboratories) as a standard. As a result, as shown in Table 9, the number of conjugated PEGs of untreated DTT-treated PEG-rMETase was 8.4 PEG / subunit, whereas the number of conjugated PEGs of DTT-treated PEG-rMETase was 7.5 PEG / subunit. , A decrease of about 1 PEG / subunit was observed. Similarly, in the case of PEG-rMETase modified with PEG at a reaction molar ratio of 30, the number of bound PEG decreased by about 1 PEG / subunit by DTT treatment.
  • PEG The power of PEG also plays an important role in the expression of methioninase in the PEG modification step. PEG forms an unstable thioester bond with Cys to lower the specific activity. It is thought that PEG-rMETase with a restored mercapto group is generated.
  • DTT-treated PEG-rMETase prepared at a reaction molar ratio of 60 and DTT-untreated PEG-rMETase were injected into the tail vein of mice of the same protein amount (140 mg / kg) (3 mice per group). Blood collection over time The concentration of methionine in plasma was measured (Jones BN and Gilligan JP, J. Chromatogr. 266, 471-482 (1983)). The result is shown in figure 2.
  • DTT-treated PEG-rMETase ( ⁇ ) maintains plasma methionine concentration at a low level for a long period of time compared to DTT-untreated PEG-rMETase (mouth), and the effect of DTT treatment can be confirmed in vivo.
  • FIG. 3 shows the results of a similar experiment in which a pump containing a PLP solution was implanted subcutaneously in a mouse.
  • DTT-treated PEG-rMETase (see) was able to maintain the plasma methionine concentration at a low level for a long period of time as compared to DTT-untreated PEG-rMETase (country). It was assumed that DTT treatment could reduce the dose required for treatment.
  • the antigenicity of DTT-treated PEG-rMETase and rMETase prepared at a reaction molar ratio of 60 was compared.
  • Mice were intraperitoneally administered with DTT-treated PEG-rMETase or rMETase at a dose of 0.1 mg / animal once a week for a total of 12 times, and blood was collected two weeks after the final administration to obtain serum (10 mice per group) .
  • Immunogenicity was measured using an enzyme immunoassay. rMETase was fixed on a gel of a polystyrene plate, blocked and washed.
  • the diluted serum was added to the well, washed, and then a peroxidase-labeled mouse anti-IgM antibody or anti-IgG antibody was added.
  • a peroxidase-labeled mouse anti-IgM antibody or anti-IgG antibody was added.
  • the titer was measured using mouse serum as a control. Table 11 shows the number of individuals at each serum dilution ratio. The antigenicity of DTT-treated PEG-rMETase was much lower than that of rMETase.

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Abstract

　ポリマーが結合したタンパク質に、メルカプト基を有する化合物を反応させることにより、システイン残基のメルカプト基にエステル結合しているポリマーを脱離させることにより、タンパク質の機能を大きく低下させることなく、タンパク質のポリマー複合体を製造することができる。

Description

明 細 書
タンパク質のポリマー複合体の製造方法
技術分野
