KR20100015578A - 세포 및/또는 거대분자의 보존 및/또는 안정화를 위한 조성물, 시스템 및 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 세포(예컨대, 전체 세포)를 보존하는 및/또는 안정화시키는 조성물들, 시스템들, 및 방법들에 관한 것이다. 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물 은 킬레이트 화합물, 킬레이트 화합물을 향상시키는 구성성분, 및 선택적으로 염기(예컨대, 퓨린 염기 또는 피리미딘 염기)을 포함할 수 있다. 세포 안정화 방법은 세포와 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물을 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 세포 안정화 시스템은 세포를 함유하는 시료 및 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물을 받기에 적합한 컨테이너를 포함할 수 있다. 주위 환경 조건하에서 (예컨대, 냉장하지 않고) 세포를 보존하거나 및/또는 안정화시킬 수 있다. 세포는, 단백질, 핵산, 및/또는 (세포 보존 및/또는 안정화의) 기타 생물분자 마커를 포함할 수 있다. 조성물은, 유세포 분석으로 분석하기 위하여 하나 또는 그 이상의 세포를 보존 및/또는 안정화시키고, 동시에 분자 분석을 위하여 하나 또는 그 이상의 세포내 핵산을 보존 및/또는 안정화시킬 수 있다.
Description
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2007년 3월 14일에 출원된 미합중국 가출원 번호 제 60/894,795호, 2007년 9월 7일에 출원된 미합중국 가출원 번호 제 60/970,881호 및 2007년 10월 29일에 출원된 미합중국 가출원 번호 제 60/983,468호의 이익을 주장한다. 본 출원은 2007년 3월 14일 출원된 미합중국 출원 번호 제 11/686,169호의 일부계속출원이다. 본 출원은 2007년 3월 14일 출원된 국제 PCT 출원 제 PCT/US07/63982호의 일부계속출원이다. 전술한 출원의 각각의 전체 내용은 여기에 참조로서 병합된다.
기술분야
본 발명은 일반적으로 거대분자 및/또는 생물분자의 보존을 위한 조성물, 시스템 및 방법에 관한 것이다. 예를 들어, 본 발명의 조성물, 시스템 및 방법은 형태-특이적인 방식 및/또는 서열 특이적인 방식으로 다른 분자와 상호작용할 수 있는 조건에서, 거대분자 및/또는 생물분자를 보존 및/또는 안정화시키기 위해 사용될 수도 있다.
거대분자 및 생물분자는 일부 조건하에서 불안정적일 수도 있다. 예를 들어, 핵산 분자는 핵산분해효소(nuclease)가 존재할 때 분해될 수도 있다. 유사하게, 단백질 분자는 단백질분해효소(protease)가 존재할 때 분해될 수도 있다. 거대분자 및 생물분자의 분해(degradation)는 시간이 지남에 따라 증가할 수도 있다. 이러한 분해가 일어나는 경우에, 이러한 분자의 성질(존재, 농도, 서열, 형태)을 검출하는 분석검사(assays)의 효능성(efficacy)이 감소되거나 손실될 수도 있다. 예를 들어, 생물분자의 미세한 함량 검출에 의존하는 진단 분석검사나 법의학 분석검사에서, 생물분자가 분해되는 경우에, 믿을 만한 결과를 회수하는 것이 불가능할 수도 있다.
성병(Sexually-transmitted disease; 이하, STD) 클리닉은 정기적으로 임질(gonorrhea) 및 매독(Syphilis)과 같은 질병의 환자를 검색하고 치료한다. 임균(gonococci)과 같은 감염원은 DNA 시료 분석에 의해 검출될 수 도 있다. HW Jaffe 등이 개시한 문헌(J. Inf. Dis.146:275-279 (1982))에 따라, GonostatTM(씨에라 다이아그노스틱스 인코포레이션스, Sonora, Calif.)와 같은, 유전자 형질전환 테스트(GTT)는, 남성의 요도(urethra) 및 여성의 자궁경부(cervix) 및 항문(anus)에서 획득한 검체에서 임균 DNA를 검출하기 위해 사용될 수 있다. WL Whittington 등도 유사한 결과를 얻었다(Abstr. Ann. Meeting Am . Soc . Microbiol ., p. 315 (1983)). 그러나, 감염원이 존재하는 환자를 즉시 테스트하는 것이 항상 가능한 것은 아니다. 예를 들어, 많은 농촌이나 미개발지역에서는 임상 실험실을 쉽게 발견되지 않는다. 이러한 환경에서, 목적하는 표적이 부분적으로 또는 전부 분해될 수 있는 시간동안에 분석실험실로 환자 테스트 검체를 전달하는 것이 필요하다.
거대분자나 생물분자의 온도를 낮춤으로써 거대분자 및/또는 생물분자의 분해를 감소시킬 수도 있다. 그러나, 이 선택은 모든 상황에서 활용될 수 있는 것이 아니거나, 또는 (예컨대, 시료 수집 시간에서부터 분석시간에 이르는) 상당히 긴 시간 동안 활용될 수 있는 것이 아닐 수 있다. 예를 들어, 멀리 떨어진 지역에서 (예컨대, 환자의) 시료가 수집되면, 시료가 분석되는 시설에 시료를 수송하는데 충분하게 길게 표적분자를 보존하는 것이 어렵거나 불가능할 수도 있다. 게다가, 냉각이 모든 시료에 걸쳐 동일하게 되지 않을 수도 있으며, 및/또는 실험과 실험이 서로 일관성이 유지되지 않을 수도 있다.
하나 또는 그 이상의 핵산분해효소 또는 단백질분해효소를 불활성화하는데 충분한 온도로 조성물을 가열하여, 거대분자 및/또는 생물분자의 분해를 감소시킬 수도 있다. 그러나, 단백질분해효소와 핵산분해효소의 제한된 수만이 가열에 의해 불활성화된다. 게다가, 가열은 표적 분자를 보존하는 것보다 분해할 수도 있다.
세포가 수집되어 분석될 때 까지 유지된 세포의 조건에 의해 질병의 진단이 의존될 수 도 있다. 그러나, 거대분자와 같은, 세포 (예컨대, 전체 세포(whole cell; 완전한 세포))는 그들의 정상 환경의 밖에서는 화학변화를 일으키기 쉬울 수도 있다. 예를 들어, 인간의 몸에서 추출한 세포 (예컨대, 혈액 세포)는 추출한 후 수 초에서 수 분 이내 악화(예컨대, 가수분해, 산화 및/또는 응고)되기 시작할 수 도 있다.
요약
그러므로, 세포(예컨대, 전체 세포)를 보존하거나 및/또는 안정화시키기 위한 조성물, 시스템 및 방법에 대한 필요성이 생겼다.
본 발명은 거대분자 및/또는 생물분자 (통칭, "거대분자(macromolecule)")를 보존하거나 및/또는 안정화시키는 조성물, 시스템 및 방법에 관한 것이다. 일부 실시들에 따르면, 거대분자 및/또는 생물분자는 단백질 및/또는 핵산( 예컨대, DNA 및 RNA)을 포함한다. 당업계의 통상의 기술자에 의해 이해될 수 있는 바와 같이, 핵산(nucleic acid)은 다수의 소스(sources)의 서열을 포함한다. 예를 들어, 단일 핵산(nucleic acid)은 인공 서열(예컨대, 프라이머 결합자리), 인간 서열(예컨대, 선종증 용종증(adenomatous polyposis coli ;APC), 아밀로이드 전구체 단백질 (APP), 유방암 1 (BRCA1), 막투과 단백질분해효소 세린 2 (TMPRSS2), v-ets 적모구증(erythroblastosis) 바이러스 E26 암유발유전자(oncogene) 유사체 (ERG)), 식물 서열, 미생물 서열 (예컨대, 항생제 저항성 유전자), 바이러스 서열(예컨대, HIV 단백질분해효소), 및/또는 그의 혼합물을 포함할 수 있다. 단일 핵산서열은 또한 일반적인 소스로부터 유래한 두 서열의 이례적인 융합이나 인공적인 융합(예컨대, TMPRSS2:ERG 융합)을 포함할 수도 있다. 만약, 거대분자가 적어도 시료 수집 시간에서부터 시료 분석 시간에 이르기까지, 검출가능한 형태로 유지되는 한 상기 거대분자는 보존적이라고 간주될 수 있다. 일부 실시들에서, 본 발명은 체액이나 배설물(예컨대, 뇨, 혈액, 혈청, 양수, 척수액, 결막액, 타액, 질액, 대변, 정액, 및 땀)의 거대분자의 보존 및/또는 안정화에 관한 것이다. 일부 실시들에서, 핵산 혼성화에서 뜻밖의 개선이 (예컨대, 본 발명의 보존 조성물, 시스템 또는 방법이 적용되지 않은 동일한 방법과 비교하여) 이러한 핵산 테스트 방법에서 관찰될 수도 있다.
본 발명은 세포 및/또는 거대분자 및/또는 생물분자(통칭하여, "거대분자")를 보존하거나 및/또는 안정화시키는 조성물, 시스템 및 방법에 관한 것이다. 예를 들어, 일부 실시들에 따르면, 본 발명은, 세포(예컨대, 전체 세포)를 보존하거나 및/또는 안정화시키는 조성물("세포 안정화 조성물")에 관한 것이다.
일부 실시들에서, 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물은 (a) 킬레이트 화합물(chelator:킬레이터) (예컨대, 에틸렌 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA); [에틸렌비스(옥시에틸렌니트릴로)]테트라아세트산(EGTA); 1,2-비스(2-아미노페녹시)에탄-N,N,N',N'-테트라아세트산(BAPTA); 및 이의 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 킬레이트 화합물), (b) 적어도 하나의 킬레이트 화합물을 향상시키는 구성성분(예컨대, 구아니딘, 염화리튬, 살리실산 나트륨, 과염소산 나트륨 및 티오시안산나트륨으로 이루어진 군으로부터 선택되는 킬레이트 화합물을 향상시키는 구성성분), 및 선택적으로 (c) 퓨린 염기 및 피리미딘 염기로 이루어진 군으로부터 선택되는 염기를 포함할 수도 있다. 킬레이트 화합물, 킬레이트 화합물을 향상시키는 구성성분, 및/또는 염기의 농도는 달성가능한 임의의 농도로 각각 선택될 수도 있다. 예를 들어, 킬레이트 화합물의 농도는 약 0.1 mM 내지 약 0.1 M의 범위일 수 있고, 킬레이트 화합물을 향상시키는 구성성분의 농도는 약 1 mM 내지 약 5 M의 범위일 수 있으며; 및/또는 염기의 농도는 약 1 mM 내지 약 5 M의 범위일 수 있다. 일부 실시들에서, 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물을 수용성 용액으로 제형화할 수도 있다. 일부 실시들에서, 킬레이트 화합물을 향상시키는 구성성분은 과염소산나트륨, 티오시안산나트륨 및 염화리튬으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수도 있다. 일부 실시들에 따르면, 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물에, 염화망간, 사르콕실, 도데실 술폰산 나트륨 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 효소 불활성화 구성성분(enzyme inactivating component)이 포함되거나 또는 제외될 수도 있다. 일부 실시들에서, 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물은 고체, 액체 및/또는 수화겔을 포함할 수 도 있다. 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물은 일부 예시에서 용매(예컨대, 물 및/또는 유기용매)를 포함할 수 도 있다. 일부 실시들에 따르면, 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물은 세포(예컨대, 손상되지 않은 세포, (완전한) 전체 세포 등), 단백질 (예컨대, 세포 단백질 및/또는 무세포 단백질(cell-free protein)), 및/또는 핵산 (예컨대, 세포의 핵산 및/또는 무세포 RNA, DNA 등)을 포함할 수도 있다.
일부 실시들에서, 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물은 가소제 (예컨대, 시트래이트 알콜(a citrated alcohol)) 및/또는 항응고제 (예컨대, 헤파린)을 포함할 수도 있다. 일부 실시들에서, 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물은 실온(예컨대, 약 20℃)에 저장된 시료(예컨대, 혈액 시료)의 응집(clumping) 및/또는 응고를 감소시키거나 및/또는 차단할 수도 있다.
일부 실시들에 따르면, 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물은 완충용액을 포함할 수도 있다. 예를 들어, 완충용액은 아세트산칼륨, 아세트산나트륨, 인산칼륨, 인산나트륨, 트리스 (하이드록시아미노)메탄, N-(2-하이드록시에틸)피페라진-N'-(2-에탄술폰산), 3-(N-모폴리노)프로판 술폰산, 2-[(2-아미노-2-옥소에틸)아미노]에탄술폰산, N-(2-아세트아미도)2-이미노디아세트산, 3-[(1,1-디메틸-2-하이드록시에틸)아미노]-2-프로판술폰산, N,N-비스(2-하이드록시에틸)-2-아미노에탄술폰산, N,N-비스(2-하이드록시에틸글리신, 비스-(2-하이드록시에틸)이미노-트리스(하이드록시메틸)메탄, 3-(사이클로헥실아미노)-1-프로판술폰산, 3-(사이클로헥실아미노)-2-하이드록시-1-프로판술폰산, 2-(N-사이클로헥실아미노)에탄술폰산, 3-[N,N-비스(2-하이드록시에틸)아미노]-2-하이드록시-프로판술폰산, N-(2-하이드록시에틸피페라진)-N'-(3-프로판술폰산), N-(2-하이드록시에틸)피페라진-N'-(2-하이드록시프로판술폰산), 2-(N-몰포린)에탄술폰산, 트리에탄올아민 완충용액, 이미다졸, 글리신, 에탄올아민, 3-(N-몰포린)-2-하이드록시프로판술폰산, 피페라진-N,N'-비스(2-에탄술폰산), 피페라진-N,N'-비스(2-하이드록시프로판술폰산), N-트리스[(하이드록시메틸)메틸]-3-아미노프로판술폰산, 2-하이드록시-3-[트리스(하이드록시메틸)메틸아미노]-1-프로판술폰산, N-[트리스(하이드록시메틸)메틸]-2-아미노에탄술폰산, N-[트리스(하이드록시메틸)메틸]글리신, 2-아미노-2-메틸-1,3-프로판디올, 2-아미노-2-메틸-1-프로판올, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물을 포함할 수도 있다.
일부 실시들에 따르면, 본 발명은 또한 세포를 보존하는 및/또는 안정화시키는 방법( "세포 안정화 방법")에 관한 것이다. 세포 안정화 방법은, 예를 들어, 거대분자를 하기를 포함하는 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물과 접촉시키는 것을 포함한다:(a) 킬레이트 화합물 (예컨대, 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), [에틸렌비스(옥시에틸렌니트릴로)]테트라아세트산 (EGTA), 1,2-비스(2-아미노페녹시)에탄-N,N,N',N'-테트라아세트산 (BAPTA), 및 그의 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 킬레이트 화합물), (b) 적어도 하나의 킬레이트 화합물을 향상시키는 구성성분 (예컨대, 구아니딘, 염화리튬, 살리실산나트륨, 과염소산나트륨, 및 티오시안산나트륨으로 구성된 군으로부터 선택되는, 킬레이트 화합물을 향상시키는 구성성분), 및 (c) 염기(예컨대, 퓨린 염기 및 피리미딘 염기로 이루어진 군으로부터 선택되는 염기). 일부 실시들에서, 세포는, 포유동물 세포, 식물 세포, 효모 세포, 박테리아 세포, 바이러스 감염 세포, 질병에 걸린 세포 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포를 포함할 수도 있다. 일부 실시들에서, 포유동물 세포는 적혈구, 백혈구, 림프구, 대식 세포, 상피 세포, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포를 포함할 수도 있다. 일부 실시들에 따르면, 포유동물 세포는, 인간 세포를 포함할 수도 있다. 거대분자 안정화 조성물 및/또는 방법으로 보존되는 및/또는 안정화되는 거대분자는, 일부 실시들에 따르면, DNA, RNA, mRNA, 및 cDNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산을 포함할 수도 있다. 핵산은 예를 들어, 원핵생물 및/또는 진핵생물의 DNA를 포함할 수도 있다. 일부 실시들에서, 세포 및/또는 거대분자를 안정화시키는 조성물 및/또는 방법으로 보존되거나 및/또는 안정화되는 세포 및/또는 거대분자는 인간 대상으로부터 채취한 체액에 존재할 수도 있다. 체액은 예를 들어, 혈액, 혈청, 양수, 척수액, 결막액, 타액, 질액, 대변, 정액, 및 땀으로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질을 포함할 수도 있다.
