CN109153992A - 生物样本中游离核酸的保存 - Google Patents
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Abstract
提供了一种用于保存生物样本中的游离核酸和/或细胞的组合物及其使用方法。该组合物包括至少一种可排除体积的聚合物、至少一种渗透剂和至少一种酶抑制剂。该组合物任选还包括至少一种代谢抑制剂。此外,提供了一种优选包含在采血管中的含有该组合物或组合物的组分的试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及用于保存生物样本中游离核酸的组合物、方法和试剂盒,特别是分离自血液或血浆样本中的游离DNA。
背景技术
众所周知,游离DNA(cfDNA)可以在血流中循环。cfDNA可以通过新合成核酸的主动释放进入血流中,或者可以由坏死和/或凋亡细胞的死亡产生。cfDNA片段的大小通常小于200bp(McLarty LJ,Yeh CH.2015.“循环游离DNA:癌症管理中的血液活检”.MOJ CellScience&Report 2[2]:00021)。虽然血流中的cfDNA是最常研究的,但在其他体液中也存在cfDNA,包括唾液和尿液。
最近的研究已经开始关注cfDNA在非侵入性诊断应用中的用途。存在于癌症患者中的cfDNA浓度升高,并且肿瘤特异性cfDNA与许多不同的癌症相关,包括血癌、结肠癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌和宫颈癌(McLarty等人(2015))。有强有力的证据表明,cfDNA可用作非侵入性生物标志物来诊断癌症、监测疾病进展并监测某些个体的治疗反应。
此外,人们对使用cfDNA在非侵入性产前检测(NIPT)中的用途感兴趣,因为在母体血浆中存在游离胎儿DNA(Lo YM等人,“胎儿DNA在母体血浆和血清中的存在”.Lancet1997;350:485-487)。目前,研究人员正在研究使用游离胎儿DNA进行胎儿性别测定、在RhD阴性母亲中进行胎儿恒河猴D(RhD)基因分型以及诊断某些遗传病症,例如软骨发育不全和非整倍体(Everett TR,Chitty LS.“游离胎儿DNA:胎儿医学的新工具”.UltrasoundObstet Gynecol 2015;45:499-507)。
在诊断应用中使用cfDNA(例如血浆cfDNA)的挑战是检测目标cfDNA,因为它们存在量极低。例如,在孕妇中,大部分血浆cfDNA是母体的,只有约10%的cfDNA构成游离胎儿DNA(Lunn FM,Chiu RW,Allen Chan KC,Yeung Leung T,Kin Lau T,Denis Lo YM.“微流体数字PCR显示母体血浆中胎儿DNA的比例高于预期部分”.Clin Chem 2008;54:1664-1672)。类似地,在癌症患者中存在的肿瘤相关血浆cfDNA的量通常小于总cfDNA的10%(Norton SE等人.“如数字PCR所确定的,稳定剂在血液样本储存和运输期间防止血浆中细胞DNA的游离DNA污染”.Clinical Biochemistry 46(2013)1561-1565)。这些数字对应于极低量,因为健康个体中总的循环cfDNA的平均浓度仅为10-30ng/mL。
在诊断应用中使用cfDNA的另一个挑战是样本采集后血浆cfDNA被基因组DNA(例如,母体或非肿瘤)污染,这是由于在储存和运输样本期间白细胞的裂解以及由此导致的基因组DNA(gDNA)释放到血浆部分。由于存在于血浆中的总cfDNA的量已经非常低,并且目标cfDNA的量仅是存在的cfDNA的一部分,因此这种gDNA的释放将干扰下游应用中目标cfDNA的检测。
防止gDNA释放到血浆部分中的常用方法是将血液采集到标准EDTA或柠檬酸钠管中,然后冷藏血液样本并通过离心在6小时内制备血浆。一旦血浆制备好,就必须在DNA分离之前将其冷冻。然而,该方法的一个问题是大多数采血站没有将血浆从血液样本中分离所需的设备,因此必须将样本运送到中心实验室或核心设施进行血浆处理和后续DNA分离。此外,即使该站点确实具有制备血浆的能力,在DNA分离和下游诊断应用之前也必须将其冷冻。因此,使用标准EDTA或柠檬酸钠管对于cfDNA在诊断应用中的广泛使用并不理想或不实用,特别是对于资源有限的实验室和地区,缺乏在运输前立即制备血浆和冷冻储存所需的设备。
防止gDNA释放到血浆成分中的另一种方法是使用化学稳定剂,例如醛(例如甲醛或戊二醛),通过在细胞水平上交联固定细胞来稳定白细胞。使用醛作为cfDNA的保护剂存在许多缺点,包括DNA-蛋白质和DNA-DNA交联的形成,这会对使用PCR扩增DNA以及DNA测序产生负面影响。由于这些交联问题,已经显示组织的甲醛固定降低了PCR扩增的成功率。此外,已经证明当使用甲醛固定组织时,可以在直接测序期间检测到高频率的非再现性的序列改变。在一项研究中,在甲醛固定的组织中发现多达每500个碱基可出现一个突变假象(Williams C等人.“高频率的序列改变是由于档案标本的福尔马林固定”.AmericanJournal of Pathology,Vol.155,No.5,November 1999)。此外,已知甲醛和戊二醛会对临床样本中的DNA造成损伤(Das K,Fernando MR,Basiaga S,Wigginton SM,Williams T.“与传统细胞稳定剂相比的新型细胞稳定剂对PCR扩增的影响”.Acta Histochemica 116(2014)55-60)。因此,虽然醛可以成功地用作细胞保护剂,但它们对下游分析具有负面影响,这可能干扰血浆样本中低丰度cfDNA的检测。
发明内容
一方面,提供了用于保存核酸的保护剂组合物,特别是生物样本中的游离核酸。保护剂组合物还可用来减少生物样本中的细胞裂解。
在一个实施例中,所述保护剂组合物包括:至少一种可排除体积的聚合物,其中可排除体积的所述聚合物按所述保护剂组合物重量计的重量百分比为约10%至约50%;至少一种渗透剂,其中所述渗透剂按所述保护剂组合物的重量计的重量百分比为约1%至约20%,和至少一种酶抑制剂,其中所述酶抑制剂按所述保护剂组合物的重量计的重量百分比为约1%至约30%。
在另一个实施例中,至少一种可排除体积的所述聚合物按所述保护剂组合物的重量计的重量百分比为约10%至约40%。至少一种可排除体积的所述聚合物优选为聚乙二醇(PEG)。
在另一个实施例中,所述渗透剂优选为NaCl。所述酶抑制剂优选为EDTA或柠檬酸盐。
在另一个实施例中,所述组合物还包括代谢抑制剂,其中所述代谢抑制剂按组合物的重量计的重量百分比为约0.01%至约10%。所述代谢抑制剂优选为叠氮化钠。
另一方面,提供了一种在生物样本中保存核酸的方法,包括以下步骤:提供所公开的保护剂组合物,使所述生物样本与所述组合物接触以提供处理过的样本。
另一方面,提供了一种用于在生物样本中保存核酸的方法,包括:使所述生物样本按任何顺序或同时接触至少一种可排除体积的聚合物、至少一种渗透剂和至少一种酶抑制剂以提供处理过的样本;其中至少一种可排除体积的所述聚合物按所述处理过的样本总重量计的重量百分比为约2%至约10%w/w;其中至少一种所述渗透剂按所述处理过的样本总重量计的重量百分比为约0.2%至约4%w/w;其中至少一种所述酶抑制剂按所述处理过的样本总重量计的重量百分比为约0.2%至约6%w/w。
在另一个实施例中,可排除体积的所述聚合物优选为聚乙二醇(PEG)。所述渗透剂优选为NaCl。所述酶抑制剂优选为EDTA或柠檬酸盐。
在另一个实施例中,所述组合物还包括代谢抑制剂,并且其中所述代谢抑制剂按所述处理过的样本总重量计的重量百分比为约0.002%至约2%w/w。
在另一个实施例中,首先通过将所述生物样本采集到含有至少一种所述酶抑制剂的容器中来使所述生物样本与至少一种所述酶抑制剂接触,然后将至少一种可排除体积的所述聚合物和至少一种所述渗透剂加入到含有所述生物样本和至少一种所述酶抑制剂的容器中以提供所述处理过的样本。所述容器可以是采血管。
在所公开的用于保存核酸的方法中,所述生物样本可以是生物液体。所述生物液体可以是血液、血浆、血清、尿液、唾液、粪便、乳汁、泪液、汗液、脑脊液、滑液、精液、阴道液、腹水、羊水或细胞培养基。在另一个实施例中,所述生物液体是全血。所述核酸可以是游离RNA、游离DNA或其组合。所述游离DNA可以分离自血液中,更具体地,所述游离DNA是游离血浆DNA。
在所公开的保存核酸的方法中,所述处理过的样本可以储存至少1天、至少7天、至少14天、至少21天、至少28天或至少40天的时间。至少一部分储存期可以在环境温度下发生。储存之后,所公开的方法可以进一步包括从所述生物样本中分离核酸的步骤。所分离的核酸可用于下游分析,包括诊断疾病或感染或用于监测疾病或感染。
另一方面,提供了一种用于保存生物样本中细胞的方法,包括以下步骤:提供所公开的保护剂组合物并使所述生物样本与所述组合物接触以提供处理过的样本。
另一方面,提供了一种用于保存生物样本中的细胞的方法,包括:使所述生物样本按任何顺序或同时接触至少一种可排除体积的聚合物、至少一种渗透剂和至少一种酶抑制剂以提供处理过的样本;其中至少一种可排除体积的所述聚合物按所述处理过的样本总重量计的重量百分比为约2%至约10%w/w;其中至少一种所述渗透剂按所述处理过的样本总重量计的重量百分比为约0.2%至约4%w/w;其中所述酶抑制剂按所述处理过的样本总重量计的重量百分比为约0.2%至约6%w/w。
在另一个实施例中,可排除体积的所述聚合物优选为聚乙二醇(PEG)。所述渗透剂优选为NaCl。所述酶抑制剂优选为EDTA或柠檬酸盐。
在另一个实施例中,所述组合物还包括代谢抑制剂,并且其中所述代谢抑制剂按所述处理过的样本总重量计的重量百分比为约0.002%至约2%w/w。所述代谢抑制剂优选为叠氮化钠。
在另一个实施例中,首先通过将所述生物样本采集到含有至少一种所述酶抑制剂的容器中来使所述生物样本与至少一种所述酶抑制剂接触,然后将至少一种可排除体积的所述聚合物和至少一种所述渗透剂的体积加入到含有所述生物样本和至少一种所述酶抑制剂的容器中以提供所述处理过的样本。所述容器可以是采血管。
在所公开的用于保存细胞的方法中,所述生物样本可以是生物液体。所述生物液体可以是血液、血浆、血清、尿液、唾液、粪便、乳汁、泪液、汗液、脑脊液、滑液、精液、阴道液、腹水、羊水或细胞培养基。在另一个实施例中,所述生物液体是全血。在另一个实施例中,所述生物液体可包括肿瘤细胞。
在所公开的保存细胞的方法中,所述处理过的样本可以储存至少1天、至少7天、至少14天、至少21天、至少28天或至少40天的时间。至少一部分储存期可以在环境温度下发生。
另一方面,公开了一种试剂盒,其包括:所公开的保护剂组合物和将所述保护剂组合物与所述生物样本组合以提供处理过的样本的说明书。在一个实施例中,所述生物样本是血液样本,并且所述试剂盒可以进一步包括采血管。
另一方面,提供了一种试剂盒,其包括:至少一种可排除体积的聚合物、至少一种渗透剂;以及将至少一种可排除体积的所述聚合物和至少一种所述渗透剂与生物样本和至少一种酶抑制剂按任何顺序或同时组合,以提供处理过的样本;其中至少一种可排除体积的该聚合物按所述处理过的样本总重量计的重量百分比为约2%至约10%w/w;其中至少一种所述渗透剂按所述处理过的样本总重量计的重量百分比为约0.2%至约4%w/w;其中至少一种该酶抑制剂按所述处理过的样本总重量计的重量百分比为约0.2%至约6%w/w。
