CN112359091A - 一种全血游离dna保存剂、真空采血管及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药的技术领域，公开了一种全血游离DNA保存剂、真空采血管及其制备方法。所述全血游离DNA保存剂包括如下按重量份计的组分：2‑200份抗凝血剂，1‑200份核酶抑制剂，5‑200份DNA稳定剂，1‑1000份蛋白交联剂，1‑1000份反应型细胞稳定剂，5000‑10000份无RNase纯化水。真空采血管含有上述全血游离DNA保存剂。本发明还公开了真空采血管的制备方法。本发明保存剂中各成分相互配合，协同作用，高效地抑制血浆中核酸酶活性，避免在保存、运输过程中，cfDNA被核酸酶降解；同时增强了细胞的稳定性，避免血细胞裂解，基因组DNA释放导致的对cfDNA检测的干扰。

Description

一种全血游离DNA保存剂、真空采血管及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及血液样品保存技术领域，具体涉及一种全血游离DNA保存剂、真空采血管及其制备方法。
背景技术
游离DNA(cell free DNA,cfDNA)是指游离于细胞之外的一类DNA，健康人血液中的cfDNA主要源于凋亡细胞，而肿瘤细胞以及孕妇的胎儿都向血液中释放cfDNA。近年来，随着测序技术的高速发展以及国家一系列利好政策的推动，以血浆中的cfDNA为研究对象的无创产前诊断和肿瘤液体活检产业蓬勃发展。然而血浆内cfDNA含量极少，易被血液中的核酸酶降解，易受到白细胞裂解释放的基因组DNA污染，严重影响检测效果。为了解决以上问题，现阶段主要采取的措施为(1)选用带抗凝剂的采血管采集全血样本，防止全血细胞凝血，减少白细胞释放基因组DNA；(2)在6h内分离出血浆，4℃低温保存运输，并且保存时间不能过长，防止血浆内核酸酶降解cfDNA。通过以上流程处理，对血浆cfDNA的精确检测得到一定程度改善。然而，4℃低温保存运输下，核酸酶仍具有一定活性，长期保存会使cfDNA大量损失，不利于精确检测。同时，低温保存与运输都为肿瘤早期筛查和产前筛查等发展带来不便及成本增加等问题。
因此，开发一种全血cfDNA保护剂、及对应的真空采血管，旨在解决采用现有血浆cfDNA保存中易受核酸酶降解、基因组DNA污染、保存时间短、需要冷链保存等问题，具有重大意义。
申请号为201811543137.6的专利申请公开了一种防止溶血的游离DNA血液保存剂及其应用，其每100毫升血液保存剂包括以下成分：40.0-100.0g咪唑烷基脲、4.0-20.0g乙二胺四乙酸三钾、4.0-10.0g甘氨酸。其中甘氨酸具有细胞膜保护功能，又被作为游离DNA与蛋白交联的抑制剂。申请号为201710128800.5的专利申请公开了一种血液DNA的保存剂组合物，其包括：20-50份防腐剂，5-15份抗凝剂，0.5-5份核酸酶抑制剂，1-5份代谢抑制剂，40-70份水。其中所述代谢抑制剂包括金黄三羧酸、甘油醛、磷酸二羟丙酮、甘油醛-3-磷酸、3-磷酸-2-磷酸甘油酸、磷酸、丙酮酸、葡萄糖酸、氟化钠、氟化钾中一种或多种。该专利申请通过抑制血细胞的代谢酶活性来抑制溶血。然而，以上路径并不能完全避免血细胞裂解，抑制基因组DNA从细胞中释放。
发明内容
本发明的目的是在于提供一种全血cfDNA保护剂、对应的真空采血管及其制备方法，旨在解决现有血浆cfDNA保存中易受核酸酶降解、基因组DNA污染、保存时间短、需要冷链保存等问题。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种全血游离DNA保存剂，包括如下按重量份计的组分：2-200份抗凝血剂，1-200份核酶抑制剂，5-200份DNA稳定剂，1-1000份蛋白交联剂，1-1000份反应型细胞稳定剂、5000-10000份无RNase纯化水。
