CN101668854A - 保存及/或稳定化细胞及/或大分子的组合物、系统及方法 - Google Patents

Abstract

本揭示内容是关于用于保存及/或稳定化细胞(例如，全细胞)的组合物、系统及方法。细胞及/或大分子稳定化组合物可包括螯合剂、螯合剂增强组份及任选碱基(例如，嘌呤碱基或嘧啶碱基)。细胞稳定化方法可包括使细胞与细胞及/或大分子稳定化组合物接触。细胞稳定化系统可包括适于容纳含有细胞及细胞及/或大分子稳定化组合物的样品的容器。细胞可在环境条件(例如，不冷藏)下保存及/或稳定化。细胞可包括蛋白质、核酸及/或细胞保存及/或稳定化的另一生物分子标记。组合物可构造为可保存及/或稳定化一种或多种用于流式细胞术分析的细胞及同时保存及/或稳定化一种或多种用于分子分析的细胞内核酸。

Description

保存及/或稳定化细胞及/或大分子的组合物、系统及方法

相关申请案交叉参考

本申请案主张2007年3月14日申请的美国临时专利申请案第60/894,795号、2007年9月7日申请的美国临时专利申请案第60/970,881号及2007年10月29日申请的美国临时专利申请案第60/983,468号的权利。本申请案是2007年3月14日申请的美国申请案第11/686,169号的部分接续申请案。本申请案是2007年3月14日申请的国际PCT申请案第PCT/US07/63982号的部分接续申请案。各前述申请案的全部内容均以引用方式并入本文中。

技术领域

概括来说，本揭示内容是关于用于保存大分子及/或生物分子的组合物、系统及方法。例如，本揭示内容的组合物、系统及方法可用以保存及/或稳定化大分子及/或生物分子，所述大分子及/或生物分子在所处条件下可以构象特异性及/或序列特异性方式与另一分子相互作用。

背景技术

大分子及生物分子在一些条件下可能不稳定。例如，核酸分子在核酸酶存在下可能会降解。同样，蛋白质分子在蛋白酶存在下可能会降解。大分子及生物分子的降解可能随时间而增加。包括检测所述分子的特性(存在性、浓度、序列、构象)在内的分析效能在所述降解发生时可能会降低或丧失。例如，在生物分子发生降解的情况下，依赖于检测极少量生物分子的诊断或法医学分析可能不能获得可靠结果。

性传播疾病(STD)门诊定期筛选和治疗患诸如淋病和梅毒等疾病的患者。可通过分析DNA样品来检测诸如淋球菌等传染原。根据杰斐(HW Jaffe)等人(传染病期刊(J.Inf.Dis.)146：275-279(1982))，可利用遗传转化测试(GTT)(例如谷诺斯特(Gonostat)^TM(西若诊断学(Sierra Diagnostics)公司，索诺拉(Sonora)，加利福尼亚州(Calif.))来检测取自男性尿道及女性子宫颈及肛门的试样中的淋球菌DNA。惠廷顿(WL Whittington)等人获得了类似结果(美国微生物学会年会摘要(Abstr.Ann.Meeting Am.Soc.Microbiol.)，第315页(1983))。然而，并不总是能够立即检验患者中是否存在传染原。例如，在许多农村或不发达地区不容易见到临床实验室。在所述情况下，需要将患者测试试样运送到分析实验室，在此期间所关注靶标可能部分或完全降解。

可通过降低大分子或生物分子的温度来减少大分子及/或生物分子的降解。然而，此选择并非在所有情况下都可利用，或其可能不能利用足够长时间段(例如，自样品采集时间到分析时间)。例如，当在偏远地区采集样品(例如，自患者)时，可能难以或不能将靶分子保存足够长时间，以致于无法将样品运送到分析样品的机构。另外，所有样品的冷却可能不统一及/或各实验可能不一致。

大分子及/或生物分子的降解可通过将组合物加热到足以灭活一种或多种核酸酶或蛋白酶的温度来减少。然而，通过加热仅使有限数量的蛋白酶及核酸酶灭活。另外，加热可能会降解而非保存靶分子。

疾病的诊断可能依赖于采集与分析间所维持细胞的状况。然而，与大分子一样，细胞(例如，全细胞)在其正常环境外可能易发生变化。例如，取自人体的细胞(例如，血细胞)可能在取出后数秒至数分钟内开始变质(例如，裂解、氧化及/或凝结)。

发明内容

因此，当前需要用于保存及/或稳定化细胞(例如，全细胞)的组合物、系统及方法。

本揭示内容是关于用于保存及/或稳定化大分子及/或生物分子(统称为“大分子”)的组合物、系统及方法。根据一些实施例，大分子及/或生物分子可包括蛋白质及/或核酸(例如，DNA及RNA)。所属领域的技术人员应了解，核酸可包括来自多种来源的序列。例如，单核酸可包括人工序列(例如，引物结合位点)、人类序列(例如，腺瘤性结肠息肉(APC)、淀粉样前蛋白(APP)、乳癌1(BRCA1)、跨膜蛋白酶丝氨酸2(TMPRSS2)、v-ets骨髓成红细胞增多症病毒E26致癌基因同系物(ERG))、植物序列、微生物序列(例如，抗生素抗性基因)、病毒序列(例如，HIV蛋白酶)及/或其组合。单核酸序列也可包括来自共同来源的两个序列的罕见或人工融合物(例如，TMPRSS2:ERG融合物)。只要大分子(若存在)在至少自样品采集时间到样品分析时间期间维持可检测到的形式，即可视为大分子得以保存。在一些实施例中，本揭示内容是关于体液或排泄物(例如，尿、血液、血清、羊水、脊髓液、结膜液、唾液、阴道液、粪便、精液及汗液)中大分子的保存及/或稳定化。在一些实施例中，在所述核酸测试方法中可能观察到核酸杂交出人意料地改善(例如，与于不存在本揭示内容的保存组合物、系统或方法下实施的相同方法相比)。

本揭示内容是关于用于保存及/或稳定化细胞(例如，全细胞)及/或大分子及/或生物分子(统称为“大分子”)的组合物、系统及方法。例如，根据一些实施例，本揭示内容是关于用于保存及/或稳定化细胞(例如，全细胞)的组合物(“细胞稳定化组合物”)。

在一些实施例中，细胞及/或大分子稳定化组合物可包括：(a)螯合剂(例如，选自由下列组成的群组的螯合剂：乙二胺四乙酸(EDTA)、[亚乙基双(氧基亚乙基次氮基)]四乙酸(EGTA)、1，2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N，N，N′，N′-四乙酸(BAPTA)及其盐)；(b)至少一种螯合剂增强组份(例如，选自由下列组成的群组的螯合剂增强组份：胍、氯化锂、水杨酸钠、高氯酸钠及硫氰酸钠)；及任选地(c)选自由嘌呤碱基及嘧啶碱基组成的群组的碱基。螯合剂、螯合剂增强组份及/或碱基的浓度可分别选自任一可得到的浓度。例如，螯合剂的浓度可为约0.1mM至约0.1M，螯合剂增强组份的浓度可为约1mM至约5M；及/或碱基的浓度可为约0.1mM至约5M。在一些实施例中，细胞及/或大分子稳定化组合物可调配成水性溶液。在一些实施例中，螯合剂增强组份可选自由高氯酸钠、硫氰酸钠及氯化锂组成的群组。根据一些实施例，细胞及/或大分子稳定化组合物可包括或不包括至少一种选自由下列组成的群组的酶灭活组份：氯化锰、肌氨酰、十二烷基硫酸钠及其组合。在一些实施例中，细胞及/或大分子稳定化组合物可包括固体、液体及/或水凝胶。在一些实施例中，细胞及/或大分子稳定化组合物可包括溶剂(例如，水及/或有机溶剂)。根据一些实施例，细胞及/或大分子稳定化组合物可包括细胞(例如，完整细胞、全细胞及其类似物)、蛋白质(例如，细胞性蛋白质及/或无细胞蛋白质)及/或核酸(例如，细胞性及/或无细胞RNA、DNA及其类似物)。

在一些实施例中，细胞及/或大分子稳定化组合物可包括增塑剂(例如，柠檬酸醇酯)及/或抗凝剂(例如，肝素)。在一些实施例中，细胞及/或大分子稳定化组合物可减少及/或阻止储存在室温(例如，约20℃)下的样品(例如，血液样品)形成团块及/或凝结。

根据一些实施例，细胞及/或大分子稳定化组合物可包括缓冲剂。例如，缓冲剂可包括选自由下列组成的群组的化合物：乙酸钾、乙酸钠、磷酸钾、磷酸钠、三(羟基氨基)甲烷、N-(2-羟基乙基)哌嗪-N′-(2-乙磺酸)、3-(N-吗啉基)丙磺酸、2-[(2-氨基-2-氧代乙基)氨基]乙磺酸、N-(2-乙酰胺基)2-亚氨基二乙酸、3-[(1，1-二甲基-2-羟基乙基)氨基]-2-丙磺酸、N，N-双(2-羟基乙基)-2-氨基乙磺酸、N，N-双(2-羟基乙基)甘氨酸、双-(2-羟基乙基)亚氨基-三(羟基甲基)甲烷、3-(环己基氨基)-1-丙磺酸、3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸、2-(N-环己基氨基)乙磺酸、3-[N，N-双(2-羟基乙基)氨基]-2-羟基-丙磺酸、N-(2-羟基乙基哌嗪)-N′-(3-丙磺酸)、N-(2-羟基乙基)哌嗪-N′-(2-羟基丙磺酸)、2-(N-吗啉基)乙磺酸、三乙醇胺缓冲剂、咪唑、甘氨酸、乙醇胺、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸、哌嗪-N，N′-双(2-乙磺酸)、哌嗪-N，N′-双(2-羟基丙磺酸)、N-三[(羟基甲基)甲基]-3-氨基丙磺酸、2-羟基-3-[三(羟基甲基)甲基氨基]-1-丙磺酸、N-[三(羟基甲基)甲基]-2-氨基乙磺酸、N-[三(羟基甲基)甲基]甘氨酸、2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇、2-氨基-2-甲基-1-丙醇及其组合。

根据一些实施例，本揭示内容也是关于保存及/或稳定化细胞的方法(“细胞稳定化方法”)。细胞稳定化方法可包括(例如)使大分子与细胞及/或大分子稳定化组合物接触，所述细胞及/或大分子稳定化组合物包含：(a)螯合剂(例如，选自由下列组成的群组的螯合剂：乙二胺四乙酸(EDTA)、[亚乙基双(氧基亚乙基次氮基)]四乙酸(EGTA)、1，2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N，N，N′，N′-四乙酸(BAPTA)及其盐)；(b)至少一种螯合剂增强组份(例如，选自由下列组成的群组的螯合剂增强组份：胍、氯化锂、水杨酸钠、高氯酸钠及硫氰酸钠)；及(c)碱基(例如，选自由嘌呤碱基及嘧啶碱基组成的群组的碱基)。在一些实施例中，细胞可包括选自由下列组成的群组的细胞：哺乳动物细胞、植物细胞、酵母细胞、细菌细胞、受病毒感染的细胞、患病细胞及其组合。在一些实施例中，哺乳动物细胞可包括选自由下列组成的群组的细胞：红细胞、白细胞、淋巴细胞、组织细胞、上皮细胞及其组合。根据一些实施例，哺乳动物细胞可包括人类细胞。根据一些实施例，拟用大分子稳定化组合物及/或方法保存及/或稳定化的大分子可包括选自由DNA、RNA、mRNA及cDNA组成的群组的核酸。例如，核酸可包括原核及/或真核DNA。在一些实施例中，拟用细胞及/或大分子稳定化组合物及/或方法保存及/或稳定化的细胞及/或大分子可存在于获自人类个体的体液中。体液可包括(例如)选自由下列组成的群组的物质：血液、血清、羊水、脊髓液、结膜液、唾液、阴道液、粪便、精液及汗液。

