CN101784663A

CN101784663A - 从固定的样品分离长片段rna的方法

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Publication number: CN101784663A
Application number: CN200880103932A
Authority: CN
Inventors: 凯瑟琳·达南伯格
Original assignee: Response Genetics Inc
Current assignee: Response Genetics Inc
Priority date: 2007-06-22
Filing date: 2008-06-23
Publication date: 2010-07-21
Also published as: JP2010530761A; CA2691209A1; KR20100012056A; TW200911988A; AR067135A1; EP2173874A2; WO2009002937A2; AU2008268467A1; WO2009002937A3; US20090092979A1; IL202889A0; NZ582219A

Abstract

本发明涉及从固定组织样本中提取长片段RNA的方法。特别是，本发明涉及从福尔马林固定、石蜡包埋的组织样本中提取RNA的方法，该方法用于生物学上的应用，包括基于寡核苷酸杂交的测定法。

Description

从固定的样品分离长片段RNA的方法

本申请要求在2007年6月22日提交的临时申请第60/945,785号的优先权，在此将其通过提述全部并入本文。

技术领域

本发明涉及从固定的组织样品中提取和分离高产率和高质量(长片段)RNA的领域。本发明涉及使用这些新型的提取方法以为在固定的或者固定并石蜡包埋的组织中的基因(例如癌生物标记)提供评估基因表达水平的方法。本发明还提供用于测定基于化疗方案的方法，其是通过测量患者肿瘤细胞中的某一生物标记的mRNA水平，并将其与预先确定的阈值表达水平比较而测定的。

背景技术

RNA类物质(RNA species)的定量测量是分子生物学的现代研究所探讨的核心问题。RNA类物质也具有非常重要的临床意义，例如，制备基因表达谱(gene expression profile)以表征各种不同组织类型，如侵袭性和非侵袭性肿瘤(1)。近来技术的进步，包括高度灵敏的基于荧光的实时RT-PCR方法和其它依赖杂交的方法(hybridization-dependent methodologies)的开发，使得现在可以对非常少量的mRNA进行快速和具体定量，例如从患者的活检样本中获得的那些mRNA。在大多数定量方法中在为了最佳结果而获取足够高质量的RNA的过程中出现了问题，特别是将RNA定量应用至临床研究时。

信使RNA(mRNA)在新鲜/冷冻的组织中是相当稳定的，并且也相对容易地以大体完整的形式分离。然而，除了在少数研究中作出了特别的努力去收集新鲜-冷冻的组织样品外，通常将取自患者的活检组织样品进行福尔马林固定并包埋在石蜡中。从在医院常规治疗的患者以及从大多数临床试验的参与者得到的组织样本就是这样处理的。福尔马林固定并石蜡包埋(FFPE)成为最常用的使用方法的主要原因是有助于组织的病理检查。对已经进行恒冷切片的新鲜-冷冻组织进行形态学检查不是最理想的，因为其使得分子组织病理学关联困难，还使得通过显微切割纯化肿瘤或其它组织更加困难。相反地，福尔马林固定并石蜡包埋组织样品保存了形态，并使得病理检查更加容易。FFPE被通常使用的次要原因是存储新鲜-冷冻组织样品的难度和成本。关于获得和保护(secure)用于诊断分析和分子化验的足够的组织样品的后勤问题(logistical problem)似乎是不能克服的。结果是，在全世界即使有，也是非常少的组织库包含足够的适于大范围遗传分析的冷冻组织样品，或者该组织库具有足够长期的患者随访及其结果数据。在另一方面，FFPE组织仍是用于目前病理学实践的基础。具有长期随访的归档的FFPE组织可以容易地获得，并且容易地被临床医师和研究人员获得，以及因此代表了用于在临床环境中的研究的遗传物质的广泛来源(2)。

遗憾的是，福尔马林固定方法，虽然更好地保存了组织的形态，但是对组织中的RNA具有不利后果。RNA分子变成片段，也就是被切割成更小的碎片，以及可能被福尔马林交联(3-6)。这两种过程大大增加了在RNA定量步骤(例如基因表达谱的产生)中使用来自FFPE样品中的RNA的难度。长度短的RNA使得更难以得到用于定量实时RT-PCR的最佳的引物-探针组，而交联阻止了合成RNA或DNA新链的RNA或DNA聚合酶酶类的推进，所述RNA或DNA的新链是对分离的RNA物质进行成功的扩增所必需的。与使用来自新鲜冷冻组织的随机片段化RNA相比，使用来自FFPE组织使扩增的RNA的产率显著降低，而短片段长度会特别地降低后续杂交步骤的效率和特异性。杂交的特异性在PCR中对避免假阳性结果和高背景扩增至关重要。基于上述理由，开发出从FFPE组织中以尽可能高的产率分离尽可能高质量的RNA的方法是很重要的。