[0001] 本発明は、タンパク質のシスティン残基のメルカプト基にエステル結合したポリマー の脱離方法、該方法を使用するタンパク質のポリマー複合体の製造方法に関する。 詳しくは、ポリマーが結合したタンパク質にメルカプト基を有する化合物を反応させ、 該タンパク質のシスティン残基のメルカプト基にエステル結合しているポリマーを脱離 する工程を含む、タンパク質のポリマー複合体の製造方法に関する。
背景技術
[0002] 一般的に、タンパク質そのものを医薬に使用する場合、血中半減期が短い、抗原 性が高い、貯蔵安定性が悪い、溶解性が低い等の問題がある。
上記の問題を解決するためには、タンパク質にポリエチレングリコール等のポリマー を結合させることにより、血中半減期を長くしたり、抗原性を減少させたり、貯蔵安定 性を改善できることが知られて 、る（特許文献 1)。
メチォニナーゼ (L メチォニン Ί リアーゼ）は、腫瘍細胞の増殖にお 、て必須で あるメチォニンの量を減らし、健康な組織を害することなぐ腫瘍細胞の増殖を選択 的に抑制することができ、抗腫瘍効果を有することが知られている (特許文献 2)。ま た、組換えメチォニナーゼ (特許文献 3)、ポリエチレングリコールが結合したメチォ- ナーゼ (特許文献 4)、アミノ酸置換により機能改変を施したメチォニナーゼも知られ ている。
特許文献 1 :米国特許第 4, 179, 337号
特許文献 2：特許第 2930723号
特許文献 3：特許第 3375834号
特許文献 4:特表 2002— 531050
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0003] 一般に、ポリエチレングリコール等のポリマーが結合したタンパク質は、結合前のタ ンパク質に比較し機能が大きく低下していることが多ぐ医薬としての利用には適さな い場合がある。こういった状況の下、タンパク質の機能を大きく低下させることなぐタ ンパク質のポリマー複合体を製造する方法が求められていた。
課題を解決するための手段
[0004] 本発明者は、タンパク質の例としてメチォニナーゼを用いて、メチォニナーゼのポリ マー複合体の製造法に関する検討を行い、（1)メチォニナーゼにポリエチレングリコ ールを結合させた場合に活性が大きく低下すること、 (2)その活性低下はメチォニナ ーゼ中のシスティン残基のメルカプト基へのポリマーのエステル結合に起因すること 、（3)該エステル結合はジチオスレィトール等で選択的に切断できること、（4)ポリエ チレングリコールを結合させたメチォニナーゼをジチオスレィトール等で処理した後 の活性は、ジチオスレィトール等で処理する前の活性よりも約 1. 5— 4倍高いこと、 ( 5)その活性はオリジナルのメチォニナーゼが示す活性の約 70%以上であることを見 出した。同様に、パパインやトランスダルタミナーゼについても活性の上昇が見られた
[0005] 上記の知見に基づいて、本発明者は、以下の発明を完成した。
(1)ポリマーが結合したタンパク質にメルカプト基を有する化合物を反応させ、該タン パク質のシスティン残基のメルカプト基にエステル結合しているポリマーを脱離する 工程を含む、タンパク質のポリマー複合体の製造方法。
(2)ポリマーが結合した該タンパク質力 システィン残基を有するタンパク質に活性 化ポリマーを反応させて得られたものである、 (1)記載の方法。
(3)該ポリマーがポリアルキレンォキシドである、（1)記載の方法。
(4)該ポリマーがポリエチレングリコールである、（3)記載の方法。
(5)該メルカプト基を有する化合物が、ジチオスレィトール、ジチォエリスリトール、 2— メルカプトエタノール、還元型グルタチオン又は N ァセチルー L システィンの!/、ずれ かである、（1)記載の方法。
(6)該メルカプト基を有する化合物が、ジチオスレィトール又は 2 メルカプトエタノー ルである、（1)記載の方法。
(7)該タンパク質が酵素である（1)記載の方法。 (8)該酵素がその活性発現に影響を与える部位にシスティン残基を含むものである 、（7)記載の方法。
(9)該酵素がメチォニナーゼ、パパインまたはトランスダルタミナーゼである（8)記載 の方法。
(10)タンパク質 1サブユニットあたり平均 0. 7-1. 3分子のポリマーを脱離するもの である、（1)記載の方法。
(11) (1)一（10)のいずれかに記載の方法で得られる、タンパク質のポリマー複合体
(12)該ポリマー複合体がメチォニナーゼ、パパインまたはトランスダルタミナーゼの ポリエチレングリコール複合体である（1)記載の方法。
(13) (12)記載の方法で得られる、メチォニナーゼ、パパインまたはトランスダルタミ ナーゼのポリエチレングリコーノレ複合体。
(14) 1サブユニットあたり平均 3. 1個以上の遊離のメルカプト基を有するものである 、メチォニナーゼのポリマー複合体。
(15) (13)または（14)に記載のメチォニナーゼのポリマー複合体を含有する抗腫瘍 剤。
(16)ポリマーが結合したタンパク質にメルカプト基を有する化合物を反応させること を特徴とする、該タンパク質のシスティン残基のメルカプト基にエステル結合したポリ マーの脱離方法。
発明の効果
[0006] 本発明の方法により、ポリマーが結合したタンパク質のシスティン残基のメルカプト 基にエステル結合したポリマーを脱離することができる。また、本発明を使用すること により、タンパク質の機能を大きく低下させることなぐタンパク質のポリマー複合体を 製造することができる。本発明を使用して得られるタンパク質のポリマー複合体は、血 中半減期が長ぐ抗原性が低減されており、貯蔵安定性も改善されているのみならず 、薬理活性も高ぐ医薬品として有用である。
図面の簡単な説明
[0007] [図 1]MALDI- TOF/MSを用いたジチオスレィトール（DTT)未処理 PEG- rMETaseおよ び DTT処理 PEG-rMETaseのサブユニットレベルでの分子質量の測定結果を示す図 である。
[図 2]DTT処理 PEG- rMETase (〇）または DTT未処理 PEG- rMETase (口）をマウス尾 静脈に注射した後の血漿中メチォニン濃度の経時変化を示す図である。
[図 3]ピリドキサールりん酸 (PLP)溶液を含有したポンプをマウス皮下に移植し、 DTT 処理 PEG-rMETase (參）または DTT未処理 PEG-rMETase (國）を投与した後の血漿 中メチォニン濃度の経時変化を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
[0008] 本発明は、ポリマーが結合したタンパク質に、メルカプト基を有する化合物を反応さ せること〖こより行うことができる。