在一些实施例中，本揭示内容进一步是关于用于保存及/或稳定化细胞(例如，全细胞)(“细胞稳定化系统”)及/或大分子(“大分子稳定化系统”)的系统。细胞及/或大分子稳定化系统可包括样品容器，其构造及布置成可容纳及含有包含细胞及细胞及/或大分子稳定化组合物(例如，包括螯合剂、至少一种螯合剂增强组份及碱基)的样品。在一些实施例中，系统也可包括使用说明书。在一些实施例中，样品容器可含有所述细胞及/或大分子稳定化组合物。例如，样品容器可包括至少一个内表面及至少一个外表面，其中细胞及/或大分子稳定化组合物涂敷到后者上。在一些实施例中，样品容器可包括至少一种小泡、脂质体及/或微胶粒。细胞及/或大分子稳定化组合物可存在于小泡、脂质体及/或微胶粒的腔中。

附图说明

本揭示内容的一些实施例可部分地通过参考下文说明及附图来了解，其中：

图1是根据本揭示内容的一个实施例经保存尿中DNA浓度的条形图；

图2是根据本揭示内容的一个实施例经保存尿的8天连续数据图；

图3所示图比较根据本揭示内容的一个实施例未经保存及经保存正常尿的PCR结果；

图4是根据本揭示内容的一个实施例经保存血清的8天连续数据图；

图5是根据本揭示内容的一个实施例经保存血清中DNA浓度的图；

图6是根据本揭示内容的一个实施例用于保存DNA的系统的图解；

图7用图表绘示在PCR分析中信号应答的比较，其中一种DNA已利用本揭示内容的保存剂进行处理且一种DNA未经处理；

图8绘示本揭示内容试剂增强经受各种储存条件的血浆样品的分支DNA分析的信号应答的效能；

图9绘示本揭示内容试剂增强血清和血浆样品的分支DNA分析的信号应答的效能；

图10所示图展示在对未经保护血清中乙型肝炎序列MD03/06的PCR扩增分析中高铁血红蛋白对PCR吸光度的干扰；

图11所示图展示在对经本揭示内容保存剂处理的血清中乙型肝炎序列MD03/06的PCR扩增分析中在减弱高铁血红蛋白对PCR吸光度的干扰方面的改良；

图12A所示图展示获自实例PCR扩增的代表性结果，所述实例PCR扩增使用MD03及MD06引物及与缓冲液(无保护)、仅胍、仅EGTA或EGTA+胍接触的血清中的乙型肝炎模板；

图12B所示图展示获自实例PCR扩增的代表性结果，所述实例PCR扩增使用MD03及MD06引物及与缓冲液(无保护)、仅EDTA、仅高氯酸钠或EDTA+高氯酸钠接触的血清中的乙型肝炎模板；

图12C所示图展示获自实例PCR扩增的代表性结果，所述实例PCR扩增使用MD03及MD06引物及与缓冲液(无保护)、仅EGTA、仅高氯酸钠或EGTA+高氯酸钠接触的血清中的乙型肝炎模板；

图12D所示图展示获自实例PCR扩增的代表性结果，所述实例PCR扩增使用MD03及MD06引物及与缓冲液(无保护)、仅EDTA或EDTA+硫氰酸钠接触的血清中的乙型肝炎模板；

图12E所示图展示获自实例PCR扩增的代表性结果，所述实例PCR扩增使用MD03及MD06引物及与缓冲液(无保护)、仅EGTA或EGTA+硫氰酸钠接触的血清中的乙型肝炎模板；

图12F所示图展示获自实例PCR扩增的代表性结果，所述实例PCR扩增使用MD03及MD06引物及与缓冲液(无保护)或仅BAPTA接触的血清中的乙型肝炎模板；

图13A-13G所示图展示通过单独添加包括于本揭示内容试剂中的某些组份未获得对储存于室温下并随后经受PCR检测的尿中淋球菌DNA的保存效果；

图14A所示图展示使用与仅胞嘧啶或硫氰酸钠+EDTA+胞嘧啶接触的新鲜尿中的淋球菌DNA模板的实例PCR扩增结果；

图14B所示图展示使用与仅鸟嘌呤或硫氰酸钠+EDTA+鸟嘌呤接触的新鲜尿中的淋球菌DNA模板的实例PCR扩增结果；

图14C所示图展示使用与仅胸腺嘧啶或硫氰酸钠+EDTA+胸腺嘧啶接触的新鲜尿中的淋球菌DNA模板的实例PCR扩增结果；

图14D所示图展示使用与仅尿嘧啶或硫氰酸钠+EDTA+尿嘧啶接触的新鲜尿中的淋球菌DNA模板的实例PCR扩增结果；

图15A所示图展示使用与1M腺嘌呤、1M硫氰酸钠、1M EDTA、或1M硫氰酸钠+0.01M EDTA+1M腺嘌呤接触的新鲜尿中的淋球菌DNA模板的实例PCR扩增结果；

图15B所示图展示使用与1M腺嘌呤、1M EDTA、2M硫氰酸钠+1M EDTA、或2M硫氰酸钠+1M EDTA+1M腺嘌呤接触的新鲜尿中的淋球菌DNA模板的实例PCR扩增结果；

图15C所示图展示使用与1M腺嘌呤、1M胍、1M胍+0.01M EDTA、2M硫氰酸钠+1M EGTA、或1M胍·HCl+1M EGTA+2M腺嘌呤接触的新鲜尿中的淋球菌DNA模板的实例PCR扩增结果；

图15D所示图展示使用与1M腺嘌呤、1M胍、1M胍+0.01M EDTA、1M氯化锂+1M BAPTA、或2M硫氰酸胍+1M BAPTA+2M腺嘌呤接触的新鲜尿中的淋球菌DNA模板的实例PCR扩增结果；

图15E所示图展示使用与1M高氯酸钠、1M硫氰酸钠+2M EDTA、或1M高氯酸钠+1M EDTA接触的新鲜尿中的淋球菌DNA模板的实例PCR扩增结果；

图16A所示图展示使用与1M胍·HCl或1M胍·HCl+0.01M BAPTA+4M腺嘌呤接触的新鲜尿中的淋球菌DNA模板的实例PCR扩增结果；

图16B所示图展示使用与0.01M EDTA、2M硫氰酸钠、1M硫氰酸钠+0.1M

EDTA+1M腺嘌呤、或2M硫氰酸钠+0.1M EGTA+2M腺嘌呤接触的新鲜尿中的淋球菌DNA模板的实例PCR扩增结果；

图17A是与测试组合物(例如，本揭示内容的实例性实施例或对照)接触并经受流式细胞术分析的细胞随时间的CD3百分比图；

图17B是与测试组合物(例如，本揭示内容的实例性实施例或对照)接触并经受流式细胞术分析的细胞随时间的CD4百分比图；

图17C是与测试组合物(例如，本揭示内容的实例性实施例或对照)接触并经受流式细胞术分析的细胞随时间的绝对CD3计数图；

图18是与测试组合物(例如，本揭示内容的实例性实施例或对照)接触的样品随时间的总RNA产量图(测量曲线下面积)；

图19A是与PAX基因(PAXgene)^TM组合物接触的含RNA样品的电泳图；

图19B是与EDTA组合物接触的含RNA样品的电泳图；

图19C是与本揭示内容的一个特定实例性实施例的组合物接触的含RNA样品的电泳图；且

图19D是与本揭示内容的一个特定实例性实施例的组合物接触的含RNA样品的电泳图。

具体实施方式

本揭示内容是关于用于延迟细胞(例如，全细胞)及/或大分子及/或生物分子(“大分子”)降解的组合物、系统及方法。

根据一些实施例，组合物可保存及/或稳定化细胞(“细胞及/或大分子稳定化组合物”)。细胞可包括全细胞。全细胞可包括(例如)细胞表面物质(例如，细胞表面蛋白、细胞外基质、细胞壁及/或外膜)。可保存及/或稳定化的细胞包括选自以下的细胞：哺乳动物细胞(例如，人类细胞)、植物细胞、酵母细胞、细菌细胞、受病毒感染的细胞、患病细胞及其组合。哺乳动物细胞可包括选自红细胞、白细胞、淋巴细胞、组织细胞、上皮细胞、干细胞及其组合的细胞。

在一些实施例中，细胞可在保持存活下保存及/或稳定化。在一些实施例中，细胞可经保存及/或稳定化，其中其保持在与活体内细胞相同或基本上相同的条件(例如，就形态学、生理学、遗传学及/或生物化学来说)下。在一些实施例中，细胞可经保存及/或稳定化，其中其保持在与其于体内或体液内时相同或基本上相同的条件(例如，健康或患病)下。例如，可在细胞能量消耗、所存在代谢产物(例如，丙酮酸盐)的量、所存在游离ATP的量、转录及/或转译速率及/或存在(或不存在)一种或多种蛋白质及/或核酸等方面对保存及/或稳定化进行评价。

根据一些实施例，大分子及/或生物分子可包括蛋白质及/或核酸(例如，DNA及RNA)。所属领域的技术人员应了解，核酸可包括来自多种来源的序列。例如，单核酸可包括人工序列(例如，引物结合位点)、人类序列(例如，腺瘤性结肠息肉(APC)、淀粉样前蛋白(APP)、乳癌1(BRCA1)、跨膜蛋白酶丝氨酸2(TMPRSS2)、v-ets骨髓成红细胞增多症病毒E26致癌基因同系物(ERG))、植物序列、微生物序列(例如，抗生素抗性基因)、病毒序列(例如，HIV蛋白酶)及/或其组合。单核酸序列也可包括来自共同来源的两个序列的罕见或人工融合物(例如，TMPRSS2:ERG融合物)。只要大分子(若存在)在至少自样品采集时间到样品分析时间期间维持可检测到的形式，即可视为大分子得以保存。在一些实施例中，本揭示内容是关于体液或排泄物(例如，尿、血液、血清、羊水、脊髓液、结膜液、唾液、阴道液、粪便、精液及汗液)中大分子的保存及/或稳定化。在一些实施例中，在所述核酸测试方法中可能观察到核酸杂交出人意料地改善(例如，与于不存在本揭示内容的保存组合物、系统或方法下实施的相同方法相比)。

降解可认为是致使所关注分子或所关注分子的集合体不可检测到的分子结构的任何变化。例如，蛋白质降解可包括一级、二级、三级或四级结构的任何改变(例如，二硫键还原、肽键水解、或共价键、离子键、疏水键、氢键或范德华键(Van der Waalsbond)的任何其它裂解)。核酸降解可包括杂交状态(例如，单链、双链或三链)、螺旋结构(例如，A、B或Z)、超螺旋、或序列的任何改变(例如，嘧啶二聚化、脱氨基作用、氧化、脱嘌呤作用、或共价键、离子键、疏水键或氢键的任何其它裂解)。此降解延迟可认为是将大分子以期望形式保存较长或无限期时间段。此延迟也可认为是将大分子以期望形式保存或稳定化确定时间段(例如，自样品采集时间至分析时间)。

本揭示内容一些实施例的组合物、系统及方法可降低或消除生物流体及/或排泄物中大分子的降解。例如，在一些实施例中，本揭示内容的组合物、系统及/或方法可消除体液(例如，尿)中所关注核酸的酶促破坏。可保存及/或稳定化的核酸包括(例如)天然及/或合成形式的DNA、RNA、RNA/DNA杂合体、及其变体。可保存及/或稳定化的核酸可包括细胞间核酸及/或细胞内核酸。可保存及/或稳定化的DNA可包括(例如)人类DNA、哺乳动物DNA、细菌DNA、真菌DNA及病毒DNA。可保存及/或稳定化的细菌DNA可包括(例如)淋球菌DNA、流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)DNA及枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DNA。

拟保存及/或稳定化的细胞及/或大分子(及/或生物分子)可包含于体液及/或排泄物、组织(例如，活组织检查组织)及/或物体(例如，骨)中。例如，大分子可包含于食物颗粒、土壤样品、法医学样品(例如，衣物物品、毛发、指印)、织物、细菌基质、粘土、环境试样及/或生物战试样中。拟保存及/或稳定化的大分子(及/或生物分子)可包含于全细胞及/或全细胞纯化物(例如，完全或部分纯化)中。