从FFPE组织中提取完整的高分子量(长片段)RNA是困难和前后不一致(inconsisitent)的过程。在本领域中已知多种从样品中提取RNA的技术(7-17)。这些提取技术经测试取得了不同程度的成功。一些研究已经提供了新方法以使从归档的FFPE组织中提取DNA和RNA最优化(18-34)，而其它研究已经研究了固定时间对定量RT-PCR分析的影响(研究人员通常无法控制的因素)(10，12，13，26)。到目前为止，研究表明即使可以将从FFPE中提取的RNA成功地进行PCR，仍然存在有关提取的RNA的分离产率和质量(长度)的一致性的问题。之前对于扩增长于200个核苷酸(nt)的提取的RNA的片段的尝试通常是不成功的，通常仅仅对范围在60至120nt的片段的扩增取得一定程度的成功(any degree of success)(2)。目前为止，大多数提取方法的研究的重点集中在从FFPE组织中得到最高产率的RNA，而不必发现怎样得到高质量的提取RNA，也就是说，通过在提取过程中避免进一步降解从而保存RNA的片段长度。通常，这两个目标并不总是能同时实现的：获得最大产率的RNA可能需要进一步降解RNA长度的条件，导致更多的、长度却更短的RNA。

另一个在大多数以前的研究中常常没有认识到的并且通常没有重视的是在DNA对RNA制备物的污染。由于DNA是比RNA更稳定的分子，FFPE提取物通常包含比RNA更多的DNA。RNA和DNA是化学上非常相似的分子，并且DNA的碱基序列在RNA中被复制。因此，在需要杂交技术的RNA分析中，大量的DNA污染可以导致虚假的结果，因为DNA可能与RNA分子竞争与杂交位点结合。例如，在PCR过程中，引物和探针可以与污染DNA和从RNA生成的cDNA结合并扩增它们。在用于RT-PCR的RNA分离物中，DNA的存在通常是通过使用所谓的RNA特异性引物来处理，也就是说，跨越内含子-外显子交界的引物，因此在DNA中应该不能扩增相应的基因序列。然而，即使使用RNA特异性引物，DNA中的伪基因也可以被扩增。在样品制备物中不含可测量的DNA的一个优点为在进行RT-PCR时不必局限于RNA-特异性引物，而因此引物结合位点的选择大大增加。

因此，需要高产率地分离高质量(长片段)RNA的方法，并且该方法具有可接受的低DNA共-分离/污染。本发明可以满足该要求。

分离RNA以测定癌组织中多种生物标记的表达水平可用于某些状况的诊断或者协助医师确定治疗的适当疗程。例如，已经鉴定了可用于诊断癌症的生物标记，以及可用于预测某种化疗方案是否有助于治疗疾病的生物标记。已知许多疾病生物标记，包括，例如癌症生物标记ERCC1、TS、DPD、Her2-neu、EGFR、GST-pi、k-ras和RRM1，这些仅是其中的一部分。

此外，在本发明公开的RNA分离的方法可以用于从任意的FFPE组织中分离长片段RNA。一般而言，FFPE组织来自源于任何癌症的肿瘤活检。

ERCC1

切除修复交叉互补(ERCC1)基因在修复DNA加合物中是关键。人ERCC1基因已经被克隆。Westerveld等，Nature(London)310：425 428(1984)；Tanaka等，Nature 348：73 76(1990)。几种使用在这种基因中存在缺陷的突变的人和仓鼠细胞系的研究以及人肿瘤组织的研究表明由ERCC1编码的产物涉及到铂-DNA加合物的切除修复。Dabholkar等，J.Natl.Cancer Inst.84：15121517(1992)；Dijt等，Cancer Res.48：6058 6062(1988)；Hansson等，NucleicAcids Res.18：35 40(1990)。

当转染至DNA修复缺陷的CHO细胞时，ERCC1赋予对顺铂的细胞抗性以及修复铂-DNA加合物。Hansson等，Nucleic acids Res.18：35 40(1990)。目前公认的切除修复模型显示损伤识别/切除步骤是切除修复过程的限速步骤。

已经检查了来自接受基于铂的疗法的癌症患者的恶性细胞中切除修复基因(例如ERCC1)的相对表达水平。Dabholkar等，J.Natl.Cancer Inst.84：15121517(1992)。已经报道了当用顺铂(DDP)/氟尿嘧啶的化疗方案治疗时，胃癌患者中ERCC1过表达对肿瘤应答和最终的存活率具有消极影响(Metzger，等，J Clin Oncol16：309，1998)。最近，有证据表明吉西他滨(gemcitabine(Gem))可以调整ERCC1核苷酸切除修复(NER)活性。因此，ERCC1表达的瘤内水平可以成为确定DDP和GEM是否有效治疗癌症患者的主要预后因素。

