CN113455495A - 一种肿瘤组织dna和rna保存液 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种生物样本保存液，尤其涉及一种肿瘤组织DNA和RNA保存液；本发明的肿瘤组织DNA和RNA保存液，其中溶解有0.05‑0.15mol/L的乙二胺四乙酸二钠(EDTA‑2Na)、0.15‑0.30g/L的异硫氰酸胍、氯化钠（NaCl）、以及体积分数为9‑15%的二甲基亚砜（DMSO），并调节pH至6.0‑9.0；本发明的肿瘤组织DNA和RNA保存液，适用于常温下保存肿瘤组织样品、操作简单、适用性较好、可应用于大规模样品检测。

Description

一种肿瘤组织DNA和RNA保存液
技术领域
本发明涉及一种生物样本保存液，尤其涉及一种肿瘤组织DNA和RNA保存液。
背景技术
肿瘤疾病已经成为威胁人类健康的重要疾病之一，恶性肿瘤造成的死亡人数仅次于心脑血管疾病居第二位。随着科技的发展，各种靶向药物的开发及新的治疗手段的出现，肿瘤疾病已经被认为是一种慢性疾病，可以通过现有的治疗做到有效的控制。但是由于人类个体之间的差异及肿瘤异质性的原因，患者对药物的反应不尽相同，造成很多不必要或者无效的治疗，甚至延误治疗时机。分子诊断技术的进步，特别是以qPCR和NGS技术为代表的基因检测技术的发展，使个性化诊疗得以实现，精准用药成为肿瘤治疗的基本要求。
基因检测技术是检测人的核酸（DNA/RNA）信息，从而识别基因变异，指导用药或者辅助临床诊断的技术。对DNA和RNA质量的要求很高。目前临床上最常用的肿瘤组织保存方法为石蜡包埋技术，但是该方法对核酸有破坏作用，特别是严重破坏RNA；而直接低温保存，如：液氮保存，可以很好的保存DNA和RNA，但是这种方法有较大的限制性：一是采用低温保存成本较高；二是体现在对于特殊设备的需求上，例如液氮罐，不适合医院使用。
目前已有技术用于组织的常温保存，例如：中国专利发布号CN201510445725的发明专利，公开了一种用于常温条件下长期保存和运输组织样本的核酸保护液，但该专利所述的保存液仅保护DNA，且保护的组织为人和除人以外的哺乳动物的神经细胞瘤组织，适用范围有限，具有使用局限性。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种适用于常温下保存肿瘤组织、常温下保护肿瘤组织中DNA和RNA的完整性、操作简单、适用性较好、可应用于大规模样品检测的肿瘤组织DNA和RNA保存液。
本发明的肿瘤组织DNA和RNA保存液，其中溶解有0.05-0.15mol/L的乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)、0.15-0.30g/L的异硫氰酸胍、氯化钠（NaCl）、以及体积分数为9-15%的二甲基亚砜（DMSO），并调节pH至6.0-9.0。
进一步的，所述保存液中溶解有0.2-0.3mol/L的乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）。
具体的，所述保存液中溶解有0.25mol/L的乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）。
进一步的，所述保存液中溶解有0.15-0.25g/L的异硫氰酸胍。
具体的，所述保存液中溶解有有0.215g/L的异硫氰酸胍。
进一步的，所述保存液中溶解有饱和氯化钠（NaCl）。
进一步的，所述保存液中溶解有质量分数为10-13%的二甲基亚砜（DMSO）。
具体的，所述保存液中溶解有质量分数为12%的二甲基亚砜（DMSO）。
进一步的，所述保存液调节pH至7.0-9.0。
具体的，所述保存液调节pH至8.0。
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：按照以上配方配制保存液，将采集的肿瘤组织直接置于保存液中，无需冻存，即可达到保护其中的DNA和RNA不发生降解。使用该配方保存肿瘤组织，可以在常温下达到冻存肿瘤组织的效果，从而使采样者在任何时候都可以进行采样和样品的保存，也能够用于肿瘤组织的长途运输。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
图1是人非小细胞肺癌组织、肝癌组织、胃癌组织、直肠癌组织使用实施例1制备得到的DNA和RNA常温保护液在常温下保存3周后提取的DNA和人非小细胞肺癌组织、肝癌组织、胃癌组织、直肠癌组织冷冻保存3周的组织提取的DNA进行琼脂糖凝胶电泳获得的电泳对比图，其中M1道是电泳Marker，1道是人非小细胞肺癌组织使用实施例1制备得到的DNA和RNA常温保护液在常温下保存3周后提取的DNA，2道是人非小细胞肺癌组织冷冻保存3周的组织提取的DNA，3道是人肝癌组织使用实施例1制备得到的DNA和RNA常温保护液在常温下保存3周后提取的DNA，4道是人肝癌组织冷冻保存3周的组织提取的DNA，5道是人胃癌组织使用实施例1制备得到的DNA和RNA常温保护液在常温下保存3周后提取的DNA，6道是人胃癌组织冷冻保存3周的组织提取的DNA，7道是人直肠癌组织使用实施例1制备得到的DNA和RNA常温保护液在常温下保存3周后提取的DNA，8道是人直肠癌组织冷冻保存3周的组织提取的DNA。
