JPH11192084A - 血液中の酵素活性の安定化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】本発明の目的は、血液試料中の酵素活性の安定
化に有る。特にリンパ球中に多く含まれる２’−５’オ
リゴアデニル酸合成酵素（２−５ＡＳ）の安定化を目的
とする。 【構成】本発明は、血液試料に還元剤を共存させること
によって達成される。還元剤としては２−メルカプトエ
タノール（２ＭＥ）が例示され、２ＭＥを含有するＨＥ
ＰＥＳ緩衝液を酵素活性安定化剤として使用する。 【効果】本発明は、均質化した血液試料中の酵素活性を
高度に安定化する。例えば、２−５ＡＳ活性を４℃保存
でも少なくとも７日間に亘って安定に維持する。この技
術は血球成分に由来する酵素の安定化に有用であり、病
態との関連をダイレクトに示す血球成分中の酵素活性を
安定化し、試料の保存を容易としたので血球中酵素の測
定系の発展に貢献すると考えられる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、血液中の酵素活性の安
定化に関するもので、血球成分に含まれる酵素の安定化
に関する。特にリンパ球中に多く含まれる２’−５’オ
リゴアデニル酸合成酵素（以下２−５ＡＳと略す）や赤
血球に多く含まれるアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）
等の血球中に含まれる酵素の溶血させて均質化した血液
中での酵素活性の安定化に関する。

【０００２】２−５ＡＳは、リンパ球等においてインタ
ーフェロン（ＩＦＮ）により誘導される酵素であり、Ｂ
型肝炎Ｃ型肝炎等のＩＦＮ治療の有効な患者ではその上
昇率も高いとされている。この２−５ＡＳは、２本鎖Ｒ
ＮＡ（以下ｄｓＲＮＡと省略する）の存在下でアデノシ
ン３リン酸（以下ＡＴＰと省略する）を基質としてアデ
ニル酸を（２’−５’）ホスホジエステル結合で重合
し、２’−５’オリゴアデニル酸（以下２−５Ａと省略
する）を産生する活性を持っている［１］。

【０００３】

【化１】

【０００４】２−５ＡＳに合成された２−５Ａの役割
は、ウイルスのｍＲＮＡのキャップ形成の阻止、細胞制
御、細胞の分化などに関係があり、２−５Ａが細胞内に
誘導された場合には、タンパク質合成やウイルスの複製
が阻止される。以上の生体防御の機序を利用し、２−５
ＡＳ活性値を各種微生物（ウイルス、細菌、マイコプラ
ズマ等）の感染やインターフェロン治療効果の指標とで
きることが確認された。現在では既に放射免疫測定法
（以下ＲＩＡと省略する）を利用した２−５ＡＳ活性の
測定用キットも市販されている。

【０００５】アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）はプリ
ン体の分解と再利用に関る酵素で、アデノシンのアミノ
基を加水分解し、イノシンとアンモニアを精製する酵素
で、血清中のみならず赤血球やリンパ球にも存在するこ
とが知られている。また肝疾患、悪性腫瘍、白血病、痛
風等でＡＤＡ活性が上昇することが知られている。

【０００６】またその他にも血球成分に含まれる酵素と
しては、ラクテートデヒドロゲナーゼ、イソクエン酸デ
ヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、β−グル
クロニダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、アデニレ
ートキナーゼ、アルドラーゼ、ピルビン酸キナーゼ、酸
性ホスファターゼ、リゾチームなど、多数が知られてお
り、それぞれ病態との関連が研究されている。

【０００７】

【従来技術の問題点】２−５ＡＳやＡＤＡは本来細胞内
酵素であり、現在測定されている血清中のそれらの酵素
活性は血球成分や組織の破壊の過程で細胞から漏れ出た
酵素の活性を測定していると考えられている。特に２−
５ＡＳは非常に不安定な酵素で、血清中の２−５ＡＳ活
性は、採血条件や保存条件の影響を大きく受けるとされ
ている。そのため、血液中のリンパ球を分離してその中
の２−５ＡＳ活性を測定する方が実際の臨床症状と相関
性が高いといわれている［２］［３］。