GST-pi

蛋白质的谷胱甘肽-S-转移酶(GST)家族涉及细胞毒性药物(cytotoxicdrug)的解毒作用。通过用谷胱甘肽催化毒性且致癌的亲电子分子的共轭，所述GST酶保护细胞大分子免受损伤(Boyer等，Preparation，characterization andproperties of glutathione S-transferases.In：Zakim D，Vessey D(eds.)Biochemical Pharmacology and Toxicology.New York，N.Y.：John Wiley andSons，1985)。这些蛋白质的某种异构类型，谷胱甘肽S-转移酶Pi(GST-pi，本发明中也可替换地称作GSTP1或GST-π)在人的上皮组织中广泛表达，并且已经显示在一些肿瘤中过表达(Terrier等，Am J Pathol 1990；137：845 853；Moscow等，Cancer Res 1989；49：1422 1428)。尽管确切的机理仍然不清楚，在耐药的肿瘤中已经发现增加的GST-pi水平(Tsuchida等，Crit Rev BiochemMol Biol 1992；27：337 384)。之前的研究已经表明GST蛋白(非mRNA)的低表达与对基于铂的化疗的应答有关(Nishimura等，Cancer.Clin Cancer Res1996；2：1859 1865；Tominaga，等，Am.J.Gastro.94：1664 1668，1999；Kase，等，Acta Cytologia.42：1397 1402，1998)。然而，这些研究并没有测量定量基因表达，而是使用半定量的免疫组织化学染色方法测量蛋白质水平。然而，需要定量的GST-pi基因表达测量以实现非常有效的预后。

Her2 neu/EGFR

肺癌在西方国家的男性和女性中均为癌症相关死亡的罪魁祸首。在美国，每年诊断出大约171,000例的肺癌新增病例，并有160,000个体因此疾病而死亡。尽管在过去20年，肺癌的检测和治疗方面已经取得了进步，但是5年的总生存率仍低于15％。Ginsberg，等，In：DeVita，等，Cancer：Principlesin Practice of Oncology，Ed.5，pp.858-910.Philadelphia Lipincott-RavenPublishers，199。为了进一步提高患有非小细胞肺癌(NSCLC)的患者生存率，其基于分子改变的预后分类是至关重要的。这种分类将提供更精确和有用的诊断手段，并且最终提供更有效的治疗选择。

受体酪氨酸激酶(RTKs)在有丝分裂信号的转导中是重要的。RTK为大跨膜蛋白，该蛋白具有用于生长因子(例如上皮生长因子(EGF))的细胞外配体结合域和在胞质蛋白(cytosol protein)上起到磷酸化酪氨酸氨基酸残基的激酶作用从而调节细胞增殖的胞内部分。已知多种类型的受体酪氨酸激酶基于与不同的受体酪氨酸激酶结合的生长因子家族(Wilks，Advances in CancerResearch，1993，60，43-73)。

I类激酶(例如受体酪氨酸激酶的EGF-R家族)包括EGF、HER2-neu、erbB、Xmrk、DER和let23受体。这些受体频繁出现在普通的人的癌症中，例如乳腺癌(Sainsbury等，Brit.J.Cancer，1988，58，458；Guerin等，OncogeneRes.，1988，3，21)、肺的鳞状细胞癌(Hendler等，Cancer Cells，1989，7，347)、膀胱癌(Neal等，Lancet，1985，366)、食管癌(Mukaida等，Cancer，1991，68，142)、胃肠癌(例如结肠、直肠或胃癌)(Bolen等，Oncogene Res.，1987，1，149)、白血病(Konaka等，Cell，1984，37，1035)和卵巢、支气管或胰腺癌(欧洲专利说明书第0400586号)。随着其它的人肿瘤组织被用于检测受体酪氨酸激酶的EFG家族，预期其广泛普遍性将在其它癌症(例如甲状腺和子宫癌)中确定。

具体地，很少在正常的细胞中探测到EGFR酪氨酸激酶活性，然而在恶性细胞中可更频繁地探测到(Hunter，Cell，1987，50，823)。最近的研究结果显示EGFR在多种的人癌症(例如脑、肺鳞状细胞、膀胱、胃、乳腺、头和颈、食管、妇科和甲状腺肿瘤)中过表达(W J Gullick，Brit.Med.Bull.，1991，47，87)。受体酪氨酸激酶在其它细胞增殖疾病(例如银屑病)中也是重要的。EGFR病症是具有如下特征的病症：一般不表达EGFR的细胞表达EGFR，或者增强的EGFR激活导致不需要的细胞增殖，和/或者不适当的EGFR水平的存在。已知EGFR被其配体EGF和转化生长因子-α(TGF-α)激活。

Her2-neu蛋白也是I类受体酪氨酸激酶(RTK)家族的成员。Yarden andUllrich，Annu.Rev.Biochem.57：443，1988；Ullrich and Schlessinger，Cell61：203，1990。Her2-neu蛋白与EGFR在结构上相关。Carraway，等，Cell 78：5，1994；Carraway，等，J.Biol.Chem.269：14303，1994。这些受体具有共同的分子结构(molecular architecture)，并在包含两个位于其胞浆域内的富半胱氨酸区和位于它们的胞浆域内的结构相关的酶区。