所述抗凝血剂优选为2-150份，更优选为5-100份。
所述核酶抑制剂优选为1-100份，更优选为1-50份。
所述DNA稳定剂优选为5-100份，更优选为10-50份。
所述蛋白交联剂优选为1-500份，更优选为1-100份。
所述反应型细胞稳定剂优选为1-200份，更优选为1-50份。
所述抗凝血剂为枸橼酸钠、柠檬酸钠、肝素钠、肝素锂、乙二胺四乙酸二钾、乙二胺四乙酸三钾、乙二胺四乙酸二钠中的一种或几种。
所述核酶抑制剂为尿素、硫酸铵、十二烷基硫酸钠、异硫氰酸胍、半胱氨酸、二硫苏糖醇、4-甲酰苯甲酸席夫碱钒配合物中的一种或几种。
所述DNA稳定剂为葡萄糖、甘露糖、海藻糖、羟乙基淀粉、聚乙烯醇、甘氨酸、聚赖氨酸中的一种或几种。
所述蛋白交联剂为1，2-乙二硫醇、1，3-丙二硫醇、1，4-丁二硫醇、2,3-二巯基-1-丙醇、丁二醛、戊二醛、己二醛中的一种或几种。
所述反应型细胞稳定剂为能够形成贵金属纳米层的四氯合金酸(HAuCl4)、四氯合金酸钾(KAuCl4)、六氯合铂酸(H2PtCl6)、六氯合铂酸钾(K2PtCl6)、三氯氨铂酸钾(KPt(NH3)Cl3)、四氯铂酸钾(K2PtCl4)、六溴铂酸钾(K2PtBr6),或者能够形成硅纳米层的甲基三甲氧基硅烷、甲基二乙氧基硅烷、乙基三乙氧基硅烷、甲基三乙氧基硅烷、正硅酸四乙酯(TEOS)、正硅酸四甲酯(TMOS)、双(三甲基硅烷基)乙酰胺(BSA)、3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)、3-巯丙基三甲氧基硅烷(MPTMS)、三甲基氯硅烷(TMCS)、氯三乙氧基硅烷(TECS)、辛基三甲氧基硅烷、环己基甲基二甲氧基硅烷、三甲氧基甲硅烷、三乙氧基硅烷、苄基三乙氧基硅烷、乙烯基三甲氧基硅烷、异丁基三乙氧基硅烷，或者能够形成钛纳米层的四异丙基钛酸酯、钛酸甲酯、钛酸四乙酯、钛酸四丁酯、钛酸四丙酯，又或者能够形成其他无机纳米层的异丙醇铝、锆酸四丁酯，或者能够形成有机纳米层的多巴胺(PDA)、鞣酸(TA)中的一种或几种；
优选地，所述反应型细胞稳定剂为能够四氯合金酸(HAuCl4)、四氯合金酸钾(KAuCl4)、六氯合铂酸(H2PtCl6)，甲基三乙氧基硅烷、正硅酸四乙酯(TEOS)、正硅酸四甲酯(TMOS)、乙烯基三甲氧基硅烷、异丁基三乙氧基硅烷，钛酸甲酯、钛酸四乙酯，钛酸四丁酯、钛酸四丙酯、异丙醇铝、锆酸四丁酯及多巴胺(PDA)、鞣酸(TA)中的一种或几种；更优选，四氯合金酸(HAuCl4)、六氯合铂酸(H2PtCl6)，甲基三乙氧基硅烷、正硅酸四乙酯(TEOS)、正硅酸四甲酯(TMOS)，钛酸甲酯、钛酸四乙酯，钛酸四丁酯、钛酸四丙酯、异丙醇铝、锆酸四丁酯中的一种或几种。
一种全血游离DNA真空采血管含有上述全血游离DNA保存剂。
所述全血游离DNA真空采血管的制备方法，包括以下步骤：
1)将抗凝血剂，核酶抑制剂，DNA稳定剂，蛋白交联剂，反应型细胞稳定剂以及纯化水混合，过滤，获得全血游离DNA保存剂；
2)将全血游离DNA保存剂置于采血管中，抽成真空负压，获得全血游离DNA真空采血管。
所述纯化水为无RNase纯化水。
步骤2)中所述全血游离DNA保存剂的体积用量与采血管管容积的比值为1：(30～150)，优选为1：(30～100)，更优选为1：(30～50)。
所述真空负压≥14.4kg/cm2，优选为14.4-17.6kg/cm2。
步骤2)中全血游离DNA保存剂在置于采血管前采用220nm滤膜过滤除去细菌。