본 발명은 추가로, 일부 실시들에서, 세포(예컨대, 전체 세포) 및/또는 거대분자를 보존하는 및/또는 안정화시키는 시스템( "세포 안정화 시스템" 및/또는 "거대분자 안정화 시스템")에 관한 것이다. 세포 및/또는 거대분자 안정화 시스템 은, 세포와, (예컨대, 킬레이트 화합물, 킬레이트 화합물을 향상시키는 적어도 하나의 구성성분, 및 염기를 포함하는) 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물을 함유하는 시료를 받거나 담기 위해 배열되고 정렬된 시료 컨테이너(container)를 포함할 수도 있다. 시스템은 또한 일부 예시에서 사용자 설명서를 포함할 수도 있다. 시료 컨테이너는, 일부 실시들에서, 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물을 포함할 수도 있다. 예를 들어, 시료 컨테이너는 코팅된 적어도 하나의 내부면(inner surface)과 적어도 하나의 외부면(outer surface)을 포함할 수도 있고, 후자에 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물이 코팅될 수 있다. 시료 컨테이너는 일부에서에서 적어도 하나의 소낭, 리포좀, 및/또는 미셀을 포함할 수도 있다. 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물은 소낭, 리포좀, 및/또는 미셀 강(lumen)에 존재할 수도 있다.
상세한 설명
본 발명은 세포(예컨대, 전체 세포) 및/또는 거대분자 및/또는 생물분자 ("거대분자")의 분해를 지연하는 조성물, 시스템, 및 방법에 관한 것이다.
일부 실시들에 따르면, 조성물은 세포를 보존 및/또는 안정화시킬 수도 있다("세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물"). 세포는 전체 세포(whole cell; 완전한 세포)를 포함할 수도 있다. 전체 세포는, 예를 들어, 세포 표면 물질 (예컨대, 세포 표면 단백질, 세포외 기질, 세포 벽, 및/또는 세포 외막)을 포함할 수도 있다. 보존 및/또는 안정화될 수 있는 세포는, 포유동물 세포 (예컨대, 인간), 식물 세포, 효모세포, 박테리아 세포, 바이러스 감염 세포, 질병에 걸린 세포 및 그의 혼합물을 포함할 수도 있다. 포유동물 세포는 적혈구, 백혈구, 림프구, 대식 세포, 상피 세포, 줄기 세포, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포를 포함할 수도 있다.
일부 실시들에서, 살아서 유지되는 시점에서 세포를 보존하거나 및/또는 안정화시킬 수도 있다. 일부 실시들에서, 세포는, 생체내 세포와 (예컨대, 형태학적으로, 생리학적으로, 유전학적으로, 및/또는 생화학적으로) 동일하거나 실질적으로 동일한 조건으로 유지되는 시점에서 보존되거나 및/또는 안정화될 수도 있다. 일부 실시들에서, 신체 또는 체액에 존재할 때와 같은 (예컨대, 건강한 또는 질병에 걸린) 동일한 조건 또는 실질적으로 동일한 조건으로 유지되는 시점에서 세포를 보존하거나 및/또는 안정화시킬 수도 있다. 예를 들어, 보존 및/또는 안정화는 세포의 에너지 소비, 존재하는 대사산물(예컨대, 피루배이트)의 함량, 존재하는 유리 ATP의 함량, 전사율 및/또는 번역율, 및/또는 하나 또는 그 이상의 단백질 및/또는 핵산의 존재(또는 부재)의 관점에서 평가될 수도 있다.
일부 실시들에 따르면, 거대분자 및/또는 생물분자는 단백질 및/또는 핵산 (예컨대, DNA 및 RNA)을 포함할 수도 있다. 당업계의 통상의 기술자에 의해 이해될 수 있는 바와 같이, 핵산은 다수의 소스의 서열을 포함할 수도 있다. 예를 들어, 단일 핵산 은 인공 서열 (예컨대, 프라이머 결합 자리), 인간 서열 (예컨대, 선종증 용종증(adenomatous polyposis coli ;APC), 아밀로이드 전구체 단백질 (APP), 유방암 1 (BRCA1), 막투과 단백질분해효소 세린 2 (TMPRSS2), v-ets 적모구증 바이러스 E26 암유발유전자(oncogene) 유사체 (ERG)), 식물 서열, 미생물 서열 (예컨대, 항생제 저항성 유전자) 바이러스 서열(예컨대, HIV 단백질분해효소), 및/또는 그의 혼합물을 포함할 수 있다. 단일 핵산 서열은 또한 일반적인 소스에서 유래된 두 서열의 이례적인 융합이나 인공적인 융합(예컨대, TMPRSS2:ERG 융합)을 포함할 수도 있다. 만약, 거대분자가 적어도 시료 수집 시간에서부터 시료 분석 시간에 이르기까지 검출가능한 형태로 유지되는 한, 상기 거대분자는 보존적이라고 간주될 수 있다. 일부 실시들에서, 본 발명은 체액이나 배설물(예컨대, 뇨, 혈액, 혈청, 양수, 척수액, 결막액, 타액, 질액, 대변, 정액, 및 땀)의 거대분자의 보존 및/또는 안정화에 관한 것이다. 일부 실시들에서, (예컨대, 본 발명의 보존 조성물, 시스템 또는 방법이 적용되지 않은 동일한 방법에 비하여) 이러한 핵산 테스트 방법에서 뜻밖의 개선된 핵산 혼성화를 관찰할 수도 있다.
분해(Degradation)는, 목적 분자 또는 목적 분자 수집을 검출할 수 없도록 하게 하는, 분자 구조에서의 어떠한 변화로 생각될 수 있다. 예를 들어, 단백질의 분해는 1차, 2차, 3차 또는 4차 구조의 모든 변형(예컨대, 이황화 결합의 환원, 펩티드 결합의 가수분해, 또는 공유 결합, 이온 결합, 소수성 결합, 수소 결합 또는 반더 발스 결합의 기타 분해)을 포함할 수도 있다. 핵산의 분해는 (예컨대, 단일선의, 이중선의, 삼중선의) 혼성화 상태, (예컨대, A, B, 또는 Z) 나선 구조, 수퍼코일링(supercoiling), 또는 (예컨대, 피리미딘 다이머화, 디아민화, 산화, 퓨린화 또는 공유 결합, 이온 결합, 소수성 결합, 또는 수소 결합의 기타 절단) 서열의 어떤 변형을 포함할 수도 있다. 분해에서 이 지연(delay)은 장시간 또는 무한한 시간동안 원하는 형태로 거대분자를 보존하는 것으로 생각될 수도 있다. 이 지연은 또한 (예컨대, 시료 수집에서 분석검사가 이루어질 때까지의) 정해진 시간 동안 원하는 형태로 거대분자를 보존하거나 안정화시키는 것으로 생각될 수도 있다.
본 발명의 몇몇 실시들에 따르면, 조성물, 시스템, 및 방법은 생물체액 및/또는 배설물에서 거대분자의 분해를 감소시키거나 또는 제거할 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물, 시스템, 및/또는 방법은, 일부 실시들에서, 체액(예컨대, 뇨)의 목적 핵산에 대한 효소적인 파괴를 제거할 수도 있다. 보존되거나 및/또는 안정화될 수 있는 핵산은, 예를 들어, 천연(natural) 및/또는 합성 형태의 DNA, RNA, RNA/DNA 혼성체, 및 그의 변이체를 포함한다. 보존되거나 및/또는 안정화될 수 있는 DNA는 세포간 핵산 및/또는 세포내 핵산을 포함할 수도 있다. 보존되거나 및/또는 안정화될 수 있는 DNA는 예를 들어, 인간 DNA, 포유동물 DNA, 박테리아 DNA, 곰팡이 DNA, 및 바이러스 DNA를 포함할 수도 있다. 보존되거나 및/또는 안정화될 수 있는 박테리아 DNA는, 예를 들어, 임균성 DNA, 해모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) DNA, 및 바실러스 서브틸리스 DNA를 포함할 수도 있다.
보존되거나 및/또는 안정화되는 세포 및/또는 거대분자 (및/또는 생물분자)는, 체액 및/또는 배설물, 조직(예컨대, 부검 조직), 및/또는 대상(예컨대, 뼈)에 포함될 수도 있다. 예를 들어, 거대분자는 음식 입자, 토양 시료, 법의학 시료(예컨대, 옷가지, 머리카락, 지문), 옷감, 박테리아 매질, 점액, 환경 검체, 및/또는 세균전 검체(biowarfare specimen)에 포함될 수도 있다. 보존되거나 및/또는 안정화되는 거대분자 (및/또는 생물분자)는 전체 세포에 포함될 수 있으며 및/또는 전체 세포로부터 정제될 수도 있다(예컨대, 완전하게 또는 부분적으로 정제).
[24]조성물, 시스템, 및/또는 방법은, (예컨대, 실온에서) 적어도 약 1 일, 적어도 약 2 일, 적어도 약 3 일, 적어도 약 4 일, 적어도 약 5 일, 적어도 약 6 일, 적어도 약 한 주, 적어도 약 2 주, 적어도 약 3 주, 및/또는 적어도 약 4 주 동안 세포 및/또는 거대분자를 보존 및/또는 안정화시킬 수도 있다. 조성물, 시스템, 및/또는 방법은, (예컨대, 실온에서) 최대 약 1 일, 최대 약 2 일, 최대 약 3 일, 최대 약 4 일, 최대 약 5 일, 최대 약 6 일, 최대 약 한 주, 최대 약 2 주, 최대 약 3 주, 및/또는 최대 약 4 주 동안 세포 및/또는 거대분자를 보존 및/또는 안정화시킬 수도 있다. 조성물, 시스템, 및/또는 방법은, 일부 실시들에서, 냉동하지 않고 전술한 어느 시간 동안 세포 및/또는 거대분자를 보존 및/또는 안정화시킬 수 있다. 예를 들어, 보존 및/또는 안정화는 주위 온도 및/또는 조성물의 온도가 약 70℃, 약 60℃, 약 55℃, 약 50℃, 약 45℃, 및/또는 약 40℃를 초과하지 않는 범위에서 성취될 수 있다. 보존 및/또는 안정화는 주위 온도 및/또는 조성물의 온도가 약 0℃ 내지 10℃, 약 10℃ 내지 20℃, 약 15℃ 내지 25℃, 약 20℃ 내지 30℃, 약 15℃ 내지 35℃, 및/또는 약 30℃ 내지 40℃인 범위에서 성취돌 수 있다. 일부 실시들에서, 온도 범위 선택은, 특이적인 시료에 대하여 예상되거나 원하는 저장 상태에 기초하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 조성물, 시스템, 및 방법은, 냉장고가 실용화되지 않거나 및/또는 냉장고를 사용할 수 없으며, 낮 온도가 50℃에 이르는 저개발국에서 수집된 재료들을 보존하고 및/또는 안정화시키는데 적용될 수 있다. 마찬가지로, 조성물, 시스템, 및 방법은, 배송 조건, 저장 조건, 및/또는 주위 온도가 20℃ 이하인 곳에서 수집된 물질을 보존하고 및/또는 안정화시키는데 적용될 수 있다.
특정 작용 기작에 한정되지는 않겠지만, 본 발명의 조성물, 시스템 및 방법은, 하나 또는 그 이상의 금속-의존성 효소나, 및/또는 목적하는 거대분자 및/또는 생물분자를 함유하는 테스트 시료(예컨대, 체액)의 하나 또는 그 이상의 금속-의존성 효소를 불활성화 할 수도 있다. 예를 들어, 2가 금속 킬레이트 화합물은, 금속-의존성 효소 (예컨대, 데옥시리보핵산분해효소)에 활용가능하며 촉매반응(즉, 핵산 분해)을 지지하기에 불충분한 범위 정도의, 활용가능한 금속(예컨대, Mg2+ 및 Ca2+)과 결합할 수 있다. 또 한편, 어느 특정 작용의 기작에 한정되지는 않겠지만, 킬레이트 화합물을 향상시키는 구성성분은 체액에서 발견되는 하나 또는 그 이상의 금속 비의존성 효소를 불활성화할 수 있다. 예를 들어, 금속 비의존성 효소는 DNA 합성효소(ligase) (예컨대, D4 DNA 합성효소), DNA 중합효소 (예컨대, T7 DNA 중합효소), 엑소뉴클리아제(exonuclease; 외측 핵산분해효소) (예컨대, 엑소뉴클리아제 2, λ-엑소뉴클리아제), 인산화촉매효소(kinase) (예컨대, T4 폴리뉴클레오타이드 키나아제), 인산분해효소(phosphotase) (예컨대, BAP 및 CIP 인산분해효소), 핵산분해효소 (예컨대, BL31 핵산분해효소 및 XO 핵산분해효소), 및 RNA-변형 효소 (예컨대, E. coli RNA 중합효소, SP6, T7, T3 RNA 중합효소, 및 T4 RNA 합성효소)를 포함할 수 있다. 어느 특정 작용 기작에 한정되지는 않겠지만, 퓨린 염기 및/또는 피리미딘 염기는 핵산에 결합할 수 있으며, DNA 및/또는 RNA를 분해하는 하나 또는 그 이상의 효소에 대한 이성질체 표적으로 작용한다.
본 발명의 몇몇 구체적인 구현예에 따르면, 퓨린 염기를 포함하는 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물과 접촉시킨 표적 핵산(예컨대, 임균 DNA)의 PCR 증폭 수율은, 퓨린 염기를 포함하는 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물과 접촉시키지 않은 동일한 표적 핵산의 PCR 증폭 수율 보다, 약 2배 높게, 약 3배 높게, 약 4배 높게, 약 5배 높게, 약 6배 높게, 약 7배 높게, 약 8배 높게, 약 9배 높게, 및/또는 10배 높게 될 수 있다. 본 발명의 몇몇 구체적인 구현예에 따르면, 킬레이트 화합물, 킬레이트 화합물을 향상시키는 구성성분, 및 퓨린 염기를 포함하는 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물과 접촉시킨 표적 핵산(예컨대, 임균성 DNA)의 PCR 증폭 수율은, 킬레이트 화합물 및 킬레이트 화합물을 향상시키는 구성성분을 포함하나, 퓨린 염기가 결핍된, 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물과 접촉시킨 동일한 표적 핵산의 PCR 증폭 수율에 비해, 약 2배 높게, 약 3배 높게, 약 4배 높게, 약 5배 높게, 약 6배 높게, 약 7배 높게, 약 8배 높게, 약 9배 높게, 및/또는 10배 높게 될 수도 있다. 예를 들어, EDTA (예컨대, 0.1 M), 티오시안산나트륨 (예컨대, 1 M), 및 아데닌을 포함하는 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물과 접촉시킨 표적 핵산(예컨대, 임균성 DNA)의 PCR 증폭 수율은, EDTA (예컨대, 0.1 M) 및 티오시안산나트륨 (예컨대, 1 M)을 포함하나, 아데닌이 결핍된, 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물과 접촉시킨 동일한 표적 핵산의 PCR 증폭 수율보다 약 10 배 높게 될 수 있다.
조성물
거대분자 및/또는 생물분자를 보존하거나 및/또는 안정화하는 조성물( "거대분자 안정화 조성물")은, 본 발명의 일부 실시들에 따르면, 킬레이트 화합물, 킬레이트 화합물을 향상시키는 구성성분, 퓨린 염기, 및/또는 피리미딘 염기를 포함할 수도 있다. 예를 들어, 거대분자 안정화 조성물은 킬레이트 화합물, 킬레이트 화합물을 향상시키는 구성성분, 및 퓨린 염기를 포함할 수도 있다. 세포 (예컨대, 전체 세포)를 보존하는 및/또는 안정화시키는 조성물 ( "세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물")은, 본 발명의 일부 실시들에 따르면, 킬레이트 화합물, 킬레이트 화합물을 향상시키는 구성성분, 퓨린 염기, 및/또는 피리미딘 염기를 포함할 수도 있다. 예를 들어, 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물은 킬레이트 화합물, 킬레이트 화합물을 향상시키는 구성성분, 및 퓨린 염기를 포함할 수도 있다.