组合物、系统及方法可将细胞及/或大分子保存及/或稳定化(例如，在室温下)至少约1天、至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约1周、至少约2周、至少约3周、及/或至少约4周。组合物、系统及方法可将细胞及/或大分子保存及/或稳定化(例如，在室温下)长达约1天、长达约2天、长达约3天、长达约4天、长达约5天、长达约6天、长达约1周、长达约2周、长达约3周、及/或长达约4周。在一些实施例中，组合物、系统及方法可在不冷藏条件下将细胞及/或大分子保存及/或稳定化任一前述时间段。例如，保存及/或稳定化可在环境温度及/或组合物温度不超过约70℃、约60℃、约55℃、约50℃、约45℃及/或约40℃下达成。保存及/或稳定化可在环境温度及/或组合物温度为约0℃至约10℃、约10℃至约20℃、约15℃至约25℃、约20℃至约30℃、约15℃至约35℃、及/或约30℃至约40℃下达成。在一些实施例中，温度范围的选择可基于特定样品的预期及/或期望储存条件予以选择。例如，所述组合物、系统及方法可适于保存及/或稳定化在冷藏不可行及/或不具备冷藏条件且日间温度接近50℃的不发达国家采集的物质。同样，所述组合物、系统及方法可适于保存及/或稳定化在运输条件、储存条件及/或环境条件包括低于20℃的温度的地区采集的物质。

不受限于任一特定作用机制，本揭示内容的组合物、系统及方法可灭活含有所关注大分子及/或生物分子的测试样品(例如，体液)中存在的一种或多种金属依赖性酶及/或一种或多种金属非依赖性酶。例如，二价金属螯合剂可结合可得到的金属(例如，Mg²⁺及Ca²⁺)，使得金属仍然可为金属依赖性酶(例如，脱氧核糖核酸酶)利用但不足以支持催化(即，核酸降解)。再次不受限于任一特定作用机制，螯合剂增强组份可灭活体液中发现的一种或多种金属非依赖性酶。例如，金属非依赖性酶可包括DNA连接酶(例如，D4DNA连接酶)、DNA聚合酶(例如，T7DNA聚合酶)、外切核酸酶(例如，外切核酸酶2、λ-外切核酸酶)、激酶(例如，T4聚核苷酸激酶)、磷酸酶(例如，BAP及CIP磷酸酶)、核酸酶(例如，BL31核酸酶及XO核酸酶)及RNA修饰酶(例如，大肠杆菌RNA聚合酶、SP6、T7、T3RNA聚合酶及T4RNA连接酶)。不受限于任一特定作用机制，嘌呤碱基及/或嘧啶碱基可与核酸结合并作为降解DNA及/或RNA的一种或多种酶的同质异构靶标。

根据本揭示内容的一些特定实例性实施例，与含有嘌呤碱基的细胞及/或大分子稳定化组合物接触的靶核酸(例如，淋球菌DNA)的PCR扩增产量比未与含有嘌呤碱基的细胞及/或大分子稳定化组合物接触的相同靶核酸的PCR扩增产量至少高约2倍、高约3倍、高约4倍、高约5倍、高约6倍、高约7倍、高约8倍、高约9倍及/或高10倍。根据本揭示内容的一些特定实例性实施例，与含有螯合剂、螯合剂增强组份及嘌呤碱基的细胞及/或大分子稳定化组合物接触的靶核酸(例如，淋球菌DNA)的PCR扩增产量比与含有螯合剂及螯合剂增强组份但不含有嘌呤碱基的细胞及/或大分子稳定化组合物接触的相同靶核酸的PCR扩增产量高约2倍、高约3倍、高约4倍、高约5倍、高约6倍、高约7倍、高约8倍、高约9倍及/或高10倍。例如，与含有EDTA(例如，0.1M)、硫氰酸钠(例如，1M)及腺嘌呤的细胞及/或大分子稳定化组合物接触的靶核酸(例如，淋球菌DNA)的PCR扩增产量比与含有EDTA(例如，0.1M)及硫氰酸钠(例如，1M)但不含有腺嘌呤的细胞及/或大分子稳定化组合物接触的相同靶核酸的PCR扩增产量高约10倍。

组合物

根据本揭示内容的一些实施例，用于保存及/或稳定化大分子及/或生物分子的组合物(“大分子稳定化组合物”)可包括螯合剂、螯合剂增强组份、嘌呤碱基及/或嘧啶碱基。例如，大分子稳定化组合物可包括螯合剂、螯合剂增强组份及嘌呤碱基。根据本揭示内容的一些实施例，用于保存及/或稳定化细胞(例如，全细胞)的组合物(“细胞及/或大分子稳定化组合物”)可包括螯合剂、螯合剂增强组份、嘌呤碱基及/或嘧啶碱基。例如，细胞及/或大分子稳定化组合物可包括螯合剂、螯合剂增强组份及嘌呤碱基。

螯合剂可包括(例如)乙二胺四乙酸(EDTA)、[亚乙基双(氧基亚乙基次氮基)]四乙酸(EGTA)及1，2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N，N，N′，N′-四乙酸(BAPTA)、及/或其盐。若包括在内，则螯合剂可以任一期望浓度存在。例如，螯合剂可以至少约0.1mM、至少约0.005M、至少约0.01M、至少约0.05M、及/或至少约0.1M的浓度包括在内。螯合剂可以直至约0.1mM、直至约5mM、直至约0.01M、直至约0.05M、及/或直至约0.1M的浓度包括在内。螯合剂可以约0.1mM至约0.1M的浓度包括在内。当在单一组合物中包括两种或更多种螯合剂时，各螯合剂的浓度或组合螯合剂的总浓度可在任一所提供的范围内。在一些实施例中，螯合剂可包括EDTA、EGTA、BAPTA、咪唑、亚氨基二乙酸盐(IDA)、双(5-脒基-2-苯并咪唑基)甲烷(BABIM)及/或其盐。

螯合剂增强组份可包括(例如)氯化锂、胍、水杨酸钠、高氯酸钠、硫氰酸钠及其组合。所属领域的技术人员应了解，胍包括鸟嘌呤、嘌呤碱基及核糖。若包括在内，则螯合剂增强组份可以任一期望浓度存在。例如，螯合剂增强组份可以至少约1mM、至少约10mM、至少约0.05M、至少约0.1M、至少约0.5M、至少约1M、至少约1.5M、至少约1.75M、至少约2M、至少约3M、至少约4M、及/或至少约5M的浓度包括在内。螯合剂增强组份可以直至约1mM、直至约0.05M、直至约0.1M、直至约0.5M、直至约1M、直至约1.5M、直至约1.75M、及/或直至约2M的浓度包括在内。所存在螯合剂增强组份的浓度可在端点由任一上述浓度界定的范围内。例如，螯合剂增强组份可以约1mM至约0.5M、约0.1M至约1.75M、约0.1M至约2.0M、约0.1M至约3.0M、约0.5M至约3.0M、及/或约0.1M至约5.0M的浓度包括在内。

嘌呤碱基可包括腺嘌呤、鸟嘌呤及其组合。嘌呤碱基也可包括类似物及/或变体(例如，甲基腺嘌呤、甲基鸟嘌呤、乙基腺嘌呤、乙基鸟嘌呤)。嘌呤碱基也可包括结构类似的类似物及/或变体，例如肌苷、咖啡因、尿酸、可可碱、茶碱、2-氨基嘌呤、6-氨基嘌呤、次黄嘌呤(6-氧嘌呤)及黄嘌呤(2，6-二氧嘌呤)。嘌呤碱基可包括盐(例如，腺嘌呤半硫酸盐、腺嘌呤盐酸盐)。若包括在内，则嘌呤碱基可以任一期望浓度存在。例如，嘌呤碱基可以至少约0.1mM、至少约1mM、至少约10mM、至少约0.1M、至少约0.25M、至少约0.5M、至少约0.75M、至少约1M、至少约1.5M、至少约1.75M、至少约2M、至少约2.5M、至少约3M、至少约4M、至少约5M、至少约6M、及/或至少约7M的浓度包括在内。嘌呤碱基可以直至约0.1mM、直至约1mM、直至约10mM、直至约0.1M、直至约0.25M、直至约0.5M、直至约0.75M、直至约1M、直至约1.5M、直至约2M、直至约2.5M、直至约3M、直至约4M、直至约5M、直至约6M、及/或直至约7M的浓度包括在内。若包括在内，则所存在嘌呤碱基的浓度可在端点由任一上述浓度界定的范围内。例如，嘌呤碱基可以约0.1mM至约100mM、约1mM至约10mM、约0.1M至约1.0M、约0.1M至约2.0M、约0.1M至约5.0M、约0.1M至约1.75M、约0.5M至约2.0M、约0.75M至约3M、及/或约0.1M至约7M的浓度包括在内。

嘧啶碱基可包括(例如)胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶及其组合。嘧啶碱基也可包括类似物及/或变体(例如，甲基胞嘧啶、甲基胸腺嘧啶、甲基尿嘧啶、乙基胞嘧啶、乙基胸腺嘧啶、乙基尿嘧啶)。嘧啶碱基也可包括结构类似的类似物及/或变体，例如乳清酸、硫胺素、5-氟尿嘧啶、6-氮杂尿嘧啶、吡嗪及/或哒嗪。嘧啶碱基可包括盐(例如，嘧啶盐、2-哌嗪基嘧啶盐)。若包括在内，则嘧啶碱基可以任一期望浓度存在。例如，嘧啶碱基可以至少约0.1mM、至少约1mM、至少约10mM、至少约0.1M、至少约0.25M、至少约0.5M、至少约0.75M、至少约1M、至少约1.5M、至少约1.75M、至少约2M、至少约2.5M、至少约3M、至少约4M、至少约5M、至少约6M、及/或至少约7M的浓度包括在内。嘧啶碱基可以直至约0.1mM、直至约1mM、直至约10mM、直至约0.1M、直至约0.25M、直至约0.5M、直至约0.75M、直至约1M、直至约1.5M、直至约2M、直至约2.5M、直至约3M、直至约4M、直至约5M、直至约6M、及/或直至约7M的浓度包括在内。若包括在内，则所存在嘧啶碱基的浓度可在端点由任一上述浓度界定的范围内。例如，嘧啶碱基可以约0.1mM至约100mM、约1mM至约10mM、约0.1M至约1.0M、约0.1M至约2.0M、约0.1M至约5.0M、约0.1M至约1.75M、约0.5M至约2.0M、约0.75M至约3M、及/或约0.1M至约7M的浓度包括在内。

在一些实施例中，细胞及/或大分子稳定化组合物可包括一定量的选自EDTA、EGTA、BAPTA及其盐的二价金属螯合剂；及一定量的选自氯化锂、胍、水杨酸钠、高氯酸钠及硫氰酸钠的至少一种螯合剂增强组份。二价金属螯合剂的量通常介于约0.1mM至约0.1M范围内。螯合剂增强组份的量通常介于约1mM至约500mM范围内。组合物中螯合剂的量可为(例如)至少约0.01M。组合物中螯合剂增强组份的量可为(例如)至少约1M。

根据一些实施例，大分子稳定化组合物可包括一定量的至少一种酶灭活组份，例如氯化锰、肌氨酰或十二烷基硫酸钠，其通常介于约0-5％摩尔浓度范围内。在一些实施例中，细胞及/或大分子稳定化组合物可包括或不包括酶灭活组份。

在一些实施例中，细胞及/或大分子稳定化组合物可包括嘌呤碱基、嘧啶碱基、或嘌呤碱基及嘧啶碱基二者。例如，组合物可包括螯合剂、螯合剂增强组份及嘌呤碱基(例如，腺嘌呤)。在一些实施例中，细胞及/或大分子稳定化组合物可仅包括(a)螯合剂、(b)螯合剂增强组份、及(c)嘌呤碱基及/或嘧啶碱基。在其它实施例中，细胞及/或大分子稳定化组合物可包括一种或多种溶剂(例如，水性溶剂及/或有机溶剂)、缓冲剂、盐、表面活性剂、氧化剂、还原剂及/或其它试剂。