Her2-neu蛋白的依赖配体的激活被认为是通过neu活化因子(neuactivating factor；NAF)调节的，其能够直接与p165(Her2-neu)结合，并刺激酶活性。Dougall等，Oncogene 9：2109，1994；Samata等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：1711，1994。Her2-neu蛋白的依赖配体的同源二聚体化和产生的受体激活是通过Her2-neu蛋白的过表达促进的。激活的Her2-neu复合物起到磷酸激酶的作用并磷酸化不同胞质蛋白。HER2-neu病症的特征在于HER2-neu的不适当的活性或过度活性具有导致不需要的细胞增殖(例如癌)的提高的HER2-neu表达。

受体酪氨酸激酶EGFR和HER2-neu的抑制剂被用作哺乳动物癌细胞生长的选择性抑制剂(Yaish等Science，1988，242，933)。例如，制表菌素(erbstatin)，一种EGF受体酪氨酸激酶抑制剂，降低了注射至无胸腺的裸鼠中的表达EGFR的人乳腺癌细胞的生长，然而对不表达EGFR的肿瘤的生长没有效果。(Toi等，Eur.J.Cancer Clin.Oncol.，1990，26，722.)。苯乙烯的多种衍生物也被宣称具有酪氨酸激酶抑制性(欧洲专利申请第0211363、0304493和0322738号)，并将用作抗肿瘤剂。两种这样的苯乙烯衍生物为第I类RTK抑制剂，其已经通过削弱注射到裸鼠中的人鳞状细胞癌的生长而显示出有效性(Yoneda等，Cancer Research，1991，51，4430)。从欧洲专利申请第0520722和0566226号还得知某些4-苯胺基喹唑啉(4-anilinoquinazoline)衍生物在用作受体酪氨酸激酶的抑制剂时十分有用。这些化合物显示的非常紧密的结构-活性关系表明了明确的结合模式，其中喹唑啉环结合在嘌呤袋(adeninepocket)中，而苯胺基环结合在邻近的、唯一的亲脂袋中。三种4-苯胺基喹唑啉类似物(4-anilinoquinazoline analogue)(两种可逆和一种不可逆抑制剂)已经作为抗癌药物进行了临床评估。Denny，Farmaco January-February2001；56(1-2)：51-6。最近，美国FDA批准使用单克隆抗体曲妥珠单抗(trastazumab)(Herceptin

)用于治疗过表达HER2-neu的转移性乳腺癌。Scheurle，等，Anticancer Res 20：2091-2096，2000。

由于对抗肿瘤的有效化疗通常需要药物的组合，确认和定量对每一种药物的耐药性和敏感性的决定因素已经成为设计个体组合化疗的重要工具。研究曾尝试寻找来自癌症患者的恶性细胞中EGFR和/或HER2-neu的表达的相对水平与生存率之间可靠的关联性，结果以失败告终。

EGFR的预后重要性和在NSCLC中EGFR的预后重要性直至现在仍然具有争议性。使用结合测定法的研究表明在晚期NSCLC中EGFR表达的增加与总生存率下降有关，然而使用用于测量EGFR mRNA或蛋白表达的半定量技术没有显示与临床结果相一致的关系。Veale等，Br.J.Caner 68：162-165，1993；Fujino等，Eur.Cancer 32：2070-2074，1996；Rusch，等，Cancer Res53：2379-2385，1993；Pfeiffer，等，Br J Cancer 74：86-91，1996；Pastorino，等，.JClin Oncol 15：2858-2865，1997。使用免疫组织化学方法对NSCLC肿瘤中EGFR表达的研究已经显示在NSCLC肿瘤中EGFR过表达的频率为32％-47％，Veale等，Br.J.Caner 55：513-516，1987；Veale等，Br.J.Caner68：162-165，1993；Fujino等，Eur.Cancer 32：2070-2074，1996；Rusch，等，CancerRes 53：2379-2385，1993；Pastorino等，J.Clin.Onc.15：2858-2865，1997；Tateishi，等，Eur J Cancer 27：1372-75，1991；Rachwal，等，Br J Cancer72：56-64，1995；Rusch，等，Cancer Res 15：2379-85，1993；Pfeiffer，等，Br J Cancer78：96-9，1998；Ohsaki，等，Oncol Rep 7：603-7，2000。此外，有人报道在组织学亚型中EGFR表达存在显著的区别，一般而言，在SCC中比在AC和LC中具有更高EGFR表达。Fujino等，Eur.Cancer 32：2070-2074，1996；Veale等，Br.J.Caner 55：513-516，1987；Pastorino等，J.Clin.Onc.15：2858-2865，1997；Pfeiffer，等，Br J Cancer 78：96-9，1998；Ohsaki等，Oncol.Rep.&：603-7，2000。然而，这些研究报道EGFR过表达与肺癌患者生存率没有一致的关联性。