킬레이트 화합물은, 예를 들어, 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), [에틸렌비스(옥시에틸렌니트릴로)]테트라아세트산 (EGTA) 및 1,2-비스(2-아미노페녹시)에탄-N,N,N',N'-테트라아세트산(BAPTA), 및/또는 그의 염을 포함할 수도 있다. 만약 포함한다면, 킬레이트 화합물은 바람직한 어느 농도로 존재할 수 있다. 예를 들어, 킬레이트 화합물은 적어도 약 0.1 mM, 적어도 약 0.005 M, 적어도 약 0.01 M, 적어도 약 0.05 M, 및/또는 적어도 약 0.1 M의 농도로 포함될 수 있다. 킬레이트 화합물은 최대 약 0.1 mM, 최대 약 5 mM, 최대 약 0.01 M, 최대 약 0.05 M, 및/또는 최대 약 0.1 M의 농도로 포함될 수 있다. 킬레이트 화합물은 약 0.1 mM 내지 약 0.1M의 농도로 포함될 수 있다. 둘 또는 그 이상의 킬레이트 화합물이 단일 조성물에 포함되는 경우에, 각각의 킬레이트 화합물의 농도 혹은 혼합된 킬레이트 화합물의 총 농도는 상기 제공된 범위 내에 있다. 일부 실시들에서, 킬레이트 화합물은 EDTA, EGTA, BAPTA, 이미다졸, 이미노디아세트산 (IDA), 비스(5-아미디노-2-벤즈이미다졸릴)메탄(BABIM), 및/또는 그의 염을 포함할 수도 있다.
킬레이트 화합물을 향상시키는 구성성분은, 예를 들어, 염화리튬, 구아니딘, 살리실산나트륨, 과염소산나트륨, 티오시안산나트륨, 및 그의 혼합물을 포함할 수도 있다. 당업계의 통상의 기술자에 의해 이해될 수 있는 바와 같이, 구아니딘은 구아닌, 퓨린 염기, 및 리보스를 포함한다. 만약 포함된다면, 킬레이트 화합물을 향상시키는 구성성분은 바람직한 어느 농도로 존재할 수 있다. 예를 들어, 킬레이트 화합물을 향상시키는 구성성분은 적어도 약 1 mM, 적어도 약 10 mM, 적어도 약 0.05 M, 적어도 약 0.1 M, 적어도 약 0.5 M, 적어도 약 1 M, 적어도 약 1.5 M, 적어도 약 1.75 M, 적어도 약 2 M, 적어도 약 3 M, 적어도 약 4 M, 및/또는 적어도 약 5 M의 농도로 포함될 수 있다. 킬레이트 화합물을 향상시키는 구성성분은 최대 약 1 mM, 최대 약 0.05 M, 최대 약 0.1 M, 최대 약 0.5 M, 최대 약 1 M, 최대 약 1.5 M, 최대 약 1.75 M, 및/또는 최대 약 2 M의 농도로 포함될 수 있다. 킬레이트 화합물을 향상시키는 구성성분은 전술한 농도 중 어느 농도에 의해 정의되는 최대치(endpoints)를 포함하는 범위 이내의 농도로 존재할 수 있다. 예를 들어, 킬레이트 화합물을 향상시키는 구성성분은 약 1mM 내지 약 0.5 M, 약 0.1 M 내지 약 1.75 M, 약 0.1 M 내지 약 2.0 M, 약 0.1 M 내지 약 3.0 M, 약 0.5 M 내지 약 3.0 M, 및/또는 약 0.1 M 내지 약 5.0 M의 농도로 포함될 수 있다.
퓨린 염기는 아데닌, 구아닌, 및 그의 혼합물을 포함할 수도 있다. 퓨린 염기는 또한 유사체 및/또는 변이체 (예컨대, 메틸아데닌, 메틸구아닌, 에틸아데닌, 에틸구아닌)를 포함할 수도 있다. 퓨린 염기는 이노신, 카페인, 요산, 테오브로민, 테오필린, 2-아미노퓨린, 6-아미노퓨린, 하이포산틴 (6-옥시 퓨린), 및 산틴 (2,6-디옥시 퓨린)등의, 구조적으로 유사한 유사체 및/또는 변이체를 포함할 수도 있다. 퓨린 염기는 염(salts)(예컨대, 아데닌 헤미술폰산염, 아데닌 염화수소산염)을 포함할 수도 있다. 만약 포함된다면, 퓨린 염기는 바람직한 어느 농도로 존재할 수 있다. 예를 들어, 퓨린 염기는 적어도 약 0.1 mM, 적어도 약 1 mM, 적어도 약 10 mM, 적어도 약 0.1 M, 적어도 약 0.25 M, 적어도 약 0.5M, 적어도 약 0.75 M, 적어도 약 1 M, 적어도 약 1.5 M, 적어도 약 1.75 M, 적어도 약 2 M, 적어도 약 2.5 M, 적어도 약 3 M, 적어도 약 4 M, 적어도 약 5 M, 적어도 약 6 M, 및/또는 적어도 약 7 M의 농도로 포함될 수 있다. 퓨린 염기는 최대 약 0.1 mM, 최대 약 1 mM, 최대 약 10 mM, 최대 약 0.1 M, 최대 약 0.25 M, 최대 약 0.5 M, 최대 약 0.75 M, 최대 약 1 M, 최대 약 1.5 M, 최대 약 2 M, 최대 약 2.5 M, 최대 약 3 M, 최대 약 4 M, 최대 약 5 M, 최대 약 6 M, 및/또는 최대 약 7 M의 농도로 포함될 수 있다. 만약 포함된다면, 퓨린 염기는 전술한 농도 중 어느 농도에 의해 정의되는 최대치(endpoints)를 포함하는 범위이내의 농도로 존재할 수 있다. 예를 들어, 퓨린 염기는 약 0.1 mM 내지 약 100 mM, 약 1 mM 내지 약 10 mM, 약 0.1 M 내지 약 1.0 M, 약 0.1 M 내지 약 2.0 M, 약 0.1 M 내지 약 5.0 M, 약 0.1 M 내지 약 1.75 M, 약 0.5 M 내지 약 2.0 M, 약 0.75 M 내지 약 3 M, 및/또는 약 0.1 M 내지 약 7 M의 농도로 포함될 수 있다.
피리미딘 염기는, 예를 들어, 시토신, 티민, 우라실, 및 그의 혼합물을 포함할 수도 있다. 피리미딘 염기는 또한 유사체 및/또는 변이체 (예컨대, 메틸시토신, 메틸티민, 메틸우라실, 에틸시토신, 에틸티민, 에틸우라실)를 포함할 수도 있다. 피리미딘 염기는 또한 오로트산, 티아민, 5-플루오로우라실, 6-아자우라실, 피라진, 및/또는 피리다진과 같은, 구조적으로 유사한 유사체 및/또는 변이체를 포함할 수도 있다. 피리미딘 염기는 염(salts)(예컨대, 피리미딘 염, 2-피페라지노피리미딘 염)을 포함할 수도 있다. 만역 포함된다면, 피리미딘 염기는, 바람직한 어느 농도로 존재할 수 있다. 예를 들어, 피리미딘 염기는 적어도 약 0.1 mM,적어도 약 1 mM, 적어도 약 10 mM, 적어도 약 0.1 M, 적어도 약 0.25 M, 적어도 약 0.5 M, 적어도 약 0.75 M, 적어도 약 1 M, 적어도 약 1.5 M, 적어도 약 1.75 M, 적어도 약 2 M, 적어도 약 2.5 M, 적어도 약 3 M, 적어도 약 4 M, 적어도 약 5 M, 적어도 약 6 M, 및/또는 적어도 약 7 M의 농도로 포함될 수 있다. 피리미딘 염기는 최대 약 0.1 mM, 최대 약 1 mM, 최대 약 10 mM, 최대 약 0.1 M, 최대 약 0.25 M, 최대 약 0.5 M, 최대 약 0.75 M, 최대 약 1 M, 최대 약 1.5 M, 최대 약 2 M, 최대 약 2.5 M, 최대 약 3 M, 최대 약 4 M, 최대 약 5 M, 최대 약 6 M, 및/또는 최대 약 7 M의 농도로 포함될 수 있다. 만약 포함된다면, 피리미딘 염기는 전술한 농도 중 어느 농도에 의해 정의되는 최대치(endpoints)를 포함하는 범위이내의 농도로 존재할 수 있다. 예를 들어, 피리미딘 염기는 약 0.1 mM 내지 약 100 mM, 약 1 mM 내지 약 10 mM, 약 0.1 M 내지 약 1.0 M, 약 0.1 M 내지 약 2.0 M, 약 0.1 M 내지 약 5.0 M, 약 0.1 M 내지 약 1.75 M, 약 0.5 M 내지 약 2.0 M, 약 0.75 M 내지 약 3 M, 및/또는 약 0.1 M 내지 약 7 M의 농도로 포함될 수 있다.
일부 실시들에서, 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물은, EDTA, EGTA BAPTA, 및 그의 염으로부터 선택되는 2가 금속 킬레이트 화합물의 함량; 및 염화리튬, 구아니딘, 살리실산나트륨, 과염소산나트륨, 및 티오시안산나트륨으로부터 선택되는 적어도 하나의 킬레이트 화합물을 향상시키는 구성성분의 함량을 포함할 수도 있다. 2가 금속 킬레이트 화합물의 함량은 대개 약 0.1 mM 내지 약 0.1 M의 범위에 있다. 킬레이트 화합물을 향상시키는 구성성분의 함량은 약 1 mM 내지 약 500 mM의 범위에 있다. 조성물에서 킬레이트 화합물은, 예를 들어, 적어도 약 0.01 M일 것이다. 조성물에서 킬레이트 화합물을 향상시키는 구성성분의 함량은, 예를 들어, 적어도 약 1 M일 것이다.
일부 실시들에 따르면, 거대분자 안정화 조성물은 염화망간, 사르콕실, 또는 도데실 술폰산 나트륨 등의, 적어도 하나의 효소 불활성화 구성성분의 함량을, 대개 약 0-5% 몰라 농도의 범위로 포함할 수도 있다. 일부 실시들에서, 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물은 효소 불활성화 구성성분을 포함하거나 또는 포함하지 않을 수도 있다.
일부 실시들에서, 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물은 퓨린 염기, 피리미딘 염기, 또는 퓨린 염기 및 피리미딘 염기 모두를 포함할 수도 있다. 예를 들어, 조성물은 킬레이트 화합물, 킬레이트 화합물을 향상시키는 구성성분, 및 퓨린 염기 (예컨대, 아데닌)을 포함할 수도 있다. 일부 실시들에서, 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물은 (a) 킬레이트 화합물, (b) 킬레이트 화합물을 향상시키는 구성성분, 및 (c) 퓨린 염기 및/또는 피리미딘 염기를 단독으로 포함할 수도 있다. 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물은, 다른 실시들에서, 하나 또는 그 이상의 (예컨대, 수용성 및/또는 유기) 용매, 완충용액, 염, 계면활성제, 산화제, 환원제 및/또는 다른 시약을 포함할 수도 있다.
일부 실시들에서, 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물은 약 4.5 내지 약 8.5의 pH를 가진다. 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물은 보존되는 및/또는 안정화되는 시료 (예컨대, 체액) 내에 혼합되고, 그 혼합물은 약 4.5 내지 약 8.5의 pH로 제형화될 수도 있다. 일부 실시들에서, 적합한 완충용액은 Good 완충용액 (예컨대, HEPES), 아세트산칼륨, 인산나트륨, 중탄산염, 트리스(하이드록시아미노)메탄 (트리스), 및 그의 조합으로부터 선택될 수도 있다. 예를 들어, 완충용액은 아세트산칼륨, 아세트산나트륨, 인산칼륨, 인산나트륨, 트리스, N-(2-하이드록시에틸)피페라진-N'-(2-에탄술폰산) (HEPES) 완충용액, 3-(N-모포리노)프로판 술폰산 (MOPS) 완충용액, 2-[(2-아미노-2-옥소에틸)아미노]에탄술폰산 (ACES) 완충용액, N-(2-아세트아미도)2-이미노디아세트산 완충용액 (ADA), 3-[(1,1-디메틸-2-하이드록시에틸)아미노]-2-프로판술폰산 (AMPSO) 완충용액, N,N-비스(2-하이드록시에틸)-2-아미노에탄술폰산 (BES) 완충용액, 비신 (N,N-비스(2-하이드록시에틸글리신) 완충용액, 비스-(2-하이드록시에틸)이미노-트리스(하이드록시메틸)메탄 (비스-트리스) 완충용액, 3-(사이클로헥실아미노)-1-프로판술폰산 (CAPS) 완충용액, 3-(사이클로헥실아미노)-2-하이드록시-1-프로판술폰산 (CAPSO) 완충용액, 2-(N-사이클로헥실아미노)에탄술폰산 (CHES) 완충용액, 3-[N,N-비스(2-하이드록시에틸)아미노]-2-하이드록시-프로판술폰산 (DIPSO) 완충용액, N-(2-하이드록시에틸피페라진)-N'-(3-프로판술폰산) (HEPPS) 완충용액, N-(2-하이드록시에틸)피페라진-N'-(2-하이드록시프로판술폰산) (HEPPSO) 완충용액, 2-(N-몰포린)에탄술폰산 (MES) 완충용액, 트리에탄올아민 완충용액, 이미다졸 완충용액, 글리신 완충용액, 에탄올아민 완충용액, phosphate 완충용액, 3-(N-몰포린)-2-하이드록시프로판술폰산 (MOPSO) 완충용액, 피페라진-N,N'-비스(2-에탄술폰산) (PIPES) 완충용액, 피페라진-N,N'-비스(2-하이드록시프로판술폰산) (POPSO) 완충용액, N-트리스[(하이드록시메틸l)메틸]-3-아미노프로판술폰산 (TAPS) 완충용액, 2-하이드록시-3-[트리스(하이드록시메틸)메틸아미노]-1-프로판술폰산 (TAPSO) 완충용액, N-[트리스(하이드록시메틸)메틸]-2-아미노에탄술폰산 (TES) 완충용액, N-[트리스(하이드록시메틸)메틸]글리신 (tricine) 완충용액, 2-아미노-2-메틸-1,3-프로판디올 완충용액, 2-아미노-2-메틸-1-프로판올 완충용액, 및 그의 혼합물을 포함할 수도 있다.
일부 실시들에서, 조성물(예컨대, 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물)은 계면활성제 및/또는 환원제를 포함할 수 있으며, 이에 한정되지 않는다. 일부 실시들에서, 계면활성제는 세제를 포함할 수도 있다. 예를 들어, 세제는 음이온성 세제, 비이온성 세제, 및/또는 양이온성 세제를 포함할 수 있다. 음이온성 세제는 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노로레인산, 옥틸-페녹시폴리에틸에탄올, 노닐-페녹시폴리에톡시에탄올, 옥틸 플루코피라노사이드, 도데실 말토피라노사이드, 헵틸 티오글루코피라노사이드, big CHAP 세제, Genapol X-80, 플로닉 세제, 알킬페놀류의 폴리옥시에틸렌 에스테르 (예컨대, 트리톤), 및/또는 유도체 및 그의 유사체를 포함할 수 있다.
본 발명의 일부 실시들에 따르면, 조성물(예컨대, 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물)은 장쇄 지방산, 장쇄 지방성 에스테르, 장쇄 지방성 알콜, 리튬, 헤파린, 헤파린분해효소, 부틸헥실시트래이트, 및/또는 그의 혼합물을 포함할 수 있다. 본 발명의 일부 실시들에 따르면, 조성물은 유세포 분석 방법으로 테스트된다. 일부 실시들에서, 조성물(예컨대, 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물)은헤파린을 포함하지 않을 수도 있다. 예를 들어, 헤파린이 존재하는 것이 바람직하지 않은 상황(예컨대, PCR에 불리하게 영향을 미치는 상황)에서는, 헤파린이 생략될 수도 있다. 몇몇의 경우에, 심지어 헤파린을 제거하기에 충분한 함량의 헤파린 분해효소를 포함할 수도 있다.
일부 실시들에 따르면, 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물은 고체, 액체, 또는 기체(예컨대, 증기)로 제조되거나 및/또는 사용될 수 있다.