在一个实施例中,可排除体积的所述聚合物优选为PEG。所述渗透剂优选为NaCl。所述酶抑制剂优选为EDTA或柠檬酸盐。至少一种可排除体积的所述聚合物和至少一种所述渗透剂可以作为单独的组分或作为组合物提供。
在另一个实施例中,所述试剂盒还包括代谢抑制剂,并且其中所述代谢抑制剂按所述处理过的样本总重量计的重量百分比为约0.002%至约2%w/w。所述代谢抑制剂优选为叠氮化钠。
在另一个实施例中,所述生物样本是血液样本,并且所述试剂盒进一步包括含有至少一种所述酶抑制剂的采血管。
所公开的试剂盒可用于保存生物样本中的核酸。所公开的试剂盒可用于保存生物样本中的细胞。
附图说明
图1是显示通过使用实时PCR检测Alu247片段的储存长达28天的血液样本中的gDNA污染的图表。将从血液中分离的DNA采集到:含有本文公开的保护剂组合物的保护剂管(A;A+柠檬酸盐;A+EDTA;B,B+柠檬酸盐;B+EDTA);含有现有技术的保护剂组合物(Streck)的保护剂管、含有柠檬酸盐(柠檬酸盐对照)的保护剂管或含有EDTA(EDTA对照)的保护剂管。
图2是通过使用实时PCR检测Alul 15片段的显示储存长达28天的血液样本中的cfDNA保存的图表。将从血液中分离的DNA采集到:含有本文公开的保护剂组合物(A;A+柠檬酸盐;A+EDTA;B,B+柠檬酸盐;B+EDTA)的保护剂管、含有现有技术的保护剂组合物(Streck)的保护剂管、含有柠檬酸盐(柠檬酸盐对照)的保护剂管或含有EDTA(EDTA对照)的保护剂管。
图3是通过使用实时PCR检测Alu247片段的显示储存长达28天的血液样本中的gDNA污染的图表。从2个不同个体(男性;女性)中抽取的血液中分离DNA并采集到含有本文公开的保护剂组合物的保护剂管(A;B)、含有现有技术的保护剂组合物(Streck)的保护剂管或含有EDTA(EDTA)的保护剂管中。
图4是通过使用实时PCR检测Alul 15片段的显示储存长达28天的血液样本中的cfDNA保存的图表。从2个不同个体(男性;女性)抽取的血液中分离DNA并采集到含有本文公开的保护剂组合物的保护剂管(A;B)、含有现有技术的保护剂组合物(Streck)的保护剂管或含有EDTA(EDTA)的保护剂管中。
图5是通过使用实时PCR检测5S rRNA的显示储存长达28天的血液样本中的cfDNA保存的图表。将从血液中分离的DNA采集到:含有本文公开的保护剂组合物的保护剂管(C;D)或者含有现有技术的保护剂剂组合物(Streck)的保护剂管中。
图6是通过使用实时PCR检测SRY基因的显示储存长达30天的女性血液样本中掺入的男性cfDNA保存的图表。图7是通过使用实时PCR检测GAPDH基因的显示女性血液样本中的cfDNA保存的图表。图8是显示检测到的SRY基因的量占女性cfDNA总量的百分比的图表。从2个不同女性个体抽取的血液中分离DNA并采集到:含有本文公开的保护剂组合物(A)的保护剂管中并掺入来自男性供体的血浆,或含有现有技术的保护剂组合物(Streck)的保护剂管中并掺入男性供体的血浆。
图9是通过在414nm处测定游离血红蛋白的吸收值的比较在各个储存时间点(长达30天)的混合血液样本中溶血量的图表。血液样本取自3个不同的个体并采集到:含有如本文公开的保护剂组合物的保护剂管(A)中、含有现有技术的保护剂剂组合物(Streck)的保护剂管或含有EDTA(EDTA)的保护剂管中。
图10是显示通过使用实时PCR检测Alul 15片段的在环境温度下储存长达30天的血液样本中cfDNA保存的图表。图11是通过使用实时PCR检测Alu247片段的显示在环境温度下储存长达30天的血液样本中gDNA污染程度的图表。从3个不同个体抽取的血液中分离DNA并采集到:含有本文公开的保护剂组合物(A)的保护剂管、含有现有技术的保护剂组合物(Streck)的保护管或含有EDTA(EDTA)的保护剂管中。
图12是通过使用实时PCR检测Alu247片段的显示在37℃下储存长达8天的血液样本中gfDNA污染程度的图表。从3个不同个体抽取的血液中分离DNA并采集到:含有本文公开的保护剂组合物(A)的保护剂管、含有现有技术的保护剂组合物(Streck)的保护剂管或含有EDTA(EDTA)的保护剂管中。
图13中的第A-J幅是显示在室温下储存长达30天的血液样本中cfDNA(信号峰值在约170-185bp)和污染的gDNA(信号峰值>185bp)的相对量的光谱图。将分离自血液中的DNA采集到:含有本文公开的保护剂组合物(A)的保护剂管或含有现有技术的保护剂组合物(Streck)的保护剂管中。
图14是通过使用实时PCR检测GAPDH基因的显示储存长达30天的血液样本中cfDNA保存的图表。将分离自血液中的DNA采集到含有本文公开的保护剂组合物的保护剂管中(E、F、G、H或I)。
图15是通过使用实时PCR检测GAPDH基因的显示储存长达30天的血液样本中cfDNA保存的图表。将分离自血液中的DNA采集到含有本文公开的使用PEG 2000、PEG 4000、PEG6000或PEG 8000制备的保护剂组合物(A)的保护剂管中。
具体实施方式
提供了可用于保存存在于生物样本中的核酸和/或细胞的组合物、方法和试剂盒。如本文所用,术语“核酸”包括核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA),并且还包括RNA和/或DNA,其是直链或支链、单链或双链,或其片段。特别地,核酸可以是游离DNA(cfDNA)、游离RNA(cfRNA)或其任何组合。包含待保存核酸的生物样本可以是任何生物液体,特别地,可以是血液。更特别地,游离核酸存在于血浆内。
当用本文公开的保护剂组合物处理生物样本时,与未处理的生物样本相比,存在于生物样本中的核酸可以得到保存。所述保护剂组合物可以帮助减少或防止生物样本中目标核酸的降解,并且还可以有助于防止细胞裂解产生的gDNA对目标核酸的污染。因此,即使在长期储存后,所述保护剂组合物也可以有助于维持样本的核酸组成—特别是游离核酸组成。例如,可以保护存在于生物样本中的游离核酸免受细胞gDNA的污染,因为用保护剂组合物处理后可以有助于减少或防止生物样本中的细胞裂解。此外,通过防止或减少生物样本中的细胞裂解,还可以最小化核酸酶的释放,因此,也可以最小化核酸的降解。因此,使用所公开的保护剂组合物保存生物样本中的核酸的益处可以是双重的。存在于在生物样本中的游离核酸可以是:1)得到防止其降解的保护;2)通过稳定存在于样本中的细胞得到免受细胞gDNA污染的保护,从而最小化由于细胞裂解而从细胞中释放的gDNA。由于所公开的保护剂组合物可以防止或减少生物样本中的细胞裂解,所以该组合物还可以用于保存生物样本中含有的细胞,例如白细胞和循环肿瘤细胞。
已经发现,用所公开的保护剂组合物处理生物样本有助于延长样本储存时间,而不必在样本处理和后续核酸分离之前冷藏。因此,使用所公开的保护剂组合物对于资源有限的环境可能是有益的,这些环境缺乏对采集的样本立即处理和/或冷藏所需的设备或资源。如实施例中所示,发现从使用所公开的保护剂组合物处理的生物样本中分离的核酸—甚至没有经过28天或更长时间的冷藏—基本上维持了它们的cfDNA组成。此外,如实施例中所示,在储存期间,能够最小化gDNA对cfDNA的污染。
从使用所公开的保护剂组合物处理的生物样本中分离的核酸可用于下游分析,包括诊断应用和非侵入性产前检测(NIPT)。由于所公开的保护剂组合物不包含醛或其他交联剂,因此可以避免DNA损伤和引入突变假象的风险。
保护剂组合物
一方面,提供了用于在生物样本中保存核酸(特别是游离核酸)的保护剂组合物,该组合物包括至少一种可排除体积的聚合物、至少一种渗透剂和至少一种酶抑制剂。意外地,发现这些组分的组合允许生物样本中的游离核酸(例如血浆中的cfDNA)可以在室温下保存至少28天,多于市售的游离DNA保护剂的两倍,例如来自Streck公司(美国奥马哈)的Streck Cell-Free DNATM。有利地,所公开的保护剂组合物不依赖于醛的使用。进一步令人惊讶地发现,使用所公开的保护剂组合物处理的样本具有产生自细胞裂解的最低量的gDNA的污染,即使样本经受了移动和摇动(例如,将在运输期间所经历的)。因此,所公开的组合物还可用于保存生物样本中的细胞,例如白细胞或循环肿瘤细胞。
不受理论束缚,据信可排除体积的聚合物和渗透剂用于稳定细胞并减少细胞裂解,从而防止细胞内含物(包括gDNA和核酸酶)的释放。据信,可排除体积的聚合物作为拥挤试剂,迫使细胞脱离溶液,从而防止细胞裂解和释放可能污染低丰度游离核酸的gDNA和会降解游离核酸的核酸酶。渗透剂用于产生高渗溶液,使得水从存在于样本中的细胞中除去,导致细胞收缩(或皱缩)。与可排除体积的聚合物相组合,据信这减少了细胞裂解和后续gDNA与核酸酶的释放。此外,酶抑制剂的存在将使样本中存在的核酸酶失活,从而防止或减少游离核酸的降解。
由于已发现所公开的保护剂组合物可减少细胞裂解,因此保护剂组合物也可用于保存体液中的全细胞,例如循环肿瘤细胞。当与所公开的保护剂组合物组合时,这些细胞可以保存长达28天或更长时间。
任选地,该保护剂组合物可进一步包括代谢抑制剂,来减少细胞内的细胞代谢和细胞呼吸。通过阻止细胞代谢,认为可进一步减少游离核酸的降解和样本中细胞的裂解。
该保护剂组合物可包括任何可排除体积的聚合物,其作为拥挤试剂并迫使细胞脱离溶液。合适的可排除体积的聚合物的实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、甘油、海藻糖、葡聚糖及其衍生物(例如硫酸葡聚糖和醋酸葡聚糖)和亲水聚合物(例如聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯和聚乙烯硫酸酯)。已发现分子量在1000和1,000,000道尔顿之间的可排除体积的聚合物特别适用于保护剂组合物。在优选的实施例中,可排除体积的所述聚合物是PEG。可以使用不同分子量的PEG,包括但不限于PEG 2000、PEG 4000、PEG 6000和PEG 8000。更优选地,可排除体积的所述聚合物是PEG 8000(也称为PEG-8K)。
该保护剂组合物优选包括约10%至50%w/w的可排除体积的聚合物,优选约10%至40%w/w的可排除体积的聚合物,更优选约15%至35%w/w的可排除体积的聚合物,甚至更优选约20%至约30%w/w的可排除体积的聚合物。
该保护剂组合物可以包括任何渗透剂,其产生高渗溶液,从而当将足量的保护剂组合物加入到包含细胞的生物样本中时,使水从细胞中除去并使细胞收缩。合适的渗透剂的实例包括但不限于盐(例如NaCl、KCl和CaCb)以及糖(例如葡萄糖或蔗糖)。在优选的实施例中,该渗透剂是NaCl。
该保护剂组合物优选包括约1%至20%w/w的渗透剂,更优选约1%至15%w/w的渗透剂,甚至更优选约1%至约10%w/w的渗透剂。
该保护剂组合物还包括酶抑制剂,用于抑制核酸酶。该酶抑制剂可包括抑制金属依赖性核酸酶的螯合剂,和/或已知抑制非金属依赖性核酸酶的其他组分。合适的酶抑制剂的实例包括但不限于乙二胺四乙酸(EDTA)、HEDTA、柠檬酸盐、草酸盐、金精三羧酸(ATA)、DTT及其任何组合。优选地,该酶抑制剂是EDTA。或者,该酶抑制剂可以是柠檬酸盐,例如柠檬酸钠或柠檬酸钾。
该保护剂组合物优选包括约1%至30%w/w的酶抑制剂,更优选约1%至20%w/w的酶抑制剂,甚至更优选约1%至约10%w/w的酶抑制剂。