本発明に用いられるタンパク質は、メルカプト基を有するタンパク質を意味し、例え ば、そのアミノ酸配列中にシスティン残基を含むタンパク質を意味する。このとき、タ ンパク質の大きさとしては、アミノ酸残基数が 10以上のものが好ましぐ分子量として は 1,000以上のものが好ましい。そのようなタンパク質としては、例えば、メチォニナ ーゼ、パパイン、キモパパイン、カテブシン、トランスグルタミナーゼ、プロテアーゼ、 ケラチン、ヘモグロビン、アルブミン、メタ口チォネイン等が挙げられる。なお、本発明 に用いられるタンパク質は、天然物力ゝら単離精製したものでもよぐ遺伝子組換技術 により作成されたものでもよ 、。
また、タンパク質としては酵素が好ましぐ特にその活性発現に影響を与える部位に システィン残基を含む酵素が好ましい。活性発現に影響を与える部位とは、酵素タン パク質において基質の特異的結合'配置に関与する部位及び触媒作用を発現する 部位のみならず、例えばァロステリックな部位をいう。このような酵素としては、例えば 、メチォニナーゼ、パパイン、キモパパイン、カテブシン、トランスグルタミナーゼ等が 挙げられる。
[0009] 本発明の方法に用いるポリマーが結合したタンパク質は、例えば、システィン残基 を有するタンパク質に活性ィ匕ポリマーを反応させることにより得ることができる。
活性ィ匕ポリマーは、タンパク質中のアミノ基ゃメルカプト基にポリマーを結合させる ために使用される。活性ィ匕ポリマーは、市販の物を使用してもよいし、市販のポリマー を活性ィ匕して調整してもよい。例えば、活性エステルに誘導されたポリマー等が使用 できる。ポリマーにカルボキシル基がある場合は、該カルボキシル基を活性エステル にすればよい。また、ポリマーにカルボキシル基がない場合であっても、カルボキシ ル基を有するリンカ一を結合させ、該カルボキシル基を活性エステルにすればょ 、。 リンカ一としては、通常使用されるものであればよぐ好ましくは、炭素数 1一 20、さら に好ましくは炭素数 2— 5ぐらいのリンカ一が使用される。
例えば、メトキシポリエチレングリコール等は Union Carbide Corporationから入手で きる。ポリマーの活性ィ匕は、 N—ヒドロキシスクシンイミド (NHS)等を用いて行うことがで きる。例えば、メトキシポリエチレングリコールスクシンィミジルプロピオネート（MSPA) 、メトキシポリエチレングリコールスクシンィミジルグルタレート（MEGC)等が挙げられ る。
[化 1]
Figure imgf000006_0001
(上記式中、 nは任意の整数。好ましくは、 50— 1000の整数。 )
ポリマーとは、同一もしくは何種類かの分子 (単量体)が結合して鎖状となった高分 子化合物をさし、特に水溶性であることが望ましい。たとえば、タンパク質修飾用ポリ マーなどが挙げられる。具体的には、デキストラン、ポリ（N-ビュル)ピロリドン、ポリア ルキレンォキシド、ポリオキシエチレンポリオール、ポリオレフインアルコール、ポリアク リルモルフアン等が例示され力 特にポリアルキレンォキシドが好まし 、。
ポリアルキレンォキシドとしては、 α置換ポリアルキレンォキシド誘導体、ポリエチレ ングリコーノレホモポリマー、ポリプロピレングリコーノレホモポリマー、ァノレコキシポリエ チレンォキシド、ビス ポリエチレンォキシド、ポリ（アルキレンォキシド）のコポリマー、 またはポリ（アルキレンォキシド)若しくはその活性ィ匕誘導体のブロックコポリマー等が 挙げられる。特に、アルコキシポリエチレンォキシドが好ましい。
アルコキシポリアルキレンォキシドとしては、アルコキシポリエチレングリコール（例え ば、メトキシポリエチレングリコール等）、アルコキシポリエチレンォキシド、アルコキシ ポリプロピレンォキシドが挙げられる。特に、メトキシポリエチレングリコールが好ましい ポリマーは、約 200—約 50, 000ドルトンの平均分子量を有するポリマーを使用す ることができる。好ましくは、約 1, 000—約 20, 000ドルトンの平均分子量を有するポ リマー、さらには、約 2, 000—約 10, 000ドルトンの平均分子量を有するポリマー、 最も好ましくは、約 4, 000—約 6, 000ドルトンの平均分子量を有するポリマーである ポリマーの形状としては直鎖状でも分岐状でもまた櫛状でも構わない。
使用する活性ィ匕ポリマーの量は、使用するタンパク質の種類 '量により異なるので 適宜、調整する必要がある。なぜなら、タンパク質中のアミノ基ゃメルカプト基の数等 により影響を受けるからである。例えば、タンパク質カ チォニナーゼの場合、 4つの サブユニットからなる 4量体であり、各サブユニットは 10個のアミノ基 (N末端アミノ基も 含む）と 4個のメルカプト基を有する。メチォニナーゼに対し、 30モル等量の活性ィ匕 ポリマーを使用した場合、各サブユニット当たり 4一 6個程度のポリマーが結合する。 また、 60モル等量の活性ィ匕ポリマーを使用した場合、各サブユニット当たり 7— 10個 程度のポリマーが結合する。
タンパク質のポリマー複合体とは、ポリマーが結合したタンパク質にメルカプト基を 有する化合物を反応させ、該タンパク質のシスティン残基のメルカプト基にエステル 結合して 、るポリマーが脱離された、タンパク質のポリマー複合体を意味する。
なお、タンパク質のポリマー複合体においては、該タンパク質に存在するすべての システィン残基のメルカプト基にエステル結合して 、るポリマーが脱離して 、る必要 はなぐ一部の該ポリマーが脱離したものも含まれる。好ましくは、少なくとも 1サブュ ニットあたり平均 0. 7-1. 3分子のポリマーが脱離したものが好ましい。
本発明の方法によりタンパク質のポリマー複合体を製造するには、まず、ポリマー（ 例えば、アルキルポリエチレングリコール)をタンパク質に結合させる。次に、ポリマー が結合したタンパク質に、メルカプト基を有する化合物を反応させ、タンパク質のシス ティン残基のメルカプト基にエステル結合しているポリマーを脱離させることにより、 目 的とするタンパク質のポリマー複合体を得ることができる。
具体的には、以下のようにして製造することができる。まずポリマーをタンパク質に 結合させるには、ポリマーにカルボキシル化剤を反応させ、カルボキシル基をポリマ 一に導入する。そのカルボキシル基が導入されたポリマーにカルボキシル基活性ィ匕 剤を反応させ、ポリマーの活性エステル体を製造する。最後に、該活性エステル体に タンパク質を反応させることにより、ポリマーが結合したタンパク質を得ることができる
。例えば、特表昭 62-501449、特開平 10—87815等を参考にしてもよい。
なお、タンパク質に結合するポリマー分子の数は、活性基、例えば、タンパク質分 子上に存在する反応基、例えばアミノ基、メルカプト基の数により変動する。また、タ ンパク質とポリマーを反応させる時の条件、例えば温度、 pH、タンパク質濃度等によ つても変動する。ここで得られるポリマーが結合したタンパク質は、ポリマーが結合し ていないタンパク質に比べて、半減期が長ぐ抗原性が少ないというメリットを有する 力 活性につ！、ては一般的に弱くなる場合が多 、。