일부 실시들에서, 전체 세포 분석검사(예컨대, 유세포 분석기)와 분자 분석검사(예컨대, PCR, RT-PCR, 조직화학) 둘 모두에 유용한 안정화 조성물이 바람직할 지도 모른다. 일부 실시들에 따르면, 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물은 (a) 킬레이트 화합물 (예컨대, 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), [에틸렌비스(옥시에틸렌니트릴로)]테트라아세트산(EGTA), 1,2-비스(2-아미노페녹시)에탄-N,N,N',N'-테트라아세트산 (BAPTA), 및 그의 염으로부터 선택되는 킬레이트 화합물), (b) 적어도 하나의 킬레이트 화합물을 향상시키는 구성성분 (예컨대, 구아니딘, 염화리튬, 살리실산나트륨, 과염소산나트륨, 및 티오시안산나트륨으로부터 선택되는 킬레이트 화합물을 향상시키는 구성성분), (c) 염기 (예컨대, 퓨린 염기 및 피리미딘 염기로 이루어진 군으로부터 선택되는 염기), (d) 항응고제 (예컨대, 황산화 글리코스아미노글리칸), 및 (e) 가소제 (예컨대, 시트래이트화 알콜)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물은, 여기에서 기술한 바와 같이, 킬레이트 화합물, 킬레이트 화합물을 향상시키는 구성성분, 및 염기를 포함할 수 있다. 일부 실시들에 따르면, 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물은, 응고나 응집이 거의 없이 또는 전혀 없이, 하나 또는 그 이상의 세포(예컨대, 적혈구 세포, 백혈구 세포)를 안정화시킬 수 있다. 이러한 안정화 세포는 유세포 분석기에 의한 분석에 적합할 수 있다. 염기는 약 0.01 mg/L 내지 약 1 mg/L, 약 0.01 mg/L 내지 약 0.5 mg/L, 및/또는 약 0.2 mg/L 내지 약 0.5 mg/L의 농도로 존재할 수 있다. 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물은 일부 예시에서 가소제를 더 포함할 수도 있다. 가소제는 약 0.1% (v/v) 내지 약 10% (v/v), 약 0.2% (v/v) 내지 약 5% (v/v), 약 0.5% (v/v) 내지 약 2% (v/v), 및/또는 약 1% (v/v) 내지 약 5% (v/v)의 농도로 존재할 수 있다. 가소제는 일부 예시에서 시트래이트 알콜을 포함할 수도 있다. 시트래이트 알콜의 예시들로는 트리에틸시트래이트, 아세틸트리에틸시트래이트, 트리부틸시트래이트, 아세틸트리부틸시트래이트, 트리옥틸시트래이트, 아세틸트리옥틸시트래이트, 트리헥실시트래이트, 아세틸트리헥실시트래이트, 부티릴트리헥실시트래이트 (예컨대, n-부티릴트리-n-헥실시트래이트), 트리메틸시트래이트, 및 그의 혼합물을 포함할 수 있다.
일부 실시들에서, 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물은 약 200 mg/L 내지 약 20 g/L, 약 400 mg/L 내지 약 5 g/L, 약 500 mg/L 내지 약 2 g/L, 및/또는 약 1 g/L 내지 약 3 g/L의 농도의 항응고제를 포함할 수 있다. 일부 실시들에서, 항응고제들은 황산화 글리코스아미노글리칸을 포함할 수 있다. 황산화 글리코스아미노글리칸의 예시들로는, 헤파린 및/또는 헤파린염(예컨대, 암모늄 헤파린, 칼슘 헤파린, 리튬 헤파린, 칼륨 헤파린, 나트륨 헤파린, 및/또는 아연리튬 헤파린)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
시스템
본 발명의 일부 실시들에 따르면, 시스템은 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물 및 시료 저장 컨테이너를 포함할 수 있다. 예를 들어, 시스템은 보존되거나 및/또는 안정화된 거대분자(들) 및/또는 생물분자(들)을 함유하는 시료를 받도록 배열되거나 정렬된 컨테이너를 포함할 수 있다. 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물을 포함하는 시료에 접촉하도록 컨테이너를 배열하고 정렬할 수도 있다. 고체(예컨대, 알약, 가루 또는 수화겔 형태)로 제형화된 하나의 간단한 예시에서, 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물은 작은 튜브의 바닥에 침적되어 있을 수도 있다. 시료(예컨대, 액체시료)를 튜브에 넣자마자, 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물은 시료환경과 접촉되고 혼합될 수 있다. 시료를 컨테이너에 넣음과 동시에 또는 컨테이너에 넣고 난 후 어떤 시점에서, 그 시료와 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물이 접촉(예컨대, 혼합)될 수 있다.
본 발명의 일부 실시들에서, 시스템은 액체, 계면활성제 및/또는 세제를 더 함유하는 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물은 미셀, 리포좀, 소낭 및/또는 막-결합 공간(membrane-bound space)에 구성될 수도 있다.
일부 실시들에 따르면, 시스템은 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물과 사용 설명서를 포함할 수 있다. 일부 실시들에서, 시스템은 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물, 시료 저장 컨테이너, 및 사용 설명서를 포함할 수도 있다. 시스템은 또한 시료 저장 컨테이너와 그 구성을 함유하도록 정렬된, 선적가능한 컨테이너를 포함할 수 있다.
일부 실시들에 따르면, 시스템은 보존된 분자 및/또는 세포의 분석용 분석장치를 포함할 수 있다. 분석장치의 예들로는 현미경, 플래이트 리더기, 크기-분획화 겔, 써모사이클러(thermocycler), 유세포 분석기(flow cytometer), 자동 혈액분석기(automated hematology analyzer), 특이형태세포계수기(differential cell counter), 세포분별장치(cell sorter), 비드들(예컨대, 자석화 비드), 친화성 기질, 및/또는 분광분석기를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
방법
거대분자 및/또는 생물분자를 보존하는 및/또는 안정화시키는 방법( "거대분자 안정화 방법")은, 본 발명의 일부 실시들에 따르면, 거대분자를 거대분자 안정화 조성물과 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 거대분자를 함유하는 체액 시료를 킬레이트 화합물, 킬레이트 화합물을 향상시키는 구성성분, 및 퓨린 염기 (예컨대, 아데닌)을 포함하는 거대분자 안정화 조성물과 접촉시킬 수도 있다. 세포(예컨대, 전체 세포)를 보존하거나 및/또는 안정화시키는 방법 ("세포 안정화 방법")은, 본 발명의 일부 실시들에 따르면, 세포를 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물과 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 세포를 함유하는 체액 시료를 킬레이트 화합물, 킬레이트 화합물을 향상시키는 구성성분, 및 퓨린 염기(예컨대, 아데닌)를 함유하는 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물과 접촉시킬 수도 있다.
본 발명은 또한, 보존된 및/또는 안정화시킨 테스트 시료("보존된 테스트 시료")를 생산하기 위하여 테스트 시료와 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물을 접촉시키는 단계, 상기 테스트 시료로부터 목적 분자 분석물질을 분리 및/또는 정제하는 단계, 및 상기 분리 및/또는 정제된 목적 분자 분석물질에서 분자 분석검사를 수행하는 단계를 포함하는, 테스트 시료의 분자 분석검사의 신호 응답을 개선하기 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명의 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물의 용도의 결과로, 핵산 분석검사의 개선된 신호 응답은 혼성화를 일부 향상하도록 할 수도 있으며, 특정 작용 기작에 한정되지 않는다.
게다가, 본 발명은 테스트 핵산과 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물을 접촉시켜 테스트 용액을 형성시키는 단계 및 테스트 핵산-표적 핵산 혼성화를 허용하는 조건하에서 상기 테스트 용액과 표적 핵산을 접촉시키는 단계를 포함하는, 핵산들의 혼성화를 개선하기 위한 방법에 관한 것이다.
일부 실시들에 따르면, 방법은, 세포가 유세포 분석의 분석 대상이 될 수 있도록 세포를 충분히 안정화시키거나 및/또는 보존하는 것을 포함할 수도 있다. 예를 들어, 방법은 세포를 보존하거나 및/또는 안정화시키는 단계를 포함할 수 있으며, 상기 세포(예컨대, 이것이 위치하는 환경(milieu))는 유세포 분석을 간섭할 수 있는 자유 응집체들 및/또는 찌꺼기이다. 보존 및/또는 안정화는 활용가능한 어느 메트릭(metric) 또는 메트릭들의 조합을 이용하여 분석검사될 수 있다. 응집 및/또는 찌꺼기의 형성은 보존 및/또는 안정화 메트릭으로서 사용될 수 있다. (예컨대, 색조) 표현 또한 보존 및/또는 안정화 메트릭으로서 사용될 수 있다.
보존 및/또는 안정화 메트릭은, 예를 들어, 시간이 지남에 따라 하나 또는 그 이상의 마커들(예컨대, 세포외 마커들(extracelluar makers))의 존재를 포함할 수 있다. 보존 및/또는 안정화 마커들은 하나 또는 그 이상의 단백질, 하나 또는 그 이상의 탄수화물, 하나 또는 그 이상의 지질, 하나 또는 그 이상의 핵산, 및/또는 그의 혼합물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 보존 마커는 하나 또는 그 이상의 림프구 표면 마커를 포함할 수 있다. 마커들의 예시로는, 예를 들어, B 세포 마커들 (예컨대, CD19, CD20, CD21, CD22, 및 그의 혼합물), T 세포 마커들 (예컨대, CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD10, 및 그의 혼합물), NK 세포 마커들 (예컨대, CD16, CD56, CD57, 및 그의 혼합물), 골수성 마커들 (예컨대, CD13, CD33, CD34, 및 그의 혼합물), 단핵구 마커들 (예컨대, CD14), 및/또는 전(모든) 백혈구 마커들 (예컨대, CD45)을 포함할 수 있다. 일부 실시들에서, 조성물(예컨대, 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물)에 접촉시킨 세포(예컨대, 림프구)는, 백분율 및/또는 절대 계수(count)의 측면에서, 약 48 시간, 약 72 시간, 및/또는 약 96 시간 동안, 실온에서 (예컨대, 약 20℃), 하나 또는 그 이상의 마커들(예컨대, 세포 표면 마커들)의 약 80% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 및/또는 약 99% 이상 유지될 수 있다. 예를 들어, 조성물에 접촉시킨 림프구는, 약 96 시간동안 (t0 은 세포가 조성물과 접촉하는 바로 그때의 시간이다), 실온에서, 하나 또는 그 이상의 T 세포 마커(예컨대, CD3, CD4, CD8)의 적어도 약 80%를 유지될 수 있다. 메트릭의 다른 하나의 예시는, 보존 세포 및/또는 안정화 세포에서 검출되거나 및/또는 회수된 하나 또는 그 이상의 핵산의 양 및/또는 질이 될 수도 있다.
일부 실시들에서, 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물과 시료의 부피 및/또는 무게 비율은 약 1:10 내지 약 10:1, 약 1:10 내지 약 1:1, 및/또는 약 1:10 내지 약 1:5일 수 있다. 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물은 시료 밀리리터 및/또는 그램 당 약 10 ㅅg 내지 약 10 mg의 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물의 비율로 시료에 혼합될 수 있다. 일부 실시들에 따르면, 시료를 보존하거나 및/또는 안정화시키기 위해서 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물을 시료(예컨대, 시료가 함유되어 있는 관(시료가 존재하고 있는 혈관 등))에 첨가할 수 있다. 일부 실시들에서, 시료를 보존하거나 및/또는 안정화시키기 위해서, 시료를 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물 (예컨대, 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물을 함유하고 있는 관(vessel))에 첨가할 수도 있다. 일부 예시에 따르면, 시료를 보존하거나 및/또는 안정화시키기 위해서 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물과 세포를 같은 시간에 서로 첨가할 수도 있다. 예를 들어, 둘 모두를 다른 비어있는 혼합 관에 첨가할 수도 있다.
당업계의 기술자에 의해 이해될 수 있는 바와 같이, 본 발명의 실시에 따르는 세포 및/또는 거대분자 및/또는 생물분자를 보존하고 및/또는 안정화시키기 위한 다른 등가의 또는 대체 조성물, 시스템 및 방법은, 그들의 필수적인 특징들에서 벗어나지 않고 계획될 수 있다. 예를 들어, 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물은 가루, 입자, 알약, 캡슐, 액체, 시럽, 페이스트로 제형될 수 있다. 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물은 어느 활용가능한 방법으로 간단한 컨테이너에 침적될 수도 있다. 예를 들어, 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물은 거대분자-함유 시료가 도입되기 전에, 시료 컨테이너의 내부면에 (예컨대, 분무 또는 분무-건조에 의해) 도포될 수도 있다. 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물은 또한 시료 컨테이너에 고체 또는 액체 형태로 간단하게 배치될 수도 있다. 또는, 시료를 시료 컨테이너에 넣고 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물을 다른 컨테이너에 보관한 다음, (추후에) 시료와 접촉만 시킬 수도 있다. 또한, 제공되었던 범위에서, 본 발명의 최종단계가 정확하게 처리되거나 및/또는 구체적인 실시에 의해 바라거나 요구되는 바와 같이 측정될 수도 있다. 게다가, 일부 실시들에서, 그것은 최종단계의 범위를 혼합하고 매치하는데 바람직할 수도 있다. 일부 실시들에서, 수적인 값을 적용할 때, 용어, "약"은, 수적인 값(이하, 수치) ㅁ 그 값의 약 1%, ㅁ 그 값의 약 5%, ㅁ 그 값의 약 10%, ㅁ 그 값의 약 25%, 및/또는 ㅁ 그 값의 약 50%를 의미한다. 일부 실시들에서, 수치가 말단 범위로 제공될 때, 용어 "약"은, 범위의 연장선상에 의존적으로 다소 융통성을 가질 수도 있다. 예를 들어, 만약 범위가 단수의 크기로 이루어진다면(예컨대, 약 1 내지 약 10), "약"은 융통성을 덜 가질 것이다. 그러나, 소수의 크기로 이루어진 범위라면(예컨대, 약 0.1 내지 약 100), 말단은 더 융통성을 가질 수도 있다. 일부 실시들에서, 용어 "최대(up to)"를 포함하는 농도 범위는(예컨대, 최대 1 mM의 NaCl), 영점(zero)보다 많은 함량에 도달하는 낮은 말단점(예컨대, 모든 미량의 NaCl)을 포함할 수 있다. 일부 실시들에서, 용어"최대"는, 특수화된 물질의 함량이 영점이 아닌 함량으로 존재하는 것으로 생각되고 및/또는 요구된다. 용이한 변이 및 변형에 따른 등가물 및 대체물은 본 발명의 범위 내에 포함되어야 한다. 본 발명은 본 발명의 범위를 기술한 것이나, 이에 한정되지 않는다. 첨부된 청구범위는 본 발명의 범위를 유사하게 묘사한 것이나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 몇몇 구체적인 실시들은 하기의 구체적인 구현예(실시예)를 참조함으로써 적어도 일부분을 이해할 수 있을 것이다. 이들 예시들은 일부(전부는 아님), 본 발명의 일부 실시들의 관점 및 추가적인 변형들을 묘사한 것으로, 이들은 본 발명의 이익을 갖는 당업계의 기술자에게 명백할 것이다.