任选地,该保护剂组合物可以进一步包括代谢抑制剂,用于抑制细胞过程,例如细胞代谢和细胞呼吸。优选地,该代谢抑制剂是叠氮化钠。
保护剂组合物优选包括约0.01%至约10%的代谢抑制剂,更优选约0.01%至5%w/w的代谢抑制剂,甚至更优选约0.01%至约2%的代谢抑制剂。
在优选的实施例中,该保护剂组合物包括:
作为可排除体积的聚合物的PEG,其中PEG按总组合物的重量计的重量百分比为约10%至50%w/w,优选约10%至40%w/w,更优选约15%至35%w/w,甚至更优选约20%至约30%w/w;
作为渗透剂的NaCl,其中NaCl按总组合物的重量计的重量百分比为约1%至20%w/w,更优选约1%至15%w/w,甚至更优选约1%至约11%w/w;
作为酶抑制剂的EDTA,其中EDTA按总组合物的重量计的重量百分比为约1%至30%w/w,更优选约1%至20%w/w,甚至更优选约1%至约10%w/w;以及
作为代谢抑制剂的叠氮化钠,其中叠氮化钠按总组合物的重量计的重量百分约0.01%至约10%w/w,更优选约0.01%至约5%w/w,甚至更优选约0.01%至约2%w/w;
可以使用合适的溶剂如水或缓冲水溶液制备该保护剂组合物。通常,该保护剂组合物的制备首先通过将可排除体积的聚合物(例如PEG)溶解在合适的溶剂(例如水)中,然后加入渗透剂、酶抑制剂和任选的代谢抑制剂。可将所得溶液pH调节至约中性。用于保存生物样本中的核酸或用于保存生物样本中的细胞(例如循环肿瘤细胞)时,该保护剂组合物可以作为水溶液来提供。或者,含水组合物可以冷冻干燥,该保护剂组合物可以以干燥形式提供以供使用,或者可以在使用之前用合适的载体重新组成。
虽然前面的讨论考虑使用预先制备的保护剂组合物,其包括可排除体积的聚合物、渗透剂、酶抑制剂和任选的代谢抑制剂,被添加到待处理的生物样本中,但是也可以考虑所公开的保护剂组合物可以在使用期间通过将组合物组分单独(按任何顺序或同时)添加到待处理的生物样本中来组成。例如,含有EDTA或柠檬酸钠(二者均是所公开的保护剂组合物的合适的酶抑制剂)的采血管是容易获得的。因此,采集到这种管中的血液将已经含有所公开的保护剂组合物的酶抑制剂组分。然后可以将适当量的保护剂组分的剩余组分单独(按任何顺序或同时)加入到已经包括酶抑制剂的血液样本中,以提供所需的最终量的可排除体积的聚合物、渗透剂和任选的代谢抑制剂(参见下文第[0073]段中的讨论,其描述了样本/保护剂混合物中每种组分的优选量)。或者,可以预先将可排除体积的聚合物、渗透剂和任选的代谢抑制剂混合在一起,并将适量的该混合物添加到血液样本(其已经包括酶抑制剂)中以组成保护剂组合物。
保存生物样本中的核酸和/或细胞的方法
另一方面,提供了一种用于保存生物样本中的核酸的方法,包括以下步骤:提供含有至少一种可排除体积的聚合物、至少一种渗透剂和至少一种酶抑制剂的保护剂组合物,使生物样本与该保护剂组合物接触以提供处理过的样本。
该方法可以使用如上文第[0050]-[0064]段中进一步详细描述的保护剂组合物来实施。该保护剂组合物可任选地进一步包括代谢抑制剂。
该保护剂组合物可以以液体形式提供,更优选地,以水溶液形式提供。该水溶液可以以包含在管(例如抽空的采血管)、注射器、安瓿、可溶解的胶囊、可渗透的袋或其他载体中来提供。该保护剂组合物也可以以固体形式提供,例如颗粒或片剂。该保护剂组合物也可以制备成水溶液,然后将其冻干。然后可以以干燥形式提供冻干的保护剂组合物以供使用,或者可以在使用之前用合适的载体重新组成。
该生物样本可以是含有核酸的任何生物液体,包括但不限于血液、血浆、血清、尿液、唾液、粪便、乳汁、眼泪、汗液、脑脊髓液、滑液、精液、阴道液、腹水、羊水、细胞培养基和其他生物液体。该生物液体可以来自任何来源,包括但不限于原核生物、真核生物、细菌、真菌、酵母、无脊椎动物、脊椎动物、爬行动物、鱼类、昆虫、植物或动物。在优选的实施例中,该生物液体是全血。该生物样本可含有细胞或可不含细胞。通过本文公开的方法保存的该核酸可以是游离RNA、游离DNA或其任何组合。在优选的实施例中,该核酸是游离血浆DNA。
可以将该生物样本直接或间接采集到任何合适的容器中,并将合适量的该保护剂组合物添加到该生物样本中以保存核酸。在一个实施例中,该生物样本优选是血液样本,更优选是人血液样本。在一个优选的实施例中,将预定量的该保护剂组合物预先装载在容器或样本采集装置中,例如真空管中,血液样本可以直接采集在容器或样本采集装置中,使得血液样本立即与该保护剂组合物接触。
该保护剂组合物与生物样本的比例可以为约1:10至1:1,优选为约1:5,更优选为约1:4。在一个优选的实施例中,可将约2mL的保护剂组合物加入约8mL的全血中。在另一个优选的实施例中,可将约1.5mL的保护剂组合物加入约8.5mL的全血中。可以考虑通过常规实验由本领域技术人员确定待添加到生物样本中的保护剂组合物的量,以保存生物样本中含有的核酸。
在另一个实施例中,提供了一种用于在生物样本中保存核酸的方法,包括使生物样本按任何顺序或同时接触至少一种可排除体积的聚合物、至少一种渗透剂和至少一种酶抑制剂,以提供处理过的样本。
在这样的一个实施例中,所公开的保护剂组合物不是使用包括可排除体积的聚合物、渗透剂、酶抑制剂和任选的代谢抑制剂的保护剂组合物,而是通过按任何顺序或同时将保护剂组合物的组分加入或接触待处理的样本而组成所公开的保护剂组合物。例如,在生物样本是全血的实施例中,可以将样本采集到标准采血管中,该标准采血管含有EDTA或柠檬酸盐作为保护剂组合物的酶抑制剂组分。这种采血管的实例包括但不限于BD EDTA(K2)血采血管(加拿大米西索加,Becton Dickinson,BDSerum Cat#366430;和BD柠檬酸钠采血管(加拿大米西索加,Becton Dickinson,Cat#369714)。在将血液采集到含有酶抑制剂的采集管中之后,可以按任何顺序将保护剂组合物的剩余组分(例如可排除体积的聚合物、渗透剂和任选的代谢抑制剂)单独添加到血液样本中,或优选地,作为预先制备的组合物。该预先制备的组合物可以以水溶液或固体形式提供,例如颗粒或片剂。该预先制备的组合物也可以制备成水溶液,然后将其冻干。然后冻干的组合物可以以干燥形式提供以供使用,或者可以在使用前用合适的载体重新组合。或者,可以将可排除体积的聚合物、渗透剂和任选的代谢抑制剂单独添加到容纳在采血管中的样本中。
在一个优选的实施例中,在该生物样本与至少一种可排除体积的聚合物、至少一种渗透剂、至少一种酶抑制剂和任选的代谢抑制剂接触后,至少一种可排除体积的聚合物(优选PEG)按处理过的样本的重量计的重量百分比为约2%至约10%w/w,优选为约2%至约8%w/w;更优选为约3%至7%w/w,甚至更优选为约4%至6%w/w;
至少一种渗透剂(优选NaCl)按处理过的样本的重量计的重量百分比为约0.2%至约4%w/w,更优选为约0.2%至3%w/w,甚至更优选为约0.2%至2%w/w;
至少一种酶抑制剂按处理过的样本的重量计的重量百分比为约0.2%至约6%w/w;更优选为约0.2%至4%w/w,甚至更优选为约0.2%至2%w/w;以及
至少一种代谢抑制剂(优选叠氮化钠)按处理过的样本的重量计的重量百分比为约0.002%至约2%w/w,更优选为约0.002%至1%w/w,甚至更优选为约0.002%至0.4%w/w。
在该生物样本与该保护剂组合物接触之后—通过向该生物样本中添加该保护剂组合物的制剂或通过将该保护剂组合物的各个组分添加到该生物样本中—得到的样本/保护剂混合物(本文也称作“处理过的样本”)可以在进一步处理(例如从全血样本中分离血浆)和分离样本中含有的核酸之前储存一段时间。处理过的样本可以在冷藏或环境温度下储存至少1天、至少7天、至少14天、至少21天、至少28天或至少40天的时间。至少一部分储存期可以在环境温度下发生。
如本文所用,游离核酸的保存时间是从该保护剂组合物与含有游离核酸的该生物样本开始接触到将游离核酸分离的时间长度。在一个优选的实施例中,该生物样本可以是血液样本,并且与保护剂组合物的接触可以在抽血后1分钟内。在一个优选的实施例中,游离核酸,更优选地游离血浆DNA,可以在血液样本与保护剂组合物接触至少1天、至少7天、至少14天、至少21天、至少28天、至少40天后从血液样本中分离出来。在此类实施例中,使用所公开的该保护剂组合物和方法保存的游离血浆DNA的保存时间可以是1分钟至28天之间的任何时间。
可以使用本领域已知的任何方法从处理过的生物样本中分离保存的游离核酸。合适的方法包括但不限于苯酚/氯仿的使用、碳化硅的使用和二氧化硅的使用。在一个优选的实施例中,纯化的核酸可用于下游分析。下游分析可以是本领域已知的任何方法,包括PCR、微阵列和测序应用,包括下一代测序。该下游分析可以用于诊断应用,包括但不限于与癌症诊断和监测相关的诊断应用、病毒感染的监测和诊断以及用于非侵入性产前检测(NIPT)。
另一方面,提供了一种用于在生物样本中保存细胞的方法,包括以下步骤:提供含有至少一种可排除体积的聚合物、至少一种渗透剂和至少一种酶抑制剂的保护剂组合物;使该生物样本与该保护剂组合物接触,以提供处理过的样本。
该方法可以使用如上文第[0050]-[0064]段中进一步详细描述的保护剂组合物来实施。包含待保存细胞的该生物样本可以是如第[0068]段中描述的任何生物液体,并且可以按第[0069]段中所述进行采集。在一个优选的实施例中,待保存的细胞是来自血液样本中的循环肿瘤细胞。保护剂组合物与生物样本的比例可以为约1:10至1:1,优选为约1:5,更优选为约1:4。在一个优选的实施例中,可将约2mL的保护剂组合物加入约8mL的全血中。在另一个优选的实施例中,可将约1.5mL的保护剂组合物加入约8mL的全血中。通过常规实验由本领域技术人员确定待添加到生物样本中的保护剂组合物的量。所得处理过的样本的储存时间可以延长,如上文第[0075]段进一步详细描述的。
另一个方面中,提供了一种用于保存生物样本中的细胞的方法,包括使生物样本按任何顺序或同时接触至少一种可排除体积的聚合物、至少一种渗透剂和至少一种酶抑制剂,以提供处理过的样本。
在一个实施例中,首先通过将该生物样本采集到含有酶抑制剂的容器中来使该生物样本与至少一种酶抑制剂接触。将至少一种可排除体积的聚合物和至少一种渗透剂加入到含有该生物样本和至少一种酶抑制剂的容器中以提供处理过的样本。在一个优选的实施例中,含有待保存细胞的该生物样本是全血,含有至少一种酶抑制剂的该容器是含有EDTA或柠檬酸盐的标准采血管,如上文第[0072]段中进一步详细描述的。在另一个优选的实施例中,待保存的该细胞是来自血液样本中的循环肿瘤细胞。优选地,在该生物样本与至少一种可排除体积的聚合物、至少一种渗透剂、至少一种酶抑制剂和任选的代谢抑制剂接触后:
至少一种可排除体积的聚合物(优选PEG)按处理过的样本的重量计的重量百分比为约2%至约10%w/w,优选为约2%至约8%w/w;更优选为约3%至7%w/w,甚至更优选为约4%至6%w/w;
至少一种渗透剂(优选NaCl)按处理过的样本的重量计的重量百分比为约0.2%至约4%w/w,更优选为约0.2%至3%w/w,甚至更优选为约0.2%至2%w/w;
至少一种酶抑制剂(优选EDTA)按处理过的样本的重量计的重量百分比为约0.2%至约6%w/w;更优选为约0.2%至4%w/w,甚至更优选为约0.2%至2%w/w;任选的代谢抑制剂(优选叠氮化钠)按处理过的样本的重量计的重量百分比为约0.002%至约2%w/w,更优选为约0.002%至1%w/w,甚至更优选为约0.002%至0.4%w/w.