在一些实施例中，细胞及/或大分子稳定化组合物可具有约4.5至约8.5的pH值。细胞及/或大分子稳定化组合物可调配成在与拟保存及/或稳定化的样品(例如，体液)组合后所获得混合物具有约4.5至约8.5的pH值。在一些实施例中，适宜缓冲剂可选自古德缓冲剂(Good buffer)(例如，羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES))、乙酸钾、磷酸钠、碳酸氢钾、三(羟基氨基)甲烷(Tris)及其组合。例如，缓冲剂可包括乙酸钾、乙酸钠、磷酸钾、磷酸钠、Tris、N-(2-羟基乙基)哌嗪-N′-(2-乙磺酸)(HEPES)缓冲剂、3-(N-吗啉基)丙磺酸(MOPS)缓冲剂、2-[(2-氨基-2-氧代乙基)氨基]乙磺酸(ACES)缓冲剂、N-(2-乙酰胺基)2-亚氨基二乙酸缓冲剂(ADA)、3-[(1，1-二甲基-2-羟基乙基)氨基]-2-丙磺酸(AMPSO)缓冲剂、N，N-双(2-羟基乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)缓冲剂、羟乙基甘氨酸(Bicine)(N，N-双(2-羟基乙基)甘氨酸)缓冲剂、双-(2-羟基乙基)亚氨基-三(羟基甲基)甲烷(Bis-Tris)缓冲剂、3-(环己基氨基)-1-丙磺酸(CAPS)缓冲剂、3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸(CAPSO)缓冲剂、2-(N-环己基氨基)乙磺酸(CHES)缓冲剂、3-[N，N-双(2-羟基乙基)氨基]-2-羟基-丙磺酸(DIPSO)缓冲剂、N-(2-羟基乙基哌嗪)-N′-(3-丙磺酸)(HEPPS)缓冲剂、N-(2-羟基乙基)哌嗪-N′-(2-羟基丙磺酸)(HEPPSO)缓冲剂、2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES)缓冲剂、三乙醇胺缓冲剂、咪唑缓冲剂、甘氨酸缓冲剂、乙醇胺缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸(MOPSO)缓冲剂、哌嗪-N，N′-双(2-乙磺酸)(PIPES)缓冲剂、哌嗪-N，N′-双(2-羟基丙磺酸)(POPSO)缓冲剂、N-三[(羟基甲基)甲基]-3-氨基丙磺酸(TAPS)缓冲剂、2-羟基-3-[三(羟基甲基)甲基氨基]-1-丙磺酸(TAPSO)缓冲剂、N-[三(羟基甲基)甲基]-2-氨基乙磺酸(TES)缓冲剂、N-[三(羟基甲基)甲基]甘氨酸(羟甲基甘氨酸(tricine))缓冲剂、2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇缓冲剂、2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲剂及其组合。

在一些实施例中，组合物(例如，细胞及/或大分子稳定化组合物)可包括(但不限于)表面活性剂及/或还原剂。在一些实施例中，表面活性剂可包括洗涤剂。洗涤剂可包括(例如)阴离子型洗涤剂、非离子型洗涤剂及/或阳离子型洗涤剂。非离子型洗涤剂可包括聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐单月桂酸酯、辛基-苯氧基聚乙氧基乙醇、壬基-苯氧基聚乙氧基乙醇、辛基吡喃葡萄糖苷、十二烷基吡喃麦芽糖苷、庚基硫代吡喃葡萄糖苷、Big CHAP洗涤剂、聚氧化乙烯十二烷基醚(Genapol X-80)、普流尼克(Pluronic)洗涤剂、烷基苯酚的聚氧乙烯酯(例如，曲拉通(Triton))及/或其衍生物及类似物。

根据本揭示内容的一些实施例，组合物(例如，细胞及/或大分子稳定化组合物)可包括长链脂肪酸、长链脂肪酸酯、长链脂肪醇、锂、肝素、肝素酶、丁基己基柠檬酸酯及/或其组合。在流式细胞术方法中对本揭示内容一些实施例的组合物进行测试。在一些实施例中，组合物(例如，细胞及/或大分子稳定化组合物)可不包括肝素。例如，当不期望存在肝素时(例如，当肝素可能不利影响PCR时)，可略去肝素。在一些情况下，甚至可包括足以移除肝素的量的肝素酶。

根据一些实施例，细胞及/或大分子稳定化组合物可以固体、液体或气体(例如，蒸气)形式制备及/或使用。

在一些实施例中，可能期望具有可用于全细胞分析(例如，流式细胞术)及分子分析(例如，PCR、RT-PCR、组织化学)二者的稳定化组合物。根据一些实施例，细胞及/或大分子稳定化组合物可包括：(a)螯合剂(例如，选自以下的螯合剂：乙二胺四乙酸(EDTA)、[亚乙基双(氧基亚乙基次氮基)]四乙酸(EGTA)、1，2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N，N，N′，N′-四乙酸(BAPTA)及其盐)；(b)至少一种螯合剂增强组份(例如，选自以下的螯合剂增强组份：胍、氯化锂、水杨酸钠、高氯酸钠及硫氰酸钠)；(c)碱基(例如，选自由嘌呤碱基及嘧啶碱基组成的群组的碱基)；(d)抗凝剂(例如，硫酸化糖胺聚糖)；及(e)增塑剂(例如，柠檬酸醇酯)。例如，细胞及/或大分子稳定化组合物可包括如上所述的螯合剂、螯合剂增强组份及碱基。根据一些实施例，细胞及/或大分子稳定化组合物可稳定化一种或多种细胞(例如，红血球、白血球)，使其很少或不凝结或形成团块。所述经稳定化的细胞可适用于流式细胞术分析。碱基可以约0.01mg/L至约1mg/L、约0.01mg/L至约0.5mg/L、及/或约0.2mg/L至约0.5mg/L的浓度存在。在一些实施例中，细胞及/或大分子稳定化组合物可进一步包括增塑剂。增塑剂可以约0.1％(v/v)至约10％(v/v)、约0.2％(v/v)至约5％(v/v)、约0.5％(v/v)至约2％(v/v)、及/或约1％(v/v)至约5％(v/v)的浓度存在。在一些实施例中，增塑剂可包括柠檬酸醇酯。柠檬酸醇酯的实例可包括柠檬酸三乙酯、柠檬酸乙酰基三乙酯、柠檬酸三丁酯、柠檬酸乙酰基三丁酯、柠檬酸三辛酯、柠檬酸乙酰基三辛酯、柠檬酸三己酯、柠檬酸乙酰基三己酯、柠檬酸丁酰基三己酯(例如，柠檬酸正丁酰基三正己酯)、柠檬酸三甲酯及其组合。

在一些实施例中，细胞及/或大分子稳定化组合物可以约200mg/L至约20g/L、约400mg/L至约5g/L、约500mg/L至约2g/L、及/或约1g/L至约3g/L的浓度包括抗凝剂。在一些实施例中，抗凝剂可包括硫酸化糖胺聚糖。硫酸化糖胺聚糖的实例可包括(但不限于)肝素及/或肝素盐(例如，肝素铵、肝素钙、肝素锂、肝素钾、肝素钠及/或肝素锌锂)。

系统

根据本揭示内容的一些实施例，系统可包括细胞及/或大分子稳定化组合物及样品储存容器。例如，系统可包括构造及布置成可容纳含有拟保存及/或稳定化的大分子及/或生物分子的样品的容器。容器可构造及布置成可使样品与细胞及/或大分子稳定化组合物接触。在一个简单实例中，调配成固体(例如，片剂、散剂或水凝胶)的细胞及/或大分子稳定化组合物可沉积于小管底部。在将样品(例如，液体样品)置于管中后，所述细胞及/或大分子稳定化组合物可与样品环境接触并混合。样品可在置于容器中的同时或一定时间后与细胞及/或大分子稳定化组合物接触(例如，混合)。

在本揭示内容的一些实施例中，系统可包括进一步包括脂质、表面活性剂及/或洗涤剂的细胞及/或大分子稳定化组合物。例如，细胞及/或大分子稳定化组合物可包含于微胶粒、脂质体、小泡及/或膜结合性空腔中。

根据一些实施例，系统可包括细胞及/或大分子稳定化组合物及使用说明。在一些实施例中，系统可包括细胞及/或大分子稳定化组合物、样品储存容器及使用说明。系统也可包括构造成含有样品储存容器及其内含物的可运输容器。

根据一些实施例，系统可包括用于分析所保存分子及/或细胞的分析装置。分析装置的实例可包括(但不限于)显微镜、读板仪、按大小分级分离用凝胶、热循环仪、流式细胞仪、自动血液分析仪、细胞分类计数器、细胞分选仪、珠粒(例如，磁性珠粒)、亲和基质及/或分光计。

方法

根据本揭示内容的一些实施例，保存及/或稳定化大分子及/或生物分子的方法(“大分子稳定化方法”)可包括使大分子与大分子稳定化组合物接触。例如，可使包含大分子的体液与含有螯合剂、螯合剂增强组份及嘌呤碱基(例如，腺嘌呤)的大分子稳定化组合物接触。根据本揭示内容的一些实施例，保存及/或稳定化细胞(例如，全细胞)的方法(“细胞稳定化方法”)可包括使细胞与细胞及/或大分子稳定化组合物接触。例如，可使包含细胞的体液与含有螯合剂、螯合剂增强组份及嘌呤碱基(例如，腺嘌呤)的细胞及/或大分子稳定化组合物接触。

本揭示内容也是关于改良测试样品的分子分析的信号应答的方法，其包括使测试样品与细胞及/或大分子稳定化组合物接触以产生经保存及/或稳定化的测试样品(“经保存的测试样品”)、自测试样品分离及/或纯化所关注的分子分析物、及对所分离及/或纯化的所关注分子分析物实施分子分析。不受限于任一特定作用机制，核酸分析中信号应答的改良可能部分缘于因使用本揭示内容的细胞及/或大分子稳定化组合物而达成的杂交增强。

本揭示内容进一步是关于改良核酸杂交的方法，其包括使测试核酸与细胞及/或大分子稳定化组合物接触以形成测试溶液及使所述测试溶液与靶核酸在容许测试核酸-靶核酸杂交的条件下接触。

根据一些实施例，方法可包含充分地稳定化及/或保存细胞，以使细胞可经受流式细胞术分析。例如，方法可包括保存及/或稳定化细胞，以使细胞(例如，其所处的环境)无可能干扰流动分析的团块及/或碎片。保存及/或稳定化可使用任何可利用的度量标准或度量标准组合进行评价。形成团块及/或碎片可用作保存及/或稳定化度量标准。外观(例如，颜色)也可用作保存及/或稳定化度量标准。

保存及/或稳定化度量标准可包括(例如)一种或多种标记(例如，细胞外标记)随时间的存在量。保存及/或稳定化标记可包含一种或多种蛋白质、一种或多种碳水化合物、一种或多种脂质、一种或多种核酸及/或其组合。例如，保存标记可包括一种或多种淋巴细胞表面标记。标记实例可包括(例如)B细胞标记(例如，CD19、CD20、CD21、CD22及其组合)、T细胞标记(例如，CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD10及其组合)、NK细胞标记(例如，CD16、CD56、CD57及其组合)、髓系标记(例如，CD13、CD33、CD34及其组合)、单核细胞标记(例如，CD14)及/或全白细胞标记(例如，CD45)。在一些实施例中，就百分比及/或绝对计数来说，与组合物(例如，细胞及/或大分子稳定化组合物)接触的细胞(例如，淋巴细胞)在室温(例如，约20℃)下在约48小时、约72小时及/或约96小时时可保留高于约80％、高于约90％、高于约95％及/或高于约99％的一种或多种标记(例如，细胞表面标记)。例如，与组合物接触的淋巴细胞在室温下可保留至少约80％的一种或多种T细胞标记(例如，CD3、CD4、CD8)达约96小时(t₀是使细胞与组合物接触的时间)。度量标准的另一实例可为经保存及/或稳定化细胞中检测到的及/或自经保存及/或稳定化细胞回收的一种或多种核酸的数量及/或质量。