본 발명의 일부 예시들은, 하기의 명세서의 상세한 설명 및 관련 도면을 참 조함으로써 일부분 이해할 수 있을 것이다. 여기에서:
도 1은 본 발명의 실시에 따라 보존된 뇨의 DNA 농도의 막대 그래프이고;
도 2는 본 발명의 실시에 따라 보존된 뇨의 8일간의 순차적인 데이터의 그래프이고,
도 3은 본 발명의 실시에 따라 비보존된 정상뇨 및 보존된 정상뇨의 PCR 결과를 비교한 그래프이고;
도 4는 본 발명의 실시에 따라 보존된 혈청의 8일간이 순차적인 데이터의 그래프이고;
도 5는 본 발명의 실시에 따라 보존된 혈청의 DNA 농도 그래프이고;
도 6은 본 발명의 하나의 실시에 따른 DNA를 보존하기 위한 시스템을 도식화한 것이고;
도 7은 PCR 분석검사에서 신호 응답의 비교를 그래프화하여 도시한 것으로, 여기에서 DNA는 본 발명의 보존제로 처리된 것과 그렇지 않은 것이고;
도 8은 본 발명의 시약이 다양한 저장 조건에 대상화된 혈장 시료에 대한, 분지된 DNA 분석 검사의 신호 응답을 향상시키는지에 대한 효능성을 도시한 것이고;
도 9는 본 발명의 시약이 가지쳐나온 혈장 시료의 DNA 분석 검사의 신호 응답을 향상시키는지에 대한 효능성을 도시한 것이고;
도 10은 보존되지 않은 혈청에 대한 간염 B 서열 MD03/06의 PCR 증폭 분석검사상의 PCR 흡광도에서 met-헤모글로빈의 간섭을 보여주는 그래프이고;
도 11은 본 발명의 보존제로 처리된 혈청에 대한 간염 B 서열 MD03/06의 PCR 증폭 분석검사상의 PCR 흡광도에서 met-헤모글로빈의 간섭을 보여주는 그래프이고;
도 12A는 MD03과 MD06 프라이머들 및 완충용액 (비보존), 구아니딘 단독, EGTA 단독, 또는 EGTA+구아니딘과 접촉시킨 혈청의 간염 B 주형을 이용하여 시료를 PCR 증폭시킨 결과를 보여주는 차트이며;
도 12B는 MD03과 MD06 프라이머들 및 완충용액 (비보존), EDTA 단독, 과염소산나트륨 단독, 또는 EDTA+과염소산나트륨과 접촉시킨 혈청의 간염 B 주형을 이용하여 시료를 PCR 증폭시킨 결과를 보여주는 차트이며;
도 12C는 MD03과 MD06 프라이머들 및 완충용액 (비보존), EGTA 단독, 과염소산나트륨 단독, 또는 EGTA+과염소산나트륨과 접촉시킨 혈청의 간염 B 주형을 이용하여 시료를 PCR 증폭시킨 결과를 보여주는 차트이며;
도 12D는 MD03과 MD06 프라이머들 및 완충용액 (비보존), EDTA 단독, 과염소산나트륨 단독, 또는 EDTA+티오시안산나트륨과 접촉시킨 혈청의 간염 B 주형을 이용하여 시료를 PCR 증폭시킨 결과를 보여주는 차트이며;
도 12E는 MD03과 MD06 프라이머들 및 완충용액 (비보존), EGTA 단독, 과염소산나트륨 단독, 또는 EGTA+티오시안산나트륨과 접촉시킨 혈청의 간염 B 주형을 이용하여 시료를 PCR 증폭시킨 결과를 보여주는 차트이며;
도 12F는 MD03과 MD06 프라이머들 및 완충용액 (비보존) 또는 BAPTA 단독과 접촉시킨 혈청의 간염 B 주형을 이용하여 시료를 PCR 증폭시킨 결과를 보여주는 차 트이며;
도 13A-13G은 뇨를 실온에 보관된 다음, 일부 구성성분을 본 발명의 시약에 개별적으로 추가하여 PCR 검출을 하면 임균성 DNA의 보존 효과가 없다는 것을 보여주는 그래프이며;
도 14A는 시토신 단독 또는 티오시안산나트륨 + EDTA + 시토신을 접촉시킨 신선한 뇨를 임균성 DNA 주형을 이용하여 PCR 증폭한 결과를 보여주는 차트이며;
도 14B는 구아닌 단독 또는 티오시안산나트륨 + EDTA + 구아닌을 접촉시킨 신선한 뇨의 임균성 DNA 주형을 이용하여 PCR 증폭한 결과를 보여주는 차트이며;
도 14C는 티민 단독 또는 티오시안산나트륨 + EDTA + 티민을 접촉시킨 신선한 뇨의 임균성 DNA 주형을 이용하여 PCR 증폭한 결과를 보여주는 차트이며;
도 14D는 우라실 단독 또는 티오시안산나트륨 + EDTA + 우라실을 접촉시킨 신선한 뇨의 임균성 DNA 주형을 이용하여 PCR 증폭한 결과를 보여주는 차트이며;
도 15A는 1 M 아데닌, 1 M 티오시안산나트륨, 1 M EDTA, 또는 1 M 티오시안산나트륨 + 0.01 M EDTA + 1 M 아데닌을 접촉시킨 신선한 뇨의 임균성 DNA 주형을 이용하여 PCR 증폭한 결과를 보여주는 차트이며;
도 15B는 1 M 아데닌, 1 M EDTA, 2 M 티오시안산나트륨+1 M EDTA, 또는 2 M 티오시안산나트륨+ 1 M EDTA + 1 M 아데닌을 접촉시킨 신선한 뇨의 임균성 DNA 주형을 이용하여 PCR 증폭한 결과를 보여주는 차트이며;
도 15C는 1 M 아데닌, 1 M 구아니딘, 1 M 구아니딘+0.01 M EDTA, 2 M 티오시안산나트륨+1 M EGTA, or 1 M 구아니딘·HCl+1 M EGTA + 2 M 아데닌을 접촉시킨 신선한 뇨의 임균성 DNA 주형을 이용하여 PCR 증폭한 결과를 보여주는 차트이며;
도 15D는 1 M 아데닌, 1 M 구아니딘, 1 M 구아니딘 + 0.01 M EDTA, 1 M 염화리튬+1 M BAPTA, 또는 2 M 티오시안산 구아니딘 + 1 M BAPTA + 2 M 아데닌을 접촉시킨 신선한 뇨의 임균성 DNA 주형을 이용하여 PCR 증폭한 결과를 보여주는 차트이며;
도 15E는 1 M 과염소산나트륨, 1 M 티오시안산나트륨 + 2 M EDTA, 또는 1 M 과염소산나트륨 + 1 M EDTA을 접촉시킨 신선한 뇨의 임균성 DNA 주형을 이용하여 PCR 증폭한 결과를 보여주는 차트이며;
도 16A는 1 M 구아니딘·HCl 또는 1 M 구아니딘·HCl + 0.01 M BAPTA + 4 M 아데닌을 접촉시킨 신선한 뇨의 임균성 DNA 주형을 이용하여 PCR 증폭한 결과를 보여주는 차트이며;
도 16B는 0.01 M EDTA, 2 M 티오시안산나트륨, 1 M 티오시안산나트륨 + 0.1 M EDTA + 1 M 아데닌, 또는 2 M 티오시안산나트륨+0.1 M EGTA + 2 M 아데닌을 접촉시킨 신선한 뇨의 임균성 DNA 주형을 이용하여 PCR 증폭한 결과를 보여주는 차트이며;
도 17A는 세포를 테스트 조성물(예컨대, 본 발명의 실시예 예시 또는 대조군)과 접촉시키고 유세포 분석을 한 다음의 CD3 백분율의 플랏이며;
도 17B는 세포를 테스트 조성물(예컨대, 본 발명의 실시예 예시 또는 대조군)과 접촉시키고 유세포 분석을 한 다음의 CD4 백분율의 플랏이며;
도 17C는 세포를 테스트 조성물(예컨대, 본 발명의 실시예 예시 또는 대조 군)과 접촉시키고 유세포 분석을 한 다음의 CD3의 절대 계수(coun t)의 플랏이며;
도 18은 시료를 테스트 조성물(예컨대, 본 발명의 실시예 예시 또는 대조군)과 접촉시킨 다음의 총 RNA 수율(곡선의 면적을 측정)의 플랏이며;
도 19A는 PAXgene™ 조성물과 접촉시킨 RNA-함유 시료의 전기이동그림(electropherogram)이며;
도 19B는 EDTA 조성물과 접촉시킨 RNA-함유 시료의 전기이동그림(electropherogram)이며;
도 19C는 본 발명의 실시의 특유의 예시에 따르는 조성물과 접촉시킨 RNA-함유 시료의 전기이동그림(electropherogram)이며; 및
도 19D는 본 발명의 실시의 특유의 예시에 따르는 조성물과 접촉시킨 RNA-함유 시료의 전기이동그림(electropherogram)이다.
실시예 1
도 1은 본 발명의 실시에 따라 보존되거나 및/또는 안정화시킨 뇨의 DNA 농도의 막대그래프이다. 뇨 검체의 열 가지 형태의 많은 형질전환체들을 GTT를 이용하여 테스트하고, 시간마다 계수한 다음, 요약하였다. 표준 Gonostat 프로토콜 (실시예 2 참조, 인프라)을 적용하였으며, 사용한 보존제는 1M 구아니딘 HCl/0.01M EDTA였다. 200 콜로니 수는 보존된 총 검체수를 나타낸 것이다. 보존된 뇨에서의 임균성 형질전환체의 수는 4시간의 테스트를 통해 200에 도달하는 상대적인 상수로 유지되었다. 뇨 검체의 여러 형태 사이에서 발견되는 보존의 수준의 차이는 없었 다. 그러므로, 테스트된 예시 조성물은 뇨 DNA를 거의 모두 보존하였다.
실시예 2
도 2는 본 발명의 실시에 따라 보존되거나 및/또는 안정화시킨 뇨의 8일 간의 GTT 순차적인 데이터의 그래프이다. 1 pg의 임균성 DNA를 9 mL의 인간의 신선한 뇨 및 1M 과염소산나트륨과 0.01M EGTA을 함유하고 있는 거대분자 안정화 조성물 수용액 1 mL에 섞었다. 300 ㎕를 Gonostat(성기능이 억제된-상품명) 생물이 깔린 플래이트(lawn of Gonostat organism)에 8일 동안 24시간 간격으로 똑똑 떨어트렸다. 상기 플래이트에는 BBL 초콜렛 II 아가가 포함되어 있으며, 이를 37℃에서 24시간 동안 배양한 후 계측하였다. 8일의 테스트 기간 동안 관찰한 콜로니 수는 188개에서 197개의 범위였다. 따라서, 본 발명의 실시예들은 이전에 제공된 기간보다 상당히 긴 기간 동안 뇨의 DNA를 보존 및/또는 안정화시킬 수 있다.
실시예 3
도 3은 본 발명의 일 실시에 따라 비보존된 정상 뇨와 보존된(보존되거나 및/또는 안정화시킨) 정상 뇨의 PCR 결과를 비교한 그래프이다. 클라미디아 트라쵸마티스(Chlamydia trachomatis) MOMP 주형을 사용하여, 표준 PCR 프로토콜을 이용하여 증폭시켰다. 200 카피(복제물)의 MOMP 표적(주형 표적)을 1M 과염소산나트륨 및 0.01M BAPTA가 함유된 9 mL의 신선한 인간의 뇨에 섞었다. 각각 1시간씩 총 8시간 동안 PCR을 수행하였다. 비보존(본 발명의 조성물을 사용하지 않은) 뇨에서, 뇨 에 DNA를 첨가한 후 한 시간째에 대략 3 정도의 PCR 흡광도가 측정되었다. 6 시간째에 PCR 흡광도 수치가 영점(zero)에 이르렀다. 대조적으로, 보존된 및/또는 안정화시킨 검체에서는, 테스트 한 시간째에 측정된 PCR 흡광도는 3을 초과하였다. 그러나, 6 시간째에도 여전히 대략 3 정도의 PCR 흡광도가 관찰되었다. 그러므로, 본 발명의 실시들은 비보존된 뇨의 테스트 한계를 넘어, PCR 테스트가 잘 수행되도록 DNA와 핵산 서열을 충분히 보존 및/또는 안정화시킬 수 있을 것이다.
실시예 4
본 발명의 시약들과 방법들은 혈청 등의 기타 체액들과 배설물들을 보존하기위해 사용될 수 있다. 도 4는 본 발명의 일 실시에 따라 보존된 및/또는 안정화된 혈청에서의 8일 간의 순차적인 데이터의 그래프이다. 프로토콜은 신선한 인간 혈청을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 3에서 사용한 것과 유사하다. 8일의 테스트 기간 동안 관찰한 형질전환체 콜로니 수는 110개에서 대략 92개(7일 째 측정치)의 범위였다. 사실상, 이 테스트 결과에서 형질전환체 콜로니 수가 7일과 8일 사이 증가되는 것으로 관찰되었다. 따라서, 본 발명의 일부 실시들은 종래의 가능한 기간보다 상당히 긴 기간 동안 혈청의 DNA를 보존 및/또는 안정화시킨다.
실시예 5
도 5는 본 발명의 일 실시에 따라 보존된 및/또는 안정화시킨 혈청의 DNA 농도 그래프이다. 혈청은 1M 구아니딘 HCl/0.01M EDTA을 함유하는 거대분자 안정화 조성물로 보존되거나 및/또는 안정화되었다. 프로토콜은 신선한 인간의 혈청을 사용한 것과 연구 기간이 10 시간인 것을 제외하고는 실시예 3과 유사하였다. 120개를 초과한 형질전환체들이 임균성 DNA를 혈청에 첨가한 그 때에 측정되었다. 6시간의 측정 동안 대략 100개의 형질전환체가 계수되었다. 그러나, 10 시간째의 테스트 결과에서, 보존된 혈청의 경우에 생물학적으로 활성적인 DNA가 대략 110개의 형질전환체 콜로니로 증가된 것으로 나타났다.
실시예 6
DNA를 보존하기 위한 방법(10)의 하나의 실시 예를 도 6에서 도식화하여 나타내었다. 이 프로토콜은 아래 표 1에 기술하였으며, 뇨 검체를 이용하여, PCR, 제한효소 단편 장다형 분석검사(restriction fragment length polymorphisms assay (RFLP)), 및 핵산 프로브의 테스트 방법에 적합한 DNA/RNA의 높은 수율을 산출하는 것으로 관찰되었다.
| 1. | 10 mL의 깨끗하게 채취한 뇨(16)를 2가 금속 킬레이트 화합물(12)와 킬레이트 화합물을 향상시키는 구성성분(14)을 함유하는 검체 테스트 튜브(18)에 첨가하였다. 뇨가 섞이도록 테스트 튜브를 위아래로 2-3회뒤집었다. |
| 2. | 테스트 튜브를 실험실로 수송하였다. 냉장할 필요는 없다. 참고: 테스트 튜브를 직사광선을 피해 차가운 곳에 보관해야 한다. |
| 3. | 실험실에서, 테스트 튜브를 10분 동안 3200rpm으로 원심분리하였다(20). |
| 4. | 멸균 전달 피펫을 이용하여, 테스트 튜브의 바닥에 있는 펠렛(22)을 완충용액(24)를 함유하는 다른 테스트 튜브에 옮겼다(가능한한 거의 대부분의 뇨가 펠렛물질과 함께 전달되어서는 안된다) |
| 5. | 테스트(28)할 때까지 완충용액에 녹인 물질(펠렛)을 2-8℃에 저장(26)하였다 |
| 6. | 분석검사를 수행하는데 필요한 검체 크기는, 사용되어온 개별적인 테스트 방법학 및 개별적인 테스트 프로토콜 상에서 확정되었다. |
실시예 7
모의 임상 검체에서 DNA 보존
하기의 실험에서, 모의 임상 뇨 검체를 생산하고 임균성 DNA가 존재하는 지 테스트하였다. 건강한 성인의 뇨 검체에 아래 표 2에 나열한 화학물질(EDTA 등)을 종래에 기술한 농도로 첨가하였다.
임균 현탁물을 각각의 뇨 검체에 즉시 첨가하였다. 첨가된 임균은 통상적인 스트레인 N. 고노호애, 49191(N. gonorrhoeae, 49191)으로서, GC 아가 배지에 37℃, 5% CO2 기압에서 밤샘동안 키웠다. N. 고노호애 콜로니를 취한 다음, GC 완충용액에 현탁하였다. 대략 ml당 10 콜로니 형성 단위(cfu)를 함유하고 있는 현탁액 의 1/10 부피를 뇨에 첨가하였다. 또한, 양성 대조군으로서, 임균 현탁물을 Hepes 완충용액에 첨가하였다.
모든 모의 임상 검체와 Hepes 대조군을 0 시간 즉, 화학물질과 임균을 첨가한 시간에 테스트하였다. 또한, 검체와 대조군을 실온에서 6일 동안 저장한 후에도 테스트하였다. 이 6일의 기간은 환자의 검체를 수집하고, 우송(mailing)하고, 테스트하는데 까지 예상되는 최대 시간에 근접하게 선별된 것이었다.
라우릴황산나트륨(Sodium dodecyl sulfate (SDS); 소듐 도데실 술폰산염) 및 사르코실(Sodium Lauryl Sarcosinate)을 함유하는 뇨 시료를 제외하고, 모의 검체와 Hepes 대조군은 하기의 방법으로 처리하였다:
1. 10 mL의 양을 4000 rpm에서 30 분 동안 원심분리하였다.
2. 상등액을 버리고, 펠렛을 1 mL의 인산염 완충용액에 현탁하였다.
3. 현탁액을 10분 동안 60℃ 온탕기에서 가열하였다.
4. 차갑게 식힌 후에, 현탁액을 GTT에 사용하였다.
SDS-EDTA 또는 사르코실-EDTA를 함유하는 모의 뇨 검체는 하기와 같이 처리하였다:
1. 대략 2 1/2 부피의 (대략 25 mL) 95% 에틸 알콜을 뇨와 거대분자 안정화 조성물이 든 튜브에 첨가하였다. 튜브를 거꾸로 몇 차례 뒤집어서 내용물을 혼합하였다.
2. 혼합물을 4000 rpm에서 30분 동안 원심분리하였다.
3. 펠렛을 10mL의 알콜에 현탁한 후 원심분리하였다.
4. 그런 다음, 펠렛을 1 mL의 인산염 완충용액으로 현탁하였다.
5. 현탁액을 60℃ 온탕기에서 10분 동안 가열하였다.
4. 차갑게 식힌 후에, 현탁액을 GTT에 사용하였다.