所得处理过的样本的储存时间可以延长,如上文第[0075]段进一步详细描述的。
用于保存生物样本中的核酸和/或细胞的试剂盒
另一方面,提供了可用于保存生物样本中的核酸,特别是游离核酸的试剂盒。在另一个实施例中,该试剂盒可用于保存生物样本中的细胞,特别是循环肿瘤细胞。该试剂盒可用于实施如上文第[0065]-[0081]段中描述的方法。
在一个实施例中,该试剂盒包括保护剂组合物,该保护剂组合物含有至少一种可排除体积的聚合物、至少一种渗透剂、至少一种酶抑制剂和关于如何将该生物样本与该保护剂组合物组合以提供处理过的样本的说明书。该保护剂组合物可以以包装形式提供,该包装具有印刷在包装上或在包装中的说明书以及说明性插页。
该试剂盒可包括如上文第[0050]-[0064]段中进一步详细描述的保护剂组合物。该保护剂组合物可任选地进一步包括代谢抑制剂。
在一个优选的实施例中,该试剂盒可以进一步包括采血管,其含有预定体积的保护剂组合物和关于如何将血液样本采集到管中的说明书,包括采血量。在一个实施例中,该管将含有约2ml的保护剂组合物,和关于将指导使用者将约8ml血液样本采集到管中的说明书。在另一个实施例中,所述管含有约1.5ml的保护剂组合物,和关于将指导使用者将约8.5ml血液样本采集到管中的说明书。含有预定体积的该保护剂组合物的采血管可以以包装的形式提供,该包装具有印刷在包装上或包装中的说明书以及说明性插页。
在另一个实施例中,提供了试剂盒,其含有:至少一种可排除体积的聚合物、至少一种渗透剂,任选地,一种代谢抑制剂;和按以下任何顺序或同时将至少一种可排除体积的聚合物、至少一种渗透剂和任选的代谢抑制剂与生物样本和至少一种酶抑制剂组合以提供处理过的样本的说明书;其中至少一种可排除体积的聚合物(优选PEG)按处理过的样本的重量计的重量百分比为约2%至约10%w/w,优选为约2%至约8%w/w;更优选为约3%至7%w/w,甚至更优选为约4%至6%w/w;其中至少一种渗透剂(优选NaCl)按处理过的样本的重量计的重量百分比为约0.2%至约4%w/w,更优选为约0.2%至3%w/w,甚至更优选为约0.2%至2%w/w;其中至少一种酶抑制剂(优选EDTA)按处理过的样本的重量计的重量百分比为约0.2%至约6%w/w;更优选为约0.2%至4%w/w,甚至更优选为约0.2%至2%w/w;其中任选的代谢抑制剂(优选叠氮化钠)按处理过的样本的重量计的重量百分比为约0.002%至约2%w/w,更优选为约0.002%至1%w/w,甚至更优选为约0.002%至0.4%w/w。
至少一种可排除体积的聚合物、至少一种渗透剂和任选的代谢抑制剂可以单独提供(例如在单独的容器中),以及将各个组分与该生物样本和至少一种酶抑制剂组合以提供处理过的样本的说明书,其中可排除体积的聚合物、渗透剂、酶抑制剂和任选的代谢抑制剂的相对量如前一段所述。或者,至少一种可排除体积的聚合物、至少一种渗透剂和任选的代谢抑制剂可以作为预先制备的组合物提供,以及将组合物与该生物样本和至少一种酶抑制剂组合的说明书,以提供处理过的样本。该试剂盒的组分可以以包装形式提供,该包装具有印刷在包装上或在包装中的说明书以及说明性插页。
使用该试剂盒产生所公开的保护剂组合物在组合物混合时组成,含有至少一种可排除体积的聚合物和至少一种渗透剂以及至少一种酶抑制剂。该组合物含有至少一种可排除体积的聚合物和至少一种渗透剂—和任选地,一种代谢抑制剂,其中代谢抑制剂按处理过的样本总重量计的重量百分比为约0.001%至约0.01%w/w,更优选为约0.002%至0.01%w/w,甚至更优选为约0.005%至0.01%w/w—可以以含水形式或干燥形式提供,如在第[0064]段中进一步详细描述的。在一个实施例中,可以在要采集生物样本的容器中提供合适量的至少一种酶抑制剂。在一个优选的实施例中,该生物样本是全血,该容器是含有EDTA和/或柠檬酸盐的标准采血容器,其实例在第[0072]段中描述。
所公开的试剂盒的优点,特别是包括含有所公开保护剂组合物的采血管的试剂盒(或者,包含组合物的试剂盒,所述组合物含有至少一种可排除体积的聚合物和至少一种渗透剂,所述渗透剂将加入到含有酶抑制剂的采血管中以组成所公开的保护剂组合物)的优点可能是减少由于在储存和运输过程中细胞裂解导致的血浆游离核酸的gDNA污染。通常在一个位置采集血液样本,然后运送到中心实验室或核心设施进行血浆制备和从血浆样本中分离游离核酸,用于下游分析和诊断应用。运输过程中的运动可能导致细胞裂解,从而导致gDNA释放到血浆部分的增加。使用所公开的试剂盒,据信含有可排除体积的聚合物和渗透剂的保护剂组合物的组合导致血液样本中存在的细胞聚集在一起,从而减少运输和储存期间的细胞裂解。采集到含有所公开保护剂的管中的血液样本在管底部形成沉淀物,当用手倒置时,其不容易恢复悬浮状态。在常规EDTA管或含有醛保护剂的管(例如美国奥马哈、Streck公司、Streck Cell-Free DNATMBCT)中采集的血液样本中未观察到这种沉降。
使用所公开的保护剂组合物有助于最小化生物样本中的细胞裂解,所公开的试剂盒,特别是包括含有所公开的保护剂组合物的采血管的试剂盒(或者,包含组合物的试剂盒,所述组合物含有至少一种可排除体积的聚合物和至少一种渗透剂,所述渗透剂将加入到含有酶抑制剂的采血管中以组成所公开的保护剂组合物),也可用于保存体液中的细胞。在一个优选的实施例中,所公开的试剂盒可用于保存体液中的循环肿瘤细胞。当与所公开的保护剂组合物组合时,这些细胞可以保存长达28天或更长时间。
使用所公开的试剂盒可以在环境温度下采集、储存和运输全血样本,从而将血浆处理的时间范围延长至28天以上。因此,所公开的试剂盒对于偏远地方和资源有限的环境可能是特别有益的,这些地方从血液采集到血浆处理可能需要更多的时间。与常规保护剂(例如基于醛的保护剂)相比,所公开的试剂盒可以有更长时间的运输和储存,从而有助于集中处理和分析,并增加用于广大人群诊断应用的cfDNA检测的可用性。
此外,与使用市售的管,例如Streck Cell-Free DNATMBCT(美国奥马哈Streck公司)相比,所公开试剂盒的采血管含有不含醛的保护剂组合物。因此,使用所公开的试剂盒可以避免与醛相关的问题,包括DNA损伤。虽然现有技术的管含有淬灭剂以防止游离醛对DNA的有害影响,但是与使用醛相关的风险不能完全消除,这是因为现有技术的保护剂依赖于醛固定来稳定细胞。
虽然仅描述了本发明的特定实施例,但显然在不脱离本发明范围的情况下可以进行改变。本发明进一步通过下面的实施例来说明,它们不以任何方式解释为对本发明范围的限制。所附权利要求意在涵盖可能落入本发明的真实范围内的所有变型。
实例
这些实例是出于描述目的而非用于限制本发明的范围。
实例1-在环境温度下延长储存时间的游离血浆DNA保存的改善
制备了本文所公开的保护剂组合物的两种变型。核酸保护剂A包括33%w/w的PEG、5%w/w的NaCl、2%w/w的EDTA、0.023%w/w的叠氮化钠,其余为水。核酸保护剂B包括25%w/w的PEG、3%w/w的NaCl、3%w/w的EDTA、0.033%w/w的叠氮化钠,其余为水。
将来自单个健康供体的血液样本抽吸入9个单独的采血管(管1至9)中。
管1是BD普通采血管(加拿大米西索加,Becton Dickinson,BDSerumCat#366430),其含有8至10ml血液和约2ml核酸保护剂A。
管2是BD柠檬酸盐采血管(加拿大米西索加,Becton Dickinson,BDSodium Citrate Tube Cat#369714),其含有4至5ml血液和约1ml核酸保护剂A。
管3是BD EDTA采血管(加拿大米西索加,Becton Dickinson,BD EDTA(K2)TubeCat#366643),其含有8至10ml血液和约2ml核酸保护剂A。
管4是BD普通采血管(加拿大米西索加,Becton Dickinson,BDSerumCat#366430),其含有8至10ml血液和约2mL核酸保护剂B。
管5是BD柠檬酸盐采血管(加拿大米西索加,Becton Dickinson,BDSodium Citrate Tube Cat#369714),其含有4至5ml血液和约1ml核酸保护剂B。
管6是BD EDTA采血管(加拿大米西索加,Becton Dickinson,BD EDTA(K2)TubeCat#366643),其含有8至10ml血液和约2ml核酸保护剂B。
管7是BD柠檬酸盐采血管(加拿大米西索加,Becton Dickinson,BD柠檬酸钠管,Cat#369714),其含有4至5ml血液。
管8是BD EDTA采血管(加拿大米西索加,Becton Dickinson,BD EDTA(K2)TubeCat#366643),其含有8至10ml血液。
管9是Streck Cell-Free DNATMBCT管(美国奥马哈,Streck,Catalog#218962),其含有8至10ml血液。
通过颠倒混合所有管,然后将1mL的等份试样分配到Eppendorf管中并在室温下储存。从第0天(立即处理)、第7天、第14天、第21天和第28天开始,在每个时间点处理等份处理过的血液。在400x g(-2,000RPM)下离心15分钟分离血浆,然后将血浆转移到一个新管中。然后根据制造商说明书,使用Norgen的血浆/血清游离循环DNA纯化微量试剂盒(加拿大索罗德尔,Norgen Biotek,Cat#55500)从血浆样本中分离出DNA。
然后使用实时PCR扩增Alu247(247bp的片段)和Alul 15(115bp的片段)基因靶来分析纯化的游离血浆DNA。高丰度ALU序列可基于大小来用于定量人基因组DNA。cfDNA通常表现出约165bp的窄尺寸分布范围。因此,Alu115可用于检测总cfDNA和高分子量gDNA,而Alu247可用于检测高分子量细胞gDNA污染的存在(Swift Biosciences Technical Note,2016)。较大的Alu247片段的增加表示细胞开始裂解,因此表示样本不再被保存。
实时PCR的条件是:
实时PCR混合:
3μL的血浆DNA
10μL的Norgen的2X PCR Master Mix(加拿大索罗德尔,Norgen Biotek,Cat#28007)
0.12μL的Alu247或者Alul 15正向引物(50μΜ)
0.12μL的Alu247或者Alul 15反向引物(50μΜ)
0.03μL的Ι00x Syber Green Mix(美国Hercules,BioRad公司,Catalog#170-8880)
6.73μL的水
20μL的PCR反应
实时PCR程序:
循环1:(IX)
步骤1:95.0℃,03:00
循环2:(45X)
步骤1:95.0℃,00:30
步骤2:64.0℃,00:30
步骤3:72.0℃,00:30
启用数据采集和实时分析。
循环3:(IX)
步骤1:57.0℃,01:00
循环4:(80X)
步骤1:57.0℃,00:10
在循环2后将设定温度提高0.5℃
启用熔解曲线数据采集和分析。
然后将来自每个时间点和9个不同管产生的Ct值(循环阈值)总结在表1中用于Alu247的扩增,表2用于Alu115的扩增。如图1和图2所示,还绘制了Ct值。
表1
表2