上記のようにして得られたポリマーが結合したタンパク質に、メルカプト基を有する 化合物を反応させ、タンパク質のシスティン残基のメルカプト基にエステル結合した ポリマーを脱離させることにより、タンパク質のポリマー複合体を製造することができる メルカプト基を有する化合物は、遊離のメルカプト基を有する化合物であればよぐ 特に低分子化合物が好ましい。例えば、ジチオスレィトール、還元型ダルタチオン、 N—ァセチルー L—システィン、 2—メルカプトエタノール、ジチォエリスリトール、等が挙 げられ、特に、ジチオスレィトール、 2—メルカプトエタノールが好ましい。
使用するメルカプト基を有する化合物の量は、反応溶液の重量に対して 0. 01— 1 0重量％程度が好ましい。
メチォニナーゼ (methioninase)は、基質メチォニンを分解する酵素であり、抗腫瘍 活性を有することが知られている（例えば、 Kreis W. and Hession C, Cancer Res., 33, 1862-1865 (1973), Kreis W. and Hession C, Cancer Res., 33, 1866-1869 (1973) ) 0メチォニナーゼは 4つのサブユニットからなるホモテトラマー構造であり、各 サブユニットの分子量は約 43 kDaである。また、そのアミノ酸配列は、例えば配列番 号 1により示され、配列中には 10個のアミノ基 (N末端アミノ基も含む）と 4個のメルカ プト基を有している。
以下に、本発明の具体例として、メチォニナ一ゼのメトキシポリエチレングリコール によるポリマー複合体の製造方法を挙げる。まず、メトキシポリエチレングリコールのメ チォニナーゼへの結合方法を説明する。約 1, 000—約 20, 000、好ましくは約 2, 0 00—約 10, 000、そして最も好ましくは約 4, 000—約 6, 000ドルトンの平均分子量 を有するメトキシポリエチレングリコールを、無水コハク酸、好ましくは無水グルタル酸 を用いて、コハク酸ィ匕またはダルタル酸ィ匕する。続いて、好ましくは N—ヒドロキシスク シンイミドを用いて、活性化メトキシポリエチレングリコールを得る。最後に、活性化メト キシポリエチレングリコールをメチォニナーゼと反応させる。
[0012] 次に、メトキシポリエチレングリコールが結合したメチォニナーゼをメルカプト基を有 する化合物で処理する工程を説明する。メトキシポリエチレングリコールが結合したメ チォニナーゼ 1分子に対し、約 1一 200モル等量のメルカプト基を有する化合物を、 摂氏 4一 50度、好ましくは 10— 40度で反応させる。この時、反応溶媒としては、ァセ トニトリル、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキサイドなどを使用することも可能で ある。反応時間は、 10分一 4時間、好ましくは 30分一 2時間である。
得られた反応液から目的のメトキシポリエチレングリコールが結合したメチォニナ一 ゼを単離精製するには、タンパク質を精製する通常の方法 (例えば、モレキュラークロ 一-ング第 3版、 Cold Spring Harbor Laboratory, 2001年）が用いられる。すなわち 、沈殿、膜分離、カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、結晶化などが 用いられる。
[0013] メチォニナーゼに関し、ポリマーを結合させる前と後、メルカプト基を有する化合物 で処理する前と後の比較を行った。
まず、ポリマーを結合させる前のメチォニナーゼのメルカプト基数を測定した。理論 的には、 1サブユニット当たり 4個のメルカプト基が存在する力 実測値は、平均約 3. 7個 Zサブユニットであった。次に、ポリマーを結合させた後のメチォニナーゼのメル カプト基数を測定した。その結果、メルカプト基数は平均約 2. 7個 Zサブユニットで あった。 次に、メルカプト基を有する化合物で処理した後のメチォニナーゼのメルカプト基 数を測定した。その結果、メルカプト基数は平均約 3. 7個 Zサブユニットであった。 本方法により、タンパク質 1サブユニットあたり平均約 1分子 (例えば、 0. 7-1. 3分 子）のポリマーを脱離させることができる。これは、反応させる活性ィ匕ポリマーの量を、 メチォニナーゼに対して 30モル等量使用した場合も、 60モル等量使用した場合もほ ぼ同じであった。これらの結果から、ポリマーを結合させると、メチォニナーゼの 1サブ ユニット当たり 4個存在するメルカプト基のうち、平均 1個のメルカプト基がポリマーと エステル結合していたことがわかる。さらにポリマーが結合したメチォニナーゼをメル カプト基を有する化合物で処理すると、そのメルカプト基にエステル結合したポリマー が脱離することがわ力つた。このときメチォニナ一ゼのァミノ基にアミド結合して 、るポ リマーは脱離しな 、ことも確認した。
これらのことから、本発明の方法により得られるメチォニナーゼのポリマー複合体に は、メルカプト基にポリマーは結合していないといえる。実際、本方法により得られるメ チォニナーゼのポリマー複合体を、例えば Ellman法（Ellman G丄.,， Arch. Biochem. Biophys., 82, 70-77 (1959))により測定すると、 1サブユニットあたり平均 2. 8個以上、 好ましくは平均 3. 1個以上、さらに好ましくは平均 3. 5個以上の遊離のメルカプト基 を有する。
[0014] さらに、メチォニナーゼに関して、ポリマーを結合させる前と後、メルカプト基を有す る化合物で処理する前と後の比較を行った。詳細は後述の実施例で説明するが、ポ リエチレングリコールを結合させたメチォニナーゼをジチオスレィトール等で処理した 後の活性は、ジチオスレィトール等で処理する前の活性よりも約 1. 5— 4倍高い。酵 素の活性上昇は、例えばアミノ酸配列が配列番号 2で示されるパパインのポリマー複 合体、及び例えばアミノ酸配列が配列番号 3で示されるトランスダルタミナーゼのポリ マー複合体においても確認された。すなわち本方法は、メルカプト基を有する化合物 を反応させる前のポリマーが結合したタンパク質に比べて、タンパク質の機能を向上 させるものであると言える。ここでタンパク質の機能とは、酵素活性、レセプター活性 等を意味する。
[0015] なおメチォニナーゼに関し、そのアミノ酸配列の 116番目のシスティン残基が、活 性との関係で重要であることが示唆されている（Inoue H., et. al. J. Biochem., 117,