【０００８】確かに、血液中のリンパ球を単離し、直接
リンパ球内の２−５ＡＳ活性を測定する方がＩＦＮなど
の影響、治療効果をすばやく捉えられると考えられる。
しかし、血液中のリンパ球を分離して酵素を抽出するに
は煩雑な操作とかなりの時間が必要となり、臨床検査と
して多数の検体を取り扱うには不適当である。それ故、
より簡便な測定法として、溶血させた血液試料中の２−
５ＡＳ活性の測定の検討が行われている［４］［５］。
この方法は血液を凍結融解もしくは物理的刺激により溶
血させ、イーグルＭＥＭ培地で３０倍に希釈し、その２
−５ＡＳ活性を市販の２−５ＡＳ活性測定ＲＩＡキット
で測定するものである。それによると血液試料中の２−
５ＡＳ活性は血清中の活性の５０〜１００倍高値を示
し、また特にＩＦＮ治療中の患者で非常に高い活性を示
し、ＩＦＮ治療のマーカーとしての有用性が示唆されて
いる。

【０００９】しかしながら全血血液中の２−５ＡＳの活
性は、血清中よりも安定ではあるが、それでも、冷所２
４時間保存で約８０％、冷所４８時間保存で５０〜７０
％に低下し、実際の臨床検査の場で使用するには安定性
が不足している。そのため上記文献では全血血液は使用
時まで−８０℃で保存し、使用時に凍結融解により溶血
し血液試料を調製し、調製した血液試料中の２−５ＡＳ
活性を測定している。なお以下にイーグルＭＥＭ培地の
組成を次に示す。これは還元剤や緩衝成分を含むもので
はない。

【００１０】イーグルＭＥＭ培地組成：（単位：mg/L） L-Arginine-HCl 126.0 L-Cystine-Na₂ 28.4 L-Glutamine 292.3 L-Histidine-HCl/H₂O 41.9 L-Isoleucine 52.5 L-Leucine 52.5 L-Lysine/HCl 73.1 L-Methionine 14.9 L-Phenylalanine 33.0 L-Threonine 47.6 L-Tryptophan 10.2 L-Tyrosine 36.2 L-Valine 46.9 CaCl₂ 200.0 KCl 400.0 MgSO₄ 97.7 NaCl 6800.0 NaHCO₃ 2000.0 NaH₂PO₄/H₂O 140.0 Choline Chloride 1.0 D-Ca Panthotenate 1.0 Folic Acid 1.0 i-Inositol 2.0 Nicotinamide 1.0 Pyridoxal/HCl 1.0 Riboflavin 0.1 Thiamin/HCl 1.0 Dextrose 1000.0 Phenol Red/Na 17.0

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】現在、血中２−５ＡＳ
活性測定は血清試料を用いる方法がほとんどであるが、
血球成分から漏出した一部分の酵素の活性を測定してい
るに過ぎず、また安定性に関しても血清試料は経時的に
急激に活性を失う。これに対し血球成分を破壊し均質化
して均一な溶液状態とした血液試料を用いることによ
り、より直接的に潜在する２−５ＡＳ酵素活性の絶対量
を測定することができるようになった。しかし血液試料
中の２−５ＡＳ活性の安定性に関しては、未だ不満があ
り、実際の臨床検査の場で用いるには安定性が不足して
いる。本発明の目的は、全血試料中の酵素活性の安定化
に有る。特に均質化した血液試料中の血球成分に含まれ
る酵素を通常の冷蔵庫等で保存可能とし、実際の臨床検
査の場で使用できるように安定化する技術を提供するこ
とが本発明の課題である。特に均質化した血液中の２−
５ＡＳ活性を安定性することを目的とする。

【００１２】精製した酵素の安定化に還元剤やＳＨ化合
物が有効であることが知られていた。例えばウリカーゼ
の安定化にアスコルビン酸等の還元剤を用いる方法
［６］、ＳＨ化合物で精製ウレアーゼを安定化する方法
［７］［８］、ＳＨ化合物でＬＤＨ、ＭＤＨ、ＨＫ、Ｇ
６ＰＤＨを含有する試薬を安定化する方法［９］［１
０］［１１］［１２］が知られていた。しかし、これら
の方法は精製酵素の安定化法であり、またＧＯＴ、ＧＰ
Ｔ、グルコース測定用試薬の安定化法であり、還元剤
（ＳＨ化合物）やその他の成分で目的とする酵素や測定
用試薬の安定化を達成している。これらの報告中には全
血中の酵素活性の安定化に還元剤が有効であるとはまっ
たく記載されておらず、その示唆すらもない。