本发明的全血cfDNA保存剂，能有效抑制核酸酶活性，保护血浆中的游离DNA；并能稳定白细胞防止其破裂，避免核DNA污染待测cfDNA；还可延长血液样品在室温下的储存时间，便于远距离运输。本发明所制备的全血cfDNA真空采血管可为肿瘤早期筛查样本和产前筛查样本的收集、存储和运输提供有效保藏方法。
本发明提供的技术方案具有如下有益效果：
本发明的保存剂中各成分相互配合，协同作用，高效地抑制血浆中核酸酶活性，避免在保存、运输过程中，cfDNA被核酸酶降解；同时增强了细胞的稳定性，避免血细胞裂解，基因组DNA释放导致的对cfDNA检测的干扰。
具体实施方式
为了更好的理解本发明的技术方案，下面结合实施例进一步阐述本发明的内容，但本发明的内容并不仅仅局限于以下实施例。
本发明的性能测试方法如下：
DNA浓度检测：取2μL待测样品加入NANODROP检测池，通过其260nm处的吸光度反推出cfDNA的浓度。
溶血率测试：方法：中华人民共和国医药行业标准，医疗器械溶血试验，材料介导的溶血实验。
试样：取20μL实验样品全血，加入25μL生理盐水制备稀释血样
阴性对照：取20μL新鲜全血，加入25μL生理盐水制备稀释阴性对照
阳性对照：取20μL新鲜全血，加入25μL蒸馏水制备稀释阳性对照由于试剂直接加入到血液中，不用对器械进行浸取，直接跳过浸取阶段。
取30μL稀释待测血样、稀释阴性对照、阳性对照加入新的离心管中，向待测血样、阴性对照管中分别加入1.5mL生理盐水，向阳性对照中加入1.5mL蒸馏水，摇匀后放入到37℃水浴锅孵育1h，每20分钟进行摇匀。
孵育完成后，将各管放入离心机中进行800g离心5min(但由于加入试剂导致血样变得粘稠，一般得离10min才能完全离下来)吸取1mL上清到新的试管。
吸取各样品到比色皿中在545nm波长进行吸光度测定。
qPCR检测：
1.PCR反应体系的设置：
RT-PCR模板：β-act
上引物A：CCACACTGTGCCCATTTACG
下引物B：ACGGCCAGCAAGATCCAA
上样量为2uL；
a.融解并混匀PCR反应所需的各种溶液。BeyoFast SYBR Green qPCR Mix(2X)完全融解并混匀后置于冰浴上或冰盒内。
b.参考下列配方在室温或冰浴上设置PCR反应体系(8连管)：
Reagent Volume for One PCR Reaction(20μL)；
BeyoFast SYBR Green qPCR Mix(2X)10μL；
Forward and Reverse Primer Mix(3μM each)2μL；
Template DNA 2μL；
RNase-Free Water 6μL；
2.PCR反应程序：
a.预变性：95℃，2min；
b.变性：95℃，15s；
c.退火/延伸：60℃，15-30s(退火温度由引物Tm值来确定)；
d.重复步骤b和步骤c，总共40个循环；
e.熔解曲线分析(可选)：95℃/15s，60℃/15s，95℃/15s；
f.使用荧光定量PCR仪提供的软件分析结果。
实施例1
一种全血cfDNA保存剂及全血游离DNA真空采血管的制备方法，包括以下步骤：
(1)全血cfDNA保存剂的配制：将以下按重量份计的组分混合：50份抗凝血剂柠檬酸钠，10份核酶抑制剂硫酸铵，10份DNA稳定剂葡萄糖，10份蛋白交联剂戊二醛，20份反应型细胞稳定剂HAuCl4、9900份无RNase纯化水；获得全血cfDNA保存剂；各组分的总量优选满足10000份；
(2)将配置好的cfDNA保存剂采用220nm滤膜过滤，备用；
(3)将过滤好的cfDNA保存剂按保存剂体积：采血管管容积比为1：30份加入体积为3mL采血管中，抽成正空负压，真空负压大于16kg/cm2，获得全血cfDNA真空采血管；
(4)采用步骤(3)的真空采血管采血3mL，置于室温放置1，3，7天后检测管内DNA的浓度，管内全血溶血情况，及用qPCR检测循环次数CT值。