如上所述,如果发生细胞裂解,则较长的Alu247片段将增加并且Ct值将降低。如表1和图1中所示,从第0天、第7天、第14天、第21天和第28天的一致Ct读数可证明核酸保护剂A(单独或与柠檬酸盐或EDTA组合)和核酸保护剂B(单独或与柠檬酸盐或EDTA组合)保存样本长达28天。相反,单独的EDTA和单独的柠檬酸盐在第7天导致细胞裂解,此时观察到Ct值显著下降。与现有技术的Streck管相比(在第14天后出现裂解),核酸保护剂A和核酸保护剂B还显示能使样本保存更长的时间。观察到的Streck管的保存时间与该产品的保存要求相一致(即长达14天)。当观察较小的Alu115片段时,所公开的保护剂组合物的改善的保存性能也是明显的。如表2和图2所示,再次,核酸保护剂A和核酸保护剂B(单独或与柠檬酸盐或EDTA组合)能够使样本保存长达28天,而单独的EDTA、单独的柠檬酸盐和现有技术的Streck管在第14天显示出细胞裂解,此时观察到Ct值下降,对应于存在的DNA量的增加。
实例2-在环境温度下延长储存时间的来自不同供体的游离血浆DNA保存的改善
将来自两个健康供体(男性-A和女性-B)的血液样本抽吸入4个单独的采血管(管1至4)中,以显示来自不同供体的样本检测时核酸保存的重现性。
管1是BD普通采血管(加拿大米西索加,Becton Dickinson,BDSerum,Cat#366430),其含有8至10ml血液和约2ml核酸保护剂A(见实例1)。
管2是BD普通采血管(加拿大米西索加,Becton Dickinson,BDSerum,Cat#366430),其含有8至10ml血液和约2ml核酸保护剂B(见实例1)。
管3是BD EDTA采血管(加拿大米西索加,Becton Dickinson,BD EDTA(K2)管,Cat#366643),其含有8至10ml血液。
管4是Streck Cell-Free DNATMBCT管(美国奥马哈,Streck,Catalog#218962),其含有8至10ml血液。
通过颠倒混合所有管,然后将1mL的等份试样分配到Eppendorf管中并在室温下储存。从第0天(立即处理)、第1天、第4天、第7天、第14天、第21天、之后第28天开始,在每个时间点处理等份处理过的血液。在400x g(-2,000RPM)下离心15分钟分离血浆,然后将血浆转移到一个新管中。然后根据制造商说明书,使用Norgen的血浆/血清游离循环DNA纯化微量试剂盒(加拿大索罗德尔,Norgen Biotek,Cat#55500)从血浆样本中分离出DNA。
然后使用实时PCR扩增Alu247和Alu115基因靶来分析纯化的游离血浆DNA。
实时PCR的条件是:
实时PCR混合:
3μL的血浆DNA
10μL的Norgen的2X PCR Master Mix(加拿大索罗德尔,Norgen Biotek,Cat#28007)
0.12μL的Alu247或者Alu115正向引物(50μΜ)
0.12μL的Alu247或者Alu115反向引物(50μΜ)
0.03μL的100x Syber Green Mix(美国Hercules,BioRad公司,Catalog#170-8880)
6.73μL的水
20μL的PCR反应
实时PCR程序:
循环1:(IX)
步骤1:95.0℃,03:00
循环2:(45X)
步骤1:95.0℃,00:30
步骤2:64.0℃,00:30
步骤3:72.0℃,00:30
启用数据采集和实时分析。
循环3:(IX)
步骤1:57.0℃,01:00
循环4:(80X)
步骤1:57.0℃,00:10
在循环2后将设定温度提高0.5℃
启用熔解曲线数据采集和分析。
然后总结从2个不同个体的每个时间点产生的Ct(循环阈值)值。表3显示来自2个不同个体的Alu247扩增的Ct值,表4显示来自2个不同个体的Alul15扩增的Ct值。如图3和图4所示,还绘制了Ct值。
表3
表4
如上所述,如果发生细胞裂解,则较长的Alu247片段将增加并且Ct值将降低。如表3和图3所示,从第0天、第1天、第4天、第7天、第14天、第21天和第28天的一致Ct读数可证明,核酸保护剂A和核酸保护剂B保存来自男性和女性供体的样本长达28天。相反,EDTA管导致细胞立即裂解,这是由于Ct值很低。此外,可以看出,与现有技术的Streck管相比(在仅第14天后出现裂解),核酸保护剂A和核酸保护剂B还显示能使样本保存更长的时间(在第28天未观察到明显的细胞裂解)。当观察较小的Alu115片段时,所公开的保护剂组合物改善的保存性能也是明显的。如表4和图4所示,再次,核酸保护剂A和核酸保护剂B能够使来自男性和女性的血液样本保存长达28天,而EDTA管几乎立即显示裂解以及现有技术Streck管在第14天显示出细胞裂解。
实例3-在环境温度和不使用代谢抑制剂的条件下延长储存时间后游离血浆DNA保存的改善
制备了本文所公开的保护剂组合物的另外两种变型。核酸保护剂C包括10%w/w的PEG和4.2%w/w的NaCl,其余为水。核酸保护剂D包括40%w/w的PEG和20%w/w的NaCl,其余为水。核酸保护剂组合物的酶抑制剂(即EDTA)组分单独在采血管中提供。
将来自单个健康供体的血液样本抽吸入3个单独的采血管(管1至3)中。
管1是BD EDTA采血管(加拿大米西索加,Becton Dickinson,BD EDTA(K2)管,Cat#366643),其含有8至10ml血液和约2ml核酸保护剂C。
管2是BD EDTA采血管(加拿大米西索加,Becton Dickinson,BD EDTA(K2)管,Cat#366643),其含有8至10ml血液和约1ml核酸保护剂D。
管3是Streck Cell-Free DNATMBCT管(美国奥马哈,Streck,Catalog#218962),其含有8至10ml血液。
通过颠倒混合所有管,然后将1mL的等份试样分配到Eppendorf管中并在室温下储存。从第1天、第7天、第13天、第22天、第30天开始,在每个时间点处理等份处理过的血液。在400x g(-2,000RPM)下离心15分钟分离血浆,然后将血浆转移到一个新管中。然后根据制造商说明书,使用Norgen的血浆/血清游离循环DNA纯化微量试剂盒(加拿大索罗德尔,NorgenBiotek,Cat#55500)从血浆样本中分离出DNA。
然后使用实时PCR扩增人5S rRNA基因来分析纯化的游离血浆DNA。具有一致Ct值的5S rRNA基因的扩增表明DNA在样本内得以保存并且没有发生细胞裂解。一旦发生过多的细胞裂解,就不能从样本中分离和采集血浆。因此,不能分离血浆DNA,也不会产生Ct值(标记为N/A)。
实时PCR的条件是:
实时PCR混合:
3μL的血浆DNA
10μL的Norgen的2X PCR Master Mix(加拿大索罗德尔,Norgen Biotek,Cat#28007)
0.12μL的5S正向引物(50μΜ)
0.12μL的5S反向引物(50μΜ)
0.03μL的100x Syber Green Mix(美国Hercules,BioRad公司,Catalog#170-8880)
6.73μL的水
20μL的PCR反应
实时PCR程序:
循环1:(1X)
步骤1:95.0℃,03:00
循环2:(45X)
步骤1:95.0℃,00:30
步骤2:64.0℃,00:30
步骤3:72.0℃,00:30
启用数据采集和实时分析。
循环3:(IX)
步骤1:57.0℃,01:00
循环4:(80X)
步骤1:57.0℃,00:10
在循环2后将设定温度提高0.5℃
启用熔解曲线数据采集和分析。
然后将来自每个时间点和3个不同管产生的Ct值(循环阈值)总结在表5中。在图5中还绘制了Ct值。如表5和图5所示,从第1天、第7天、第13天、第22天和第30天的一致Ct读数可证明,核酸保护剂C和核酸保护剂D保存样本长达30天。相反,可以看出,现有技术的Streck管在第13天后导致大量的细胞裂解,同样地不能分离出血浆并且不能分离出DNA。这些结果表明,与现有技术的Streck管相比,核酸保护剂C和核酸保护剂D强化了长期保存。
表5
实例4-掺入女性血样样本中的男性DNA保存的改善
将来自健康男性供体的10mL血液样本抽吸入3个单独的BD EDTA采血管(加拿大米西索加,Becton Dickinson,BD EDTA(K2)Tube Cat#366643)中。在1000×g下离心15分钟,然后将血浆转移到一个新的15cc管中,从3个血液样本中的每一个中分离血浆。将血浆再次在1000×g下离心15分钟,然后转移到一个新的15cc管中。将转移的血浆在3000×g下进一步离心15分钟,然后转移到一个新的15cc管中。最后,将回收的男性供体血浆在4000×g下再次离心15分钟,然后转移到一个新的15cc管中。合并从所有3个血液样本中回收的男性供体血浆,并通过温和颠倒混合。
将来自两名健康女性供体的血液样本抽吸入5个单独的采血管中,该采血管含有核酸保护剂A(保护剂A-女性供体1和保护剂A-女性供体2)和5个单独的Streck Cell-FreeDNATMBCT管(Streck-女性供体1和Streck-女性供体2)。
含有核酸保护剂A(参见实例1)的采血管是BD普通采血管(加拿大米西索加,Becton Dickinson,BDSerum Cat#366430),含有约1.5mL的核酸保护剂A。在采血后,将每个管填充至含有约9mL血液/核酸保护剂A。
在采血后,将每个Streck Cell-Free DNATMBCT管(美国奥马哈,Streck,Catalog#218962),填充至含有约9mL血液/Streck保护剂。
采血后,立即将所有管通过温和颠倒混合10次。在从两个健康女性供体采集的所有血液样本中加入1mL先前回收的男性供体血浆。所有的管通过温和颠倒混合。然后将所有20个管在室温下储存。
在每个时间点(第0天、第7天、第14天、第21天和第30天),通过在1000xg下离心15分钟,从每个核酸保护剂A管和Streck管中分离男性供体血浆,随后将血浆转移到一个新的15cc管中。然后将血浆在1000×g下离心15分钟,然后转移到一个新的15cc管中。将转移的血浆在3000×g下再次离心15分钟,然后转移到一个新的15cc管中。最后,将回收的血浆在4000×g下再次离心15分钟,然后转移到一个新的15cc管中。记录在每个时间点从所有管中回收的血浆体积(表6)。将从两个女性供体回收的所有血浆储存在-70℃直至cfDNA分离。
然后使用Norgen的血浆/血清游离循环DNA纯化Midi试剂盒(加拿大索罗德尔,Norgen Biotek,Cat#55600)或使用Norgen的血浆/血清游离循环DNA纯化Maxi试剂盒(加拿大索罗德尔,Norgen Biotek,Cat#55800)从每一个血浆样本中分离cfDNA,这取决于下表6中显示的血浆样本体积以及按照制造商的说明书。
表6。从血液样本中回收的血浆体积—之前采集到含有核酸保护剂A的采血管或StreckCell-Free DNATMBCT管中—来自在不同的储存时间点的女性供体1和女性供体2。
使用实时PCR扩增156bp的GAPDH基因来分析总纯化的游离血浆DNA的水平,而使用实时PCR扩增128bp的SRY基因来分析掺入的男性DNA的水平。在30天的保存期间,掺入的男性128bp的SRY基因和总cfDNA(以156bp的GAPDH基因为参照)的一致量表明掺入的男性DNA和内源性的女性cfDNA保存良好。女性cfDNA的量随着时间的增加表明细胞的裂解,因此保存不良。掺入的男性DNA量的减少表明:1)由于DNA降解导致保存不良或2)男性DNA已经被裂解细胞中gDNA的泄漏所掩盖,这将干扰掺入的男性DNA的检测。
此外,与30天保存期间的总DNA相比,掺入的男性128bp的SRY基因的一致百分比表明DNA在女性血浆样本中保存良好。与总DNA相比,掺入的男性128bp SRY基因的百分比减少表明DNA降解,因此保存不良。在30天保存期间,156bp GAPDH基因的一致量表明女性总cfDNA保存良好,没有细胞裂解的迹象。156bp GAPDH基因总量的增加表明细胞正在发生裂解。