在一些实施例中，细胞及/或大分子稳定化组合物与样品的体积及/或重量比可为约1∶10至约10∶1、约1∶10至约1∶1、及/或约1∶10至约1∶5。细胞及/或大分子稳定化组合物可以每毫升及/或每克样品约10μg至约10mg细胞及/或大分子稳定化组合物的比率与样品组合。根据一些实施例，可将细胞及/或大分子稳定化组合物添加到拟保存及/或稳定化的样品(例如，含有样品的器皿)中。在一些实施例中，可将拟保存及/或稳定化的样品添加到细胞及/或大分子稳定化组合物(例如，含有细胞及/或大分子稳定化组合物的器皿)中。根据一些实施例，细胞及/或大分子稳定化组合物及拟保存及/或稳定化的样品可同时彼此互相添加。例如，二者可添加到另外的空混合器皿中。

所属领域的技术人员应了解，根据本揭示内容实施例可构想出用于保存及/或稳定化细胞及/或大分子及/或生物分子的其它等效或替代组合物、系统及方法，此并不背离其基本特征。例如，细胞及/或大分子稳定化组合物可调配成散剂、颗粒剂、片剂、胶囊、液体、糖浆、糊剂。细胞及/或大分子稳定化组合物可通过任一可用方法沉积于样品容器中。例如，细胞及/或大分子稳定化组合物可涂敷(例如，喷雾或喷雾干燥)到样品容器的内表面上，随后引入含有大分子的样品。细胞及/或大分子稳定化组合物也可以固体或液体形式简单地置于样品容器中。或者，细胞及/或大分子稳定化组合物可保存于单独容器中，并且仅在将样品置于样品容器中之后与样品接触。而且，在提供范围的情况下，所揭示的端点可视特定实施例期望或要求而进行准确及/或估计处理。另外，在一些实施例中，可能期望混合及匹配范围端点。在一些实施例中，当应用于数值时，术语“约”係指数值加上或减去所述值的约1％、加上或减去所述值的约5％、加上或减去所述值的约10％、加上或减去所述值的约25％及/或加上或减去所述值的约50％。根据一些实施例，当所提供的数值为范围端点时，视范围广度而定，术语“约”可具有或多或少的灵活性。例如，若范围涵盖单个数量级(例如，约1至约10)，则“约”可能具有较低灵活性。然而，对于涵盖数个数量级(例如，约0.1至约100)的范围，端点可能具有较高灵活性。在一些实施例中，包括术语“直至”的浓度范围(例如，直至1mM NaCl)可包括达到零以上任一物质量的较低端点值(例如，任一痕量NaCl)。在一些实施例中，术语“直至”可涵盖及/或要求存在一定非零量特定物质。这些等效形式及替代形式以及显而易见的改动及修改均意欲包括于本揭示内容范围内。本揭示内容旨在作为对本揭示内容范围的例示性而非限定性说明。随附权利要求书同样旨在作为对本揭示内容范围的例示性而非限定性说明。

本揭示内容的一些特定实施例可至少部分地通过参考下文特定实例性实施例来了解。这些实例阐释本揭示内容一些实施例的一些(但不一定全部)方面，且所属领域的技术人员依据本揭示内容将显而易见其它变动。

实例1

图1是根据本揭示内容的一个实施例经保存及/或稳定化尿中DNA浓度的条形图。利用GTT每小时计数来测试10种类型尿试样中转化体的数量，并随后进行总结。利用标准谷诺斯特(Gonostat)方案(参见实例2，下文)，且所用保存剂是1M胍HCl/0.01M EDTA。200个菌落的计数显示经完全保存的试样。经保存尿中淋球菌转化体的数量在整个4小时测试期间保持相对恒定，接近200。不同类型尿试样之间未观察到保存水平的显著差异。因此，所测试实例组合物对尿中的DNA提供几乎完全保护。

实例2

图2是根据本揭示内容的一个实施例经保存及/或稳定化尿的8天GTT连续数据图。将1pg淋球菌DNA掺加到9mL新鲜人尿及1mL含有1M高氯酸钠及0.01M EGTA的水性大分子稳定化组合物中。将300μL点至谷诺斯特生物体的菌苔上，以24小时间隔持续8天。所述板含有BBL巧克力II琼脂(BBL Chocolate II agar)，并在37℃下培育24小时，随后进行读数。整个8天测试时间段期间所观察到的菌落数介于低计数188至高计数197范围内。因此，本揭示内容实施例可保存及/或稳定化尿中的DNA达较先前提供时间段显著较长的时间段。

实例3

图3所示图比较根据本揭示内容的一个实施例未经保存及经保存(经保存及/或稳定化)正常尿的PCR结果。使用沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)主要外膜蛋白(MOMP)模板，并利用标准PCR方案进行扩增。将200拷贝MOMP靶标掺加到含有1M高氯酸钠及0.01M BAPTA的9mL新鲜人尿中。每隔一小时实施一次PCR，总共8小时。在未经保护尿中，在将DNA添加到尿中后1小时测量到约3个PCR吸光度。截止第6小时，PCR吸光度的数量接近零。相比之下，在经保存及/或稳定化试样中，在测试1小时时测量到超过3个PCR吸光度。然而，截止第6小时仍然观察到约3个PCR吸光度。因此，本揭示内容实施例可保存及/或稳定化足够DNA及核酸序列而容许PCR测试，远远超过未经保存尿的测试限值。尿试样中的所有DNA类型的图中所示结果一致。

实例4

本揭示内容的试剂及方法可用以保存其它体液及排泄物(例如血清)。图4是根据本揭示内容的一个实施例经保存及/或稳定化血清的8天连续数据图。所用方案与实例3类似，只是使用新鲜人类血清。整个8天测试时间段期间所观察到的转化体菌落数介于测量第1天的高计数110至测量第7天的低计数约92范围内。事实上，测试结果实际上显示第7天与第8天间转化体菌落增加。因此，本揭示内容一些实施例可保存及/或稳定化血清中的DNA达较先前获得时间段显著较长的时间段。

实例5

图5是根据本揭示内容的一个实施例经保存及/或稳定化血清中的DNA浓度的图。将血清用包含1M胍HCl/0.01M EDTA的大分子稳定化组合物保存及/或稳定化。所用方案与实例3类似，只是使用新鲜人类血清，且研究持续时间为10小时。在将淋球菌DNA添加到血清中时测量到超过120个转化体。在测量6小时时计数到约100个转化体。然而，截止第10小时，测试显示经保存血清中生物活性DNA的浓度增加到约110个转化体菌落。

实例6

用于保存DNA的方法10的实例性实施例示意性地显示于图6中。此方案阐述于下文表1中，且已观察到产生适用于诸如使用尿试样的PCR、限制性片段长度多肽性分析(RFLP)及核酸探针等测试方法的高产量DNA/RNA。

表1

1.	将10mL清洁收集的尿16添加到含有二价金属螯合剂12及螯合剂增强组份14的试样试管18中。将试管颠倒两次或三次以混合尿。
		2.	将试管运送到实验室。不需要冷藏。注意：试管应在凉爽处储存且避免阳光直射。
3.	在实验室，将试管在3200rpm下离心20达10分钟。
		4.	使用无菌移液管将试管底部的沉淀物22转移到含有缓冲剂的另一试管24中。(应使尽可能少的尿与沉淀物物质一起转移。)
5.	将缓冲物质在2-8℃下储存26，直至准备测试28。

6.	实施分析所需要的试样量对于所用各测试方法及各测试方案均有效。

实例7

模拟临床试样中DNA的保存

在以下实验中，产生模拟临床尿试样并测试是否存在淋球菌DNA。以先前所述浓度向健康成人的尿试样中添加下文表2中所列示的化学品以及EDTA。

紧接地，将淋球菌悬浮液添加到各尿试样中。所添加淋球菌是普通淋球菌(N.gonorrhoeae)菌株49191，使其在GC琼脂培养基上于37℃下于5％CO₂气氛中生长过夜。挑选出淋球菌菌落并悬浮于GC缓冲液中。将1/10体积的每毫升含有约10个菌落形成单位(cfu)的悬浮液添加到尿中。作为阳性对照，也将淋球菌悬浮液添加到Hepes缓冲液中。

在零时间(即，添加化学品及淋球菌时)，测试所有模拟临床试样及Hepes对照。也在于室温下储存6天后测试试样及对照。所选此6天时间段近似于预期的患者试样采集、邮寄与测试间的最长时间。

除含有十二烷基硫酸钠(SDS)及肌氨酰的尿样品外，其它模拟试样及Hepes对照均如下进行处理：

1.将10mL量在4000rpm下离心30分钟。

2.轻轻倒出上清液，并将沉淀物悬浮于1mL磷酸盐缓冲液中。

3.将悬浮液在60℃水浴中加热10分钟。

4.冷却后，将悬浮液用于GTT。

含有SDS-EDTA或肌氨酰-EDTA的模拟尿试样如下进行处理：

1.将约21/2体积(约25mL)的95％乙醇添加到含有尿及大分子稳定化组合物的试管中。藉由颠倒试管数次将内含物混合。

2.将混合物在4000rpm下离心30分钟。

3.将沉淀物悬浮于10mL 70％醇中，并离心。

4.随后将沉淀物悬浮于1mL磷酸盐缓冲液中。

5.将悬浮液在60℃水浴中加热10分钟。

6.冷却后，将悬浮液用于GTT。

将接种的尿在室温下储存6天，随后进行测试。显示，经调配物保存及/或稳定化(+)或未经保存及/或稳定化(-)的接种尿中的淋球菌DNA在6天后与Hepes缓冲液对照达到近似相同程度。尽管谷诺斯特(Gonostat)^TM分析的结果可能是半定量的，但所述测试未设计成给大分子稳定化组合物的相对效能进行分级。因此，表2中给出的结果表明，与特定化学品无关，经保存及/或稳定化尿中的DNA在6天时间段后达到与Hepes缓冲液相同的程度。

表2

男性尿试样所展示的92％灵敏性与文献中所报导的培养物结果相当。另外，女性尿试样所展示的88％灵敏性超过先前所报导的水平。

尽管本揭示内容的一个较佳实施例是关于淋球菌DNA的保存，但所属领域的技术人员易知本揭示内容也适用于保存其它类型DNA，例如流感嗜血菌DNA及枯草芽孢杆菌DNA。本揭示内容的一些实施例也可用于保存及/或稳定化体液样品中所含有的RNA。所述经保存的RNA可用于病毒区段的RNA转录酶及逆转录酶分析及人类基因序列测试。

此外，尽管可将大分子稳定化组合物添加到体液(例如，尿试样)中，但也可将尿试样添加到大分子稳定化组合物中，此并不损害保存/稳定化效能。DNA的最佳保存可通过将一种本揭示内容的大分子稳定化组合物添加到试样中来达成。

实例8

产青霉素酶淋球菌(Neisseria gonorrhea)的PCR检测

通过以下实例来阐述本揭示内容大分子稳定化组合物的PCR信号增强作用。在PPNG中发现四种编码TEM的质粒。这四种是6.7kb(4.4Mda)亚洲型(Asian type)、5.1kb(3.2Mda)非洲型(African type)、4.9kb(3.05Mda)多伦多型(Toronto type)和4.8kb(2.9Mda)里约型(Rio Type)。针对PPNG的此PCR分析利用以下事实：TEM-1基因位于靠近转位子Tn2末端的地方；使用TEM-1基因中的一种引物和远离Tn2末端的序列中的另一种引物，且对于所有四种质粒均适用，所获得PCR产物仅来自质粒而非来自编码TEM-1的质粒。(下文表3)修改与此方案相关的条件以在杂交中包括所述大分子稳定化组合物，并按照标准PCR方案将经处理探针与761bp扩增产物混合。读取A₄₅₀nm结果。