在一些非结论性的研究中对EGFR过表达与患者生存率降低的假定(purposed)的相关性进行了观察。Veale等，1987；Ohsaki等，2000。然而，Veale等人分析了仅仅只有19个NSCLC患者的总体。Ohsaki等人将EGFR蛋白表达与在具有p53过表达的NSCLC患者的预后不良关联起来(P＝0.024)。

正如EGFR一样，HER2-neu的预后重要性和在NSCLC中的HER2-neu的预后重要性直至目前仍然存在争议。在NSCLC(包括鳞状细胞癌、腺癌和大细胞癌)中已经显示HER2-neu蛋白过表达。Veale等，1987；Schneider，等，Cancer Res 49：4968-4971，1989；Kern等，Cancer Res.50：5184-5191，1990；Weiner，等，Cancer Res 50：421425，1990；Scheurle，等，Anticancer Res.20：2091-2096，2000。使用蛋白测定法的早期研究报道肺腺癌(AC)中的HER2-neu蛋白过表达与较低的总生存率的相关性。Kern，等，Cancer Res50：5184-5191，1990；Kern等，J Clin Invest 93：516-20，1994。然而，与之相矛盾的研究报道肺腺癌(AC)中的HER2-neu蛋白过表达与较低的总生存率没有相关性。Pfeiffer等，Br.J.Cancer 74：86-91，1996。

另一个关键的问题是评估作为癌症预后者(prognosticator)的HER2-neu与EGFR共过表达(co-over expression)之间的相互关系。Tateishi等人(Eur.J.Cancer 27：1372-75，1991)测量了13％进行分析的AC中的EGFR和HER2-neu蛋白共-表达，并发现这两种基因共-过表达与较低的5年生存率存在关联性。然而，就单独的HER2-neu过表达而言，HER2-neu和EGFR共过表达与肺的鳞状细胞癌(SCC)和大细胞癌(LCC)的生存率之间相关性还没有报道。

测定EGFR和HER2-neu表达水平的方法学不一致是测定这些基因的何种表达程度可以用于预示癌症患者生存率中存在的问题的根本。到目前为止，对NSCLC中HER2-neu表达和EGFR表达的研究在针对EGFR和HER2-neu二者的表达均得到正分数的NSCLC肿瘤(NSCLC tumor scoredpositive for both EGFR and HER2-neu expression)的频率方面有着巨大变化。通过使用在光学显微镜载玻片上的石蜡包埋组织和HER2-neu抗血清，在13-80％腺癌(AC)，2-45％的鳞状细胞癌(SCC)，以及在0-20％的大细胞癌(LC)中报告了通过正蛋白染色(positive protein staining)所定义的HER2-neu过表达。Pfeiffer等，1996；Kern等，1990；Kern等，1994；Tateishi等，1991；Shi，等，Mol Carcing 5：213-8，1992；Bongiorno，等，J Thorac Cardiovasc Surg107：590-5，1994；Harpole，等，Clin Cancer Res 1：659-64，1995；Volm等，Anticancer Res 12：11-20，1992。此外，最近的报告实例了目前设计用来评估HER2-neu表达水平的反感的非特异性。在浸润性乳腺癌中用于测量HER2-neu表达的HercepTest

显示具有非常高的假阳性。Jacobs等，J ClinOncol 17：1983-1987，1999。

如果存在用于测定EGFR和HER2-neu的表达水平的精密的、准确的和一致性的方法，可以确定什么样的表达水平与患者的生存率相关，以及受体酪氨酸激酶靶向性化疗是否合适。在确立用于目前和将来的受体酪氨酸激酶靶向性化疗(例如化疗剂、基于抗体的药物)的临床试验中，使用标准方法连贯一致地证实NSCLC中的EGFR和/或HER2-neu过表达是理想的，以治疗过表达这些受体的癌症。

DPD

5-氟尿嘧啶(5-FU)是用于治疗许多不同类型癌症的使用非常广泛的药物，这些癌症包括主要癌症，例如胃肠道和乳腺的癌症(Moertel，C.G.NewEngl.J.Med.，330：1136-1142，1994)。40多年以来，结肠直肠癌的标准的一线疗法是单独使用5-FU，但是其作为“护理标准”被5-FU和CPT-11的组合所代替(Saltz等，Irinotecan Study Group.New England Journal of Medicine.343：905-14，2000)。近来，5-FU和奥沙利铂(oxaliplatin)的组合已经在结肠直肠癌中引起高应答率(Raymond等，Semin.Oncol.，25：4-12，1998)。因此，5-FU可能将会多年继续用于癌症治疗，因为其保存了目前化疗法的主要组分。此外，单剂5-FU疗法将会继续用于CPT-11或奥沙利铂的联合疗法对其很可能具有过度毒性的患者。