【００１３】

【問題を解決するための手段】本発明の課題は、血液に
還元剤を共存させることによって達成される。ここで活
性を安定化すべき酵素とは、血球成分に由来するもの、
白血球または赤血球に由来するもの、特にリンパ球に由
来するものである。リンパ球に由来する酵素としては例
えば２−５ＡＳが挙げられ、赤血球由来の酵素の例とし
ては、ＡＤＡが挙げられる。また血液中に共存させる還
元剤としては、例えば２−メルカプトエタノール（２Ｍ
Ｅ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、システインが例
示され、その中でも２−メルカプトエタノール（２Ｍ
Ｅ）が本発明には好ましい。これらの還元剤は単独で用
いても、また複数を組み合わせても良い。その濃度は血
液に対して５〜１００ｍＭで用いることが好ましい。ま
た、本発明の還元剤は、均質化の有無に関わりなく全血
中の酵素活性を安定化するが、酵素活性の測定が均質化
された血液試料を検体として行われるので、血液は還元
剤を加えた均質化血液試料として測定時まで保存するの
が望ましい。

【００１４】また本発明は、次の工程ａ）−ｄ）を含む
血液中の２−５ＡＳの活性測定方法を提供する。 ａ）採取した血液を還元剤を含む希釈液で希釈する工程 ｂ）希釈した血液中の血球成分を破壊して均質化する工
程 ｃ）２’−５’オリゴアデニル酸合成酵素の基質を与え
て酵素反応を行う工程 ｄ）酵素反応の結果生じる変化を観察する工程

【００１５】本発明の測定方法において、まず血液は抗
凝固剤を含んだ採血管で採血される。抗凝固剤として
は、ヘパリン、ＥＤＴＡ（及びその塩）、クエン酸ナト
リウム、フッ化ナトリウム、シュウ酸ナトリウムなどの
一般的な抗凝固剤が使用可能であり、その中でもヘパリ
ンやＥＤＴＡ−２Ｎａが用いられる。次いで工程ａ）で
血液は希釈される。この時用いる採取した血液を希釈す
る希釈液は、ヒトの２−５ＡＳがｐＨ７．０〜８．０、
好ましくはｐＨ７．５〜７．８で最大の活性を示すとさ
れているので、この範囲のｐＨを与える緩衝液が好まし
い。具体的には、還元剤を含んだ１〜１００ｍＭ、好ま
しくは５〜３０ｍＭのＨＥＰＥＳ(2-[4-(2-hydroxyethy
l)-1-piperazyl] ethansulfonic acid)緩衝液を示すこ
とができる。また希釈の倍数は１０倍程度が適当であ
る。

【００１６】ついで工程ｂ）において希釈した血液中の
血球成分を破壊して均質化する。血球成分の破壊均質化
は、凍結融解、溶血剤の添加、超音波破砕、あるいは機
械的刺激による溶血といった一般的な手段により達成さ
れる。溶血剤としてはサポニン、Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４
０等の界面活性剤等を含ませて低浸透圧とした溶血剤を
使用する。またピペット等で強く撹拌したり、超音波に
よる機械的刺激で溶血しても良い。しかし、界面活性剤
によっては酵素反応を阻害するものもあり、血球成分中
の酵素によっては機械的な刺激に弱いものも存在するの
で、活性を安定化すべき酵素によって、溶血方法は選択
される。凍結融解による溶血方法は一般的であり、酵素
に対するダメージが少ない方法の一つと考えられてい
る。本発明において溶血方法は、凍結融解を２回または
３回繰り返すことが好ましい。凍結は例えばドライアイ
ス−アルコール混液で−８０℃程度に急速冷却・凍結
し、溶解は２０〜４０℃程度の温浴で急速融解すると速
やかに均質化される。この方法によって均質化された還
元剤を含む血液試料は冷蔵庫程度の冷所における保存で
も十分安定である。なおこの操作によってリンパ球のみ
ならず赤血球も破壊され着色するが、最終的な酵素反応
生成物の測定に着色やヘモグロビンによる酵素的な触媒
活性による影響の無い限り問題となることはない。