材料和试剂

BBL巧克力11琼脂板

无菌Tris缓冲液10mM Tris(pH 7.4)，1mM EDTA

0.5mL基因扩增反应试管

无菌一次性巴斯德(Pasteur)吸头

自封闭防回渗吸头(Aerosol-resistant tip)

PCR主体混合物：

50mM KCl

2mM MgCl

50μM以下各种试剂：

脱氧核糖核苷三磷酸；

2.5U Taq聚合酶(伯金埃尔默(Perkin Elmer))；

5％甘油；

50pmol引物PPNG-L和PNG-R中的每一种(每100μL反应物)

变性溶液

1M Na 5X登哈特溶液(Denhardt′s solution)

预杂交溶液

5X SSC(1X SSC是0.015M NaCl加上0.015M柠檬酸钠)；

5X登哈特溶液；

0.05％SDS；

0.1％焦磷酸钠(Sodium Ppi)；及

100μg经超声波处理的鲑鱼精DNA/mL。

杂交溶液

与预杂交溶液相同，只是不含登哈特溶液且包括200μL大分子稳定化组合物1。

1mL DNA/RNA大分子稳定化组合物(1M胍HCl/0.01M EDTA)

抗生物素蛋白(Avidin)-HRP过氧化物酶复合物(Zymed)

磁性微粒(泰瑞达(Seradyne))

表3

功能	名称	核苷酸序列5′至3′
			引物	PPNG-L	AGT TAT CTA CAC GAC GG(SEQ ID NO：1)
引物	PPNG-R	GGC GTA CTA TTC ACT CT(SEQ ID NO：2)
			探针	PPNG-C	GCG TCA GAC CCC TAT CTA TAA ACT C(SEQ ID NO：3)

方法

样品制备：从巧克力琼脂板中挑选2个菌落。在准备PCR之前将菌落悬浮于去离子水中。根据以上配方制备主体混合物。将5μL新制得的细菌悬浮液添加到95μL主体混合物中。使DNA释放出来并在热循环仪中利用三个于94℃下3min和于55℃下3min的循环使其变性。使DNA在所述热循环仪中通过利用两阶段曲线来扩增：于95℃下变性25s和于55℃下复性25s，总共三十个循环。对两个温度平台之间的时间进行设定以在所述两个温度之间能够尽可能最快的复性。在有及没有大分子稳定化组合物的情况下在37℃下将15pmol经标记(抗生物素蛋白-HRP复合物)检测探针PPNG-C添加到结合至磁性微粒的杂交溶液中，并维持1小时。然后将对照和经处理探针添加到扩增产物中，并以A_450nm以色度法检测反应。已发现，获自用本揭示内容大分子稳定化组合物处理的杂交探针的信号明显高于未经处理探针的信号。

实例9

本揭示内容一些实施例的组合物、系统及方法可使利用诸如聚合酶链反应(PCR)、LC_x和遗传转化测试(GTT)等核酸测试方法获得的信号增加。例如，组合物、系统及方法可使诸如PCR等核酸测试方法中的杂交增强。图7显示对于产青霉素酶淋球菌(PPNG)DNA及PPNG-C探针的杂交通过使用本文所揭示大分子稳定化组合物的特定实例性实施例所获得的杂交得以改善。此PCR方案与实例10中所述相同。

实例10

图8及图9进一步展示本揭示内容组合物、系统及方法的特定实例性实施例改良利用核酸测试方法(在此情况下为分支DNA分析(凯龙(Chiron)))所获得的结果的效能。在图8中所实施的测试中，使用bDNA分析来评价大分子稳定化组合物的保护作用。将来自丙型肝炎病毒的DNA序列掺加到血清和血浆中。将经保护血清和血浆与9ml血清或血浆和1ml大分子稳定化组合物混合。使用以下调配物：1)1M胍HCl/0.01M EDTA；2)1M高氯酸钠/0.01M BAPTA；3)1M硫氰酸钠/0.01M EGTA；及4)1M氯化锂/0.01M EGTA。将调配物在4℃下储存7天。bDNA分析依赖于杂交；自吸光度结果可以清楚地看到，靶序列不仅受保护免于降解，而且吸光度结果增加了一倍多表明靶序列的杂交/复性增强。

图9展示血清对血浆的研究。将50μL新鲜人类血浆样品和1ml新鲜人类血清样品用1M胍HCl/0.01M EDTA保护，并将所述样品在20°F下储存48小时，随后对这些样品实施bDNA分析。将结果与未经保护的样品进行比较。自吸光度结果可以清楚地看到，靶序列不仅受保护免于降解，而且吸光度结果增加了一倍多表明靶序列的杂交/复性增强。

实例11

已观察到诸如高铁血红蛋白等血红素化合物会干扰核酸的PCR扩增。例如，图10显示按照实例10实施的一系列PCR分析的结果，其中将模板新鲜人类血清与增加量的高铁血红蛋白掺加到一起。如图所示，吸光度随高铁血红蛋白浓度变化而减小。在最高浓度下，根本观察不到吸光度(即，扩增)。

根据一些实施例，本揭示内容的大分子稳定化组合物在实施的血清PCR分析中可除去血红素化合物(例如，高铁血红蛋白)的干扰。图11展示通过向血清样品中添加包含1M硫氰酸钠及0.1M EDTA的大分子稳定化组合物所获得的改良(即，扩增增加，如通过吸光度(A₄₅₀)所测量)。与对照一样(图10)，将血清样品与增加量的高铁血红蛋白(至10dl/mL浓度)掺加到一起。在4小时时间段内实施连续PCR分析。

实例12

包括二价金属螯合剂及螯合剂增强组份的实例组合物对于保护血清中的乙型肝炎序列具有令人惊奇的协同效应。具体来说，使乙型肝炎模板与测试组合物(例如，1M高氯酸钠/0.01M EGTA)在室温下接触长达36小时(以2小时间隔取样)。使样品经受使用MD03及MD06引物使用如实例10中所述样品PCR方案的PCR扩增。所获得的代表性结果提供于图12A-12F中。总之，这些图显示，与单独添加EGTA或高氯酸钠相比，使用本揭示内容大分子稳定化组合物的特定实例性实施例时，乙型肝炎序列的保存及/或扩增增加。

实例13

图13展示通过单独添加本揭示内容试剂的组份而提供的对储存于室温下且随后经受PCR检测的尿中淋球菌DNA的保存效果(相对普通)，即，二价金属螯合剂0.01MBAPTA(图13A)、0.01M EDTA(图13B)、0.01M EGTA(图13C)；及螯合剂增强组份1M高氯酸钠(图13D)、1M水杨酸(图13E)、1M胍HCl(图13F)、1M硫氰酸钠(图13G)及氯化锂(图13H)。利用GTT每小时计数来测试10种类型尿试样中转化体的数量，并随后进行总结。利用标准谷诺斯特方案(参见实例2，下文)，且展示通过将二价金属螯合剂与螯合剂增强组份组合而获得的对储存于室温下并随后经受PCR检测的尿中淋球菌DNA的协同保护作用。

实例14

制备含或不含硫氰酸钠(1M)及EDTA(0.1M)的包含嘌呤碱基或嘧啶碱基(1M)的组合物。采集新鲜人尿样品，掺加1pg淋球菌DNA，与所述组合物之一组合，并在室温下培育。8小时后取分液，并通过PCR测试是否存在可扩增的淋球菌DNA。此PCR方案与实例10中所述相同。如图14中所展示，含有硫氰酸钠、EDTA及嘌呤或嘧啶碱基的组合物比仅含有嘌呤或嘧啶碱基的组合物更有效地稳定化尿中的淋球菌DNA。

实例15

制备包含硫氰酸钠、EDTA及/或腺嘌呤的组合物。采集新鲜人尿样品，掺加1pg淋球菌DNA，与所述组合物之一组合，并在室温下培育。8小时后取分液，并通过PCR测试是否存在可扩增的淋球菌DNA。此PCR方案与实例10中所述相同。如图15A中所展示，含有硫氰酸钠、EDTA及腺嘌呤的组合物通常比不含有所有三种组份的组合物更有效地稳定化尿中的淋球菌DNA。所观察到的唯一例外是包含硫氰酸钠及EGTA的组合物。

实例16

制备包含高氯酸钠、氯化锂、胍HCl、硫氰酸胍、EDTA、EGTA、BAPTA及/或腺嘌呤的组合物。采集新鲜人尿样品，掺加1pg淋球菌DNA，与所述组合物之一组合，并在室温下培育。8小时后取分液，并通过PCR测试是否存在可扩增的淋球菌DNA。此PCR方案与实例10中所述相同。如图15B中所展示，含有螯合剂、螯合剂增强组份及腺嘌呤的组合物比不含有所有三种组份的组合物更有效地稳定化尿中的淋球菌DNA。

实例17

制备包含硫氰酸钠、胍HCl、EDTA、EGTA、BAPTA及/或腺嘌呤的组合物。采集新鲜人尿样品，掺加1pg淋球菌DNA，与所述组合物之一组合，并在室温下培育。8小时后取分液，并通过PCR测试是否存在可扩增的淋球菌DNA。此PCR方案与实例10中所述相同。如图16中所展示，含有螯合剂、螯合剂增强组份及腺嘌呤的组合物比仅含有所述组份之一的组合物更有效地稳定化尿中的淋球菌DNA。

实例18

根据一些实施例，本揭示内容组合物可保存及/或稳定化全细胞(“细胞及/或大分子稳定化组合物”)。在一特定实例中，自患有一种或多种以下病状的患者取300份尿试样：急性肾小球肾炎、急性肾盂肾炎、肾病综合征、急性肾小管坏死、膀胱炎、泌尿道赘瘤形成及病毒感染。

在采集后10分钟内，将尿样品冷藏(2-8℃)或与含有1M硫氰酸钠、0.01M EDTA及1M腺嘌呤的细胞及/或大分子稳定化组合物(CSC)组合(9mL尿+1mL大分子稳定化组合物)。在采集后2小时内处理冷藏样品。

如表4中所示，使用细胞及/或大分子稳定化组合物来保存及/或稳定化多种全细胞至少与冷藏一样有效。

表4：全细胞的保存/稳定化

细胞类型	冷藏	CSC
			红细胞	正常	略微皱缩
非均一性红细胞	可检测到	可检测到
			白细胞	颗粒状球体+核段(Nuclear Seg.)结晶紫+	颗粒状球体(正常)+核段结晶紫+
脓尿(标准化载玻片)	＞20hpf	＞20hpf
			淋巴细胞-组织细胞	可检测到	可检测到(正常)
肾小管上皮细胞5个片段(若存在)	可检测到可辨别	可检测到(正常)可辨别
			肾小管上皮脂质马尔他十字形成(Maltese CrossFormation)	可检测到	可检测到
肾小管上皮细胞中的色素	普鲁士蓝(PrussianBlue)+	普鲁士蓝+

鳞状上皮细胞	可检测到(正常)	可检测到(正常)
			透明管型(相位差检测)	可检测到	可检测到
蜡样管型(亮视野显微镜检查)	可检测到，形态正常	可检测到，略微较宽
			颗粒管型	可检测到	可检测到
脂肪管型	可检测到	可检测到
			晶体管型	可检测到	可检测到
血红蛋白血细胞管型	可检测到	非常苍白
			肌红蛋白管型	可检测到	不可检测到
红细胞管型	可检测到	可检测到
			白细胞管型：亮视野显微镜检查相位差证实	可检测到是	可检测到是
肾小管上皮细胞管型(巴氏染剂(pap stain)、相位差显微镜检查)	可检测到	易变
			细菌	可检测到	可检测到
晶体酸性尿：草酸钙、尿酸、结晶尿酸盐	可检测到可检测到可检测到	可检测到可检测到可检测到
			晶体碱性尿：非晶型磷酸盐(CA-Mg)碳酸钙	可检测到可检测到	可检测到可检测到
晶体异常尿：胱氨酸磺酰胺晶体	可检测到可检测到	可检测到可检测到

