CN108244094A - 血液保存剂及其配套的采血管 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种血液保存剂，包括抗凝剂、防腐剂、细胞膜保护剂、抗氧化剂，该保存剂，本发明的血液保存剂可以防止有核细胞破碎，本发明的血液保存剂可以防止核酸降解，本发明的血液保存剂可以防止溶血，本发明有效维持红细胞变形能力，能够有效维持红细胞的功能和膜的完整性，提高血液保存质量，本发明的血液保存剂使用效果良好，可以防止有核细胞裂解后释放基因组污染Cell Free DNA，防止Cell Free DNA本身降解，防止溶血的发生，并且成本低。

Description

血液保存剂及其配套的采血管

技术领域

本发明属于生物领域，特别涉及血液保存。

背景技术

Cell Free DNA是指游离于细胞之外的一类DNA，又称为循环核酸；健康人血浆中的游离DNA主要来源于凋亡细胞，其次所有的活细胞都自发性的向血液中释放DNA片段；对于癌症患者而言，循环游离DNA不仅来源于上述途径，也来源于坏死的细胞及上皮间质转化过程中脱离人血的播散肿瘤细胞；其大小主要分布在70-200bp，少数大的片段则可达到10000bp以上，其半衰期从十几分钟到几个小时不等。血浆游离DNA水平的增减与许多临床疾病相关。研究表明血浆游离DNA的检测可作为一种非侵入性的，快速灵敏的诊断工具；也可应用于急性病的分子诊断和检测，及胎儿遗传疾病的产前诊断等研究。

在样本运输保存过程中，普通的抗凝管核酸在6个小时之内分离出血浆，低温保存运输，并且保存时间不能过长。几天之内有核细胞裂解后释放基因组污染Cell Free DNA，另外Cell Free DNA本身裂解的比较严重，溶血情况也很严重。因此需要一种含有保护剂的采血管可以保证在运输及一定时间内稳定保存样本中的游离核酸。国外有类似的产品Streck、凯杰无创管，售价较高，每支100元以上。

发明内容

有鉴于此，本发明其中一个明的目的在提供适用Cell Free DNA检测用的血液保存剂，同时提供配套的采血管，采血管可以是真空采血管或者是血液保存管。本发明的血液保存剂使用效果良好，可以防止有核细胞裂解后释放基因组污染Cell Free DNA，防止CellFree DNA本身降解，防止溶血的发生，并且成本低。

根据本发明提供的一种血液保存剂，包括抗凝剂、防腐剂、细胞膜保护剂、抗氧化剂。

根据本发明提供的一种血液保存剂，抗凝剂含量为1.5mg/mL-2.2mg/mL，防腐剂含量为0.1mg/mL-12mg/mL，细胞膜保护剂含量为0.1mg/mL-20mg/mL，抗氧化剂含量为1mg/L-90mg/L。

根据本发明提供的一种血液保存剂，抗凝剂为乙二胺四乙酸二钾二水化合物(EDTA-2K·2H₂O)、乙二胺四乙酸三钾(EDTA-3K)其中一种或两者组合。防腐剂为尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、尼泊金丙酯、尼泊金丁酯、苯甲酸、二唑烷基脲、咪唑烷基脲、脱氢乙酸、对羟苯甲酸、对羟苯甲酸乙酯、对羟苯甲酸丙酯、对羟苯甲酸丁酯、对羟苯甲酸异丙酯、对羟苯甲酸异丁酯、对苯二酚等其中的一种或多个组合。细胞膜保护剂为PEG2000、海藻糖、山梨醇、邻苯二甲酸二辛酯、邻苯二甲酸二丁酯、乙酰柠檬酸三丁酯、对苯二甲酸二辛酯等其中的一种或多个组合。抗氧化剂为α-硫辛酸、二氢硫辛酸、维生素A、维生素C、维生素E、谷胱甘肽、胡萝卜素、超氧化物歧化酶、邻氮二菲等其中的一种或多个组合。

根据本发明提供的一种血液保存剂，该血液保存剂还包括核酸酶抑制剂，含量为0.1mg/mL-30mg/mL。核酸酶抑制剂为ATA、二硫苏糖醇、β-巯基乙醇、半胱氨酸及二价阳离子等其中的一种或多个组合。