实时PCR的条件是:
实时PCR混合:
5μL的血浆DNA
10μL的Norgen的2X PCR Master Mix(加拿大索罗德尔,Norgen Biotek,Cat#28007)
0.4μL的GAPDH引物Mix(25μΜ)
0.4μL的SRY引物Mix(25μΜ)
0.2μL的GAPDH TaqMan Hex-探针(25μΜ)
0.2μL的SRY TaqMan FAM-探针(25μΜ)
3.8μL的水
20μL的PCR反应
实时PCR程序:
循环1:(1X)
步骤1:95.0℃,03:00
循环2:(40X)
步骤1:95.0℃,00:15
步骤2:60.0℃,00:30
启用数据采集和实时分析。
掺入的男性128bp SRY基因的量绘制在图6中。如图6所示,从第0天、第7天、第14天、第21天和第30天的男性DNA的一致量可证明,核酸保护剂A以及Streck的DNA BCT管将女性血浆样本中掺入的男性128bp SRY基因维持在恒定量长达30天。这表明掺入的男性DNA在两个试管中都不随时间产生降解。
以156bp GAPDH基因为参照的总DNA量绘制在图7中。如图7所示,从第0天、第7天、第14天、第21天和第30天的女性总DNA的一致量可证明,核酸保护剂A将女性156bp GAPDH基因维持在恒定量长达30天。由于总DNA的量没有增加,这表明在含有核酸保护剂A的管中储存的样本中细胞没有裂解。相反,储存现有技术Streck管中的样本导致第7天之后总DNA量的增加,表明由女性血浆中gDNA的释放可证明样本保存不良。
掺入的男性128bp SRY基因的量占女性总cfDNA的百分比绘制在图8中。如图8所示,从第0天、第7天、第14天、第21天和第30天的男性DNA占女性总cfDNA的百分比的一致量可证明,核酸保护剂A将女性血浆样本中掺入的男性128bp SRY基因维持在恒定量长达30天。相反,储存现有技术Streck管中导致第7天之后男性DNA占女性总cfDNA的百分比减少。这些结果表明,与现有技术的Streck保护剂相比,核酸保护剂A强化了血浆中128bp SRY基因的长期保存并且防止了任何细胞的裂解,所述Streck保护剂在30天期间导致裂解以及总DNA的增加。
实例5-随时间测量采集的血液的溶血。
将来自三个健康供体的血液样本抽吸入5个单独的采血管(含有核酸保护剂A(参见实例1))、5个单独的Streck Cell-Free DNATMBCT管和5个单独的BDEDTA(K2)采血管中。
含有核酸保护剂A的血液管是BD普通采血管(加拿大米西索加,BectonDickinson,BDSerum Cat#366430),其含有约1.5mL的核酸保护剂A。在采血后,将每个管填充至含有约10mL血液/核酸保护剂A。
在采血后,每个Streck Cell-Free DNATMBCT管(美国奥马哈,Streck,Catalog#218962),含有约10mL血液/Streck保护剂。
在采血后,每个BD EDTA(K2)采血管(加拿大米西索加,Becton Dickinson,BDEDTA(K2)管,Cat#366643),含有约10mL血液。
将所有管通过温和颠倒混合10次,并在室温下储存30天。从第0天、第7天、第14天、第21天和第30天开始,在每个时间点处理血液样本。在450x g(-2,000RPM)下离心15分钟分离血浆,随后将血浆转移到一个新管中。
通过使用Nanodrop 2000/2000c(加拿大渥太华,Thermo Fisher Scientific)测量在几个时间点的414nm处的来自3个受试者的回收血浆中游离血红蛋白的吸收值来确定溶血。对于所有时间点,来自3个不同血管的单独的414nm吸收值在图9中示出(3个供体在每个时间点的平均值)。如图9所示,从含有核酸保护剂A的管中回收的血浆在室温下保存的整个30天内维持在非常低的游离血红蛋白水平,表明优良的保存和细胞裂解(溶血)的抑制。从Streck管回收的血浆在第14天开始显示高游离血红蛋白水平,表明细胞的裂解和保存不良,然而从EDTA管回收的血浆在第0天后即开始显示游离血红蛋白水平的增加。
实例6-环境温度储存对游离血浆DNA保存和gDNA污染的影响
将来自三个健康供体的血液样本抽吸入5个单独的采血管(含有核酸保护剂A(参见实例1))、5个单独的Streck Cell-Free DNATMBCT管和5个单独的BD EDTA(K2)采血管中。
含有核酸保护剂A的血液管是BD普通采血管(加拿大米西索加,BectonDickinson,BDSerum Cat#366430),其含有约1.5mL的核酸保护剂A。在采血后,每个管含有约10mL血液/核酸保护剂A。
在采血后,每个Streck Cell-Free DNATMBCT管(美国奥马哈,Streck,Catalog#218962),含有约10mL血液/Streck保护剂。
在采血后,每个BD EDTA(K2)采血管(加拿大米西索加,Becton Dickinson,BDEDTA(K2)管,Cat#366643),含有约10mL血液。
将所有管通过温和颠倒混合10次,并在室温下储存30天。从第0天、第7天、第14天、第21天和第30天开始,在每个时间点处理血液样本。在450xg(-2,000RPM)下离心15分钟分离血浆,随后将血浆转移到一个新管中。然后根据制造商说明书,使用Norgen的血浆/血清游离循环DNA纯化Mini试剂盒(加拿大索罗德尔,Norgen Biotek,Cat#55500)从每个0.5ml血浆样本中分离游离血浆DNA。
然后使用实时PCR扩增Alu115(cfDNA为参照)和Alu247(gDNA为参照)基因靶来分析纯化的游离血浆DNA。具有一致Ct值的短ALU基因靶(Alul15)和长ALU基因靶(Alu247)表明游离血浆DNA保存在样本内并且没有发生细胞裂解。Ct值的下降,特别是对于长ALU基因(Alu247),表明细胞的裂解并因此表明游离血浆DNA中gDNA的污染。
实时PCR混合:
3μL的血浆DNA
10μL的Norgen的2X PCR Master Mix(加拿大索罗德尔,Norgen Biotek,Cat#28007)
0.12μL的ALU正向引物(50μΜ)
0.12μL的ALU反向引物(50μΜ)
0.03μL的100x Syber Green Mix(美国Hercules,BioRad公司,Catalog#170-8880)
6.73μL的水
20μL的PCR反应
实时PCR程序:
循环1:(1X)
步骤1:95.0℃,03:00
循环2:(45X)
步骤1:95.0℃,00:30
步骤2:64.0℃,00:30
步骤3:72.0℃,00:30
启用数据采集和实时分析。
循环3:(IX)
步骤1:57.0℃,01:00
循环4:(80X)
步骤1:57.0℃,00:10
在循环2后将设定温度提高0.5℃
启用熔解曲线数据采集和分析。
在图10(对于Alu115)和图11(对于Alu247)中绘制了所有3个供体的3个不同管在每个时间点的平均值产生的平均Ct(循环阈值)值。从第0天、第7天、第14天、第21天和第30天的短ALU基因靶(Alul15-图10)和长ALU基因靶(Alu247-图11)的一致Ct读数可证明,核酸保护剂A将样本保存长达30天。相比之下,如通过短ALU基因靶(Alul15-图10)和长ALU基因靶(Alu247-图11)的Ct值显著降低所证明,在现有技术的Streck管中储存第14天后导致细胞裂解。至于从BD EDTA(K2)采血管中采集的血液样本中回收的血浆,如短ALU基因靶(Alul15-图11)和长ALU基因靶(Alu247-图11)的Ct值显著降低所证明,在采血后1-2天发生了明显的细胞裂解。
实例7-高温(37℃)储存8天对gDNA污染的影响
将来自三个健康供体的血液样本抽吸入5个单独的采血管(含有核酸保护剂A(参见实例1))、5个单独的Streck Cell-Free DNATMBCT管和5个单独的BD EDTA(K2)采血管中。
含有核酸保护剂A的血液管是BD普通采血管(加拿大米西索加,BectonDickinson,BDSerum Cat#366430),其含有约1.5mL的核酸保护剂A。在采血后,每个管含有约10mL血液/核酸保护剂A。
在采血后,每一个Streck Cell-Free DNATMBCT管(美国奥马哈,Streck,Catalog#218962),含有约10mL血液/Streck保护剂。
在采血后,每个BD EDTA(K2)采血管(加拿大米西索加,Becton Dickinson,BDEDTA(K2)管,Cat#366643),含有约10mL血液。
将所有管通过温和颠倒混合10次,并在37℃下储存8天。从第0天、第1天、第2天、第4天和第8天开始的每个时间点处理血液样本。在450x g(-2,000RPM)下离心15分钟分离血浆,随后将该血浆转移到一个新管中。使用Norgen的血浆/血清游离循环DNA纯化Mini试剂盒(加拿大索罗德尔,Norgen Biotek,Cat#55500)从每个0.5ml血浆样本中分离游离血浆DNA。
然后使用实时PCR扩增表示gDNA的长ALU基因(Alu247)来分析纯化的游离血浆DNA。具有一致Ct值的长ALU基因靶(Alu247)的扩增表明游离血浆DNA保存在样本内并且没有发生细胞裂解。Ct值的下降表明细胞的裂解,因此表明游离血浆DNA的gDNA污染。
实时PCR的条件是:
实时PCR混合:
3μL的血浆DNA
10μL的Norgen的2X PCR Master Mix(加拿大索罗德尔,Norgen Biotek,Cat#28007)
0.12μL的ALU正向引物(50μΜ)
0.12μL的ALU反向引物(50μΜ)
0.03μL的100x Syber Green Mix(美国Hercules,BioRad公司,Catalog#170-8880)
6.73μL的水
20μL的PCR反应
实时PCR程序:
循环1:(1X)
步骤1:95.0℃,03:00
循环2:(45X)
步骤1:95.0℃,00:30
步骤2:64.0℃,00:30
步骤3:72.0℃,00:30
启用数据采集和实时分析。
循环3:(IX)
步骤1:57.0℃,01:00
循环4:(80X)
步骤1:57.0℃,00:10
在循环2后将设定温度提高0.5℃
启用熔解曲线数据采集和分析。
在图12中绘制了所有3个供体的3个不同管在每个时间点的平均值产生的平均Ct(循环阈值)值。从第0天、第1天、第2天、第4天和第8天的长ALU基因靶(Alu247)的一致Ct读数可证明,核酸保护剂A在37℃下可将样本保存长达8天。相比之下,如通过长ALU基因靶(Alu247)的Ct值显著降低所证明,在现有技术的Streck管中储存第4天后导致细胞裂解。至于从BD EDTA(K2)采血管中采集的血液样本中回收的血浆,如通过第1天长ALU基因靶(Alu247)的Ct值显著降低所证明,在采血后几小时发生了显著细胞裂解。
实例8-使用安捷伦高灵敏度DNA试剂盒对纯化的游离血浆DNA进行质量评估
将来自健康女性供体的血液样本抽吸入含有核酸保护剂A(参见实例1)的5个单独的管和5个单独的Streck BCT DNA管中。
含有核酸保护剂A的血液管是BD普通采血管(加拿大米西索加,BectonDickinson,BDSerum Cat#366430),其含有约1.5mL的核酸保护剂A。在采血后,每个管含有约10mL血液/核酸保护剂A。