【００１７】なお、上述の均質化した血液試料の作成は
工程ａ）ｂ）の順番を逆とした工程 ａ’）採取した血液中の血球成分を破壊して均質化する
工程 ｂ’）均質化した血液を還元剤を含む希釈液で希釈する
工程 によっても達成される。要するに均質化し希釈された血
液試料中に還元剤が含まれていることが重要であるの
で、工程ａ）ｂ）及びａ’）ｂ’）の順番は問わず、ど
ちらの工程を選択しても作成された血液試料は冷所保存
で充分安定となる。また上述の工程では還元剤を含んだ
希釈液を用いているが、還元剤を単独で用い、均質化し
希釈した血液試料中に別途加えても良い。

【００１８】次いで、工程ｃ）において２−５ＡＳの基
質ＡＴＰを与えて酵素反応を行う。２−５ＡＳは酵素活
性の発現に当たってＭｇ²⁺のような２価の金属イオンを
要求する。したがって工程ｃ）を行うためには、２−５
ＡＳの活性を十分に維持するためにこれら２価の金属イ
オンを供給しておく必要がある。Ｍｇ²⁺は酢酸マグネシ
ウムのような塩として添加すると良い。またその使用濃
度は、反応液中で０．５〜５０ｍＭ、好ましくは３〜１
０ｍＭ程度を例示することができる。

【００１９】また２−５ＡＳによる酵素反応は、２０−
５０℃の温和な温度条件の下で行うことが好ましい。特
に好ましい温度は３０−４０℃である。また２−５ＡＳ
はＳＨ酵素であるため、２ＭＥやＤＴＴのようなＳＨ保
護剤の共存下で反応を行うと良い。これらの保護剤は本
発明の安定化剤として試料中に既に加えられているが、
酵素反応時にさらに添加することによって、酵素反応時
の失活を抑えることができる。さらに酵素反応時の失活
を抑えるために、１０〜５０％程度のグリセロールの添
加が有効であることが知られている。また２−５ＡＳの
酵素活性を十分に発現させるために適当な塩濃度を与え
るのが好ましい。たとえば塩としてＫ塩やＮａ塩を用い
る場合、反応液中で２０〜１００ｍＭ、好ましくは３０
〜６０ｍＭの塩濃度が好適である。

【００２０】次いで、工程ｄ）酵素反応の結果生じる変
化を観察する工程に移る。つまり、工程ｃ）において生
成する２−５Ａ、ピロリン酸（ＰＰｉ）、あるいは消費
されるＡＴＰ等を測定し、血液試料中の２−５ＡＳの活
性を決定する工程である。工程ｃ）で２−５ＡＳの酵素
反応に必要な条件を与えれば、２−５ＡＳに触媒される
反応は酵素活性に律速され、その反応生成物の量は酵素
活性に左右される。このような好適な条件を与えれば反
応生成物（または消費される物質）の量を指標として酵
素活性を決定することができ、これらの反応生成物の量
や濃度はそのまま酵素活性の指標とする事ができる。予
め２−５ＡＳ酵素の蛋白量と酵素反応生成物の生成速度
について検定した標準を用いれば、この標準を基に酵素
活性単位として捉えることも可能である。酵素活性の指
標となる反応生成物としては、２−５Ａ、そしてピロリ
ン酸を挙げることができる。各生成物の測定方法を以下
に具体的に述べる。

【００２１】２−５Ａの測定法：２−５Ａは、酵素、発
光物質、蛍光物質、ＲＩといった公知の標識技術を利用
した免疫測定法によって測定することができる。特に
¹²⁵Ｉ標識を用いたＲＩＡ法［１３］は高い感度を簡単
な操作で達成することができるので、本発明における好
ましい態様として挙げられる。この他に³²Ｐによる標識
抗原を用いる方法［１４］［１５］も公知であるが、感
度や半減期を考慮すると¹²⁵Ｉの方が有利である。また
本出願人も従来のＲＩＡ法を改良した２−５Ａ測定法を
開発し、既に特許出願している［１６］。