根据本发明提供的一种血液保存剂，防腐剂优选尼泊金甲酯、咪唑烷基脲、对羟苯甲酸、对苯二酚中的一种，尼泊金甲酯含量为0.1-2mg/mL、咪唑烷基脲含量为1-12mg/mL、对羟苯甲酸含量为0.1-2mg/mL、对苯二酚含量为0.2-1mg/mL。

细胞膜保护剂优选PEG2000、邻苯二甲酸二辛酯、乙酰柠檬酸三丁酯、海藻糖中的一种，PEG2000含量为0.2-5mg/mL、邻苯二甲酸二辛酯含量为0.1-1.2mg/mL、乙酰柠檬酸三丁酯含量为1-5mg/mL、海藻糖含量为1-20mg/mL。

抗氧化剂优选α-硫辛酸、二氢硫辛酸、维生素C、邻氮二菲中的一种。α-硫辛酸含量为1-50mg/L、二氢硫辛酸含量为5-50mg/L、维生素C含量为50-90mg/L、邻氮二菲含量为10-50mg/L。

根据本发明提供的一种血液保存剂，核酸酶抑制剂优选ATA、β-巯基乙醇、二硫苏糖醇中的一种。ATA含量为0.1-1mg/mL、β-巯基乙醇含量为0.4-5mg/mL、二硫苏糖醇5-30mg/mL。

根据本发明的一方面提供了一种采血管，采血管含有本发明的血液保存剂。

本发明的血液保存剂可以防止有核细胞破碎，作用体现在以下3个方面：细胞膜保护剂可以对细胞起到一定的固定作用，使细胞离体后可以一定程度的保护；细胞膜保护剂可以稳定细胞膜，例如海藻糖羟基可与磷脂分子头部基团形成氢键，替代了原来脂和水之间的氢键，阻止磷脂头部互相靠近，降低磷脂相转变温度，稳定生物膜结构和功能，抗氧化剂可以间接的保护细胞免受破碎。机体内自由基生成增多时，则自由基可以攻击不饱和或含琉基氨基酸，使蛋白质变性和交联；作用于细胞膜等生物膜上不饱和脂肪酸，可使生物膜功能改变，膜上的有关离子通透性发生改变，脆性也增加，容易导致细胞破碎。

本发明的血液保存剂可以防止核酸降解，主要体现在对核酸酶的抑制及抗凝剂的螯合金属离子作用，DNase I活性依赖于钙离子，并能被镁离子或二价锰离子激活。

本发明的血液保存剂可以防止溶血，原理在于，SOD是红细胞重要的抗氧化酶和自由基清除剂，对红细胞和机体的氧化与抗氧化平衡起着重要的作用。然而，随着保存时间的延长，SOD活性下降，使自由基清除率降低，自由基水平升高，导致红细胞膜的脂质过氧化，破坏了膜的结构和功能，造成红细胞的损伤。例如维生素E有很强的抗氧化作用，能够抵御氧化物质对红细胞的氧化损伤。有效维持SOD的活性，抵抗超氧自由基对红细胞的损伤。从而有效维持红细胞变形能力，添加抗氧化剂能够有效维持红细胞的功能和膜的完整性，提高血液保存质量。

本发明由多种成分组成，各组分各有效果，但本发明选择的组合用于cfDNA检测中血液样本的保存取得了良好的效果，并且好于预期。

本发明可以在2周时间内常温保护全血，本发明首先对细胞进行了固定，让细胞尤其是白细胞有核细胞固定，不容易破碎。这样细胞中的核酸就不会释放出干扰游离核酸，另外，由于细胞裂解后会释放核酸酶会对游离的核酸进行降解，影响游离核酸的总量。其次，抗氧化剂在氧化还原过程中被消耗，但是不同抗氧化剂之间通过一系列协同反应可以循环再生，提高抗氧化剂的利用效率。α-硫辛酸能直接再生谷胱甘肽，间接再生维生素C、维生素E等抗氧化剂。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1几种采血管运输4天后溶血检测对比图

