CN104830831A

CN104830831A - 一种保存外周血中游离dna的保存剂

Info

Publication number: CN104830831A
Application number: CN201510226039.XA
Authority: CN
Inventors: 陈洪亮; 段利朋; 郑海灵
Original assignee: Happy Raw Side In Shenzhen And Bio Tech Ltd; XIAMEN VANGENES BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Happy Raw Side In Shenzhen And Bio Tech Ltd; XIAMEN VANGENES BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2015-05-06
Filing date: 2015-05-06
Publication date: 2015-08-12

Abstract

本发明公开一种保存外周血中游离DNA的保存剂，其中，按质量百分比计，包括：超纯无菌水60~80%；抗凝剂5~8%；防腐剂10~25%；代谢抑制剂1~5%；核酸酶抑制剂0.5~3%。本发明的保存剂可以保证外周血在常温下保存7天以上，最多可至14天，常温运输72小时以上，最多可至96小时，并且游离DNA的量在此期间内不会发生明显变化。

Description

一种保存外周血中游离DNA的保存剂

技术领域

本发明涉及DNA保存领域，尤其涉及一种保存外周血中游离DNA的保存剂。

背景技术

目前，外周血中的游离DNA在临床上的应用越来越多，例如无创产前基因检测和肿瘤诊断都是以外周血中的游离DNA为检测目标。在检测过程中游离DNA的量的多少是一个关键的指标，如果外周血中有白细胞或者核红细胞破裂，那么基因组DNA将降解进入到血浆中污染游离DNA，这会严重影响检测结果。所以，在上述检测过程中，外周血都要求在6个小时之内分离出血浆，低温保存运输，并且保存时间不能过长。

因此，现有技术还有待于改进和发展。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种保存外周血中游离DNA的保存剂，旨在解决现有的血浆游离DNA保存方法保存时间短、保存温度低的问题。

本发明的技术方案如下：

一种保存外周血中游离DNA的保存剂，其中，按质量百分比计，包括：

超纯无菌水 60~80%；

抗凝剂 5~8%；

防腐剂 10~25%；

代谢抑制剂 1~5%；

核酸酶抑制剂 0.5~3%。

所述的保存外周血中游离DNA的保存剂，其中，所述抗凝剂包括EDTA钾盐、EDTA钠盐、柠檬酸钠、肝素及枸杞酸钠中的一种或多种组合。

所述的保存外周血中游离DNA的保存剂，其中，所述防腐剂包括二唑烷基脲、咪唑烷基脲、1,3-二氯-5,5-二甲基乙内酰脲、钠羟甲基甘氨酸、二羟甲基脲、2-溴-2-硝基-1,3-二醇、恶唑烷、钠羟甲基甘氨酸及金刚烷季铵中的一种或多种组合。

所述的保存外周血中游离DNA的保存剂，其中，所述代谢抑制剂包括ATA、甘油醛、磷酸二羟丙酮、甘油醛-3-磷酸、3-磷酸-2-磷酸甘油酸、磷酸、丙酮酸、氟化钠及钾代谢抑制剂中的一种或多种组合。

所述的保存外周血中游离DNA的保存剂，其中，所述核酸酶抑制剂硫酸铵、二硫苏糖醇、β-巯基乙醇、半胱氨酸、二硫赤藓醇及二价阳离子的一种或多种组合。

所述的保存外周血中游离DNA的保存剂，其中，所述二价阳离子为Mg² ⁺、Mn² ⁺、Zn² ⁺、Fe² ⁺、Ca² ⁺或Cu² ⁺。

所述的保存外周血中游离DNA的保存剂，其中，所述防腐剂的浓度为50g/L~500g/L。

所述的保存外周血中游离DNA的保存剂，其中，所述防腐剂的浓度为150g/L~250g/L。

所述的保存外周血中游离DNA的保存剂，其中，所述保存剂为半固态。

所述的保存外周血中游离DNA的保存剂，其中，所述保存剂保存在真空采血管中。

有益效果：本发明的保存剂可以保证外周血在常温下保存7天以上，最多可至14天，常温运输72小时以上，最多可至96小时，并且游离DNA的量在此期间内不会发生明显变化。