图2是人非小细胞肺癌组织使用实施例1制备得到的DNA和RNA常温保护液在常温下保存3周后提取的RNA进行Agilent2200Tapestation毛细管电泳获得的结果图。
图3是人非小细胞肺癌组织冷冻保存3周的组织提取的RNA进行琼脂糖凝胶电泳获得的电泳对比图，其中M1道是电泳Marker，进行Agilent2200Tapestation毛细管电泳获得的结果图。
图4是人非小细胞肺癌组织使用实施例1制备得到的DNA和RNA常温保护液在常温下保存3周后提取的RNA和人非小细胞肺癌组织冷冻保存3周的组织提取的RNA进行琼脂糖凝胶电泳获得的电泳对比图，其中M1道是电泳Marker，1道是人非小细胞肺癌组织使用实施例1制备得到的DNA和RNA常温保护液在常温下保存3周后提取的RNA，2道是人非小细胞肺癌组织冷冻保存3周的组织提取的RNA。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例一。
1.按照表1成分组成配置DNA和RNA保存液。
表1
乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na) 0.25mol/L
异硫氰酸胍 0.215g/L
二甲基亚砜(DMSO) 12％
饱和氯化钠(NaCl) 饱和
pH 7.0-8.0
2.配置好的保存液置于高压蒸汽灭菌锅中，压力为103.4kPa（1.05kg/cm2），温度为121.3°C条件下，灭菌25分钟。
实施例二：
1.将手术切除的新鲜非小细胞肺癌组织、肝癌组织、胃癌组织、直肠癌组织，分成2份，一份立即放入实施例1配置的保存液中，常温下储存3周；一份立即冷冻，然后-80℃冰箱保存3周。
2.分别使用步骤1获得的、经过3周保存的小细胞肺癌组织、肝癌组织、胃癌组织、直肠癌组织进行DNA提取，并与立即冷冻，然后-80℃冰箱保存3周提取的DNA进行对比。DNA提取均按照如下方案进行：
(1)取组织20mg；
(2)加入180μl Buffer ATL ,使用Tissuelyser进行组织匀浆后再加入20ul蛋白酶K，混匀，56℃消化1-3h或直至消化完全；
(3)向步骤(2)所得消化后的样本中加入4μl RNase A(Takara ,10mg/ml)，上下颠倒混匀后，常温消化2mins；
(4)向步骤(3)所得的消化后的样本加入200μl Buffer AL，用移液枪吸打混匀，再加入200μl乙醇(96％-100％)混匀，用移液枪吸打混匀后得混合液；
(5)转移混合液到过滤柱Spin column，采用2ml收集管，8000rpm离1min，弃滤液，换一新2ml收集管；
(6)加500μlBuffer AW1到过滤柱中，8000rpm离1min，弃滤液，换一新2ml收集管；
(7)加500μlBuffer AW2到过滤柱中，涡旋混匀15s，14000rpm离3min，弃滤液及旧收集管；
(8)将过滤柱转移至新1 .5ml离心管，100μlBuffer AE温室孵育1min，14000rpm离心1min洗脱；
(9)进行gDNA定量。
3.结果：
(1)冷冻保存3周的小细胞肺癌组织所提取DNA的A260与A280的比值为1 .95，A260与A230的比值为2 .21；浓度[Nanodrop]320 .5ng/ul；总量30ug。保存液常温保存3周的非小细胞肺癌组织所提取DNA的A260与A280的比值为1 .82，A260与A230的比值为2 .42；浓度[Nanodrop] 295 .1ng/ul；总量29ug。
(2)冷冻保存3周的肝癌组织所提取DNA的A260与A280的比值为1 .85，A260与A230的比值为2 .32；浓度[Nanodrop]430 .5ng/ul；总量40ug。保存液常温保存3周的肝癌组织所提取DNA的A260与A280的比值为1 .82，A260与A230的比值为2 .61；浓度[Nanodrop] 345.1ng/ul；总量35ug。
(3)冷冻保存3周的胃癌组织所提取DNA的A260与A280的比值为1 .89，A260与A230的比值为2 .51；浓度[Nanodrop]370 .5ng/ul；总量37ug。保存液常温保存3周的胃癌组织所提取DNA的A260与A280的比值为1 .75，A260与A230的比值为2 .53；浓度[Nanodrop] 336.1ng/ul；总量33ug。冷冻保存3周的直肠癌组织所提取DNA的A260与A280的比值为1 .77，A260与A230的比值为2 .41；浓度[Nanodrop] 240 .5ng/ul；总量24ug。保存液常温保存3周的直肠癌组织所提取DNA的A260与A280的比值为1 .78，A260与A230的比值为2 .53；浓度[Nanodrop] 234 .1ng/ul；总量23ug.