图2几种采血管运输6天后溶血检测对比图

图3几种采血管运输8天后溶血检测对比图

图4几种采血管运输4、6、8天核酸降解对比图

图5几种采血管运输4、6、8天细胞裂解对比图

图6几种采血管运输4天Agilent2100检测对比图

图7几种采血管运输6天Agilent2100检测对比图

图8几种采血管运输8天Agilent2100检测对比图

图9几种采血管静置14天溶血检测对比图

图10几种采血管静置14天核酸降解对比图

图11几种采血管静置14天细胞裂解对比图

图12几种采血管静置14天Agilent2100检测对比图

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

配方为EDTA-2K、尼泊金甲酯、PEG2000、α-硫辛酸，分别设置了3个梯度

实施例2

EDTA-2K、尼泊金甲酯、PEG2000、α-硫辛酸、ATA

实施例3

EDTA-2K、咪唑烷基脲、邻苯二甲酸二辛酯、维生素C、甘氨酸

实施例4

EDTA-3K、咪唑烷基脲、邻苯二甲酸二辛酯、二氢硫辛酸、β-巯基乙醇

实施例5

EDTA-3K、对羟苯甲酸、乙酰柠檬酸三丁酯、二氢硫辛酸

实施例6

EDTA-3K、对苯二酚、海藻糖、邻氮二菲、二硫苏糖醇

效果验证及对比实验

实验模型

实验耗材：Streck管购置Streck公司，PAXgene购置QIAGEN，普通抗凝管购置力因精准医疗产品有限公司，Cell Free DNA提取试剂盒购置QIAGEN(货号55114)，18个配方见上述各表，MDx为配方4b，EGFR L858R突变dsDNA由金唯智生物科技有限公司合成。

样本处理：实验一为采集3名志愿者，每名90mL,采血后运输7天检测；实验二为采集6名志愿者血液，3名各提供90mL血液(Streck、PAXgene(QIAGEN)、MDx、普通抗凝管(EDTA)各3支)，另3名各提供135mL血液(Streck、PAXgene、MDx、普通抗凝管各3支)。实验一与实验二上下颠倒混匀后每支分别投入等量的基因EGFR L858R突变dsDNA。

指标评价

溶血

①血浆颜色

②血红蛋白吸光度(414nm)

核酸降解

ddPCR检测EGFR L858R

细胞裂解

核酸分布评估：ddPCR检测EGFR wild

降解与裂解总体考察

Agilent 2100检测提取的核酸峰型变化

实验一血液保存剂优选配方筛选

18种血液保存剂配方运输7天后，第8天进行检测，综合溶血、细胞裂解和核酸降解三方面指标比较，筛选出配方4b做为优选配方。

实验二含优选配方的血液保存管与其他保存管效果比较

运输及静置考察：0℃-37℃，真实运输3个地点分别为4天，6天，8天时间；室温静置0天、3天、7天、14天，分别对其血浆提取，-80℃放置后共同进行后续提取检测。

运输结果：

溶血

如图1、图2和图3所示，通过414nm波长处测定受试者的血浆中游离血红蛋白吸光度来检测溶血情况，吸光度越大说明溶血程度越厉害。经过运输后Streck、PAXgene、MDx、普通抗凝管都会一定程度的溶血，从吸光度看，0天时吸光度在0.25左右，经过运输后4天内没有特别大的差异，但是运输6天及8天时，差异变化明显，普通抗凝管上升到9.45，而Streck为1.26，PAXgene为1.12，MDx为0.81，MDX的效果较好，仅从肉眼观察便可以清晰分辨溶血程度。

核酸降解

如图4所示，ddPCR分别检测外投的基因(EGFR)，模拟Cell Free DNA，随着保存时间的延长拷贝数降低，降低的越厉害说明降解的越厉害。初始投入的模板拷贝数理论值为1500copy。在经过运输后，除了普通抗凝管降解的特别厉害，第8天已经降解了约70％。其它管(Streck、PAXgene、MDx)降解程度不明显，几乎没有降解。

细胞裂解

如图5所示，在细胞裂解上，拷贝数增大说明细胞破损释放了基因组，使对应内参基因检测拷贝数增大。MDx对保护细胞不破碎方面效果突出，其它管都有一定的裂解。尤其普通抗凝管，在运输4天内，虽然溶血程度与其它管差异不大，但在细胞保护能力上差异明显(溶血程度与细胞破碎不成正相关)，在很短时间内便会污染Cell Free DNA。Streck有一定破碎，PAXgene比StrecK有一定优势，而MDx维持恒定，达到了较好的稳固细胞不破碎的性能。