实施例2
一种全血cfDNA保存剂及全血游离DNA真空采血管的制备方法，包括以下步骤：
(1)全血cfDNA保存剂的配制：将以下按重量份计的组分混合：100份抗凝血剂乙二胺四乙酸三钾，10份核酶抑制剂异硫氰酸胍，10份DNA稳定剂海藻糖，10份蛋白交联剂1，2-乙二硫醇，20份反应型细胞稳定剂TEOS、9900份无RNase纯化水，获得全血cfDNA保存剂；
(2)将配置好的cfDNA保存剂采用220nm滤膜过滤，备用；
(3)将过滤好的cfDNA保存剂按保存剂体积：采血管管容积比例1：150份加入3mL采血管中，抽成真空负压，真空负压大于16kg/cm2，获得全血cfDNA真空采血管；
(4)采用步骤(3)的真空采血管采血3mL，置于室温放置1，3，7天后检测馆内DNA的浓度，管内全血溶血情况，及用qPCR检测循环次数CT值。
对比例1
直接使用商用紫盖EDTA真空管采血3mL，置于室温放置1，3，7天后检测馆内DNA的浓度，管内全血溶血情况，及用qPCR检测循环次数CT值。
对比例2
直接使用商用阳普医疗游离DNA保存真空管采血3mL，置于室温放置1，3，7天后检测馆内DNA的浓度，管内全血溶血情况，及用qPCR检测循环次数CT值。
对比例3
直接使用商用Streck游离DNA保存真空管采血3mL，置于室温放置1，3，7天后检测馆内DNA的浓度，管内全血溶血情况，及用qPCR检测循环次数CT值。
对比例4(未加入反应型细胞稳定剂)
一种全血cfDNA保存剂及全血游离DNA真空采血管的制备方法，包括以下步骤：
(1)全血cfDNA保存剂的配制：将以下按重量份计的组分混合：100份抗凝血剂乙二胺四乙酸三钾，10份核酶抑制剂异硫氰酸胍，20份DNA稳定剂海藻糖，20份蛋白交联剂1，2-乙二硫醇，9900份无RNase纯化水，获得全血cfDNA保存剂；
(2)将配置好的cfDNA保存剂采用220nm滤膜过滤，备用；
(3)将过滤好的cfDNA保存剂按保存剂体积：采血管管容积比例1：150份加入3mL采血管中，抽成真空负压，真空负压大于16kg/cm2，获得全血cfDNA真空采血管；
(4)采用步骤(3)的真空采血管采血3mL，置于室温放置1，3，7天后检测馆内DNA的浓度，管内全血溶血情况，及用qPCR检测循环次数CT值。
对比例5(未加入蛋白交联剂)
一种全血cfDNA保存剂及全血游离DNA真空采血管的制备方法，包括以下步骤：
(1)全血cfDNA保存剂的配制：将以下按重量份计的组分混合：100份抗凝血剂乙二胺四乙酸三钾，10份核酶抑制剂异硫氰酸胍，20份DNA稳定剂海藻糖，20份反应型细胞稳定剂APTES、9900份无RNase纯化水，获得全血cfDNA保存剂；
(2)将配置好的cfDNA保存剂采用220nm滤膜过滤，备用；
(3)将过滤好的cfDNA保存剂按保存剂体积：采血管管容积比例1：150份加入3mL采血管中，抽成真空负压，真空负压大于16kg/cm2，获得全血cfDNA真空采血管；
(4)采用步骤(3)的真空采血管采血3mL，置于室温放置1，3，7天后检测馆内DNA的浓度，管内全血溶血情况，及用qPCR检测循环次数CT值。
实施例1～2以及对比例1～5的保存剂的性能测试数据如表1。
表1实施例1～2以及对比例1～5的保存剂的性能参数
Figure BDA0002719973350000081
本领域技术人员可以理解，在本说明书的教导之下，可对本发明做出一些修改或调整。这些修改或调整也应当在本发明权利要求所限定的范围之内。

Claims (10)

1.一种全血游离DNA保存剂，其特征在于：包括如下按重量份计的组分：2-200份抗凝血剂，1-200份核酶抑制剂，5-200份DNA稳定剂，1-1000份蛋白交联剂，1-1000份反应型细胞稳定剂、5000-10000份无RNase纯化水；