(4)将冷冻保存3周的肿瘤组织和保存液常温保存3周的肿瘤组织所提取的DNA进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果请见图1。
实施例三：
1.将手术切除的新鲜小细胞肺癌组织分成2份，一份立即放入实施例1配置的保存液中，常温下储存3周；一份立即冷冻，然后-80℃冰箱保存3周。
2.分别使用步骤1获得的、经过3周保存的小细胞肺癌组织进行RNA提取，并与立即冷冻，然后-80℃冰箱保存3周提取的RNA进行对比。RNA提取均按照如下方案进行：
(1)取组织20mg；
(2)匀浆处理： 向20 mg组织加300 μl裂解液RL，用研磨杵将组织彻底研磨；
(3)随后向匀浆液 中加入590 μl RNase-Free ddH2O和10 μl Proteinase K，混匀后56℃处理10-20 min；
(4)12,000 rpm离心5 min，取上清进行以下操作；
(5)缓慢加入0.5倍上清体积无水乙醇混匀，得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中12,000 rpm离心60 sec，弃掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中；
(6)向吸附柱CR3中加入350 μl 去蛋白液RW1，12,000 rpm离心60 sec，弃废液，将吸附柱放回收集管中；
(7)向吸附柱CR3中央加入80 μl的DNase I工作液，室温放置15 min；
(8)向吸附柱CR3中加入350 μl去蛋白液RW1，12,000 rpm离心60 sec，弃废液，将吸附柱放回收集管中；
(9)向吸附柱CR3中加入500 μl漂洗液RW，室温静置2 min，12,000 rpm离心60sec，弃废液，将吸附柱CR3放回收集管中；
(10)重复步骤8；
(11)12,000 rpm离心2 min，倒掉废液，将吸附柱CR3置于室温放置5分钟；
(12)将吸附柱CR3转入一个新的RNase-Free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30- 100 μl RNase-Free ddH2O，室温放置2 min，12,000 rpm离心2 min，得到 RNA溶液；
(13)进行RNA定量。
3.结果：
(1)将冷冻保存3周的肿瘤组织和保存液常温保存3周的肿瘤组织所提取的RNA进行Agilent 2200Tapestation毛细管电泳，结果见图2-图3。
(2)将冷冻保存3周的肿瘤组织和保存液常温保存3周的肿瘤组织所提取的RNA进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果请见图4。
本申请中无需保证组织样品中的细胞存活，只需保证经过保存后的组织样品中能提取出稳定、质量有保障的核酸即可。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种肿瘤组织DNA和RNA保存液，其特征在于：其中溶解有0.15-0.35mol/L的乙二胺四乙酸二钠、0.15-0.30g/L的异硫氰酸胍、氯化钠、以及体积分数为9-15%的二甲基亚砜，并调节pH至6.0-9.0。
2.根据权利要求1所述的肿瘤组织DNA和RNA保存液，其特征在于：所述保存液中溶解有0.2-0.3mol/L的乙二胺四乙酸二钠。
3.根据权利要求2所述的肿瘤组织DNA和RNA保存液，其特征在于：所述保存液中溶解有0.25mol/L的乙二胺四乙酸二钠。
4.根据权利要求1所述的肿瘤组织DNA和RNA保存液，其特征在于：所述保存液中溶解有0.215g/L的异硫氰酸胍。
5.根据权利要求1所述的肿瘤组织DNA和RNA保存液，其特征在于：所述保存液中溶解有饱和氯化钠。
6.根据权利要求5所述的肿瘤组织DNA和RNA保存液，其特征在于：所述保存液中溶解有体积分数为12%的二甲基亚砜。
7.根据权利要求1所述的肿瘤组织DNA和RNA保存液，其特征在于：所述保存液调节pH至7.0-9.0。
8.根据权利要求7所述的肿瘤组织DNA和RNA保存液，其特征在于：所述保存液调节pH至8.0。
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