접종한 뇨를 실온에 6 일 동안 저장한 후에 테스트하였다. 접종한 뇨의 임균성 DNA를 6일 동안 Hepes 완충용액에서와 같은 정도로 보존된 및/또는 안정화시킨 (+) 제형 또는 보존되지 않은 및/또는 안정화시키지 않은 (-) 제형을 나타내었다. 비록 GonostatTM 분석검사가 세미-질량평가(semi-quantitated)는 될 수 있지만, 거대분자 안정화 조성물의 상대적인 효능성을 평가하기 위한 것은 아니었다. 따라서, 표 2의 결과는, 특유의 화학물질이 6일 동안의 기간에 걸쳐 Hepes 완충용액과 동일한 정도로 뇨의 DNA를 보존하거나 및/또는 안정화시키는지를 나타낸다.
| 거대분자 안정화 조성물 | ||
| + | - | |
| 0.01M EDTA + 구아니딘 염화수소산염 (1M) | 과요드산나트륨 (1M) | |
| 0.01M EDTA + 구아니딘 티오시안산염 (1M) | 트리클로로아세트산(1M) | |
| 0.01M EDTA + 염화리튬 (1M) | 우레아 (1M) | |
| 0.01M EDTA + 염화 망간 (1M) | ||
| 0.01M EDTA + 사르코실 (1% w/v) | ||
| 0.01M EDTA + SDS (1% w/v) | ||
| 0.01M EDTA + 과염소산나트륨 (1M) | ||
| 0.01M EDTA + 살리실산나트륨 (1M) | ||
| 0.01M EDTA + 티오시안산나트륨 (1M) | ||
남성의 뇨 검체로 (실시하여) 나타낸 92% 민감성은 문헌에 보고된 배양 결과와 비교할 만하다. 게다가, 여성 뇨 검체로 (실시하여) 나타낸 88% 민감성은 종래에 보고된 수준을 초과한다.
본 발명의 바람직한 실시로써, 임균성 DNA의 보존에 관한 것으로, 본 발명이 해모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) 및 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)의 DNA 등의 기타 다른 형태의 DNA 보존에 사용하기에 적합할 것임은 당업계의 기술자에게는 명백할 것이다. 그러한 보존된 RNA는 바이러스성 절편들과 인간 유전자 서열 테스트를 위한 RNA 전사효소 및 역전사효소의 분석검사에 사용될 수도 있다.
더군다나, 비록 거대분자 안정화 조성물을 체액, 예컨대, 뇨 검체에 첨가할 수 있으나, 또한 보존/안정화의 효능성에 손실을 주지 않으면서, 뇨 검체를 거대분자 안정화 조성물에 첨가할 수도 있다. 최적의 DNA 보존은, 본 발명의 단일의 거대분자 안정화 조성물을 검체에 첨가하여 수행될 수 있다.
실시예 8
페니실린 분해효소를 생산하는 네이세리아 고노래(
Neisseria gonorrhea
)(PPNG)의 PCR 검출
본 발명의 거대분자 안정화 조성물의 PCR 신호를 향상시키는 효과(PCR signal-enhancing effect)를 하기의 예시로 기술하였다. PPNG에서 4 가지 TEM-암호화 플라스미드 변이체를 발견하였다. 6.7 kb (4.4 MDa)의 아시안 형, 5.1 kb (3.2 Mda)의 아프리카 형, 4.9 kb (3.05-Mda)의 토론토 형 및 4.8 kb (2.9-Mda) 리오 형이 있다. PPNG에 대한 이 PCR 분석검사는 TEM-1 유전자가 트랜스포손 Tn2의 말단에 인접하여 위치한다는 사실, 즉, TEM-1 유전자에 한 프라이머를 사용하고 Tn2 말단 범위 밖의 서열에 다른 프라이머를 사용하며, 4 가지 플라스미드 모두에 공통적인, PCR 산물이 오직 플라스미드에서 얻어지는 것이지 TEM-1을 암호하는 플라스미드로부터 얻어지는 것은 아니라는 사실의 이점을 가진다(표 3, 아래). 이 프로토콜과 연관된 조건들은 혼성화에서 거대분자 안정화 조성물을 포함하도록 변형되었으며, 처리된 프로브(probe)는 표준 PCR 프로토콜 당 761 bp의 증폭 산물과 혼합하였다. 그 결과는 A450 nm에서 측정하였다.
재료 및 시약
BBL 초콜렛 11 아가 플래이트들
멸균 Tris 완충용액 10 mM Tris (pH 7.4), 1 mM EDTA
0.5-mL Gene Amp 반응 튜브(PCR 용 튜브)
소모성(1회용) 멸균 파스퇴르 피펫 팁
공기주입방지 팁(Aerosol-resistant tips)
PCR 마스터 믹스:
50 mM KCl
2 mM MgCl
각각 50 μM의
데옥시리보뉴클레오사이드 3인산;
2.5 U의 Taq 폴리머라아제(Perkin Elmer);
5% 글리세롤;
각각 50 pmol의 PPNG-L 및 PNG-R 프라이머 (100 ㎕ 반응 당)
변성 용액
1M Na 5X Denhardt's 용액
전-혼성화 용액
5X SSC(1X SSC는 0.015 M NaCl + 0.015 M 나트륨 시트래이트임);
5X Denhardt's 용액;
0.05% SDS;
0.1% 나트륨 Ppi, 및
mL 당 100 g의 초음파 분쇄한 연어 정자
혼성화 용액
Denhardt's 용액은 함유되어 있지 않지만 200㎕의 거대분자 안정화 조성물 1이 포함되는 것을 제외하고는 전-혼성화 용액과 동일.
1 mL의 DNA/RNA 거대분자 안정화 조성물 (1M 구아니딘 HCl/0.01M EDTA)
아비딘-HRP 퍼옥시다아제 복합체 (Zymed)
자석 미세입자(Magnetic microparticles (Seradyne))
| 기능 | 이름 | 뉴클레오타이드 서열 5' 에서 3' |
| 프라이머 | PPNG-L | AGT TAT CTA CAC GAC GG (서열번호 제 1) |
| 프라이머 | PPNG-R | GGC GTA CTA TTC ACT CT(서열번호 제 2) |
| 프로브 | PPNG-C | GCG TCA GAC CCC TAT CTA TAA ACT C(서열번호 제 3) |
방법
시료 준비: 초콜렛 아가 플래이트에서 2개의 콜로니를 선택하였다. PCR 세팅하기 바로 전에 이온화시킨 물에 콜로니들을 현탁하였다. 상기 방법에 따라 마스터 믹스를 준비하였다. 95㎕의 마스터 믹스에 신선하게 준비한 5㎕의 박테리아 현탁액을 첨가하였다. 써모사이클러(thermocycler)에서 94℃에서 3분 및 55℃에서 3분으로 이루어진 주기를 3회 실시하여 DNA를 유리시키고, 변성시켰다. 하기의 두 단계를 이용하여 써모사이클러에서 DNA를 증폭시켰다: 95℃, 25초 동안 변성 및 55℃에서 25초 동안 어닐링(annealing)을 총 30회 반복. 두 온도 사이에 가장 빠른 어닐링이 가능하도록 두 온도의 안정기 상태 사이의 시간을 세팅하였다. (아비딘-HRP 복합체로) 라벨한 검출 프로브 PPNG-C 15 pmol을 거대분자 안정화 조성물이 있는 자기성 미세입자 및 거대분자 안정화 조성물이 없는 자기성 미세입자가 결합된 혼성화 용액에 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 그런 다음, 대조군과 처리된 프로브를 증폭 산물에 첨가하여 그 반응을 A450nm에서 측색법의 방법으로 검출하였다. 본 발명의 거대분자 안정화 조성물로 처리된 혼성화 프로브들의 신호는 처리되지 않은 프로브들보다 상당히 높아진 것으로 밝혀졌다.
실시예 9
본 발명의 일부 실시들에 따른 조성물, 시스템, 및 방법은, 중합효소 연쇄반응(PCR), LCX, 및 유전자 형질전환 테스팅(GTT) 등의 핵산 테스트 방법으로 얻어지는 신호를 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 조성물, 시스템, 및 방법은 PCR과 같은 핵산 테스트 방법에서 혼성화를 증가시킬 수 있다. 도 7은 페니실린분해효소를 생산하는 네이세리아 고노래(Neisseria gonorrhea (PPNG))의 DNA와 PPNG-C 프로브의 혼성화상에서 혼성화가 향상되어 획득된 본 발명의 거대분자 안정화 조성물의 구체적인 실시예를 나타내었다. PCR 프로토콜은 실시예 10에서 기술한 것과 동일하였다.
실시예 10
도 8과 도 9는, 분지된 DNA 분석검사(Chiron)의 핵산 테스트 방법으로 획득된 결과를 향상시키는, 본 발명의 조성물, 시스템, 및 방법의 구체적인 실시예의 효능성을 나타낸 것이다. 도 8의 테스트에서, bDNA 분석검사는 거대분자 안정화 조성물들의 보존효과를 평가하기 위하여 사용되었다. 간염 C 바이러스의 DNA 서열을 혈청과 혈장에 섞었다. 보존된 혈청과 혈장을 9 mL의 혈청이나 혈장 및 1 mL의 거대분자 안정화 조성물과 혼합하였다. 제형은 하기를 이용하였다: 1) 1 M 구아니딘 HCl/0.01M EDTA, 2) 1 M 과염소산나트륨/0.01M BAPTA, 3) 1 M 티오시안산나트륨/0.01M EGTA, 및 4) 1 M 염화리튬/0.01 M EGTA. 4℃에서 그 제형을 여러 날 보관하였다. bDNA 분석검사는 혼성화에 의존하는데 즉, 표적 서열의 분해를 보호할 뿐만 아니라, 표적 서열의 혼성화/어닐링을 나타내는 흡광도 결과의 2배 이상의 흡광도 결과들을 명확하게 확인할 수 있다.
도 9는 혈청 대 혈장의 연구를 나타낸 것이다. 50㎕의 신선한 인간의 혈장과 1 mL의 신선한 인간 혈청 시료는 1M 구아니딘 HCl/0.01M EDTA로 보존하고, 20℉에서 48시간 동안 보관한 다음, 이 시료에 대한 bDNA 분석검사를 실시하였다. 표적 서열의 분해를 보호할 뿐만 아니라, 표적 서열의 혼성화/어닐링을 나타내는 흡광도 결과의 2배 이상의 흡광도 결과들을 명확하게 확인할 수 있다.
실시예 11
메트-헤모글로빈과 같은 헴(Heme) 성분은 핵산의 PCR 증폭을 간섭하는 것으로 관찰되었다. 예를 들어, 도 10은 실시예 10에 따라 수행된 PCR 분석검사의 시리즈 결과들을 보여주는 것으로, 상기 주형인 신선한 인간 혈청을 메트-헤모글로빈의 함량을 증가시키면서 섞었다. 결과에서 알 수 있듯이, (메트-헤모글로빈 농도가 높을수록) 메트-헤모글로빈 농도의 기능에 의해 흡광도가 감소되었다. 가장 높은 농도에서, 흡광도(즉, 증폭)가 전혀 관찰되지 않았다.
본 발명의 거대분자 안정화 조성물은, 혈청으로 분석한 PCR 분석검사 상에서 헴 성분(예컨대, 메트-헤모글로빈)에 의한 간섭을 제거할 수 있다. 도 11은 1 M 티오시안산나트륨 및 0.1 M EDTA을 포함하는 거대분자 안정화 조성물을 혈청시료에 첨가하여 얻은 결과(즉, 흡광도 (A450)에서 측정된 증폭이 증가된 결과)를 나타낸 것이다. 대조군(도 10)에서와 마찬가지로, 혈청 시료를 10 dl/mL의 농도까지 증가시킨 메트-헤모글로빈 함량과 섞었다. 순차적인 PCR 분석검사를 4 시간 이상 수행하였다.
실시예 12
2가 금속 킬레이트 화합물과 킬레이트 화합물을 향상시키는 구성성분을 포함하는 조성물의 예시는 혈청의 간염 B 서열의 보존에 놀랄만한 상승효과를 가졌다. 특이적으로, 실온에서 간염 B 주형을 최대 36시간까지 테스트 조성물(예컨대, 1M 과염소산나트륨/0.01M EGTA)과 접촉시켰다. 실시예 10에 기술한 PCR 프로토콜 예시를 이용하여 시료들을 MD03과 MD06 프라이머로 PCR 증폭을 수행하였다. 얻어진 결과들을 도 12A-12F에 나타내었다. 이 도들은, 공동적으로, 본 발명의 거대분자 안정화 조성물의 구체적인 실시 예들로서, EGTA 혹은 과염소산나트륨의 각각의 첨가에 비해, 간염 B 서열의 보존 및/또는 증폭이 증가됨을 보여준다.
실시예 13
도 13은, 실온에 보관하고, 각각 하기에 제공한 본 발명의 시약 성분을 첨가하여 PCR 검출을 실시한 뇨의 임균성 DNA에 대한(상대적으로 적당한) 보존적인 효과를 나타내었다: 2가 금속 킬레이트 화합물 0.01M BAPTA (도 13A), 0.01M EDTA (도 13B), 0.01M EGTA (도 13C); 및 킬레이트 화합물을 향상시키는 구성성분 1M 과염소산나트륨 (도 13D), 1M 살리실산 (도 13E), 1M 구아니딘 HCl (도 13F), 1M 티오시안산나트륨 (도 13G), 및 염화리튬 (도 13H). GTT를 이용하여 10 가지 형태의 뇨 검체의 형질전환체 수를 테스트하고, 시간별로 계수한 다음, 이를 요약하였다. 뇨를 실온에 보관한 다음 PCR 검출을 실시하여 보존된 뇨의 임균성 DNA에 대하여 표준 Gonostat 프로토콜 (실시예 2 참조, 인프라)을 적용한 다음, 2가 금속 킬레이트 화합물과 킬레이트 화합물을 향상시키는 구성성분의 조합으로 획득한 상승효과를 나타내었다.
실시예 14
티오시안산나트륨 (1 M) 및 EDTA (0.1 M)을 함유하거나 함유하지 않는, 퓨린 염기 또는 피리미딘 염기(1 M)을 포함하는 조성물을 제조하였다. 인간의 신선한 뇨 시료들을 수집하여, 1 pg의 임균성 DNA와 섞고, 상기 언급한 조성물 중의 하나와 혼합하여, 실온에서 배양하였다. 8시간 후에 분할물(Aliquots)을 옮기고 증폭가능한 임균성 DNA가 있는지 PCR을 이용하여 테스트하였다. PCR 프로토콜은 실시예 10에 기술한 것과 동일한 것이다. 도 14에 나타낸 바와 같이, 티오시안산나트륨, EDTA, 및 퓨린 또는 피리미딘 염기를 포함하는 조성물들은 퓨린 또는 피리미딘 염기를 단독으로 포함하는 조성물보다 효과적으로 뇨의 임균성 DNA를 안정화시켰다.
실시예 15
티오시안산나트륨, EDTA, 및/또는 아데닌을 함유하는 조성물들을 제조하였다. 인간의 신선한 뇨 시료를 수집한 다음, 1 pg의 임균성 DNA와 섞고, 상기 언급한 조성물 중의 하나와 혼합하여 실온에서 배양하였다. 8 시간 후에 분할물을 옮기고 증폭가능한 임균성 DNA가 있는지 테스트하였다. PCR 프로토콜은 실시예 10에 기술한 것과 동일한 것이다. 도 15A에 나타낸 바와 같이, 티오시안산나트륨, EDTA, 및/또는 아데닌을 함유하는 조성물들은 일반적으로 세 가지 모든 구성성분 미만의(두 가지 이하의) 구성성분을 함유하는 조성물보다 효과적으로 뇨의 임균성 DNA를 안정화시켰다. 다만, 티오시안산나트륨과 EGTA가 함유된 조성물에서는 예외적인 것으로 관찰되었다.
실시예 16
과염소산나트륨, 염화리튬, 구아니딘 HCl, 구아니딘 티오시안산염, EDTA, EGTA, BAPTA, 및/또는 아데닌을 함유하는 조성물들을 제조하였다. 인간의 신선한 뇨 시료를 수집한 다음, 1 pg의 임균성 DNA와 섞고, 상기 언급한 조성물 중의 하나와 혼합하여 실온에서 배양하였다. 8 시간 후에 분할물을 옮기고 증폭가능한 임균성 DNA가 있는지 테스트하였다. PCR 프로토콜은 실시예 10에 기술한 것과 동일한 것이다. 도 15B에 나타낸 바와 같이, 킬레이트 화합물, 킬레이트 화합물을 향상시키는 구성성분, 및 아데닌을 함유하는 조성물들은 세 가지 모든 구성성분 미만의 구성성분을 함유하는 조성물보다 효과적으로 뇨의 임균성 DNA를 안정화시켰다.