所述反应型细胞稳定剂为能够形成贵金属纳米层的四氯合金酸、四氯合金酸钾、六氯合铂酸、六氯合铂酸钾、三氯氨铂酸钾、四氯铂酸钾、六溴铂酸钾，或者能够形成硅纳米层的甲基三甲氧基硅烷、甲基二乙氧基硅烷、乙基三乙氧基硅烷、甲基三乙氧基硅烷、正硅酸四乙酯、正硅酸四甲酯、双(三甲基硅烷基)乙酰胺、3-氨丙基三乙氧基硅烷、3-巯丙基三甲氧基硅烷、三甲基氯硅烷、氯三乙氧基硅烷、辛基三甲氧基硅烷、环己基甲基二甲氧基硅烷、三甲氧基甲硅烷、三乙氧基硅烷、苄基三乙氧基硅烷、乙烯基三甲氧基硅烷、异丁基三乙氧基硅烷，或者能够形成钛纳米层的四异丙基钛酸酯、钛酸甲酯、钛酸四乙酯、钛酸四丁酯、钛酸四丙酯，又或者能够形成其他无机纳米层的异丙醇铝、锆酸四丁酯，或者能够形成有机纳米层的多巴胺、鞣酸中的一种或几种。
2.根据权利要求1所述全血游离DNA保存剂，其特征在于：所述抗凝血剂为2-150份；所述核酶抑制剂为1-100份；所述DNA稳定剂为5-100份；所述蛋白交联剂为1-500份；所述反应型细胞稳定剂为1-200份。
3.根据权利要求2所述全血游离DNA保存剂，其特征在于：所述抗凝血剂为5-100份，所述核酶抑制剂为1-50份，所述DNA稳定剂为10-50份，所述蛋白交联剂为1-100份，所述反应型细胞稳定剂为1-50份。
4.根据权利要求1所述全血游离DNA保存剂，其特征在于：所述反应型细胞稳定剂为四氯合金酸、四氯合金酸钾、六氯合铂酸、甲基三乙氧基硅烷、正硅酸四乙酯、正硅酸四甲酯、乙烯基三甲氧基硅烷、异丁基三乙氧基硅烷，钛酸甲酯、钛酸四乙酯，钛酸四丁酯、钛酸四丙酯、异丙醇铝、锆酸四丁酯及多巴胺、鞣酸中的一种或几种。
5.根据权利要求4所述全血游离DNA保存剂，其特征在于：所述反应型细胞稳定剂为四氯合金酸、六氯合铂酸，甲基三乙氧基硅烷、正硅酸四乙酯、正硅酸四甲酯、钛酸甲酯、钛酸四乙酯，钛酸四丁酯、钛酸四丙酯、异丙醇铝、锆酸四丁酯中的一种或几种。
6.根据权利要求1所述全血游离DNA保存剂，其特征在于：所述抗凝血剂为枸橼酸钠、柠檬酸钠、肝素钠、肝素锂、乙二胺四乙酸二钾、乙二胺四乙酸三钾、乙二胺四乙酸二钠中的一种或几种；
所述核酶抑制剂为尿素、硫酸铵、十二烷基硫酸钠、异硫氰酸胍、半胱氨酸、二硫苏糖醇、4-甲酰苯甲酸席夫碱钒配合物中的一种或几种；
所述DNA稳定剂为葡萄糖、甘露糖、海藻糖、羟乙基淀粉、聚乙烯醇、甘氨酸、聚赖氨酸中的一种或几种；
所述蛋白交联剂为1，2-乙二硫醇、1，3-丙二硫醇、1，4-丁二硫醇、2,3-二巯基-1-丙醇、丁二醛、戊二醛、己二醛中的一种或几种。
7.一种全血游离DNA真空采血管，其特征在于：含有权利要求1～6任一项所述全血游离DNA保存剂。
8.根据权利要求7所述全血游离DNA真空采血管的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)将抗凝血剂、核酶抑制剂、DNA稳定剂、蛋白交联剂、反应型细胞稳定剂以及纯化水混合，过滤，获得全血游离DNA保存剂；所述纯化水为无RNase纯化水；
2)将全血游离DNA保存剂置于采血管中，抽成真空负压，获得全血游离DNA真空采血管。
9.根据权利要求8所述全血游离DNA真空采血管的制备方法，其特征在于：
步骤2)中所述全血游离DNA保存剂的体积用量与采血管管容积的比值为1：(30～150)；
所述真空负压≥14.4kg/cm2。
10.根据权利要求7所述全血游离DNA真空采血管的制备方法，其特征在于：步骤2)中全血游离DNA保存剂在置于采血管前采用220nm滤膜过滤除去细菌。
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