1120-1125 (1995)、 Nakayama T" et. al" Agric. Biol. Chem., 52, 177-183 (1988))。 上記の結果をこの報告と共に考えると、メチォニナーゼの 116番目のシスティン残基 にエステル結合したポリマー力 S、メルカプト基を有する化合物で処理することにより、 脱離した可能性が高いと言える。すなわち、本発明の方法により得られたメチォニナ ーゼのポリマー複合体は、 116番目のアミノ酸が遊離のメルカプト基である、メチォ- ナーゼのポリマー複合体力 なる組成物である可能性が高い。
[0016] 本発明の方法により得られるメチォニナーゼのポリマー複合体は、腫瘍細胞の増殖 を効果的に抑制することができ、結腸、乳房、前立線、卵巣、腎臓、咽頭、黒色腫、 肉腫、肺、脳、胃、膀胱等の癌の治療および Zまたは予防等に有用である。すなわ ち、本発明を使用して得られたメチォニナーゼのポリマー複合体を含有する抗腫瘍 剤は、抗原性が低いのみならず、高い活性を保持しており、医薬として有用である。
[0017] 本発明により得られたタンパク質のポリマー複合体を医薬として投与する場合、経 口的、非経口的のいずれの方法でも投与することができる。経口投与は常法に従つ て錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、丸剤、液剤、シロップ剤、ノ ッカル剤または舌下 剤等の通常用いられる剤型に調製して投与すればよい。非経口投与は、例えば筋 肉内投与、静脈内投与等の注射剤、坐剤、経皮吸収剤、吸入剤等、通常用いられる いずれの剤型でも好適に投与することができる。例えば、本発明の方法により得られ るメチォニナーゼのポリマー複合体は、点滴静注等に使用することができる。
[0018] 本発明により得られるタンパク質のポリマー複合体の有効量にその剤型に適した賦 形剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤等の各種医薬用添加剤とを必要に 応じて混合し医薬製剤とすることができる。注射剤の場合には適当な担体と共に滅 菌処理を行なって製剤とすればょ ヽ。
具体的には、賦形剤としては乳糖、白糖、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウムもし くは結晶セルロース等、結合剤としてはメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース 、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンもしくはポリビュルピロリドン等、崩壊剤として はカルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、デンプン、ァ ルギン酸ナトリウム、カンテン末もしくはラウリル硫酸ナトリウム等、滑沢剤としてはタル ク、ステアリン酸マグネシウムもしくはマクロゴール等が挙げられる。坐剤の基剤として はカカオ脂、マクロゴールもしくはメチルセルロース等を用いることができる。また、液剤 もしくは乳濁性、懸濁性の注射剤として調製する場合には通常使用されている溶解 補助剤、懸濁化剤、乳化剤、安定化剤、保存剤、等張剤等を適宜添加しても良ぐ経 口投与の場合には嬌味剤、芳香剤等を加えても良い。
例えば、本発明の方法により得られるメチォニナーゼのポリマー複合体は、凍結乾 燥して使用してもよい。
[0019] 本発明により得られるタンパク質のポリマー複合体の医薬としての投与量は、患者 の年齢、体重、疾病の種類や程度、投与経路等を考慮した上で設定することが望ま しいが、成人に経口投与する場合、通常 0. 05— 200mgZkgZ日であり、好ましく は 0. 1— lOOmgZkgZ日の範囲内である。非経口投与の場合には投与経路により 大きく異なる力 s、通常 0. 005— 20mgZkgZ曰であり、好ましくは 0. 01-10mg/k gZ日の範囲内である。これを 1日 1回一数回に分けて注射、もしくは点滴で投与す れば良い。なお、これらの投与量は、タンパク質の種類により異なる。従って、上記の 投与量の範囲外であっても使用することができる。
実施例 1
[0020] 以下に、タンパク質として組換えメチォニナーゼ（以下、 rMETaseと記載することもあ る）を使って、本発明を説明する。なお、本発明は実施例に限定されるものではない ジチオスレィトール（DTT)処理ポリエチレングリコール修飾組換えメチォニナーゼ（ PEG- rMETase)の製造法
(1) rMETase
特願平 9-270676に準じて実施取得した。
(2) rMETase濃縮 ·調整工程
約 170 gの rMETaseに 120 mMホウ酸ナトリウム緩衝液（pH 9.0)を 2倍量カ卩ぇ混合し た。次に分画分子量 10 kDa, 1.8 m2の膜を用いて 100 g/Lまで濃縮した。濃縮した 150 gの rMETaseを、 PEG修飾工程へ用いた。
(3) PEG修飾、 DTT処理工程 150 gの rMETaseに活性化 PEG (MEGC- 50HS、 日本油脂製） 275.4 gを 3回（91.8 g X 3)に分けて 37°C恒温下で 10— 15分毎に添カ卩した。 3回目の添加から 10— 15分反 応後に 100 mMりん酸水素-ナトリウム溶液で pHを 7.2に調整した。 DTTを 0.5%濃度 になるように添加し、 37°C恒温下で 2時間撹拌し、反応を行い、 15°Cで一夜保存した
(4) Diafiltration工程
得られた反応液を総量が 36.0 Lとなるように 50 mMりん酸ナトリウム緩衝液 pH 7.2を 加え混合した。 42 Lの 50 mMりん酸ナトリウム緩衝液 pH 7.2を 0.7 L/minの流速で添 加しながら分画分子量 50 kDa, 2.1 m2の膜を用いて Diafiltrationを行った。引き続き 約 3 Lになるまで濃縮を行った。 2 Lの 50 mMりん酸ナトリウム緩衝液 pH 7.2を用いて 膜内のタンパク質を回収し濃縮液と混合して Diafiltration処理液とした。
(5)イオン交換カラムクロマトグラフィー工程
50 mMりん酸ナトリウム緩衝液 pH 7.2で平衡化された DEAE Sepharose- FFカラム（ φ 140 X 65 mm, 1 L)に Diafiltration処理液を 50 cm/hの流速で送液し、 pass through 画分を取得した。溶出液に 50 mMりん酸ナトリウム緩衝液 pH 7.2を添加し 12.0 Lに調 整し、 0.2 μ m, 0.05 m2の膜でろ過して 15°Cで保存した。
(6)ゲル濾過工程