附图说明

图1为本发明实施例真空采血管（100μL保存剂）中血液样品0天后的DNA片段分布图。

图2为本发明实施例真空采血管（100μL保存剂）中血液样品3天后的DNA片段分布图。

图3为本发明实施例真空采血管（100μL保存剂）中血液样品7天后的DNA片段分布图。

图4为本发明实施例Streck BCT管中血液样品0天后的DNA片段分布图。

图5为本发明实施例Streck BCT管中血液样品7天后的DNA片段分布图。

图6为本发明实施例真空采血管（200μL保存剂）中血液样品0天后的DNA片段分布图。

图7为本发明实施例真空采血管（200μL保存剂）中血液样品7天后的DNA片段分布图。

图8为本发明实施例真空采血管（200μL保存剂）中血液样品14天后的DNA片段分布图。

具体实施方式

本发明提供一种保存外周血中游离DNA的保存剂，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明所提供的一种保存外周血中游离DNA的保存剂，按质量百分比计，包括：

超纯无菌水 60~80%；

抗凝剂 5~8%；

防腐剂 10~25%；

代谢抑制剂 1~5%

核酸酶抑制剂 0.5~3%。

其中的超纯无菌水，经过灭菌处理的超纯水。

进一步，所述抗凝剂包括EDTA钾盐、EDTA钠盐、柠檬酸钠、肝素及枸杞酸钠中的一种或多种组合。抗凝剂的主要作用为防止血液凝固。

进一步，所述防腐剂包括二唑烷基脲、咪唑烷基脲、1,3-二氯-5,5-二甲基乙内酰脲、钠羟甲基甘氨酸、二羟甲基脲、2-溴-2-硝基-1,3-二醇、恶唑烷、钠羟甲基甘氨酸及金刚烷季铵中的一种或多种组合。防腐剂的主要作用是防止血液变质。优选地，所述防腐剂为二唑烷基脲或咪唑烷基脲。

进一步，所述代谢抑制剂包括ATA、甘油醛、磷酸二羟丙酮、甘油醛-3-磷酸、3-磷酸-2-磷酸甘油酸、磷酸、丙酮酸、氟化钠及钾代谢抑制剂中的一种或多种组合。代谢抑制剂可以减少游离DNA降解，也减少了细胞裂解，使得细胞DNA不会成为混入到游离DNA中。优选地，所述代谢抑制剂为ATA、氟化钠、甘油醛和它们的任意组合。更优选地，所述代谢抑制剂为甘油醛、磷酸二羟丙酮、甘油醛-3-磷酸和它们的任意组合。

进一步，所述核酸酶抑制剂为硫酸铵、二硫苏糖醇（DTT）、β-巯基乙醇、半胱氨酸、二硫赤藓醇及二价阳离子的一种或多种组合。添加核酸酶抑制剂可防止DNA酶的活性的降低，影响游离DNA的质量和数量。优选地，所述核酸酶抑制剂硫酸铵，二硫苏糖醇（DTT）。

进一步，所述二价阳离子为Mg² ⁺、Mn² ⁺、Zn² ⁺、Fe² ⁺、Ca² ⁺或Cu² ⁺。

进一步，所述防腐剂的浓度为50g/L~500g/L。更优选地，进一步，所述防腐剂的浓度为150g/L~250g/L。所述防腐剂的浓度是应当小于核酸和蛋白交联一起的浓度，该交联可以用琼脂糖凝胶电泳所指示。

进一步，本发明中的保存剂可位于一个专门的设备中，并在采血之前加入。更优选，该设备是一个抽真空采集容器中，通常是一个管，也可以但不仅仅是真空采血管。所述保存剂为半固态。其可以是高粘性的，使得其可以有效地作为一种半固态的涂层使用。

真空采血管中保存剂的量足以维持细胞形态和防止细胞降解，同时也防止了游离状态中有害Dnase(核酸酶)活性。当然，核酸酶的活性也可以足够低，使得在样品中的游离核酸没有实质性稀释。

血液样品被吸入到本发明的真空采血管中，至少7天后，游离DNA的存在量，至多增加约5％。如果无保存液存在，则7天后游离DNA的量会增加至少10倍，甚至达到20倍以上。游离DNA和细胞DNA混合会减少在血液样品中的任何一种测量游离DNA的量的精确度。例如，在某种特定癌症的严重程度可通过游离DNA的量来进行测量情况下，样品没有经过处理，可能会显示测量得到的游离DNA量异常高，但是很多游离DNA源自于一个或更多个有核细胞的降解。因此，测试结果可能是假阳性，该结果指示该样品的癌症严重程度远高于实际情况，而实际上的真正的游离DNA的量是很低的，即癌症的症状并不那么严重。