실시예
17
티오시안산나트륨, 구아니딘 HCl, EDTA, EGTA, BAPTA, 및/또는 아데닌을 함유하는 조성물들을 제조하였다. 인간의 신선한 뇨 시료를 수집한 다음, 1 pg의 임균성 DNA와 섞고, 상기 언급한 조성물 중의 하나와 혼합하여 실온에서 배양하였다. 8 시간 후에 분할물을 옮기고 증폭가능한 임균성 DNA가 있는지 테스트하였다. PCR 프로토콜은 실시예 10에 기술한 것과 동일한 것이다. 도 16에 나타낸 바와 같이, 킬레이트 화합물, 킬레이트 화합물을 향상시키는 구성성분, 및 아데닌을 함유하는 조성물들은 이들 구성성분들 중 하나만 함유하는 조성물보다 효과적으로 뇨의 임균성 DNA를 안정화시켰다.
실시예 18
일부 실시들에 따르면, 본 발명의 조성물은 전체 세포 ( "세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물")를 보존 및/또는 안정화시킬 수 있다. 구체적인 하나의 예시에서, 300개의 뇨 검체를 하나 또는 그 이상의 하기의 상태를 가지는 환자들로부터 채취하였다: 급성 사구체 신염(acute glomerulonephritis), 급성 신우신염(acute pyelonephritis), 신장증 증후군(nephrotic syndrome), 급성 관상 괴사, 방광염, 요로관 종양 및 바이러스 감염.
수집 10분 이내, 뇨 시료를 냉장(2-8℃)하거나 1 M 티오시안산나트륨, 0.01 M EDTA, 및 1 M 아데닌 (9 mL urine + 1 mL 거대분자 안정화 조성물)을 함유하는 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물 (CSC)과 혼합하였다.
표 4에서 알 수 있듯이, 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물을 이용한 다양한 전체 세포의 보존 및/또는 안정화는 적어도 냉장만큼 좋았다.
| 세포 타입 | 냉장 | CSC |
| 적혈구 | 정상 | 약간 톱날모양 |
| 이형성 적혈구 | 검출가능 | 검출가능 |
| 백혈구 | 과립구 +핵 절편 크리스탈 바이올렛 + | 과립구 (정상) +핵 절편 크리스탈바이올렛 + |
| 농뇨 (표준 슬라이드) | >20 hpf | >20 hpf |
| 임파구성 대식구 | 검출가능 | 검출가능 (정상) |
| 신세뇨관 상피세포 5 단편들(존재시) | 검출가능 구별가능 | 검출가능 (정상) 구별가능 |
| 신세뇨관 상피지질 말테스십자형성 | 검출가능 | 검출가능 |
| 신세뇨관 상피세포의 색소 | 프러시안 블루+ | 프러시안 블루+ |
| 비닐모양의 상피세포 | 검출가능 (정상) | 검출가능 (정상) |
| 초자 원주(Hyaline Casts) (역상 검출) | 검출가능 | 검출가능 |
| 왁스성 원주(Waxy Casts) (일반 광학 현미경(brightfield microscopy)) | 검출가능, 정상 형태 | 검출가능, 약간 폭넓게 |
| 과립 원주(Granular Casts) | 검출가능 | 검출가능 |
| 지방성 원주(Fatty Casts) | 검출가능 | 검출가능 |
| 결정형 원주(Crystal Casts) | 검출가능 | 검출가능 |
| 헤모글로빈 혈액 원주(Hemoglobin Blood Casts) | 검출가능 | 매우 창백 |
| 미오글로빈 원주(Myoglobin Casts) | 검출가능 | 검출블가능 |
| 적혈구 원주 | 검출가능 | 검출가능 |
| 백혈구 원주: 일반광학현미경 역상확립 | 검출가능 Yes | 검출가능 Yes |
| 신세뇨관 상피세포 원주(팝 염색, 역상 현미경) | 검출가능 | 다양함 |
| 박테리아 | 검출가능 | 검출가능 |
| 결정형 산성뇨: 수산 칼슘 요산 결정성 요소산염 | 검출가능 검출가능 검출가능 | 검출가능 검출가능 검출가능 |
| 결정성 알칼리성뇨: 비결정형 인산염(CA-Mg) 탄산칼슘 | 검출가능 검출가능 | 검출가능 검출가능 |
| 결정성 비정상 뇨: 시스테인 술폰아마이드 결정 | 검출가능 검출가능 | 검출가능 검출가능 |
실시예 19
초기 유세포 실험시, 0.01 M EDTA 및 1 M 티오시안산나트륨으로 구성된 조성물과 접촉시킨 몇몇 적혈구 세포는 첫째 날에는 좋은 상태로 보였으나, 테스트한 특유의 조건하에서 3-5일째에 응집을 형성하는 것으로 관찰되었다. 응집된 세포를 포함한 시료들은 유세포 분석에 더 어려운 것으로 생각될 수 있다. 따라서, 유세포 분석을 위하여 세포를 안정화시키는 개선된 제형들이 모색되었다.
실시예 20
일부 실시들에 따르면, 동일한 조건하에서 관찰되는 포획 및 응집 없이, 적혈구 세포 집단과 백혈구 세포 집단 모두를 보존하기 위하여 백혈구 세포상에서 공존하는 표면 항원 마커를 허용할 수 있는 제형을 제조하였다.
하기에 조성물의 구현예를 제조하였다:
1. 물이 포함된 혼합용 컨테이너에 리튬 헤파린을 첨가하기. 맑아질 때까지 혼합하기
2. 혼합용 컨테이너에 진락(Genelock) 저장 화학물(chemistry) 첨가하기.
3. 아데닌 첨가한 후 맑아질 때까지 혼합하기.
4. 계면활성제(예컨대, 부티릴트리-n-헥살 시트래이트) 첨가하기. 10분동안 혼합하기.
5. 원하는 부피가 될 때까지 총 부피가 되도록 물을 첨가하기.
6. 15분 동안 혼합하기.
7. 여과(예컨대, 멸균 여과)하여 최종 조성물을 만들기.
일부 실시들에 따르면, 화학물의 변화로는 인산 시트래이트 완충화 시스템에 대한 리튬 헤파린의 치환 및 아데닌 농도의 증가를 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 하기를 포함할 수 있다:
| 함량/100 mL | |
| 진락 저장 화학물 1 M 티오시안산나트륨 0.01 M EDTA | 20 mL |
| 아데닌 | 0.03 g |
| 리튬 헤파린 | 0.20 g |
| 부틸릴트리-n-헥실 시트래이트 (5% stock) | 0.5 mL |
| QNS 물을 (최종) 부피까지 넣기 |
첫째 날, 혈액을 채취하여, 1:7의 혈액 보존 비율(preservative-to-blood ratio)로 이 조성물과 혼합하고, 주위 환경 온도 (예컨대, 실온(RT))에서 3일 동안 두었다. 그 혈액은 베크만 쿨터(Beckman coulter) 세포 분석기에서 차별적인 세포 분석을 실행하였다. 그 분석에서 백혈구와 적혈구 세포 집단의 우수한 보존을 보여주었다. 그 혈액은 신선하게 수집한 혈액의 색깔이 약간만 변하여 핑크색을 띠며 점성이 있었다. 시각적으로는 혈액이 변화된 증거는 없었으며 유세포 분석에 적합할 것으로 예상된다.
실시예
21
하기의 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물이 제조되었다:
조성물 1:
분자적
전체 혈액 튜브
| A 군 | g/L |
| 덱스트로스 (1수화물) | 31.9 |
| 나트륨 시트래이트(2수화물) | 26.3 |
| 구연산(무수) | 3.27 |
| 1 염기 인산나트륨(1수화물) | 2.22 |
| 아데닌 | 0.275 |
| B 군 | |
| 티오시안산나트륨 | 405 g/L |
| EDTA (0.1 M) | 500 mL/L |
| 조성물 1 (A+B) | mL |
| A 군 | 1000 |
| B 군 | 100 |
| DIUF 물 | 200 |
| 합계 | 1300 |
| 조성물 FC | |
| 티오시안산나트륨 | 81 g/L |
| EDTA (0.1 M) | 100 mL |
| 아데닌 | 0.30 g/L |
| 헤파린 나트륨 | 2000 mg/L |
| n-부티릴트리-n-헥실 시트래이트 | 10 mL/L |
| DIUF 물 | qs |
| 합계 | 1000mL |
| 조성물 U-1 | |
| 티오시안산나트륨 | 81 g/L |
| EDTA (0.1 M) | 100 mL |
| DIUF 물 | qs |
| 합계 | 1000mL |
| 조성물 U-2 | |
| 티오시안산나트륨 | 81 g/L |
| EDTA (0.1 M) | 100 mL |
| 아데닌 | 0.30 g/L |
| DIUF 물 | qs |
| 합계 | 1000mL |
| 조성물 S | |
| 티오시안산나트륨 | 81 g/L |
| EDTA (0.1 M) | 100 mL |
| DMSO | 20 mL/L |
| 글리세롤 | 25 mL/L |
| 1염기 인산 칼륨 | 3.93 g/L |
| 3염기 인산 칼륨 | 5.02 g/L |
신선한 혈액을 1:7의 혈액 보존 비율(preservative-to-blood ratio)로 조성물 1 및 조성물 FC와 각각 혼합하고, 주위 환경 온도 (예컨대, 실온(RT))에서 3일 동안 두었다. 24시간 후에, 조성물 U-1과 혼합시킨 혈액이 응집되었다. 대조적으로, 조성물 FC와 혼합시킨 혈액은 72시간 후에도 응집이 없었다. 트리판 블루 분석검사를 이용하여 생존율을 평가하였다. 72시간 후에, 조성물 FC와 혼합시킨 혈액의 백혈구의 99% 이상을 접촉시켰다(보존하였다). 결과들을 표 5에 나타내었다.
| 조성물 | 응집 | 생존율 | ||||
| 24 시간 | 48 시간 | 72 시간 | 24 시간 | 48 시간 | 72 시간 | |
| 1 | + | ++ | ++ | - | -- | -- |
| FC | -- | -- | -- | ++ | ++ | ++ |
응집: 없음 (--), 중간정도 (+), 광범위 (++)
생존율: 검출안됨 (--), 생존 세포 거의 없음 (-); 99%+ 생존가능성 (++)
실시예 22
주위 환경 온도와 기압에서, 킬레이트 화합물을 향상시키는 구성성분 (예컨대, 티오시안산나트륨)과 이온화시킨 초여과(ultra-filtered (DIUF)) 물을 혼합용 컨테이너에 첨가한 다음, 10분 동안 혼합하여 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물을 제조하였다. 다음으로, 미리용해시킨 킬레이트 화합물 (예컨대, EDTA)을 혼합용 컨테이너에 첨가한 후 10분 동안 혼합하였다. 그런 다음, 염기(예컨대, 아데닌)를 컨테이너에 첨가한 후 맑은 용액을 얻을 때까지 혼합하였다. 만약 완충용액(예컨대, 인산염 완충용액)을 첨가하기를 원한다면, 이 시점에서 첨가하였다. 마지막으로, 혼합용 컨테이너의 부피가 원하는 총 부피가 될 때까지 DUIF 물을 첨가하고 이 용액을 10분 동안 혼합하였다. 멸균 컨테이너(예컨대, 날젠사의 병(이하, 날젠 병)) 내로 그 결과 혼합물을 멸균 여과하여 최종 용액를 획득하였다. 유세포 분석을 실시한 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물의 몇몇 구체적인 실시예에 대한 제형을 표 5에 상세히 나타내었다.
| T-5 | T-8 (1X) | T-8 인산염(1X) | T-8.25 (1X) | T-8.5 (1X) | |
| 티오시안산나트륨 | 8.1 g | 2.1 g | 2.1 g | 0.525 g | 1.05 g |
| 0.01 M EDTA | 10 mL | 10 mL | 10 mL | 10 mL | 10 mL |
| n-부티릴트리-헥실-시트래이트 | 1 mL | -(없음) | - | - | - |
| 아데닌 | 0.03 g | 0.03 g | 0.03 g | 0.03 g | 0.03 g |
| 인산염 완충용액 | - | - | - | - | |
| 합계부피 | 100 mL | 100 mL | 100 mL | 100 mL | 100 mL |
| pH | 5 | 8.0 | 6.5 | 8.25 | 8.5 |
실시예 23
주위 환경 온도 및 기압에서, USP-정제한 물의 분할물(aliquot)을 적당한 크기의 컨테이너에 첨가하고, 킬레이트 화합물을 향상시키는 구성성분 (예컨대, 티오시안산나트륨)을 첨가한 다음, 이를 혼합하여 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물을 제조하였다. 그 다음에, 미리 용해시킨 킬레이트 화합물 (예컨대, EDTA)을 그 혼합용 컨테이너에 첨가한 후 혼합하였다. 마지막으로, 혼합용 컨테이너의 부피가 원하는 총 부피가 될 때까지 USP-정제한 물을 첨가한 후, 그 용액을 혼합하였다. 멸균 컨테이너(예컨대, 날젠 병) 내로 그 결과 혼합물을 멸균 여과하여 최종 용액(용액 A)를 얻었다.
물을 두 번째 컨테이너에 첨가하였다. 덱스트로스를 첨가한 다음, 그 조성물이 맑아질 때까지 혼합하였다. 그 다음에, 나트륨 시트래이트를 첨가하고 그 조성물이 맑아질 때까지 혼합하였다. 그 다음, 구연산을 첨가하고 그 조성물이 맑아질 때까지 혼합하였다. 제 1 인산나트륨을 첨가하고 그 조성물이 맑아질 때까지 혼합하였다. 그런 다음, 아데닌을 첨가하고 그 조성물이 맑아질 때까지 혼합하였다. 마지막으로, 혼합용 컨테이너의 부피가 원하는 총 부피가 될 때까지 DUIF 물을 첨가하였다. 멸균 컨테이너(예컨대, 날젠 병) 내로 그 결과 혼합물을 멸균 여과하여 최종 용액(용액 B)를 획득하였다.
용액 A 분할물이 든 컨테이너에 용액 B 분할물을 첨가하였다. 혼합 용액을 주위 환경 조건하에서 (예컨대, 15 분 동안) 혼합하였다. 유세포 분석 검사에 사용된 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물의 구체적인 실시예 제형은 표 6에 상세히 설명하였다.
| 용액 A | 용액 B | T-10 | |
| 티오시안산나트륨 | 10.02 g | ||
| 0.01 M EDTA | 50 mL | ||
| 덱스트로스 (1수화물) | 3.19 g | ||
| 나트륨 시트래이트 (2수화물) | 2.63 g | ||
| 구연산 (무수) | 0.327 g | ||
| 1염기 인산나트륨(1수화물) | 0.220 g | ||
| 아데닌 | 0.0275 g | ||
| 용액 A | 28 mL | ||
| 용액 B | 120 mL | ||
| 합계 부피 | 100 mL | 100 mL | |
| pH | 8.25 |
실시예 24
방법: 유세포 분석기에 의한 표준 임파구 면역표현형 분석은 절대 계수 측정용 비드를 장착한 벡턴 디킨슨 팩스칼리버(Becton Dickenson FacsCalibur)에서 수행하였다. 가수분해/비-수세 기술(lyse/no wash technique)을 사용하기 위하여, 전체 혈액을 한 튜브에서는 CD3, CD4, CD8, 및 CD45를 염색하고, 다른 한 튜브에서는 CD16+56, CD19, 및 CD45를 염색하였다. 전방 스캐터(forward scatter: 세포를 흩뿌려주는 장치)에 통과시켜 CD4인 임파구들을 확인하였으며, 10,000 개(events)가 계수되었다. 각 CD 항원을 염색한 임파구의 백분율과 각 항원에 대한 양성 임파구의 절대수를 0, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 및 160 시간에 측정하여 기재하였다. 대조군 튜브는 테스트 조성물들의 어떤 희석 효과를 계수하기 위하여 용액 내에 EDTA (표준 보라색 상단) 및 헤파린 (표준 녹색 상단)뿐만 아니라, EDTA와 헤파린을 포함하였다. 실시예 22 및 23에 따라, 안정화 테스트 시약을 제조하였다. 각각의 조성물의 pH는 표 7에 나타내었다. 유동 매개 변수는 표 8에 나타내었다.
| 희석강도(Strength/Dilution) | |||
| pH | 0.25 X | 0.5 X | 1 X |
| T-8 | 8.0 | 8.0 | 8.0 |
| T-8 인산염 | 6.5 | 6.5 | 6.5 |
| 스캐터 모드 | 전방 (FSC) | |||
| 측면 (SSC) | ||||
| 형광성 | FL1 | FITC | CD3 | T-세포 |
| FL2 | PE | CD8 | 억제세포 | |
| CD16+56 | NK 세포 | |||
| FL3 | PerCP | CD45 | 백혈구 | |
| FL4 | APC | CD4 | 헬퍼 세포 | |
| CD19 | B-세포 |
결과: 시간별로, 임파구 마커의 백분율 및/또는 절대수를 플라팅(점을 이어 그림)하여, 다양한 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물의 유효성을 현재 골드 표준 보존적인 EDTA 및 헤파린의 경우와 비교할 수 있다. 예를 들어, 도 17A에는 대조군에 비해 상기 제형에 대한 CD3 백분율을 전체 시간에 걸쳐(시간별로) 플랏하여 나타내었다. 유사하게, 도 17B에는 대조군과 비교한 제형에 대한 백분율을 전체 시간에 걸쳐(시간별로) 플랏하여 나타내었다. CD3 및 CD4 백분율에서는, 심지어 160시간 이상에서 조차, 과거 오랫동안 권장되고 허용된 EDTA와 헤파린 둘 모두에 대한 안정성 정도로 안정한 것으로 보였다. 게다가, CD3의 절대수(혈액 1mL당 CD3 세포의 수)는 96 시간 이상에서도 안정하였다 (도. 17C).