10 mMりん酸ナトリウム緩衝液 pH 8.0で平衡化された Sephacryl S200 HRカラム（ φ 600 X 600 mm, 170 L)にイオン交換カラムクロマトグラフィー溶出液を 11 cm/hの流速 で送液した。活性画分を集めて 30 kDa, 1.2 m2の膜を用いて濃縮を行った。約 1しの 10 mMりん酸ナトリウム緩衝液 pH 8.0を用いて膜内のタンパク質を回収し、さらに 10 mMりん酸ナトリウム緩衝液を添加しタンパク質濃度が約 40 g/Lになるよう調整した。
(7)ピリドキサ一ノレりん酸 (PLP)添加工程
濃縮液に 1 mM濃度に調製した PLP溶液を濃縮液量の 1/9量添加して混合後、滅菌 済み 0.22 μ m, 0.02 m2の膜を用いて約 200 mLずつ容量 250 mLのボトルに分注し- 80 °Cで保存した。
実施例 2
DTT処理が酵素活性に及ぼす影響 (rMETase) DTT処理を施して!/ヽな 、PEG— rMETaseおよび rMETase、 DTT処理を施した
PEG-rMETaseおよび rMETaseの比活性を測定した。活性測定は Takakuraらの方法（ Takakura T. et. al., Anal Biochem., 3 27, 233-240 (2004)に従って実施した。その結 果、表 1に示すように PEG修飾により酵素活性は低下した力 DTT処理を施すことに より回復した。一方、 rMETaseの酵素活性は DTT処理を施しても変化はな力つた。
[表 1] rMETase, PEG- METaseの酵素活性に及ぼす DTT処理の効果
比活性
DTT処理
(U/mg)
56
rMETase + 56
16
PEG-rMETase + 44
[0022] 次に、 MEGC-50HSとは分子量の異なる活性ィ匕 PEG (日本油脂製)を用いて反応モル 比 30で同様の実験を行った。その結果、表 2に示すように活性ィ匕 PEGの分子量が異 なっても PEG修飾により酵素活性は低下した力 DTT処理を施すことにより回復した。
[表 2] 異なる分子量の活性化 PEGで PEG修飾した rMETaseの酵素活性に及ぼす DTT処理の 効果
活性化 PEG 比活性
分子量 DTT処理 (U/mg)
33
MEGC-50HS 5 kDa + 45
32
MEGC-10TS 10 kDa + 47
33
MEGC-20TS 20 kDa + 47
[0023] さらに MEGC- 50HSと異なるリンカ一を含む他の活性化 PEG (MSPA5000, NEKTAR 製）と、異なる活性基を含む他の活性ィ匕 PEG (MENP-50H, 日本油脂製)を用いて反 応モル比 30で同様の実験を行った。その結果、表 3に示すように活性ィ匕 PEGのリンカ 一および活性基が異なっても PEG修飾により酵素活性は低下したが、 DTT処理を施 すことにより回復した。
[表 3] 異なるリンカ一 ·活性基を含む活性化 PEGで PEG修飾した rMETaseの酵素活性に及 ぽす DTT処理の効果
リンカー 活性基 DTT 比活性
処理 (U/mg)
33
MEGC-50HS Glutaryl NHS + 45
33
MSPA5000 Propionyl NHS + 38
10
MENP-50H Carbonyl Λ'ラニト□ 7ェ ル
+ 30 メチォニナーゼ以外のタンパク質と MEGC-50HSとの反応における DTT処理の効果 メチォニナーゼの場合と同様にパパイン (和光純薬製)を用いて PEG修飾反応と DTT 処理を行い、 DTT処理前後の比活性を比較した。ノパインの活性評価は 0.1 mM L- システィン、 2 mM EDTA'2Na、および 1 mM Ν- α -ベンゾィル - DL-アルギニン- p-二 トロア-リド塩酸塩を含む 50 mMトリス塩酸緩衝液中（pH 7.5)で反応を行い、 37°Cで 1分間に生成する トロア-リンの量を 410 nmでモニターし測定した。その結果、表 4に示すように PEG修飾によりパパインの酵素活性は低下した力 DTT処理を施すこ とにより回復した。
[表 4]
PEG修飾パパィンの酵素活性に及ぼす DTT処理の効果
相対比活性 (%)
Papain 100
PEG修飾反応液 42
DTT処理液 106
(2)トランスグルタミナーゼ（TGase)
放線菌 Streptomyces sp.を 2.0%ポリペプトン、 2.0%可溶性澱粉、 0.2%リン酸水素- カリウム、 0.1%硫酸マグネシウム、 0.1%酵母エキスよりなる培地 (pH 7.0)を用いて 30 °C、 3日間振とう培養した。遠心分離によって菌体を除去した後、 25 mMホウ酸ナトリ ゥム緩衝液 (pH 8.5)で透析して TGaseの粗酵素液を取得した。この粗酵素液 0.25mL に MEGC- 50HSを 4 mgを添カ卩して 25°Cで 1時間反応させた。反応液の最終濃度の 0.1%で DTT処理して、比活性を比較した。なお、酵素活性は Folk J.E. and Chung SI (MethodsEnzymoL, 113, 358-375 (1985))の方法に準じて測定した。その結果、表 5 に示すように PEG修飾により低下した酵素活性は DTT処理を施すことにより回復した
[表 5]
PEG修飾 TGaseの酵素活性に及ぼす DTT処理の効果
相対比活性 （％)
TGase 100
PEG修飾反応液 36
DTT処理液 70
(3)
以上のことから DTT処理による効果はメチォニナーゼに限定されたものではなぐそ の他のタンパク質や酵素、特にシスティン残基のメルカプト基が活性発現に重要な 役割を果たすタンパク質や酵素に幅広く適用できると言える。
実施例 3
DTTは下に示すようにメルカプト基と水酸基を保有する。
[化 2]
H OH HS-CH2― C— C― CH -SH
OH H
DTT処理による比活性上昇がメルカプト基と水酸基のいずれに起因するの力調べ た。メルカプト基を保有する化合物（ジチオスレィトール、還元型ダルタチオン、 N-ァ セチル -L-システィン、 2-メルカプトエタノール）、および水酸基を保有するアルコー ル（メタノール、エタノール、メトキシエタノール、 1-プロパノール、 2-プロパノール、 1- ブタノール、 2-ブタノール、 2-メチル -1-プロパノール）について、従来の方法で得ら れた PEG-rMETaseと反応させ、比活性を比較した。その結果、表 6に示すように、メ ルカプト基を保有する化合物と接触させた場合のみ比活性の回復が確認され、 DTT 処理による比活性上昇はメルカプト基に起因していることが示唆された。
[表 6] PEG-rMETaseの比活性回復に影響を及ぼす化合物
化合物 相対比活性
(%)
TV1 Acetyl L-cvsteine 79
Glutathione^元型) 55
2-Mercaptoethanoi 70
Dithiothreitol 100
Methanol 5
Ethanol 4