实例19

在初始流式细胞术实验期间，与由0.01M EDTA及1M硫氰酸钠组成的组合物接触的一些红血球似乎在第1天处于良好状态，但观察到在所测试的特定条件下在第3-5天形成团块。含有团块细胞的样品可认为难以通过流式细胞术进行分析。因此，寻求可稳定化用于流动分析的细胞的改良调配物。

实例20

根据一些实施例，所制备调配物应允许保存红细胞群体及白细胞群体及白细胞上的共存表面抗原标记，而无在一些条件下可能观察到的溶胀及形成团块。

组合物的实例性实施例可如下制备：

1.将肝素锂添加到含有水的混合容器中。混合直至澄清。

2.将基因锁原液化学物质(Genelock stock chemistry)添加到混合容器中。

3.添加腺嘌呤并混合直至澄清。

4.添加表面活性剂(例如，柠檬酸丁酰基三正己酯)。混合10min。

5.添加水以使总体积达到期望最终体积。

6.混合15min。

7.过滤(例如，杀菌过滤)，得到最终组合物。

根据一些实施例，化学上的变化可包括用肝素锂代替柠檬酸盐磷酸盐缓冲系统及腺嘌呤浓度增加。例如，组合物可包括以下成份：

	量/100mL
		基因锁原液化学物质(Genelock stock chemistry)1M硫氰酸钠0.01M EDTA	20mL
腺嘌呤	0.03g
		肝素锂	0.20g
柠檬酸丁酰基三正己酯(5％原液)	0.5mL
		量不足，添加水补足体积(QNS water to volume)

在第1天抽取血液，以1∶7的保存剂∶血液比与所述组合物组合，并在环境温度(例如，室温(RT))下陈化3天。在贝克曼(Beckman)计数器细胞分析仪上对血液实施分类细胞分析。所述分析显示白细胞群体及红细胞群体均保存得非常好。血液呈粉红色且具有粘性，与刚采集的血液相比颜色变化较小。不存在表明血液发生变化的可见证据，且预期适用于流动分析。

实例21

制备以下细胞及/或大分子稳定化组合物：

组合物1：分子全血试管

群组A                              g/L

右旋糖(单水合物)                   31.9

柠檬酸钠(二水合物)                 26.3

柠檬酸(无水)                       3.27

磷酸二氢钠(单水合物)               2.22

腺嘌呤                             0.275

群组B

硫氰酸钠                             405g/L

EDTA(0.1M)                           500mL/L

组合物1(A+B)                         mL

群组A                                1000

 群组B                          100

 DIUF水                         200

                                            

 总计                           1300

 组合物FC

 硫氰酸钠                       81g/L

 EDTA(0.1M)                     100mL

 腺嘌呤                         0.30g/L

 肝素钠                         2000mg/L

 柠檬酸正丁酰基三正己酯         10mL/L

 DIUF水                         足量

                                        

 总计                           1000mL

 组合物U-1

 硫氰酸钠                        81g/L

 EDTA(0.1M)                      100mL

 DIUF水                          足量

                                          

 总计                            1000mL

 组合物U-2

 硫氰酸钠                         81g/L

 EDTA(0.1M)                       100mL

 腺嘌呤                           0.30g/L

 DIUF水                           足量

                                              总计                             1000mL

 组合物S

 硫氰酸钠                         8.1g/L

 EDTA(0.1M)                       100mL

 DMSO                             20mL/L

 甘油                             25mL/L

 磷酸二氢钾                       3.93g/L

 磷酸钾                           5.02g/L

将新鲜血液以1∶7的保存剂∶血液比与组合物1及FC之一组合，并在环境温度(例如，室温(RT))下陈化3天。24小时后，与组合物U-1组合的血液形成团块。相比之下，与组合物FC组合的血液在72小时后无团块。利用锥虫蓝分析来评价生存力。超过99％的来自与组合物FC组合的血液的白细胞在72小时后保持完整(得以保存)。结果显示于表5中。

形成团块：无(--)，较少(+)，大量(++)

生存力：未检测到(--)，少许存活细胞(-)；99％+存活(++)

实例22

在环境温度及压力下通过将螯合剂增强组份(例如，硫氰酸钠)及去离子超滤(DIUF)水添加到混合容器中并随后混合10分钟来制备细胞及/或大分子稳定化组合物。然后，将预溶解的螯合剂(例如，EDTA)添加到混合容器中，并混合10分钟。随后将碱基(例如，腺嘌呤)添加到容器中并混合，直至获得澄清溶液。若期望，则在此时添加缓冲剂(例如，磷酸盐缓冲剂)。最后，添加DIUF水以使混合容器中的体积达到总期望体积，并将溶液混合10分钟。通过将所得混合物杀菌过滤到无菌容器(例如，纳吉恩瓶(Nalgene bottle))中获得最终溶液。流式细胞术分析中所用细胞及/或大分子稳定化组合物的数个特定实例的配方详述于表5中。

表5：细胞及/或大分子稳定化组合物

	T-5	T-8(1X)	T-8磷酸盐(1X)	T-8.25(1X)	T-8.5(1X)
						硫氰酸钠	8.1g	2.1g	2.1g	0.525g	1.05g
0.01M EDTA	10mL	10mL	10mL	10mL	10mL
						柠檬酸正丁酰基三己酯	1mL	无	无	无	无
腺嘌呤	0.03g	0.03g	0.03g	0.03g	0.03g
						磷酸盐缓冲剂	无	无		无	无
总体积	100mL	100mL	100mL	100mL	100mL
						pH值	5	8.0	6.5	8.25	8.5

实例23

在环境温度及压力下通过将USP纯净水分液添加到合适大小的容器中、添加螯合剂增强组份(例如，硫氰酸钠)并随后混合来制备细胞及/或大分子稳定化组合物。然后，将预溶解的螯合剂(例如，EDTA)添加到混合容器中，并混合。最后，添加USP纯净水以使混合容器中的体积达到总期望体积，并混合溶液。通过将所得混合物杀菌过滤到无菌容器(例如，纳吉恩瓶)中获得最终溶液(溶液A)。

向第二容器中添加水。添加右旋糖并混合组合物直至澄清。然后，添加柠檬酸钠并混合组合物直至澄清。随后添加柠檬酸，并再次混合组合物直至澄清。添加磷酸二氢钠并混合组合物直至澄清。随后添加腺嘌呤并混合组合物直至澄清。最后，添加DUIF水以使混合容器中的体积达到总期望体积，并混合溶液。通过将所得混合物杀菌过滤到无菌容器(例如，纳吉恩瓶)中获得最终溶液(溶液B)。

将溶液B的分液添加到容器中，随后添加溶液A的分液。在环境条件下混合组合的溶液(例如，15分钟)。流式细胞术分析中所用细胞及/或大分子稳定化组合物的特定实例的配方详述于表6中。

表6：细胞及/或大分子稳定化组合物

	溶液A	溶液B	T-10
				硫氰酸钠	10.02g
0.01M EDTA	50mL
				右旋糖(单水合物)		3.19g
柠檬酸钠(二水合物)		2.63g
				柠檬酸(无水)		0.327g
磷酸二氢钠(单水合物)		0.220g
				腺嘌呤		0.0275g
溶液A			28mL
				溶液B			120mL
总体积	100mL	100mL
				pH值			8.25

实例24

 方法：通过流式细胞术的标准淋巴细胞免疫表型分型是在贝克顿迪肯森流式细胞分析仪(Becton Dickenson FacsCalibur)上使用珠粒进行绝对计数校准来实施。利用裂解/免洗技术，在一根管中对全血实施CD3、CD4、CD8及CD45染色，且在另一根管中实施CD16+56、CD19及CD45染色。通过CD45/前向散射设门来识别淋巴细胞且计数到10,000个事件。在第0、24、48、72、96、120、144及160小时报告各CD抗原染色的淋巴细胞百分比及呈各抗原阳性的淋巴细胞绝对计数。对照管包括EDTA(标准紫色顶部)溶液及肝素(标准绿色顶部)溶液以及含EDTA与肝素的溶液以考虑到测试组合物的任何稀释效应。按照实例22及23来制备稳定化测试试剂。各组合物的pH值显示于表7中。流动参数显示于表8中。

表7：用于流式细胞术的组合物的pH值

表8：用于流式细胞术的组合物的pH值

散射模式：	前向(FSC)
						侧向(SSC)
					荧光：	FL1	FITC	CD3	T细胞

	FL2	PE	CD8	抑制性细胞
								CD16+56	NK细胞
	FL3	PerCP	CD45	白细胞
						FL4	APC	CD4	辅助细胞
			CD19	B细胞

结果：通过绘制淋巴细胞标记百分比及/或绝对计数随时间的变化曲线，可将不同细胞及/或大分子稳定化组合物的效力与当前黄金标准保存剂EDTA及肝素进行比较。例如，图17A绘示所述调配物与对照相比CD3百分比随时间的变化曲线。同样，图17B绘示所述调配物与对照相比CD4百分比随时间的变化曲线。CD3及CD4百分比甚至在160小时后看起来仍然稳定，该时间远远超过了对EDTA及肝素二者所推荐及公认的稳定性时间。另外，CD3的绝对计数(每毫升血液CD3细胞的数量)在96小时后仍稳定(图17C)。

实例25

RNA方法：RNA是在不同时间点自PAX基因^TM管(其可包括十四烷基三甲基草酸铵及酒石酸)或在红血球低渗裂解后使用凯俊RNA血液微型试剂盒(Qiagen RNABlood Mini kit)来分离。随后确定经分离RNA的数量并使用安捷伦2100生物分析仪(Agilent 2100BioAnalyzer)使用皮克柱(Pico cartridge)(安捷伦(Agilent))评价其质量。

RNA结果：如图18中所示，在长达且包括48小时的时间点，经T8及T10处理而保存的样品的RNA产量高于PAX基因^TM且与EDTA对照近似相等。在第72小时，来自PAX基因^TM、T8、T10及EDTA的RNA产量全部大致相等。72小时后一些管不时发生凝固而阻止分析。利用本揭示内容细胞及/或大分子稳定化组合物不仅获得的RNA的量较大，而且来自T8及T10的RNA的质量也优于PAX基因^TM RNA的质量且与EDTA对照相当。与PAX基因^TM、EDTA、T8及T10接触的RNA在第72小时的质量数据分别显示于图19A、19B、19C及19D中。所述测试的RNA完整性指数(RIN)为6.20(19A)、7.90(19B)、7.90(19C)及7.4(19D)。RNA质量可通过在迹线的右半部分存在两个核糖体RNA峰来评价。在PAX基因^TM管中不存在较大核糖体峰(距右端最远)，表明显著降解。

Claims (61)

1、一种细胞及/或大分子稳定化组合物，所述组合物包含：

(a)螯合剂，选自由乙二胺四乙酸(EDTA)、[亚乙基双(氧基亚乙基次氮基)]四乙酸(EGTA)、1，2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N，N，N′，N′-四乙酸(BAPTA)及其盐组成的群组；