실시예 25
RNA 방법: 다양한 시간별로, (테트라데실트리메틸암모늄 옥살산염 및 타르타르산이 포함될 수 있는)PAXgene™ 튜브로부터, 혹은 Qiagen RNA 혈액 미니 키트를 이용하여 저삼투압으로 적혈구 세포를 세포 분해한 후에, RNA를 분리하였다. 그런 다음, 분리한 RNA를 정량하고 애질런트 2100 바이오애널자이저(Agilent 2100 BioAnalyzer) 및 피코 단위의 카트리지(애질런트사)를 이용하여 품질을 평가하였다.
RNA 결과: 도 18에서 알 수 있듯이, 48시간을 포함한 최대 48시간에서는, T8 및 T10 처리에 의해 보존된 시료들의 RNA 수율이 PAXgene™의 경우보다 많았으며, EDTA 대조군과 대략 동일하였다. 72시간째에, PAXgene™, T8, T10 및 EDTA에서 생산된 RNA는 모두 대략 동일하였다. 72시간째에, 산발적인 응고에 의해 몇몇 튜브의 분석이 방해되었다. 본 발명의 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물에서 획득한 RNA 함량이 더 많았을 뿐만 아니라, T8 및 T10에서 획득한 RNA 품질이 PAXgene™RNA 의 품질보다 우수하였으며, EDTA 대조군과는 동등한 값이었다. 72 시간째에 PAXgene™, EDTA, T8, 및T10에 접촉시킨 RNA의 품질 데이터를 도 19A, 19B, 19C, 및 19D에 각각 나타내었다. 이 테스트에 대한 RNA 보전성 수치RIN)는 6.20 (19A), 7.90 (19B), 7.90 (19C), 및 7.4 (19D)였다. 오른쪽 분할면에 있는 두 개의 리보솜의 RNA 피크(꼭지점)에 의해 RNA 품질을 평가할 수 있다. 상당한 분해에 해당되는 리보솜의 큰 피크(제일 오른쪽)가 PAXgene™ 튜브의 경우에는 없었다.
Claims (61)
- 하기를 포함하는 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물:(a) 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), [에틸렌비스(옥시에틸렌니트릴로)]테트라아세트산 (EGTA), 1,2-비스(2-아미노페녹시)에탄-N,N,N',N'-테트라아세트산 (BAPTA), 및 그의 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 킬레이트 화합물;(b) 구아니딘, 염화리튬, 살리실산나트륨, 과염소산나트륨, 및 티오시안산나트륨으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 킬레이트 화합물을 향상시키는 구성성분; 및(c) 퓨린 염기 및 피리미딘 염기로 이루어진 군으로부터 선택되는 염기.
- 제 1항에 있어서, 상기 킬레이트 화합물의 농도는 약 0.1 mM 내지 약 0.1 M인 것인 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 적어도 하나의 킬레이트 화합물을 향상시키는 구성성분의 농도는 약 1 mM 내지 약 5 M인 것인 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 염기의 농도는 약 0.1 mM 내지 약 5 M인 것인 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물은 수용성 용액으로 제형된 것인 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 적어도 하나의 킬레이트 화합물을 향상시키는 구성성분은 과염소산나트륨, 티오시안산나트륨, 및 염화리튬으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 적어도 하나의 킬레이트 화합물을 향상시키는 구성성분은 약 1 M의 함량으로 존재하는 것인 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 2가 금속 킬레이트 화합물은 약 1 mM의 함량으로 존재하는 것인 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 염기는 약 2 mM의 함량으로 존재하는 것인 조성물.
- 제 1항에 있어서, 완충용액을 더 포함하는 것인 조성물.
- 제 10항에 있어서, 상기 완충용액은 아세트산칼륨, 아세트산나트륨, 인산칼륨, 인산나트륨, 트리스(하이드록시아미노)메탄, N-(2-하이드록시에틸)피페라진-N'-(2-에탄술폰산), 3-(N-몰포리노)프로판술폰산, 2-[(2-아미노-2-옥소에틸)아미노]에탄술폰산, N-(2-아세트아미도)2-이미노디아세트산, 3-[(1,1-디메틸-2-하이드록시에틸)아미노]-2-프로판술폰산, N,N-비스(2-하이드록시에틸)-2-아미노에탄술폰산, N,N-비스(2-하이드록시에틸글리신, 비스-(2-하이드록시에틸)이미노-트리스(하이드록시메틸)메탄, 3-(사이클로헥실아미노)-1-프로판술폰산, 3-(사이클로헥실아미노)-2-하이드록시-1-프로판술폰산, 2-(N-사이클로헥실아미노)에탄술폰산, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물을 포함하는 것인 조성물.
- 제 10항에 있어서, 상기 완충용액은 3-[N,N-비스(2-하이드록시에틸)아미노]-2-하이드록시-프로판술폰산, N-(2-하이드록시에틸피페라진)-N'-(3-프로판술폰 산), N-(2-하이드록시에틸)피페라진-N'-(2-하이드록시프로판술폰산), 2-(N-몰포린)에탄술폰산, 트리에탄올아민 완충용액, 이미다졸, 글리신, 에탄올아민, 3-(N-몰포린)-2-하이드록시프로판술폰산, 피페라진-N,N'-비스(2-에탄술폰산), 피페라진-N,N'-비스(2-하이드록시프로판술폰산), N-트리스[(하이드록시메틸)메틸]-3-아미노프로판술폰산, 2-하이드록시-3-[트리스(하이드록시메틸)메틸아미노]-1-프로판술폰산, N-[트리스(하이드록시메틸)메틸]-2-아미노에탄술폰산, N-[트리스(하이드록시메틸)메틸]글리신, 2-아미노-2-메틸-1,3-프로판디올, 2-아미노-2-메틸-1-프로판올, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
- 제 1항에 있어서, 세포를 더 포함하는 것인 조성물.
- 제 13항에 있어서, 상기 세포는 포유동물 세포, 식물 세포, 효모 세포, 박테리아 세포, 바이러스-감염 세포, 질병에 걸린 세포, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
- 제 14항에 있어서, 상기 포유동물 세포는 적혈구 세포, 백혈구 세포, 림프구 세포, 조직구 세포, 상피 세포, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되 는 세포를 포함하는 것인 조성물.
- 제 1항에 있어서, 핵산을 더 포함하는 것인 조성물.
- 제 16항에 있어서, 상기 핵산은 리보 핵산, 데옥시리보 핵산, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 다중 핵산을 포함하는 것인 조성물.
- 제 1항에 있어서, 가소제를 더 포함하는 것인 조성물.
- 제 18항에 있어서, 상기 가소제는 트리에틸시트래이트, 아세틸트리에틸시트래이트, 트리부틸시트래이트, 아세틸트리부틸시트래이트, 트리옥틸시트래이트, 아세틸트리옥틸시트래이트, 트리헥실시트래이트, 아세틸트리헥실시트래이트, 부티릴트리헥실시트래이트, 트리메틸시트래이트, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 시트래이트화 알콜을 포함하는 것인 조성물.
- 제 18항에 있어서, 상기 가소제는 부티릴트리헥실시트래이트인 것인 조성물.
- 제 20항에 있어서, 상기 부티릴트리헥실시트래이트는 n-부티릴트리-n-헥실 시트래이트를 포함하는 것인 조성물.
- 제 18항에 있어서, 상기 가소제의 농도는 약 0.1% (v/v) 내지 약 10% (v/v)인 것인 조성물.
- 제 1항에 있어서, 항응고제를 더 포함하는 것인 조성물.
- 제 23항에 있어서, 상기 항응고제는 헤파린, 헤파린염 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 황산화 글리코스아미노글리칸을 포함하는 것인 조성물.
- 제 23항에 있어서, 상기 항응고제는 암모늄 헤파린, 칼슘 헤파린, 리튬 헤파린, 칼륨 헤파린, 나트륨 헤파린, 및/또는 아연리튬 헤파린, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 헤파린염인 것인 조성물.
- 제 23항에 있어서, 상기 항응고제의 농도는 약 200 mg/L 내지 약 20 g/L인 것인 조성물.
- 제 1항에 있어서, 헤파린분해효소를 더 포함하는 것인 조성물.
- 세포를, 하기를 포함하는 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포의 보존 및/또는 안정화 방법:(a)에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), [에틸렌비스(옥시에틸렌니트릴로)]테트라아세트산 (EGTA), 1,2-비스(2-아미노페녹시)에탄-N,N,N',N'-테트라아세트산 (BAPTA), 및 그의 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 킬레이트 화합물; 및(b) 구아니딘, 염화리튬, 살리실산나트륨, 과염소산나트륨, 및 티오시안산나트륨으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 킬레이트 화합물을 향상시키는 구성성분 .
- 제 28항에 있어서, 상기 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물은 퓨린 염기 및 피리미딘 염기로 이루어진 군으로부터 선택되는 염기를 더 포함하는 것인 방법.
- 제 28항에 있어서, 상기 세포는 포유동물 세포, 바이러스-감염 세포, 질병에 걸린 세포, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포를 포함하는 것인 방법.
- 제 30항에 있어서, 상기 포유동물 세포는 적혈구, 백혈구, 림프구, 대식 세포, 상피 세포, 줄기 세포, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포를 포함하는 것인 방법.
- 제 30항에 있어서, 상기 포유동물 세포는 인간의 세포를 포함하는 것인 방법.
- 제 28항에 있어서, 상기 킬레이트 화합물의 농도는 약 0.1 mM 내지 약 0.1 M인 것인 방법.
- 제 28항에 있어서, 상기 적어도 하나의 킬레이트 화합물을 향상시키는 구성성분의 농도는 약 0.1 mM 내지 약 0.5 M인 것인 방법.
- 제 29항에 있어서, 상기 염기의 농도는 약 0.1 mM 내지 약 5 M인 것인 방법.
- 제 28항에 있어서, 상기 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물은 수용성 용액으로 제형된 것인 방법.
- 제 28항에 있어서, 상기 적어도 하나의 킬레이트 화합물을 향상시키는 구성성분은 과염소산나트륨, 티오시안산나트륨, 및 염화리튬으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제 28항에 있어서, DNA, RNA, mRNA, 및 cDNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포내 핵산을 보존하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
- 제 38항에 있어서, 상기 핵산은 진핵생물의 RNA인 것인 방법.
- 제 28항에 있어서, 상기 세포는 인간 대상으로부터 얻은 체액에 존재하는 것인 방법.
- 제 40항에 있어서, 세포 및/또는 거대분자 조성물 대 체액의 부피비는 약 1:10 내지 약 10:1인 것인 방법.
- 제 40항에 있어서, 상기 세포를, 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물을 접촉시키는 단계는, 세포를 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물에 첨가하는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제 40항에 있어서, 상기 세포를, 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물과 접촉시키는 단계는, 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물을 세포에 첨가하는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제 40항에 있어서, 상기 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물과 체액은, 세포를, 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물에 접촉시킨 후 최대 약 5일 동안 응집체가 실질적으로 없는 상태로 유지되도록 함께 안정화시킨 체액 조성물을 형성하는 것인 방법.
- 제 40항에 있어서, 상기 체액은 혈액, 혈청, 양수, 척수액, 결막액, 타액, 질액, 대변, 정액, 및 땀으로 이루어진 군으로부터 선택되는 재료를 포함하는 것인 방법.
- 제 28항에 있어서, 상기 세포는 림프구인 것인 방법.
- 제 28항에 있어서, 상기 세포는, 세포를 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물과 접촉시킨 후에 적어도 약 3일 동안 적어도 약 80%의 세포외 마커를 유지하는 것인 방법.
- 제 47항에 있어서, 상기 세포외 마커는 CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD10, CD13, CD14, CD16, CD19, CD20, CD21, CD22, CD33, CD34, CD45, CD56, CD57, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제 28항에 있어서, 상기 세포는, 세포를 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물과 접촉시킨 후에 약 5일에 적어도 약 95%의 세포외 마커를 유지하는 것인 방법.
- 제 28항에 있어서, 상기 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물은, 장쇄 지방산, 장쇄 지방성 에스테르, 장쇄 지방성 알콜, 리튬, 헤파린, 헤파린분해효소, 부틸헥실시트래이트, 및/또는 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 적어도 하나의 화합물을 더 포함하는 것인 방법.
- 제 29항에 있어서, 세포를 유세포 분석기에 접촉시키는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
- 제 51항에 있어서, 상기 세포를 유세포 분석기에 접촉시키는 단계는, 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물과 접촉시킨 후, 최대 약 2 일, 최대 약 3 일, 최대 약 4 일, 최대 약 5 일, 최대 약 6 일, 또는 최대 약 7 일까지 수행하는 것인 방법.
- 세포를 함유하는 시료를 받고 담기 위해 배열되고 정렬된 시료 컨테이너; 및하기를 포함하는 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물을 포함하는, 시료의 세포를 보존하기 위한 시스템:(a) 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), [에틸렌비스(옥시에틸렌니트릴로)]테트라아세트산 (EGTA), 1,2-비스(2-아미노페녹시)에탄-N,N,N',N'-테트라아세트산 (BAPTA), 및 그의 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 킬레이트 화합물;(b) 구아니딘, 염화리튬, 살리실산나트륨, 과염소산나트륨, 및 티오시안산나트륨으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 킬레이트 화합물을 향상 시키는 구성성분; 및(c) 퓨린 염기 및 피리미딘 염기로 이루어진 군으로부터 선택되는 염기.
- 제 53항에 있어서, 사용자 설명서를 더 포함하는 것인 시스템.
- 제 53항에 있어서, 상기 시료 컨테이너는 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물을 포함하는 것인 시스템.
- 제 53항에 있어서, 상기 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물은, 고체, 액체, 또는 수화겔을 더 포함하는 것인 시스템.
- 제 53항에 있어서, 상기 시료 컨테이너는 적어도 하나의 내부면과 적어도 하나의 외부면을 포함하는 것인 시스템.
- 제 53항에 있어서, 상기 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물은 적어도 하 나의 내부면에 코팅된 것인 시스템.
- 하기를 포함하는 시스템:(a) 보존된 세포;(b) 하기를 포함하는, 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물:(i) 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), [에틸렌비스(옥시에틸렌니트릴로)]테트라아세트산 (EGTA), 1,2-비스(2-아미노페녹시)에탄-N,N,N',N'-테트라아세트산 (BAPTA), 및 그의 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 킬레이트 화합물;(ii) 구아니딘, 염화리튬, 살리실산나트륨, 과염소산나트륨, 및 티오시안산나트륨으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 킬레이트 화합물을 향상시키는 구성성분; 및(iii) 퓨린 염기 및 피리미딘 염기로 이루어진 군으로부터 선택되는 염기; 및(c) 분석 장치.
- 제 59항에 있어서, 상기 세포 및/또는 거대분자 안정화 조성물은 가소제 및 항응고제를 더 포함하는 것인 시스템.
- 제 59항에 있어서, 상기 분석 장치는 현미경, 플래이트 리더기, 크기-분획화 겔, 써모사이클러, 유세포 분석기(flow cytometer), 자동 혈액분석기, 특이형태세포계수기, 세포분별장치(cell sorter), 비드들, 친화성 기질, 및/또는 분광분석기, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 시스템.
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