【００２２】ピロリン酸の測定法：ＡＴＰを重合して２
−５Ａとする時に副産物として生成するのがピロリン酸
（ＰＰｉ）である。したがってピロリン酸は定量的に生
成し、酵素活性の指標とすることが可能である。ピロリ
ン酸の測定にはさまざまな方法が知られているが、高い
感度の期待できる生物発光反応に基づく測定法が有利で
ある。このような測定法として、細胞培養物の２−５Ａ
活性をピロリン酸の酵素的な測定系の応用により、吸光
度測定した報告が有る［１７］。反応原理は次の反応式
によって示すとおりである。このような酵素的な反応を
ピロリン酸の測定法として本発明に応用することができ
る。酵素的な反応ではＲＩ標識物質を使わないで測定系
を構成できるので、設備面では有利であるが、ＲＩＡに
匹敵する感度を達成するには発光増強剤などとの組み合
わせが必要な場合も有る。

【００２３】

【化２】

【００２４】ＡＴＰの測定法：ＡＴＰは２−５ＡＳ活性
の発現に伴って定量的に消費される物質である。したが
って２−５ＡＳによる酵素反応の前後でＡＴＰ濃度を測
定して差を求めれば、原理的には２−５ＡＳ活性の指標
とすることができる。ＡＴＰは一般的な蛍光法で測定し
ても良いが、２−５ＡＳ活性測定には高感度が要求され
るので、ルミノール等を用いる化学発光法や、ルシフェ
ラーゼ等を用いる生物発光法で測定するのが好ましい。

【００２５】また、本発明は還元剤を含む血液試料中の
２’−５’オリゴアデニル酸合成酵素活性安定化剤を提
供する。例えば還元剤として２ＭＥを適当な緩衝液、例
えばＨＥＰＥＳに溶解し、安定化剤として使用すること
ができる。実際には、２ＭＥとＨＥＰＥＳ緩衝液を要時
に混合し、２−５ＡＳ酵素活性安定化剤とする。また先
に２ＭＥ−ＨＥＰＥＳ液を用意しておいて採取した血液
に加えてもよい。更に一歩進めて採血管に、抗凝固剤と
ともに入れておき、採血後直ちに均質化処理を行う２−
５ＡＳ活性測定用採血管としてもよい。

【００２６】より具体的には、２−メルカプトエタノー
ルを５〜１００ｍＭ、酢酸マグネシウムを０．５〜５０
ｍＭ、塩化カリウムを２０〜１００ｍＭ、グリセロール
を１０〜５０％含有する１〜１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩
衝液（ｐＨ７〜８）よりなる処方の血液試料中の２−５
ＡＳ酵素活性安定化剤とする。必要に応じてアジ化ナト
リウムのような防腐剤を加えても良い。

【００２７】さらに具体的には本発明の２−５ＡＳ酵素
活性安定化方法を利用した、２−５ＡＳ活性測定は次の
ような手順で行われる。 《血液の採取》ＥＤＴＡ−２Ｎａ、ヘパリンなど一般的
な抗凝固剤含有採血管などを使用して、血液を採取す
る。 《血液試料の調製》採取血液を十分に抗凝固剤と混和し
た後、酵素活性安定化剤９００μｌ（１０ｍＭ ２Ｍ
Ｅ、３ｍＭ 酢酸マグネシウム、５０ｍＭ ＫＣｌ、２５
％ グリセリンを含む１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液）があ
らかじめ分注してある試験管に血液１００μｌを添加
し、十分に混和する。−８０℃の超低温漕中、またはド
ライアイスをメタノールに加えた急速冷媒中で凍結さ
せ、十分に凍結した後、水浴中で溶解する。この凍結融
解を２〜３回繰り返し、血球を破砕し、均質化された試
料、つまり血液試料が調製される。本発明の酵素活性安
定化剤により、血液は１０倍に希釈された状態で調製さ
れ、均質化血液試料となる。なお、当酵素活性測定時に
用いる測定系は希釈直線性に優れたものであるので、更
なる希釈が必要な高値試料は生理食塩水など適当な希釈
溶媒を用いて測定時に適宜希釈を行えばよい。 《２−５Ａ合成酵素活性測定方法》上記のように調製し
た血液試料５０μｌ、酵素活性賦活剤ｐｏｌｙ（Ｉ）ｐ
ｏｌｙ（Ｃ）溶液試薬２００μｌ、基質ＡＴＰ溶液２０
０μｌを一つの試験管内で混和し、３７度の温浴中で３
０分間反応を遂行させる。この反応で、試料中の当酵素
の触媒活性により基質ＡＴＰが重合し、２−５Ａが生成
する。酵素反応終了後、¹²⁵Ｉ標識２−５Ａ溶液２００
μｌ、抗２−５Ａ抗血清溶液試薬２００μｌを混和し、
３７℃の温浴中で１時間反応させる。反応終了後、遠心
分離によってＢ／Ｆ分離を行い、上清中の未反応分画を
吸引除去する。以上のような操作手順によって得られた
各反応チューブの放射線量をガンマカウンターで測定す
る。この測定操作によって生成された２−５Ａの量を標
準曲線から算定する。