在采血后,每个Streck Cell-Free DNATMBCT管(美国奥马哈,Streck,Catalog#218962),含有约10mL血液/Streck核酸保护剂。
采血后,立即通过温和颠倒混合所有管10次。在每个时间点(第0天、第7天、第14天、第21天和第30天),通过在1000×g下离心15分钟将血浆从管中分离,随后将血浆转移到一个新的15cc管中。然后将血浆在1000×g下离心15分钟,之后转移到一个新的15cc管中。然后将转移的血浆再次在3000×g下离心15分钟,之后转移到一个新的15cc管中。最后,将回收的血浆在4000×g下再次离心15分钟,然后转移到一个新的15cc管中。在每个时间点从所有管中回收的血浆体积记录在表7中。将所有回收的血浆储存在-70℃直至cfDNA分离。
然后,使用Norgen的血浆/血清游离循环DNA纯化Midi试剂盒(加拿大索罗德尔,Norgen Biotek,Cat#55600)或Norgen的血浆/血清游离循环DNA纯化Maxi试剂盒(加拿大索罗德尔,Norgen Biotek,Cat#55800)从全部血浆样本中分离cfDNA,这取决于血浆样本体积(见表7)以及按照制造商的说明书。
表7。从血液样本中回收的血浆体积—之前采集到含有核酸防保护A的采血管或StreckCell-Free DNATMBCT管中—来自在不同的储存时间点的女性供体1和女性供体2。
在每个时间点(第0天、第7天、第14天、第21天和第30天)从血浆样本中纯化的游离血浆DNA的质量通过使用安捷伦高灵敏度DNA试剂盒(美国圣克拉拉,AliglentTechnologies,Cat#.5067-4626)分析1μL洗脱液来进行评价。大小范围在170-185bp之间的单个核小体峰的出现代表了通常存在于血浆样本中的cfDNA。具有比先前提到的核小体大小范围更大尺寸的其它峰的出现表明存在由细胞裂解产生的凋亡gDNA片段,因此表明样本保存不良。此外,核小体峰在170-185bp处的大小的减小,或峰分布的变化,也表明由于DNA降解或gDNA片段污染导致样本保存不良。
核酸保护剂A有助于防止高分子量gDNA释放到血浆中,同时也最小化从死亡的外周血白细胞中污染性凋亡梯的积累。如图12的图A、C、E、G和I所示,从含有核酸保护剂A并在室温下储存30天的管中回收的血浆维持单个核小体峰(由实心圆圈表示)。对于这些样本,没有gDNA污染的迹象(例如,凋亡DNA梯的释放)。因此,零时刻存在于血浆中的原始游离DNA在30天内保持不降解或受到gDNA的污染。相反,如图12的第B幅、第D幅、第F幅、第H幅和第J幅所示,在现有技术的Streck管中室温下储存14天后导致细胞裂解和凋亡DNA梯的释放(如虚线中的峰所示),以及在零时刻170-185bp处原始峰中存在的DNA量的增加(如实心圆圈所示)。
实例9-当使用不同比例的PEG与NaCl时,保存游离血浆DNA长达28天
制备了本文所公开的保护剂组合物的五种不同变型,每种都具有不同的PEG:NaCl比例。
核酸保护剂E包括25%w/w的PEG;7.5%w/w的NaCl;2%w/w的EDTA;0.023%w/w的叠氮化钠,其余为水。PEG:NaCl的比例约为3:1。
核酸保护剂F包括26%w/w的PEG;6.5%w/w的NaCl;2%w/w的EDTA;0.023%w/w的叠氮化钠,其余为水。PEG:NaCl的比例约为4:1。
核酸保护剂G包括27%w/w的PEG;5.5%w/w的NaCl;2%w/w的EDTA;0.023%w/w的叠氮化钠,其余为水。PEG:NaCl的比例约为5:1。
核酸保护剂H包括28%w/w的PEG;4.5%w/w的NaCl;2%w/w的EDTA;0.023%w/w的叠氮化钠,其余为水。PEG:NaCl的比例约为6:1。
核酸保护剂H包括29%w/w的PEG;3.5%w/w的NaCl;2%w/w的EDTA;0.023%w/w的叠氮化钠,其余为水。PEG:NaCl的比例约为8:1。
将来自单个健康供体的血液样本抽吸入5个单独的采血管(管1-5)中。
管1是BD普通采血管(加拿大米西索加,Becton Dickinson,BDSerum,Cat#366430),其含有8-9ml血液和约1.5-2mL核酸保护剂E。
管2是BD普通采血管(加拿大米西索加,Becton Dickinson,BDSerum,Cat#366430),含有8-9ml血液和约1.5-2mL核酸保护剂F。
管3是BD普通采血管(加拿大米西索加,Becton Dickinson,BDSerum,Cat#366430),含有8-9ml血液和约1.5-2mL核酸保护剂G。
管4是BD普通采血管(加拿大米西索加,Becton Dickinson,BDSerum,Cat#366430),含有8-9ml血液和约1.5-2mL核酸保护剂H。
管5是BD普通采血管(加拿大米西索加,Becton Dickinson,BDSerum,Cat#366430),含有8-9ml血液和约1.5-2mL核酸保护剂I。
在采血后,将所有管通过颠倒混合10次并置于室温下。从每个管中取出保存血液的初始等份试样以表示零时间,并且在第10天和第28天之后从管1至5中取出保存血液的等份试样用于取样。在400x g(-2,000RPM)下离心15分钟分离血浆,随后将1mL血浆转移到一个新管中。将回收的1mL血浆分成两个0.5mL级分,然后按照制造商说明书使用Norgen的血浆/血清游离循环DNA微量纯化试剂盒(加拿大索罗德尔,Norgen Biotek,Cat#55100)从两份重复的0.5mL级分中分离游离血浆DNA。
使用实时PCR扩增156bp GAPDH基因靶来分析总纯化的游离血浆DNA的水平。每种保护剂在每个时间点产生平均Ct(循环阈值)值。一致的Ct值表明在28天保存期内血浆样本中的总cfDNA的一致量,以GAPDH基因为参照。因此,一致的Ct值表明cfDNA保存良好。如果在储存期间发生细胞裂解,那么以GAPDH基因为参照的cfDNA的总量将随时间增加,并且Ct值将相应地降低。因此,cfDNA总量随时间的增加表明样本保存不良。
实时PCR的条件是:
实时PCR混合:
5μL的血浆DNA
10μL的Norgen的2X PCR Master Mix(加拿大索罗德尔,Norgen Biotek,Cat#28007)
0.4μL的GAPDH引物Mix(25μΜ)
0.2μL的GAPDH TaqMan Hex-探针(25μΜ)
4.4μL的水
20μL的PCR反应
实时PCR程序:
循环1:(1X)
步骤1:95.0℃,03:00
循环2:(40X)
步骤1:95.0℃,00:15
步骤2:60.0℃,00:30
启用数据采集和实时分析。
测定每种保护剂在每个时间点产生的平均Ct(循环阈值)值并绘制在图14中。如上所述,如果样本中的总cfDNA已受到保护,那么Ct值将在28天内保持一致。如果样本未被保护并且已经发生细胞裂解,那么GAPDH的量将增加并且Ct值将降低。如图14所示,用具有不同PEG:NaCl比例的每种不同保护剂处理的样本显示恒定量的GAPDH基因长达28天。这些结果显示,使用本文公开的含有不同比例PEG和NaCl的保护剂组合物可以实现有效保存。
实例10-当使用不同比例的PEG衍生物时,保存游离血浆DNA长达30天
使用PEG 2000、PEG 4000、PEG 6000或PEG 8000制备四种不同的核酸保护剂A(参见实例1)。
将来自单个健康供体的血液样本抽吸入4个单独的采血管(管1-4)中。
管1是BD普通采血管(加拿大米西索加,Becton Dickinson,BDSerum,Cat#366430),其含有8-9ml血液和约1.5-2mL用PEG 2000制备的核酸保护剂。
管2是BD普通采血管(加拿大米西索加,Becton Dickinson,BDSerum,Cat#366430),其含有8-9ml血液和约1.5-2mL用PEG 4000制备的核酸保护剂。
管3是BD普通采血管(加拿大米西索加,Becton Dickinson,BDSerum,Cat#366430),其含有8-9ml血液和约1.5-2mL用PEG 6000制备的核酸保护剂。
管4是BD普通采血管(加拿大米西索加,Becton Dickinson,BDSerum,Cat#366430),其含有8-9ml血液和约1.5-2mL用PEG 8000制备的核酸保护剂。
采血后,将所有管通过颠倒混合10次并置于室温下。从每个管中取出保存血液的初始等份试样以表示零时刻,并且在第10天、第20天和第30天之后从管1至4中取出保存血液的等份试样用于取样。在400x g(-2,000RPM)下离心15分钟分离血浆,随后将1mL血浆转移到一个新管中。将回收的1mL血浆分成两个0.5mL级分,然后按照制造商说明书使用Norgen的血浆/血清游离循环DNA纯化Mini试剂盒(加拿大索罗德尔,Norgen Biotek,Cat#55100)在每个时间点从两份重复的0.5mL级分中分离游离血浆DNA。
使用实时PCR扩增156bp GAPDH基因靶来分析总纯化的游离血浆DNA的水平。测定每种保护剂在每个时间点产生的平均Ct(循环阈值)值。如先前提到的,一致的Ct值表明在30天保存期内血浆样本中的总cfDNA的一致量,以GAPDH基因为参照。因此,一致的Ct值表明cfDNA保存良好。如果在储存期间发生细胞裂解,那么以GAPDH基因为参照的cfDNA的总量将随时间增加,并且Ct值将相应地降低。因此,cfDNA总量随时间的增加表明样本保存不良。
实时PCR的条件是:
实时PCR混合:
5μL的血浆DNA
10μL的Norgen的2X PCR Master Mix(加拿大索罗德尔,Norgen Biotek,Cat#28007)
0.4μL的GAPDH引物Mix(25μΜ)
0.2μL的GAPDH TaqMan Hex-探针(25μΜ)
4.4μL的水
20μL的PCR反应
实时PCR程序:
循环1:(1X)
步骤1:95.0℃,03:00
循环2:(40X)
步骤1:95.0℃,00:15
步骤2:60.0℃,00:30
启用数据采集和实时分析。
测定每种保护剂在每个时间点产生的平均Ct(循环阈值)值并绘制在图15中。如上所述,如果样本中的总cfDNA已受到保护,那么Ct值将在30天内保持一致。如果在储存期间发生细胞裂解,那么以GAPDH基因为参照的cfDNA的总量将随时间增加,并且Ct值将相应地降低。如图15所示,用含有不同PEG衍生物的每种不同保护剂处理的样本显示恒定量的GAPDH基因长达30天。这些结果显示,使用本文公开的含有不同分子量的PEG的保护剂组合物可以实现有效保存。
Claims (70)
1.一种组合物,其包括:
至少一种可排除体积的聚合物,其中至少一种可排除体积的所述聚合物按所述组合物的重量计的重量百分比为约10%至约50%;
至少一种渗透剂,其中至少一种所述渗透剂按所述组合物的重量计的重量百分比为约1%至约20%,以及
至少一种酶抑制剂,其中至少一种所述酶抑制剂按所述组合物的重量计的重量百分比为约1%至约30%。
2.根据权利要求2所述的组合物,其中至少一种可排除体积的所述聚合物按所述组合物的重量计的重量百分比为约10%至约40%。
3.根据权利要求1或2的所述组合物,其中至少一种可排除体积的所述聚合物是聚乙二醇。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物,其中至少一种所述渗透剂是NaCl。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物,其中至少一种所述酶抑制剂是EDTA。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物,其中至少一种所述酶抑制剂是柠檬酸盐。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的组合物,还含有代谢抑制剂,其中所述代谢抑制剂按所述组合物的重量计的重量百分比为约0.01%至约10%。