保存剂中的任何活性成分的量可以按重量计通常为至少0.01％。保护剂中的任何活性成分的量可以按重量计通常为约小于80％。

在本发明中，血液样品与保存剂的初始接触需要足够长的时间，即需事先混匀，以抑制细胞裂解，降低核酸酶的活性。血液样品和保存剂初始接触，至少约10秒，可长达约1分钟，具体操作可以是上下颠倒至少10次，均匀混合血液样品和保存剂。样品接触保存剂到DNA分离的时间可以是2小时，6小时，24小时，甚至7天。

血液样品用保存剂接触后，允许血液样本被分离和检测核酸之前储存一段时间。血液样品可以在一个地方（例如医院）被抽取，接触所述保护剂，并稍后传输至不同的远程地方（例如实验室）的核酸分离和测试过程。核酸可以从血液样品中分离并测试在所述远程位置，将所得的诊断信息可以被报告给原始抽血的部门。所述核酸分离过程可以在一个远程位置来执行，将所得数据进行分析，以确定疾病状态的存在、不存在或严重程度。可替代地，无细胞核酸分离过程的结果可以被发送回初始抽血的部门并分析。所得的诊断信息可以被返回到远程位置或初始抽血的部门。

已经分离的游离DNA，可以对它们进行测试，以确定疾病状态，包括存在、不存在或严重程度，可以应用于但不限于无创产前基因检测和多种癌症检测。本发明可以使用任何核酸检测方法，包括：进行核酸检测，但不限于聚合酶链反应（PCR），逆转录聚合酶链反应（RT-PCR），定量实时聚合酶链反应（Q-PCR），凝胶电泳，毛细管电泳，质谱，荧光检测，紫外光谱，DNA杂交，等位基因特异性聚合酶链反应，聚合酶循环装配（PCA），不对称聚合酶链反应，线性指数聚合酶链反应（LATE-PCR），解旋酶后依赖性扩增（HDA），热启动聚合酶链反应，intersequence特异性聚合酶链反应（ISSR），逆聚合酶链反应，连接反应介导的聚合酶链反应，甲基化特异性聚合酶链反应（MSP），多重聚合酶链反应，嵌套聚合酶链反应，固相聚合酶链反应，高通量测序（NGS），数字PCR（digital PCR）或它们的任意组合。

本发明下述实施例其具体成分是： EDTA钾盐5~6%，防腐剂15~20%，代谢抑制剂1~3%，核酸酶抑制剂1~2%，余量为超纯无菌水。

本实施例主要利用看家基因β-actin的CT值来检测血浆（血液样品）中游离DNA量的变化。用2100 DNA高灵敏度芯片来检测血浆中游离DNA的片段大小。分别做了室温静置0~14天，常温运输48小时和72小时的对比实验。室温静置0、3、7、14天样品，常温运输前和运输回来的样品，取同样体积的血浆（500μl）进行游离DNA的提取，溶解在45ul超纯水中，取4ul DNA模板进行Q-PCR测试。DNA片段大小是用Ion Proton标准建库后进行2100测试。分别以0天的样本以及进口Streck BCT管的样本为参照进行比较。

室温保存试验：6个志愿者血液样品，分别取5mL置于真空采血管（含有100μL保存剂）中，上下颠倒10次混匀，室温放置。对0天、3天、和7 天真空采血管中的血液样品进行处理。

根据以上实验结果，设计了室温放置7天和14天后真空采血管（含有200μL保存剂）中血液样品的处理实验。

运输试验：6个志愿者血液样品，分别取5mL置于真空采血管中，上下颠倒10次混匀。分别在运输48h，72h后对样品进行处理。以0天的真空采血管样品作对照。

游离DNA片段大小实验：3天、7天后真空采血管（100μL保存剂）中血液样品的处理以及7天、14天后真空采血管（200μL保存剂）的处理实验中各取一个样品，进行2100高灵敏度测定，以0天的真空采血管（100μL保存剂）和真空采血管（200μL保存剂）、以及进口的Streck BCT管0天、7天样品作为参考。

测试结果

（1）室温静置试验

室温静置，使用Q-PCR检测0天、3天、7天真空采血管（100μL保存剂）以及0天、7天和14天真空采血管（200μL保存剂）样品游离DNA的CT值，如表1和表2所示。