5-FU属于典型的大多数抗癌药物，因为只有少数的患者对该治疗体验到有利的应答。大型随机临床试验显示患有结肠直肠癌的患者对作为单剂的5-FU的肿瘤应答率在15-20％的范围内(Moertel，C.G.New Engl.J.Med.，330：1136-1142，1994)。结合前述的其它化疗，对基于5-FU方案的肿瘤应答率增加至几乎40％。然而，大多数受治疗的患者从接受基于5-FU的化疗中没有得到明显效益，而且经受重大的风险、不适和支出。由于在治疗之前，没有预期个体的肿瘤的应答性的可靠的方法，标准的临床实践使所有的病人接受基于5-FU的治疗，充分认识到大多数将会得到不满意的结果。

多年来，已经深入地研究了5-FU的作用机理和代谢途径以鉴定对该药物的抗肿瘤活性最重要的生物化学决定子(determinant)。最终目标是通过如下几方面来改善5-FU的临床功效：a)调节其细胞内代谢和生物化学；和b)在治疗前测定患者的应答决定子以预测最可能对该药物产生应答(或者无应答)的患者。从这些研究中得到两种主要的决定子：1)5-FU的靶酶，即胸苷酸合酶(TS)的鉴定和2)5-FU分解代谢酶，即二氢嘧啶脱氢酶(DPD)的鉴定。

在基于5-FU疗法的肿瘤应答预测领域中最初的研究集中在结肠直肠癌中的靶酶TS上。Leichman等(Leichman等，J.Clin Oncol.，15：3223-3229，1997)进行了前瞻性的临床试验以将对5-FU的肿瘤应答与TS基因表达相关联，所述TS基因表达是通过在来自结肠直肠癌的预处理的活检中进行RT-PCR而测定的。本研究显示：1)在这些肿瘤中，TS基因表达水平在50倍的大范围内；和2)在应答和无应答肿瘤之间的TS基因表达水平显著不同。应答组的TS水平的范围(0.5-4.1×10^-3，相对于内部控制)比无应答组TS水平的范围(1.6-23.0×10^-3，相对于内部控制)窄。研究者确定了因此得出的TS表达的“无应答的截止值(non-response cutoff)”阈值水平，高于该阈值只能是无应答者。因此，TS表达高于该“无应答的截止值”阈值的患者可以在治疗之前确认为无应答者。“无应答”分类包括具有如下特征的所有的治疗应答：肿瘤缩小＜50％、导致肿瘤增加＞25％的进展性生长，以及或者缩小＜50％、无变化或者增加＜25％的非进展性肿瘤。这些肿瘤具有最高的TS水平。因此，高TS表达鉴定出特别有抗性的肿瘤。高于某一阈值的TS表达水平鉴定出对5-FU无应答的肿瘤亚组，而低于这个数值的TS表达水平预测了稍高的应答率，但是不能明确地鉴定应答肿瘤。

后续的研究调查了DPD表达水平作为5-FU治疗的肿瘤应答决定子与TS表达水平一起结合的有效性。DPD为分解代谢酶，其使5-FU的5，6双键还原，使得其为无活性的细胞毒性剂。之前的研究显示在正常组织中的DPD水平可以影响5-FU的生物可利用性(bio-availability)，从而调节其药代动力学和抗肿瘤活性(Harris等，Cancer Res.，50：197-201，1990)。此外，证据表明肿瘤中的DPD水平与对5-FU的敏感性相关(Etienne等，J.Clin.Oncol.，13：1663-1670，1995；Beck等，Eur.J.Cancer，30：1517-1522，1994)。Salonga等，(Clin Cancer Res.，6：1322-1327，2000)研究了DPD的基因表达在已经测定了TS表达的一组肿瘤中用于5-FU/亚叶酸钙治疗的肿瘤应答决定子。至于TS，与无应答肿瘤的DPD表达的范围(0.2-16×10^-3，80倍；相对于内部控制)相比，在应答肿瘤中的DPD表达的范围相对较窄(0.6-2.5×10^-3，4.2倍；相对于内部控制)。不存在DPD表达高于大约2.5×10^-3的阈值水平的应答肿瘤。此外，DPD和TS表达水平之间彼此没有显示相关性，表明它们为独立调节的基因。在TS和DPD表达水平同时低于其各自的“无应答截止值”阈值水平的肿瘤组中，92％对5-FU/LV应答。因此，基于DPD和TS的低表达能够鉴定应答肿瘤。

DPD也是5-FU毒性的重要的标志物。观察到具有非常低的DPD水平的患者(例如DPD缺乏综合征中；即，胸腺嘧啶-尿嘧啶尿(uraciluria))在进行基于5-FU治疗时遭遇到威胁生命的毒性(Lyss等，Cancer Invest.，11：2390240，1993)。5-FU与抗病毒化合物索立夫定之间不利的药物相互作用导致在日本出现19例死亡案例(Diasio等，Br.J.Clin.Pharmacol.46，1-4，1998)，这确实戏剧性地示例了DPD水平在5-FU治疗中的重要性。后续发现索立夫定的代谢产物为DPD的有力抑制剂。这种治疗导致类似于DPD缺乏综合征的降低的DPD水平，其增加5-FU对患者的毒性(Diasio等，Br.J.Clin.Pharmacol.46，1-4，1998)。