alethoxyethanol 4
1- Propanol 4
2- Propanol 4
1- Butanol 5
2- Butanol 1
2-Methyl- l-propanol 5
No addition 5
酵素溶液は DTTを含まない緩衝液を用いて調製 実施例 4
残存メルカプト基の定量
メチォニナーゼは 1サブユニットあたり 4個のメルカプト基を有して 、る。 PEG修飾反 応及び DTT処理に伴う rMETase中に存在する遊離したメルカプト基数の推移を、ドデ シル硫酸ナトリウム処理によりタンパク質を変性させた後 Ellman法（Ellman G丄.,， Arch. Biochem. Biophys., 82, 70-77 (1959))を用いて定量した。
(l) DTT処理 PEG- rMETase製造工程におけるメルカプト基数の推移
表 7に示すように活性化 PEG (MEGC-50HS)と反応させる前の rMETaseのメルカプト 基数は 3.7 SH/サブユニットあった力 PEG化反応で 2.7 SH/サブユニットとなり 1 SH/ サブユニットの減少が認められた。次に 0.5%DTTで処理後精製して取得した
PEG- rMETaseの残存メルカプト基数は 3.7 SH/サブユニットへ回復し、 rMETaseのメ ルカプト基数と同等の値となった。一方、 0.5%DTTで処理を行なわず精製して取得し た PEG- METaseの残存メルカプト基数は 3.0 SH/サブユニットであった。
(2)
これらの結果により PEGィ匕工程で平均して 1サブユニットあたり 1個のメルカプト基が活 性化 PEG(MEGC- 50HS)と反応する力 DTT処理によりメルカプト基に結合した PEG は脱離したと考えることができる。また、 DTT処理によって PEGが脱離したメルカプト 基は酵素活性に重大な影響を与える部位であると推測された。
[表 7] PEG-rMETase製造工程におけるメルカプト基数の推移
工程 SH/subunit
rMETase 3.7
PEG修飾反応液 2.7
PEG-METase
DTT処理 3.7
DTT未処理 3.0 実施例 5
[0027] モノョード酢酸 (MIA)を用いたシスティン残基（Cys)のメルカプト基修飾
rMETase, DTT処理 PEG- rMETase、及び DTT未処理 PEG- rMETaseをメルカプト基 修飾剤として知られている MIAと反応させた後、さらに DTT処理を施した。結果を表 8 に示す。 MIAでメルカプト基を修飾することで DTT未処理 PEG-rMETase、 DTT処理 PEG-rMETaseのいずれも比活性は大きく低下した。その後、 DTTを添カ卩して反応さ せた結果、 DTT未処理 PEG-rMETaseのみ比活性の上昇が認められた。これは、 DTT未処理 PEG-rMETaseの場合メルカプト基力PEGによって予め修飾されていたた め、 MIAによるメルカプトプト基修飾を受けず、 DTT処理を施すことによってメルカプト 基力も PEGが脱離し酵素の活性が上昇したものと思われる。
[表 8]
MIA処理を施した rMETase, DTT未処理 PEG-rMETase, DTT処理 PEG-rMETaseの 比活性に及ぼす DTT処理の影響
比活性 （U/mg)
DTT未処理 DTT処理
rMETase PEG-rMETase PEG-rMETase
MIA反応刖 54 17 38
MIA反応後 2.4 3.8 4.0
DTT処理 2.7 12 4.6
[0028] 実施例 4及び 5の結果より、以下のことがわかる。すなわち、 rMETaseは活性ィ匕 PEG と反応させることでその比活性は大きく低下するが、 DTT処理を施すことで回復した。 rMETaseの 1サブユニット中に存在する 4個の Cysのうち N末端より 116番目に存在す る Cysが活性発現に関与する重要因子であるとの報告（Inoue H., et. al. J. Biochem., 117, 1120-1125 (1995)、 Nakayama T.， et. al., Agric. Biol. Chem., 52, 177-183 (1988))もあることから PEGは、この活性発現に関与する Cysを選択的に修飾し、また DTTは、その Cys結合 PEGのみを脱離させていることが推測された。 Cysへの PEG修 飾の可能性に関して検討した結果、 DTT以外のメルカプト基含有化合物でも比活性 の上昇が認められた。
rMETaseのメルカプト基数は 3.7 SH/サブユニットであった力 PEG修飾反応で 2.7 SH/サブユニットに低下した。その後、 DTT処理を施すことによって 3.7 SH/サブュ- ットに回復した。また MIAによりメルカプト基を修飾することで比活性は大きく低下した が、 DTT処理を施すことにより DTT未処理 PEG-rMETaseのみ比活性が上昇した。 以上の結果より、活性化 PEG (MEGC- 50HS)は rMETase中の活性発現に重要な役 割を果たすメルカプト基 (Cys)を修飾すると結論できる。
実施例 6
[0029] PEG- rMETaseの結合 PEG数の定量（MALDI- TOF/MS)
DTT未処理 PEG- rMETaseおよび DTT処理 PEG- rMETaseのサブユニットレベルで の分子質量を MALDI-TOF/MSで分析した。その結果、図 1に示すように DTT未処理 PEG-rMETaseに対して DTT処理 PEG-rMETaseは分子量が約 5 kDa低下して!/、るこ とが判った。 PEGの分子量が約 5 kDaであること力も DTT処理により 1 PEG/サブュ- ットが脱離したことが考えられた。
実施例 7
[0030] PEG- rMETaseの結合 PEG数の定量（HPLC)
DTT未処理 PEG- rMETase、 DTT処理 PEG- rMETaseの結合 PEG数を測定した（ Bullock J., et.al, Anal. Biochem.,, 254, 254-262 (1997)) 0アルカリ加水分解により 遊離した PEGを PEG4120 (Polymer Laboratories製）を標準とし HPLCを用いて定量し た。その結果、表 9に示すように DTT未処理 PEG- rMETaseの結合 PEG数は 8.4 PEG/ サブユニットであつたのに対して、 DTT処理 PEG- rMETaseの結合 PEG数は 7.5 PEG/ サブユニットであり、約 1 PEG/サブユニットの低下が認められた。また、反応モル比 30 で PEG修飾した PEG-rMETaseの場合も同様に、 DTT処理によって結合 PEG数は約 1 PEG/サブユニット低下して ヽた。
[表 9] PEG-rMETaseの DTT処理に伴う結合 PEG数の変化