【００２８】

【作用】本発明における還元剤の正確な作用機序は不明
である。しかし、本来細胞内酵素である２−５ＡＳは、
血清中に単独で存在するよりも、血球成分とともに存在
する均質化した血液試料中の方が安定性は高い。しかし
それでも空気中の酸素といった酸化成分による酸化を受
けて失活するものと考えられ、２ＭＥ等の還元剤はその
酸化反応を防止するものと推定される。

【００２９】

【発明の効果】現在、血清試料を用いて測定されている
血中２−５ＡＳ活性は、血球成分から漏出した一部分の
酵素の活性を測定しているに過ぎず、また安定性に関し
ても血清試料は経時的に急激に活性を失う。これに対し
全血血液の血球成分を破壊し均質化して均一な溶液状態
とした血液試料は、より直接的に潜在する２−５ＡＳ酵
素活性の絶対量を測定することができる。しかし全血試
料は、実際の臨床検査の場では−８０℃で保存されてい
るが、それでも安定性が不足しており、−８０℃で保存
しても酵素活性は経時的に低下する。それ故、２−５Ａ
Ｓ活性を安定化する方法が望まれていた。本発明は、全
血血液を適当な緩衝液中で均質化した血液試料中に還元
剤を共存させることにより、血液試料中の酵素活性を安
定化した。具体的には、２ＭＥを含むＨＥＰＥＳ緩衝液
中で全血血液を均質化することにより、２−５ＡＳ活性
を４℃保存でも少なくとも７日間にわたって安定に維持
することを可能とした。また高価なディープフリーザー
の使用も不要とした。この技術は血球成分に由来する酵
素の安定化に有用であり、病態との関連をダイレクトに
示す血球成分中の酵素活性を安定化し、試料の保存を容
易としたので血球中酵素の測定系の発展に貢献すると考
えられる。

【００３０】

【実施例】以下、実施例に基づき本発明を詳細に説明す
るが、本発明はこれに限定されるものではない。本発明
において２−５ＡＳ活性測定は、酵素反応により生成し
た２−５Ａを二抗体ＲＩＡ法で測る方法を採用した［１
６］。測定操作フローを図１に示した。また得られた検
量線を図２に示した。２−５ＡＳ酵素活性は生成した２
−５Ａの濃度（ｐｍｏｌ／ｄｌ）で表わされる。

【００３１】参考例 −２０℃で凍結保存した全血血液
の安定性 −２０℃で１週間凍結保存した全血血液中の２−５ＡＳ
活性の安定性を、−８０℃で一週間保存した全血血液中
の２−５ＡＳ活性と比較。 操作：ヘパリン採血した血液を−２０℃及び−８０℃で
７日間凍結保存し、酵素活性測定直前に融解し、均質化
した血液試料の活性を測定した。試料の希釈は生理食塩
水で行った。結果を表１に示す。表１に示すように、２
−５ＡＳは不安定な酵素であり、−２０℃で凍結保存し
ても全血血液中の２−５ＡＳは、−８０℃保存の血液と
比較して、血液によっては４０％以上失活した。

【００３２】

【表１】

【００３３】実施例１ 血液試料の調製法（希釈溶媒の
選択） 血液試料の調製に用いる希釈溶媒の選択を行った。ヘパ
リン採血した血液を、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、生理食塩
水、精製水、ＭＥＭ、及び１０ｍＭ ２ＭＥを含む１０
ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ＨＥＰＥＳ＋２ＭＥ）で１０倍希釈
し、凍結融解１回で均質化した血液試料を測定し、測定
値を比較した。結果を表２にしめす。