因此，由于：a)5-FU在治疗癌症中的广泛应用；b)DPD表达在预测对5-FU的肿瘤应答的重要作用；和c)患有DPD缺乏综合征的个体对普通的基于5-FU治疗的敏感性，可以清楚地看到在化疗之前的精确地测定DPD表达水平将为癌症患者带来一个重要的好处。

测量DPD酶活性需要大量包含活性酶的新鲜组织。不幸的是，可以获得的大多数预处理的肿瘤活检只能作为不包含活性酶的固定石蜡包埋(FPE)组织，特别是福尔马林固定的石蜡包埋组织。而且，活检通常仅仅包含非常少量的非均质组织(heterogeneous tissue)。

可以得到RT-PCR引物和探针序列以分析冷冻组织或新鲜组织中的DPD表达。然而，这些引物不适合用于通过RT-PCR对来自固定组织的DPDmRNA进行的定量。到目前为止，现存的引物不能得到结果或得到的结果不稳定。这被认为是由于：a)DPD RNA的固有低水平；b)包埋在石蜡中的组织量非常小；和c)石蜡中的RNA降解成＜100bp的短片段。结果，其它的研究人员对于得到允许定量石蜡化组织中DPD表达的寡核苷酸引物组已经做出了一致的，却不成功的尝试。因此，需要定量来自固定组织的DPD mRNA的方法以提供对提议的癌症疗法的早期预后。因为已经显示DPD酶活性和相应的mRNA表达水平密切相关(Ishikawa等，Clin.Cancer Res.，5：883-889，1999；Johnson等，Analyt.Biochem.278：175-184，2000)，测量FPE样本中的DPD mRNA表达提供了一种评估患者的DPD表达水平状态的方式，而无需测定新鲜组织中的酶活性。此外，FPE样本容易进行显微切割，因而可以测定未被间质组织污染的肿瘤组织中的DPD基因表达。

TS

胸苷酸合酶(TS)为在DNA生物合成中的整合酶(integral enzyme)，在生物合成中其催化脱氧尿苷一磷酸(dUMP)还原性甲基化成为脱氧胸苷一磷酸(dTMP)，并提供在细胞内重新合成嘧啶核苷酸的唯一途径(Johnston等，1995)。胸苷酸合酶为化疗药物(最常见为抗叶酸剂药物5-氟尿嘧啶(5-FU))的靶。作为治疗结肠癌、头颈癌和乳腺癌的最有效的单剂，5-FU的主要作用为抑制TS活性，导致细胞内胸腺嘧啶水平的损耗，并随后导致细胞死亡。

已经报道了在来自原发性肿瘤(Johnston等，1995；Lenz等，1995)和转移灶(Farrugia等，1997；Leichmann等，1997)二者的临床肿瘤样本中TS表达的可观变化。例如，在结肠直肠癌肿，肿瘤组织相对于正常胃肠粘膜组织的TS表达比的范围为2至10(Ardalan and Zang，1996)。

同样已知胸苷酸合酶在肿瘤抗性的形成中具有临床重要性，如下述研究所证明的，该研究显示了在暴露于5-FU后赘生细胞中TS蛋白的急性诱导和TS酶水平的增加(Spears等1982；Swain等1989)。肿瘤相应于细胞毒性剂(例如5-FU)而急性过表达TS的能力在氟尿嘧啶抗性的形成过程中可能起了某些作用。之前的研究显示TS蛋白水平与5-FU疗法的有效性直接相关，即存在蛋白质与RNA表达的直接相关性(Jackman等，1985)，还显示了TS表达为结肠直肠癌和乳腺癌中强有力的预后标志物(Jackman等，1985；Horikoshi等，1992)。

在晚期的转移性疾病中，显示了由RT-PCR定量的高TS mRNA和高TS蛋白表达来预测对用于结肠直肠癌(Johnston等，1995，Farrugia等，1997，Leichman等，1997)、胃癌(Lenz等，1995，Alexander等，1995)和头颈癌(Johnston等，1997)的基于氟嘧啶的疗法的弱应答。应答者与无应答者之间的大量的重叠经常出现在低TS类型内，但是TS水平高于中位值的患者大多数为无应答者。如果与其它分子特性(例如二氢嘧啶脱氢酶(DPD)和胸苷磷酸化酶(TP)表达水平)、复制错误阳性(RER+)状态(Kitchens and Berger 1997)和p53状态(Lenz等，1997)结合，可以进一步提高TS过表达的预测值。到目前为止，评估人肿瘤中TS表达的研究表明，基于人肿瘤中的TS表达预测应答和结果的能力可以在未来提供选择最可能受益于TS-指导的治疗的机会。