PEG-rMETase 反応モル比 60 反応モル比 30
DTT処理 PEG/subunit PEG/subunit
8.4 5.0
+ 7.5 4.1 実施例 8
[0031] アミノ基修飾率の測定 (蛍光検出法）
Fluorescamineを用いた蛍光検出法（Karr L.J., et.al.,Meth. EnzymoL, 228, 377-390 (1994))により DTT未処理 PEG- rMETase、および DTT処理 PEG - rMETase のァミノ基修飾率を rMETaseを対象として測定した。その結果、表 10に示すよう〖こ DTT処理の有無に関わらずアミノ基修飾率はほぼ同等であった。従ってァミノ基に結 合した PEGは DTT処理に伴う脱離は生じないことを確認した。
[表 10]
PEG-rMETaseの DTT処理に伴うァミノ基修飾率の変化
PEG-rMETase 修飾率
DTT処理 (%)
75
+ 74
[0032] DTT処理を施した結果、 PEG-rMETaseは 1サブユニットあたりメルカプト基数は約 1 SH基の増加、約 1 PEG分子に相当する分子質量の減少、および約 1 PEG分子に相 当する結合 PEG数の低下が認められた。し力しながらアミノ基修飾率は不変であった 。これらのことより、 DTT処理を行うことでメルカプト基に修飾したサブユニットあたり平 均 1分子の PEGを脱離することができたと結論できる。
[0033] 以上のこと力も PEG修飾工程において、 PEGはメチォニナーゼの活性発現に重要 な役割を果たす Cysと不安定なチォエステル結合を形成して比活性を低下させるが、 DTT処理を施すことにより交換反応が起こり、メルカプト基の回復した PEG-rMETase が生じると考えられる。
実施例 9
[0034] 反応モル比 60で調製された DTT処理 PEG- rMETaseと DTT未処理 PEG- rMETaseを 同一タンパク質量（140 mg/kg)マウス尾静脈に注射した (各群 3匹)。経時的に採血し 、血漿中のメチォニン濃度を測定した (Jones B.N. and Gilligan J.P., J. Chromatogr. 266, 471-482 (1983))。結果を図 2に示す。 DTT処理 PEG-rMETase(〇）は DTT未処 理 PEG-rMETase (口）と比較して血漿中のメチォニン濃度を長期間低レベルに維持 し、 DTT処理の効果を in vivoで確認することができた。さら〖こ、 PLP溶液を含有したポ ンプをマウス皮下に移植して同様の実験を行った場合の結果を図 3に示す。 DTT処 理 PEG-rMETase (參）は DTT未処理 PEG-rMETase (國）と比較して血漿中のメチォ二 ン濃度を長期間低レベルに維持することができた。 DTT処理を施すことにより、治療 に必要な投与量の低減が可能と想定された。
実施例 10
反応モル比 60で調製された DTT処理 PEG-rMETaseと rMETaseの抗原性を比較した 。マウスに DTT処理 PEG-rMETaseまたは rMETaseを 0.1 mg/匹の用量で 1週間に 1回 、合計 12回腹腔内投与し、最終投与後 2週間目に採血し血清を得た (各群 10匹)。抗 原性は酵素免疫測定法を用いて測定した。 rMETaseをポリスチレン製プレートのゥェ ルに固定ィ匕し、ブロッキング、洗浄した。希釈した血清をゥエルに添加、洗浄した後、 パーォキシダーゼ標識したマウス抗 IgM抗体または抗 IgG抗体を添加した。 DTT処理 PEG-rMETaseまたは rMETaseを投与して!/ヽな 、マウス血清をコントロールとして用い 、力価を測定した。各血清希釈倍率における個体数を表 11に示した。 DTT処理 PEG- rMETaseの抗原性は rMETaseよりも大幅に低下していた。
[表 11] rMETaseと DTT処理 PEG-rMETaseの抗体化の比較
抗体クラス 抗原 希釈倍率 (Log)
0 1 2 3 4 5 6 7
Ig M rMETase 0 0 3 6 1 0 -
DTT処理 PEG-rMETase 8 0 1 1 0 0 -
Ig G rMETase 0 0 0 0 4 4 2 0
DTT処理 PEG-rMETase 0 0 6 1 1 2 0 0

Claims

請求の範囲
[I] ポリマーが結合したタンパク質にメルカプト基を有する化合物を反応させ、該タンパク 質のシスティン残基のメルカプト基にエステル結合しているポリマーを脱離する工程 を含む、タンパク質のポリマー複合体の製造方法。
[2] ポリマーが結合した該タンパク質が、システィン残基を有するタンパク質に活性ィ匕ポリ マーを反応させて得られたものである、請求項 1記載の方法。
[3] 該ポリマーがポリアルキレンォキシドである、請求項 1記載の方法。
[4] 該ポリマーがポリエチレングリコールである、請求項 3記載の方法。
[5] 該メルカプト基を有する化合物が、ジチオスレィトール、ジチォエリスリトール、 2—メル カプトエタノール、還元型グルタチオン又は N ァセチルー L システィンの!/ヽずれか である、請求項 1記載の方法。
[6] 該メルカプト基を有する化合物が、ジチオスレィトール又は 2 メルカプトエタノールで ある、請求項 1記載の方法。
[7] 該タンパク質が酵素である請求項 1記載の方法。
[8] 該酵素がその活性発現に影響を与える部位ににシスティン残基を含むものである、 請求項 7記載の方法。
[9] 該酵素がメチォニナーゼ、ノ パインまたはトランスダルタミナーゼである請求項 8記載 の方法。
[10] タンパク質 1サブユニットあたり平均 0. 7-1. 3分子のポリマーを脱離するものである 、請求項 1記載の方法。
[II] 請求項 1一 10のいずれかに記載の方法で得られる、タンパク質のポリマー複合体。
[12] 該ポリマー複合体がメチォニナーゼ、パパインまたはトランスグルタミナ一ゼのポリエ チレングリコール複合体である請求項 1記載の方法。
[13] 請求項 12記載の方法で得られる、メチォニナーゼ、パパインまたはトランスグルタミナ ーゼのポリエチレングリコール複合体。
[14] 1サブユニットあたり平均 3. 1個以上の遊離のメルカプト基を有するものである、メチ ォニナーゼのポリマー複合体。
[15] 請求項 13または 14に記載のメチォニナーゼのポリマー複合体を含有する抗腫瘍剤 [16] ポリマーが結合したタンパク質にメルカプト基を有する化合物を反応させることを特徴 とする、該タンパク質のシスティン残基のメルカプト基にエステル結合したポリマーの 脱離方法。
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