Agilent2100检测

图6、图7和图8所示，在整体上可以看出核酸的整体分布情况，在运输8天时Streck及PAXgene都有一定程度的裂解，MDx效果明显要好，几乎没有裂解。在运输4天时间里，除了普通抗凝管，整体上看不出较大差异，但是在运输8天时间里，除了MDx，其它都有出现杂峰，细胞裂解非常明显。反应的结果也与内参基因检测保持一致。

静置结果：

溶血

如图9所示，在静置过程中，因为避免了运输过程中的机械振荡，溶血情况明显减轻，但是普通抗凝管在第14天时溶血相当厉害了，在静置过程中PAXgene与MDx的溶血程度相差甚微，分别为0.93,1.01。Streck溶血为1.92。

核酸降解

如图10所示，0天至14天，几种无创管都呈现随时间延长不断降解的趋势，普通抗凝管降幅较大，其它降解轻微。在降解的趋势上，MDx降解的幅度最小。

细胞裂解

如图11所示，从图中的趋势看，MDx几乎没有上升变化，而Streck和PAXgene上升趋势明显，细胞裂解比较厉害。

Agilent2100检测

如图12所示，随着静置时间的延长，有不同程度的细胞裂解，尤其是普通抗凝管及Streck,14天时出现大片段杂峰较厉害，而MDx几乎没有变化。

Claims (9)

1.血液保存剂，其特征在于，包括抗凝剂、防腐剂、细胞膜保护剂、抗氧化剂。

2.根据权利要求1所述的血液保存剂，所述抗凝剂含量为1.5mg/mL-2.2mg/mL，所述防腐剂含量为0.1mg/mL-12mg/mL，所述细胞膜保护剂含量为0.1mg/mL-20mg/mL，所述抗氧化剂含量为1mg/L-90mg/L。

3.根据权利要求2所述的血液保存剂，其特征在于，所述抗凝剂为乙二胺四乙酸二钾二水化合物(EDTA-2K·2H2O)、乙二胺四乙酸三钾(EDTA-3K)其中一种或两者组合，所述防腐剂为尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、尼泊金丙酯、尼泊金丁酯、苯甲酸、二唑烷基脲、咪唑烷基脲、脱氢乙酸、对羟苯甲酸、对羟苯甲酸乙酯、对羟苯甲酸丙酯、对羟苯甲酸丁酯、对羟苯甲酸异丙酯、对羟苯甲酸异丁酯、对苯二酚等其中的一种或多个组合，所述细胞膜保护剂为PEG2000、海藻糖、山梨醇、邻苯二甲酸二辛酯、邻苯二甲酸二丁酯、乙酰柠檬酸三丁酯、对苯二甲酸二辛酯等其中的一种或多个组合，所述抗氧化剂为α-硫辛酸、二氢硫辛酸、维生素A、维生素C、维生素E、谷胱甘肽、胡萝卜素、超氧化物歧化酶、邻氮二菲等其中的一种或多个组合。

4.根据权利要求3所述的血液保存剂，其特征在于，所述的尼泊金甲酯含量为0.1-2mg/mL，咪唑烷基脲含量为1-12mg/mL、对羟苯甲酸含量为0.1-2mg/mL、对苯二酚含量为0.2-1mg/mL，所述的PEG2000含量为0.2-5mg/mL、邻苯二甲酸二辛酯含量为0.1-1.2mg/mL、乙酰柠檬酸三丁酯含量为1-5mg/mL、海藻糖含量为1-20mg/mL，所述的α-硫辛酸含量为1-50mg/L、二氢硫辛酸含量为5-50mg/L、维生素C含量为50-90mg/L、邻氮二菲含量为10-50mg/L。

5.根据权利要求1--4中任意一项所述的血液保存剂，其特征在于，还包括核酸酶抑制剂，含量为0.1mg/mL-30mg/mL。

6.根据权利要求5所述的血液保存剂，其特征在于，所述核酸酶抑制剂为ATA、二硫苏糖醇、β-巯基乙醇、半胱氨酸及二价阳离子等其中的一种或多个组合。

7.根据权利要求6所述的血液保存剂，其特征在于所述的核酸酶抑制剂优选ATA、β-巯基乙醇、二硫苏糖醇中的一种。

8.根据权利要求7所述的血液保存剂，其特征在于ATA含量为0.1-1mg/mL、β-巯基乙醇含量为0.4-5mg/mL、二硫苏糖醇5-30mg/mL。

9.采血管，其特征在于，所述采血管含有权利要求1或5所述血液保存剂。