表1

表2

表3

实验结果：以真空采血管（100μL保存剂）0天CT值为参考，3天和7天真空采血管的CT值均与之无显著差异，因此当真空采血管中保存剂为100μL时，真空采血管对血液样品的保存时间可长达7天；同理，当真空采血管中保存剂为200μL时，真空采血管对血液样品的保存时间可达到14天。本实施例中的Streck BCT管室温静置7天后发现降解现象，见表3，各采血管样品的DNA片段大小请参看图1至图8（安捷伦2100生物分析仪对DNA大小和浓度的分析），从图中可以看出，真空采血管在加入100μL的保存剂时DNA片段在7天内分布一致，基本无杂峰出现，但是Streck BCT管7天后出现了很多不同大小的片段，这可能是由于基因组DNA降解污染；真空采血管在加入200μL的保存剂时DNA片段在14天内分布一致，基本无杂峰出现。

综上所述：本次研发的采血管可以根据客户的需求进行两个规格的生产，若需要保存7天以内，选择加入100μL保存剂采血管即可，若需要保存14天，则选择加200μL保存剂采血管效果更理想。

(2)运输试验

横向比较：运输48小时后，真空采血管（100μL保存剂）和市售采血管（Streck BCT管）对血液样品保存的差异性比较：使用Q-PCR检测真空采血管和市售采血管（Streck BCT管）对血液样品游离DNA的CT值。本次测试结果表明两种管子未见显著差异，结果参见表4。

表4

纵向比较：测试运输三天后真空采血管（200μL保存剂）和0天真空采血管（200μL保存剂）对血液样品保存的差异：使用Q-PCR检测血液样品游离DNA的CT值，结果见表5和表6。

表5

表6

实验结果：运输48小时候，真空采血管（100ul保存剂）和进口streck BCT管之间无显著差异。运输72小时后真空采血管（200μL保存剂）在0天和3天的CT值经过比较，无显著性差异，说明在三天运输时间内，真空采血管对血液保存具有良好的效果，而本次测试的Streck管有降解嫌疑。

应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims

1.一种保存外周血中游离DNA的保存剂，其特征在于，按质量百分比计，包括：

超纯无菌水 60~80%；

抗凝剂 5~8%；

防腐剂 10~25%；

代谢抑制剂 1~5%；

核酸酶抑制剂 0.5~3%。

2.根据权利要求1所述的保存外周血中游离DNA的保存剂，其特征在于，所述抗凝剂包括EDTA钾盐、EDTA钠盐、柠檬酸钠、肝素及枸杞酸钠中的一种或多种组合。

3.根据权利要求1所述的保存外周血中游离DNA的保存剂，其特征在于，所述防腐剂包括二唑烷基脲、咪唑烷基脲、1,3-二氯-5,5-二甲基乙内酰脲、钠羟甲基甘氨酸、二羟甲基脲、2-溴-2-硝基-1,3-二醇、恶唑烷、钠羟甲基甘氨酸及金刚烷季铵中的一种或多种组合。

4.根据权利要求1所述的保存外周血中游离DNA的保存剂，其特征在于，所述代谢抑制剂包括ATA、甘油醛、磷酸二羟丙酮、甘油醛-3-磷酸、3-磷酸-2-磷酸甘油酸、磷酸、丙酮酸、氟化钠及钾代谢抑制剂中的一种或多种组合。

5.根据权利要求1所述的保存外周血中游离DNA的保存剂，其特征在于，所述核酸酶抑制剂硫酸铵、二硫苏糖醇、β-巯基乙醇、半胱氨酸、二硫赤藓醇及二价阳离子的一种或多种组合。

6.根据权利要求5所述的保存外周血中游离DNA的保存剂，其特征在于，所述二价阳离子为Mg² ⁺、Mn² ⁺、Zn² ⁺、Fe² ⁺、Ca² ⁺或Cu² ⁺。

7.根据权利要求1所述的保存外周血中游离DNA的保存剂，其特征在于，所述防腐剂的浓度为50g/L~500g/L。

8.根据权利要求7所述的保存外周血中游离DNA的保存剂，其特征在于，所述防腐剂的浓度为150g/L~250g/L。

9.根据权利要求1所述的保存外周血中游离DNA的保存剂，其特征在于，所述保存剂为半固态。

10.根据权利要求1所述的保存外周血中游离DNA的保存剂，其特征在于，所述保存剂保存在真空采血管中。