【００３４】

【表２】

【００３５】ＨＥＰＥＳ＋２ＭＥ緩衝液系が最も良い結
果を与えた。またＨＥＰＥＳは２−５ＡＳ活性測定に用
いる緩衝液でもあるので、希釈溶媒としてはＨＥＰＥＳ
を選択し、ＨＥＰＥＳ＋還元剤を、今後の血液試料の調
製に使用することとした。またＨＥＰＥＳ＋還元剤を、
２−５ＡＳ活性賦活剤であるｐｏｌｙ（Ｉ）ｐｏｌｙ
（Ｃ）試薬や基質であるＡＴＰ溶液の溶解にも用いるこ
ととした。なお、ＭＥＭ希釈試料はフィブリンの形成が
見られ、ＭＥＭは血液希釈用溶媒には不適当であった。

【００３６】実施例２ 血液試料の調製法（凍結融解の
回数の選択） 全血血液を均質化するのに最適な凍結融解の回数の選択
を行った。ヘパリン採血した全血血液を１０ｍＭ ＨＥ
ＰＥＳ＋１０ｍＭ ２ＭＥで１０倍希釈し、均質化する
際の凍結融解の回数を１〜４回に変えて試料を調製し、
２−５ＡＳ活性を測定し、測定値を比較した。結果を表
３に示す。

【００３７】

【表３】

【００３８】表３より、凍結融解２回または３回で測定
値が最大となる。操作の容易性を考えて凍結融解２回を
選択し、今後の均質化に使用した。

【００３９】実施例３ 血液試料の調製法（希釈と凍結
融解の順序の選択） ヘパリン採血した血液を、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ＋１０
ｍＭ ２ＭＥで希釈し、凍結融解２回の血液試料の２−
５ＡＳ活性を測定した。希釈／凍結融解の操作順序を変
えて測定値を比較した。結果を表４に示す。

【００４０】

【表４】

【００４１】どちらの操作でも測定値に差がないので、
凍結融解操作のやりやすさから、操作Ｂ：希釈後凍結融
解を選択した。

【００４２】実施例４ 血液試料の調製法（抗凝固剤の
選択） ＥＤＴＡ採血及びヘパリン採血した全血試料を１０ｍＭ
ＨＥＰＥＳ＋１０ｍＭ ２ＭＥで希釈後、凍結融解を２
回行い、均質化した血液試料を測定した。結果を表５に
示す。どちらの抗凝固剤を用いても測定値に差は見られ
なかった。

【００４３】

【表５】

【００４４】実施例５ 血液試料の保存安定性 ヘパリン採血した全血血液を、１０ｍＭ ２ＭＥ、３ｍ
Ｍ 酢酸マグネシウム、５０ｍＭ ＫＣｌ、２５％ グリ
セリンを含む１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．
５）よりなる２−５ＡＳ酵素活性安定化剤で希釈し、凍
結融解を２回行い、均質化した血液試料を４℃で７日間
保存し、安定性を調べた。結果を表６に示す。

【００４５】

【表６】

【００４６】表６に示されるように、本発明の酵素活性
安定化剤で希釈・均質化された血液試料は冷所で７日保
存後であっても、その酵素活性を良好に保持しており、
安定であった。

【００４７】ＲＥＦＥＲＥＮＣＥＳ： ［１］免疫薬理、１、８０−８８、１９８３ ［２］Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ＆ Ｐｈａｒｍａｃｏ
ｔｈｅｒａｐｙ， ３７， １７６−１８０， １９８
３ ［３］Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ， ８， ３６６−３７
０， １９８８ ［４］臨床検査、３９、１４６１−１４６４、１９９５ ［５］臨床病理、４２（補冊）、９６、１９９４ ［６］特公昭４６−２９７８５号 ［７］特公昭６１−１７４６４号 ［８］特公昭６０−２７５１６号 ［９］特公平１−４２６７９号 ［１０］特公平１−４２６８０号 ［１１］特公平１−５５８８０号 ［１２］特公平２−４４５２０号 ［１３］Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ
ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ．
Ｖｏｌ．２０２，１９８５，‘ Ｔｈｅ ２−５Ａ Ｓ
ｙｓｔｅｍ − Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｃｌｉ
ｎｉｃａｌ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅ
ｒｆｅｒｏｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｐａｔｈｗａｙ
’ ｐ９７−１０４ ［１４］ Ｎａｔｕｒｅ ２８８（１３），１８９−１
９２，１９８２ ［１５］ Ｊ． Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９
（３），１７２７−１７３０，１９８４ ［１６］特開平９−１０７９９３号 ［１７］Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０７，９０−９
３，１９９２