8.根据权利要求7所述的组合物,其中所述代谢抑制剂是叠氮化钠。
9.根据权利要求7所述的组合物,其中,
至少一种可排除体积的所述聚合物是PEG,其中所述PEG按所述组合物的重量计的重量百分比为约10%至约50%;
至少一种所述渗透剂是NaCl,其中所述NaCl按所述组合物的重量计的重量百分比为约1%至约20%;
至少一种所述酶抑制剂是EDTA或柠檬酸盐,其中所述EDTA或柠檬酸盐按所述组合物的重量计的重量百分比为约1%至约30%;以及
所述代谢抑制剂是叠氮化钠,其中所述叠氮化钠按所述组合物的重量计的重量百分比为约0.01%至约10%。
10.一种用于保存生物样本中的核酸的方法,包括以下所述步骤:
提供一种组合物,其含有:
至少一种可排除体积的聚合物,其中至少一种可排除体积的所述聚合物按所述组合物的重量计的重量百分比为约10%至约50%;
至少一种渗透剂,其中至少一种所述渗透剂按所述组合物的重量计的重量百分比为约1%至约20%;
至少一种酶抑制剂,其中至少一种所述酶抑制剂按所述组合物的重量计的重量百分比为约1%至约30%;以及使所述生物样本与所述组合物接触,以提供处理过的样本。
11.根据权利要求10所述的方法,其中至少一种可排除体积的所述聚合物按所述组合物的重量计的重量百分比为约10%至约40%。
12.根据权利要求10或11所述的方法,其中至少一种可排除体积的所述聚合物是聚乙二醇。
13.根据权利要求10至12中任一项所述的方法,其中至少一种所述渗透剂是NaCl。
14.根据权利要求10至13中任一项所述的方法,其中至少一种所述酶抑制剂是EDTA或柠檬酸盐。
15.根据权利要求10至14中任一项所述的方法,其中所述组合物还含有代谢抑制剂,且其中所述代谢抑制剂按所述组合物的重量计的重量百分比为约0.01%至约10%。
16.根据权利要求15所述的方法,其中所述代谢抑制剂是叠氮化钠。
17.根据权利要求15所述的方法,其中
至少一种可排除体积的所述聚合物是PEG,其中所述PEG按所述组合物的重量计的重量百分比为约10%至约50%;
至少一种所述渗透剂是NaCl,其中所述NaCl按所述组合物的重量计的重量百分比为约1%至约20%;
至少一种所述酶抑制剂是EDTA或柠檬酸盐,其中所述EDTA或柠檬酸盐量按所述组合物的重量计的重量百分比为约1%至约30%;以及
所述代谢抑制剂是叠氮化钠,其中所述叠氮化钠按所述组合物的重量计的重量百分比为约0.01%至约10%。
18.一种用于保存生物样本中的核酸的方法,其包括:
使所述生物样本按任何顺序或同时接触至少一种可排除体积的聚合物、至少一种渗透剂和至少一种酶抑制剂,以提供处理过的样本,
其中至少一种可排除体积的所述聚合物按所述处理过的样本总重量计的重量百分比为约2%至约10%w/w;
其中至少一种所述渗透剂按所述处理过的样本重量的重量百分比为约0.2%至约4%w/w;以及
其中至少一种所述酶抑制剂按所述处理过的样本总重量的重量百分比为约0.002%至约2%w/w。
19.根据权利要求18所述的方法,其中至少一种可排除体积的所述聚合物是聚乙二醇。
20.根据权利要求18或19所述的方法,其中至少一种所述渗透剂是NaCl。
21.根据权利要求18至20中任一项所述的方法,其中至少一种所述酶抑制剂是EDTA或柠檬酸盐。
22.根据权利要求18至21中任一项所述的方法,其中首先通过将所述生物样本采集到含有至少一种所述酶抑制剂的容器中来使所述生物样本与至少一种所述酶抑制剂接触,然后将至少一种可排除体积的所述聚合物和至少一种所述渗透剂加入到含有所述生物样本和所述酶抑制剂的所述容器中,以提供所述处理过的样本。
23.根据权利要求22所述的方法,其中所述容器是采血管。
24.根据权利要求18至23中任一项所述的方法,其中所述方法还包括使所述生物样本与一种代谢抑制剂接触,并且其中所述代谢抑制剂按处理过的样本总重量计的重量百分比为约0.002%至约2%w/w。
25.根据权利要求24所述的方法,其中所述代谢抑制剂是叠氮化钠。
26.根据权利要求10至25中任一项所述的方法,其中所述生物样本是生物液体。
27.根据权利要求26所述的方法,其中所述生物液体是血液、血浆、血清、尿液、唾液、粪便、乳汁、泪液、汗液、脑脊液、滑液、精液、阴道液、腹水、羊水或细胞培养基。
28.根据权利要求26所述的方法,其中所述生物液体是全血。
29.根据权利要求10至28中任一项所述的方法,其中所述核酸是游离RNA、游离DNA或其组合。
30.根据权利要求29所述的方法,其中所述游离DNA是从血液中分离的。
31.根据权利要求30所述的方法,其中所述游离DNA是游离血浆DNA。
32.根据权利要求10-31中任一项所述的方法,其中将所述处理过的样本储存至少1天、至少7天、至少14天、至少21天、至少28天或至少40天。
33.根据权利要求32所述的方法,其中至少一部分储存期在环境温度下发生。
34.根据权利要求10至33中任一项所述的方法,还包括从所述生物样本中分离所述核酸的步骤。
35.根据权利要求34所述的方法,其中分离的所述核酸用于下游分析。
36.根据权利要求35所述的方法,其中所述下游分析用于诊断疾病或感染或用于监测疾病或感染。
37.一种用于保存生物样本中的细胞的方法,其包括以下步骤:
提供一种组合物,其包括:
至少一种可排除体积的聚合物,其中至少一种可排除体积的所述聚合物按所述组合物的重量计的重量百分比为约10%至约50%;
至少一种渗透剂,其中至少一种所述渗透剂按所述组合物的重量计的重量百分比为约1%至约20%;
至少一种酶抑制剂,其中至少一种所述酶抑制剂按所述组合物的重量计的重量百分比为约1%至约30%;以及
使所述生物样本与所述保护剂组合物接触,以提供处理过的样本。
38.根据权利要求37所述的方法,其中至少一种可排除体积的所述聚合物按所述组合物的重量计的重量百分比为约10%至约40%。
39.根据权利要求37或38所述的方法,其中至少一种可排除体积的所述聚合物是聚乙二醇。
40.根据权利要求37至39中任一项所述的方法,其中至少一种所述渗透剂是NaCl。
41.根据权利要求37-40中任一项所述的方法,其中至少一种所述酶抑制剂是EDTA或柠檬酸盐。
42.根据权利要求37至41中任一项所述的方法,其中所述组合物还含有一种代谢抑制剂,且其中所述代谢抑制剂按所述组合物的重量计的重量百分比为约0.01%至约10%。
43.根据权利要求42所述的方法,其中所述代谢抑制剂是叠氮化钠。
44.根据权利要求42所述的方法,其中
至少一种可排除体积的所述聚合物是PEG,其中所述PEG按所述组合物的重量计的重量百分比为约10%至约50%;
至少一种所述渗透剂是NaCl,其中所述NaCl按所述组合物的重量计的重量百分比为约1%至约20%;
至少一种所述酶抑制剂是EDTA或柠檬酸盐,其中所述EDTA或柠檬酸盐按所述组合物的重量计的重量百分比为约1%至约30%;以及
所述代谢抑制剂是叠氮化钠,其中所述叠氮化钠按所述组合物的重量计的重量百分比为约0.01%至约10%。
45.一种保存生物样本中细胞的方法,其包括:
使所述生物样本按任何顺序或同时接触至少一种可排除体积的聚合物、至少一种渗透剂和至少一种酶抑制剂,以提供处理过的样本;
其中至少一种可排除体积的所述聚合物按所述处理过的样本总重量计的重量百分比为约2%至约10%w/w;
其中至少一种所述渗透剂按所述处理过的样本总重量计的重量百分比为约0.2%至约4%w/w;以及
其中至少一种所述酶抑制剂按所述处理过的样本总重量计的重量百分比为约0.2%至约6%w/w。
46.根据权利要求45所述的方法,其中至少一种可排除体积的所述聚合物是聚乙二醇。
47.根据权利要求45或46所述的方法,其中至少一种所述渗透剂是NaCl。
48.根据权利要求45-46中任一项所述的方法,其中至少一种所述酶抑制剂是EDTA或柠檬酸盐。
49.根据权利要求45-48中任一项所述的方法,其中首先通过将所述生物样本采集到含有至少一种所述酶抑制剂的容器中来使所述生物样本与至少一种所述酶抑制剂接触,然后将至少一种可排除体积的所述聚合物和至少一种所述渗透剂加入到含有所述生物样本和所述酶抑制剂的所述容器中,以提供所述处理过的样本。
50.根据权利要求49所述的方法,其中所述容器是采血管。
51.根据权利要求45-50中任一项所述的方法,其中所述方法还包括使所述生物样本与一种代谢抑制剂接触,并且其中所述代谢抑制剂按所述处理过的样本总重量计的重量百分比为约0.002%至约2%w/w。
52.权利要求51所述的方法,其中所述代谢抑制剂是叠氮化钠。
53.根据权利要求37至52中任一项所述的方法,其中所述生物样本是生物液体。
54.根据权利要求53所述的方法,其中所述生物液体是血液、血浆、血清、尿液、唾液、粪便、乳汁、泪液、汗液、脑脊液、滑液、精液、阴道液、腹水、羊水或细胞培养基。
55.根据权利要求53所述的方法,其中所述生物液体是全血。
56.根据权利要求54所述的方法,其中所述生物液体包括肿瘤细胞。
57.根据权利要求37-56中任一项所述的方法,其中将所述处理过的样本储存至少1天、至少7天、至少14天、至少21天、至少28天或至少40天。
58.根据权利要求57所述的方法,其中至少一部分储存期在环境温度下发生。
59.一种试剂盒,其包括:
根据权利要求1至9中任一项所述的组合物;以及
将所述组合物与生物样本组合以提供处理过的样本的说明书。
60.根据权利要求59所述的试剂盒,其中所述生物样本是血液样本,并且其中所述试剂盒还包括采血管。
61.一种试剂盒,其包括:
至少一种可排除体积的聚合物;
至少一种渗透剂;以及
按以下任何顺序或同时将至少一种可排除体积的聚合物和至少一种渗透剂与生物样本和至少一种酶抑制剂组合以提供处理过的样本的说明书;
其中至少一种可排除体积的所述聚合物按所述处理过的样本总重量计的重量百分比为约2%至约10%w/w;
其中至少一种所述渗透剂按所述处理过的样本总重量计的重量百分比为约0.2%至约4%w/w;以及
其中至少一种所述酶抑制剂按所述处理过的样本总重量计的重量百分比为约0.2%至约6%w/w。
62.根据权利要求61所述的试剂盒,其中至少一种可排除体积的所述聚合物是聚乙二醇。
63.根据权利要求61或62所述的试剂盒,其中至少一种所述渗透剂是NaCl。
64.根据权利要求61至63中任一项所述的试剂盒,其中至少一种所述酶抑制剂是EDTA或柠檬酸盐。
65.根据权利要求61至64中任一项所述的试剂盒,其中至少一种可排除体积的所述聚合物和至少一种所述渗透剂作为组合物来提供。
66.根据权利要求61至65中任一项所述的试剂盒,其中所述生物样本是血液样本,并且其中所述试剂盒还包括含有至少一种所述酶抑制剂的采血管。
67.根据权利要求61至66中任一项所述的试剂盒,其中所述试剂盒还包括代谢抑制剂,并且其中所述代谢抑制剂按所述处理过的样本总重量计的重量百分比为约0.002%至约2%w/w。
68.权利要求65所述的试剂盒,其中所述代谢抑制剂是叠氮化钠。
69.根据权利要求61至68中任一项所述的试剂盒在用于保存生物样本中的核酸的用途。
70.根据权利要求61至68中任一项所述的试剂盒在用于保存生物样本中的细胞的用途。
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