(b)至少一种螯合剂增强组份，选自由胍、氯化锂、水杨酸钠、高氯酸钠及硫氰酸钠组成的群组；及

(c)碱基，选自由嘌呤碱基及嘧啶碱基组成的群组。

2、如权利要求1所述的细胞及/或大分子稳定化组合物，其中所述螯合剂的浓度是约0.1mM至约0.1M。

3、如权利要求1所述的细胞及/或大分子稳定化组合物，其中所述至少一种螯合剂增强组份的浓度是约1mM至约5M。

4、如权利要求1所述的细胞及/或大分子稳定化组合物，其中所述碱基的浓度是约0.1mM至约5M。

5、如权利要求1所述的细胞及/或大分子稳定化组合物，其中所述细胞及/或大分子稳定化组合物调配成水性溶液。

6、如权利要求1所述的细胞及/或大分子稳定化组合物，其中所述至少一种螯合剂增强组份选自由高氯酸钠、硫氰酸钠及氯化锂组成的群组。

7、如权利要求1所述的细胞及/或大分子稳定化组合物，其中所述至少一种螯合剂增强组份以约1M的量存在。

8、如权利要求1所述的细胞及/或大分子稳定化组合物，其中所述二价金属螯合剂以约1mM的量存在。

9、如权利要求1所述的细胞及/或大分子稳定化组合物，其中所述碱基以约2mM的量存在。

10、如权利要求1所述的细胞及/或大分子稳定化组合物，其进一步包含缓冲剂。

11、如权利要求10所述的细胞及/或大分子稳定化组合物，其中所述缓冲剂包含选自由下列组成的群组的化合物：乙酸钾、乙酸钠、磷酸钾、磷酸钠、三(羟基氨基)甲烷、N-(2-羟基乙基)哌嗪-N′-(2-乙磺酸)、3-(N-吗啉基)丙磺酸、2-[(2-氨基-2-氧代乙基)氨基]乙磺酸、N-(2-乙酰胺基)2-亚氨基二乙酸、3-[(1，1-二甲基-2-羟基乙基)氨基]-2-丙磺酸、N，N-双(2-羟基乙基)-2-氨基乙磺酸、N，N-双(2-羟基乙基)甘氨酸、双-(2-羟基乙基)亚氨基-三(羟基甲基)甲烷、3-(环己基氨基)-1-丙磺酸、3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸、2-(N-环己基氨基)乙磺酸及其组合。

12、如权利要求10所述的细胞及/或大分子稳定化组合物，其中所述缓冲剂包含选自由下列组成的群组的化合物：3-[N，N-双(2-羟基乙基)氨基]-2-羟基-丙磺酸、N-(2-羟基乙基哌嗪)-N′-(3-丙磺酸)、N-(2-羟基乙基)哌嗪-N′-(2-羟基丙磺酸)、2-(N-吗啉基)乙磺酸、三乙醇胺缓冲剂、咪唑、甘氨酸、乙醇胺、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸、哌嗪-N，N′-双(2-乙磺酸)、哌嗪-N，N′-双(2-羟基丙磺酸)、N-三[(羟基甲基)甲基]-3-氨基丙磺酸、2-羟基-3-[三(羟基甲基)甲基氨基]-1-丙磺酸、N-[三(羟基甲基)甲基]-2-氨基乙磺酸、N-[三(羟基甲基)甲基]甘氨酸、2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇、2-氨基-2-甲基-1-丙醇及其组合。

13、如权利要求1所述的细胞及/或大分子稳定化组合物，其进一步包含细胞。

14、如权利要求13所述的细胞及/或大分子稳定化组合物，其中所述细胞包含选自由下列组成的群组的细胞：哺乳动物细胞、植物细胞、酵母细胞、细菌细胞、受病毒感染的细胞、患病细胞及其组合。

15、如权利要求14所述的细胞及/或大分子稳定化组合物，其中所述哺乳动物细胞包含选自由下列组成的群组的细胞：红细胞、白细胞、淋巴细胞、组织细胞、上皮细胞及其组合。

16、如权利要求1所述的细胞及/或大分子稳定化组合物，其进一步包含核酸。

17、如权利要求16所述的细胞及/或大分子稳定化组合物，其中所述核酸包含选自由核糖核酸、脱氧核糖核酸及其组合组成的群组的聚核酸。

18、如权利要求1所述的细胞及/或大分子稳定化组合物，其进一步包含增塑剂。

19、如权利要求18所述的细胞及/或大分子稳定化组合物，其中所述增塑剂包含选自由下列组成的群组的柠檬酸醇酯：柠檬酸三乙酯、柠檬酸乙酰基三乙酯、柠檬酸三丁酯、柠檬酸乙酰基三丁酯、柠檬酸三辛酯、柠檬酸乙酰基三辛酯、柠檬酸三己酯、柠檬酸乙酰基三己酯、柠檬酸丁酰基三己酯、柠檬酸三甲酯及其组合。

20、如权利要求18所述的细胞及/或大分子稳定化组合物，其中所述增塑剂是柠檬酸丁酰基三己酯。

21、如权利要求20所述的细胞及/或大分子稳定化组合物，其中所述柠檬酸丁酰基三己酯包含柠檬酸正丁酰基三正己酯。

22、如权利要求18所述的细胞及/或大分子稳定化组合物，其中所述增塑剂的浓度是约0.1％(v/v)至约10％(v/v)。

23、如权利要求1所述的细胞及/或大分子稳定化组合物，其进一步包含抗凝剂。

24、如权利要求23所述的细胞及/或大分子稳定化组合物，其中所述抗凝剂包含选自由肝素、肝素盐及其组合组成的群组的硫酸化糖胺聚糖。

25、如权利要求23所述的细胞及/或大分子稳定化组合物，其中所述抗凝剂是选自由下列组成的群组的肝素盐：肝素铵、肝素钙、肝素锂、肝素钾、肝素钠、肝素锌锂及其组合。

26、如权利要求23所述的细胞及/或大分子稳定化组合物，其中所述抗凝剂的浓度是约200mg/L至约20g/L。

27、如权利要求1所述的细胞及/或大分子稳定化组合物，其进一步包含肝素酶。

28、一种保存及/或稳定化细胞的方法，所述方法包含：

使细胞与细胞及/或大分子稳定化组合物接触，所述细胞及/或大分子稳定化组合物包含：

(a)螯合剂，选自由乙二胺四乙酸(EDTA)、[亚乙基双(氧基亚乙基次氮基)]四乙酸(EGTA)、1，2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N，N，N′，N′-四乙酸(BAPTA)及其盐组成的群组；及

(b)至少一种螯合剂增强组份，选自由胍、氯化锂、水杨酸钠、高氯酸钠及硫氰酸钠组成的群组。

29、如权利要求28所述的方法，其中所述细胞及/或大分子稳定化组合物进一步包含选自由嘌呤碱基及嘧啶碱基组成的群组的碱基。

30、如权利要求28所述的方法，其中所述细胞包含选自由哺乳动物细胞、受病毒感染的细胞、患病细胞及其组合组成的群组的细胞。

31、如权利要求30所述的方法，其中所述哺乳动物细胞包含选自由下列组成的群组的细胞：红细胞、白细胞、淋巴细胞、组织细胞、上皮细胞及其组合。

32、如权利要求30所述的方法，其中所述哺乳动物细胞包含人类细胞。

33、如权利要求28所述的方法，其中所述螯合剂的浓度是约0.1mM至约0.1M。

34、如权利要求28所述的方法，其中所述至少一种螯合剂增强组份的浓度是约0.1mM至约0.5M。

35、如权利要求29所述的方法，其中所述碱基的浓度是约0.1mM至约5M。

36、如权利要求28所述的方法，其中所述细胞及/或大分子稳定化组合物调配成水性溶液。

37、如权利要求28所述的方法，其中所述至少一种螯合剂增强组份选自由高氯酸钠、硫氰酸钠及氯化锂组成的群组。

38、如权利要求28所述的方法，其进一步包含保存细胞内核酸，其中所述核酸选自由DNA、RNA、mRNA及cDNA组成的群组。

39、如权利要求38所述的方法，其中所述核酸是真核RNA。

40、如权利要求28所述的方法，其中所述细胞存在于获自人类个体的体液中。

41、如权利要求40所述的方法，其中细胞及/或大分子组合物与体液的体积比是约1∶10至约10∶1。

42、如权利要求40所述的方法，其中所述使所述细胞与所述细胞及/或大分子稳定化组合物接触包含将所述细胞添加到所述细胞及/或大分子稳定化组合物中。

43、如权利要求40所述的方法，其中所述使所述细胞与所述细胞及/或大分子稳定化组合物接触包含将所述细胞及/或大分子稳定化组合物添加到所述细胞中。

44、如权利要求40所述的方法，其中在使所述细胞与所述细胞及/或大分子稳定化组合物接触后，所述细胞及/或大分子稳定化组合物与所述体液一起形成稳定的体液组合物，其保持基本上无团块长达约5天。

45、如权利要求40所述的方法，其中所述体液包含选自由下列组成的群组的物质：血液、血清、羊水、脊髓液、结膜液、唾液、阴道液、粪便、精液及汗液。

46、如权利要求28所述的方法，其中所述细胞是淋巴细胞。

47、如权利要求28所述的方法，其中在所述使所述细胞与所述细胞及/或大分子稳定化组合物接触后，所述细胞保留至少约80％的细胞外标记至少约3天。

48、如权利要求47所述的方法，其中所述细胞外标记选自由下列组成的群组：CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD10、CD13、CD14、CD16、CD19、CD20、CD21、CD22、CD33、CD34、CD45、CD56、CD57及其组合。

49、如权利要求28所述的方法，其中在所述使所述细胞与所述细胞及/或大分子稳定化组合物接触后约5天时所述细胞保留至少约95％的细胞外标记。

50、如权利要求28所述的方法，其中所述细胞及/或大分子稳定化组合物进一步包含至少一种选自由下列组成的群组的化合物：长链脂肪酸、长链脂肪酸酯、长链脂肪醇、锂、肝素、肝素酶、丁基己基柠檬酸酯及/或其组合。

51、如权利要求29所述的方法，其进一步包含使所述细胞与流式细胞仪接触。

52、如权利要求51所述的方法，其中所述使所述细胞与流式细胞仪接触发生在所述与细胞及/或大分子稳定化组合物接触后长达约2天、长达约3天、长达约4天、长达约5天、长达约6天或长达约7天时。

53、一种用于保存样品中的细胞的系统，所述系统包含：

样品容器，其构造及布置成可容纳及含有包含所述细胞的样品；及

细胞及/或大分子稳定化组合物，其包含

(a)螯合剂，选自由乙二胺四乙酸(EDTA)、[亚乙基双(氧基亚乙基次氮基)]四乙酸(EGTA)、1，2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N，N，N′，N′-四乙酸(BAPTA)及其盐组成的群组；

(b)至少一种螯合剂增强组份，选自由胍、氯化锂、水杨酸钠、高氯酸钠及硫氰酸钠组成的群组；及

(c)碱基，选自由嘌呤碱基及嘧啶碱基组成的群组。

54、如权利要求53所述的系统，其进一步包含使用说明书。

55、如权利要求53所述的系统，其中所述样品容器含有所述细胞及/或大分子稳定化组合物。

56、如权利要求53所述的系统，其中所述细胞及/或大分子稳定化组合物进一步包含固体、液体或水凝胶。

57、如权利要求53所述的系统，其中所述样品容器包含至少一个内表面及至少一个外表面。

58、如权利要求53所述的系统，其中所述细胞及/或大分子稳定化组合物是位于所述至少一个内表面上的涂层。

59、一种系统，其包含：

(a)所保存的细胞；

(b)细胞及/或大分子稳定化组合物，所述组合物包含：

(i)螯合剂，选自由乙二胺四乙酸(EDTA)、[亚乙基双(氧基亚乙基次氮基)]四乙酸(EGTA)、1，2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N，N，N′，N′-四乙酸(BAPTA)及其盐组成的群组；

(ii)至少一种螯合剂增强组份，选自由胍、氯化锂、水杨酸钠、高氯酸钠及硫氰酸钠组成的群组；及

(iii)碱基，选自由嘌呤碱基及嘧啶碱基组成的群组；及

(c)分析装置。

60、如权利要求59所述的系统，其中所述细胞及/或大分子稳定化组合物进一步包含增塑剂及抗凝剂。

61、如权利要求59所述的系统，其中所述分析装置选自由下列组成的群组：显微镜、读板仪、按大小分级分离用凝胶、热循环仪、流式细胞仪、自动血液分析仪、细胞分类计数器、细胞分选仪、珠粒、亲和基质、分光计及其组合。

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