【図面の簡単な説明】

【図１】２−５ＡＳ活性測定法フロー

【図２】２−５ＡＳ活性標準曲線

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】還元剤を共存させることによって血液中の
   酵素活性を安定化する方法
2. 【請求項２】活性を安定化すべき酵素が、血球成分に由
   来するものである請求項１の酵素活性を安定化する方法
3. 【請求項３】活性を安定化すべき酵素が、白血球または
   赤血球に由来するものである請求項１の酵素活性を安定
   化する方法
4. 【請求項４】活性を安定化すべき酵素が、リンパ球に由
   来するものである請求項１の酵素活性を安定化する方法
5. 【請求項５】活性を安定化すべき酵素が、２’−５’オ
   リゴアデニル酸合成酵素である請求項１の酵素活性を安
   定化する方法
6. 【請求項６】活性を安定化すべき酵素が、アデノシンデ
   アミナーゼである請求項１の酵素活性を安定化する方法
7. 【請求項７】還元剤が、ＳＨ化合物である請求項１の酵
   素活性を安定化する方法
8. 【請求項８】還元剤が、２−メルカプトエタノール、ジ
   チオトレイトール、システインよりなる群より選ばれる
   ひとつまたは複数の還元剤である請求項１記載の酵素活
   性を安定化する方法
9. 【請求項９】還元剤が、２−メルカプトエタノールであ
   る請求項１の酵素活性を安定化する方法
10. 【請求項１０】還元剤を血液に対して５〜１００ｍＭで
    用いる請求項１の酵素活性を安定化する方法
11. 【請求項１１】血液が血球成分を破壊して均質化された
    状態にあることを特徴とする請求項１の酵素活性を安定
    化する方法
12. 【請求項１２】次の工程ａ）−ｄ）を含む血液中の２’
    −５’オリゴアデニル酸合成酵素活性測定方法 ａ）採取した血液を還元剤を含む希釈液で希釈する工程 ｂ）希釈した血液中の血球成分を破壊して均質化する工
    程 ｃ）２’−５’オリゴアデニル酸合成酵素の基質を与え
    て酵素反応を行う工程 ｄ）酵素反応の結果生じる変化を観察する工程
13. 【請求項１３】次の工程ａ’）−ｄ）を含む血液中の
    ２’−５’オリゴアデニル酸合成酵素活性測定方法 ａ’）採取した血液中の血球成分を破壊して均質化する
    工程 ｂ’）均質化した血液を還元剤を含む希釈液で希釈する
    工程 ｃ）２’−５’オリゴアデニル酸合成酵素の基質を与え
    て酵素反応を行う工程 ｄ）酵素反応の結果生じる変化を観察する工程
14. 【請求項１４】血球成分の破壊を、凍結融解により達成
    する請求項１３もしくは請求項１４の２’−５’オリゴ
    アデニル酸合成酵素活性測定方法
15. 【請求項１５】必要に応じて工程ｂ）もしくは工程
    ｂ’）後の均質化試料を冷所で保存する請求項１３もし
    くは請求項１４の２’−５’オリゴアデニル酸合成酵素
    活性測定方法
16. 【請求項１６】還元剤を含有することを特徴とする血液
    試料中の２’−５’オリゴアデニル酸合成酵素活性安定
    化剤
17. 【請求項１７】少なくとも２−メルカプトエタノールを
    ５〜１００ｍＭ、酢酸マグネシウムを０．５〜５０ｍ
    Ｍ、塩化カリウムを２０〜１００ｍＭ、グリセロールを
    １０〜５０％含有する、１〜１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩
    衝液（ｐＨ７〜８）よりなる血液試料中の２’−５’オ
    リゴアデニル酸合成酵素活性安定化剤