发明内容

本发明的一个方面提供了从固定组织样本提取RNA的方法。本发明也提供了从福尔马林固定石蜡包埋的组织分离RNA的可靠和可重复的方法。

本发明提供了从固定组织样品分离长片段RNA的方法，该方法包括加热在提取溶液中的固定的组织样品至大约44至大约62℃的范围内的温度持续3小时以上的时间，其中，所述提取溶液包含浓度为大约0.1mM至大约20mM的螯合剂和蛋白酶K(优选以大约5μg蛋白酶K/400μL(12.5μg蛋白酶K/mL)的浓度)；和去除DNA污染并从提取溶液分离所述的RNA。

在某些实施方式中，可以在范围在大约45至大约60℃，从大约48至大约58℃，从大约48至大约55℃，从大约48至大约52℃或者大约50℃的温度下加热。特别优选的加热温度为大约50-56℃。

在某些实施方式中，所述时间大于4小时，大于8小时，大于大约12小时，大于大约14小时或大约16小时。在优选的实施方式中，所述时间为大约16小时。

所述螯合剂可以为任意螯合剂，例如EDTA、EGTA、柠檬酸盐类、柠檬酸类、水杨酸、水杨酸盐类、邻苯二甲酸、2，4-戊二酮类(2，4-pentanedines)、组氨酸类、二盐酸组氨醇类、8-羟基喹啉类、8-羟基喹啉、柠檬酸盐类或邻羟基醌类。在优选的实施方式中，所述螯合剂为EDTA或柠檬酸钠。

在某些实施方式中，所述螯合剂为EDTA或柠檬酸钠，并且以大约2.5mM至大约5.0mM的浓度存在。在某些实施方式中，所述EDTA或柠檬酸钠以大约2.5mM至大约5.0mM的浓度、以大约3.0mM至大约4.0mM的浓度，以大约3.25至大约3.75mM的浓度存在。在优选的实施方式中，所述EDTA或柠檬酸钠以大约0.6mM至大约3.6mM的浓度存在。在另一优选的实施方式中，EDTA或柠檬酸钠以大约3.6mM的浓度存在。

通过本领域已知的方法可以去除DNA污染，所述方法例如但不限于苯酚/氯仿/异戊醇(PCI)提取，通过两种苯酚/氯仿/异戊醇(isoamyl)(两种都加入或者没有加入DNA酶)，其中在第一PCI提取中、或者在第二PCI提取中或者在两者中存在离液剂，或者通过市售的纯化柱(即，具有或者没有DNA酶的Qiagen，或者其它产品)(即，Ambion Turbo无DNA酶的方法)。在一些实施方式中，可以综合采用这些方法。

所述离液剂可以为任意已知的离液剂，例如尿素、异硫氰酸胍、硫氰酸钠(NaSCN)、盐酸胍(Guanidine HCl)、盐酸胍(guanidinium chloride)、硫氰酸胍、四氯乙酸锂(lithium tetrachloroacetate)、高氯酸钠、四氯乙酸铷、碘化钾或三氟乙酸铯。在某些实施方式中，离液剂为异硫氰酸胍。

在某些实施方式中，固定的福尔马林固定的石蜡包埋的组织样品为16年或更短时间的。在优选的实施方式中，所述组织样品为5年或更短时间的，以及在优选的实施方式中，所述组织样品为2年或更短时间的。

在某些实施方式中，所述长片段RNA的长度长于200个核苷酸。在其它实施方式中，所述长片段RNA为300个核苷酸以上。在优选的实施方式中，所述长片段RNA长度在大约300至大约400个核苷酸之间。

附图简述

图1A和1B显示了温度对长片段RNA产率的影响。这些数据显示在更低温度下的更长时间的温育会分离出更高产率的更长片段的RNA。

图2A和B显示了加热时间对RNA产率的影响。该数据显示在更长的加热时间下所有大小的RNA片段的产率都提高了。100bp片段的产率提高超过10倍(3.5个PCR循环)，而当延长加热时间时，300bp片段的产率提高了几乎2⁶或者大约600倍。400b片段的产率也类似地提高。

图3A和B显示温育温度和提取溶液的EDTA浓度对来自FFPE组织的RNA的影响。这些数据表明50℃为优选的加热温度，以及3.6mM为优选的EDTA浓度。

图4显示在从石蜡基质(paraffin matrix)取出RNA的提取步骤中改变蛋白酶K的量的影响。数据显示就最大RNA产率以及最小DNA污染而言优选浓度均为5μg(图1中的1×)。

图5A和5B显示对使用五种提取方法的RNA产率和DNA污染的比较结果：1)高温离液剂法；2)PK法(本发明的方法，其包括(蛋白酶K、低温和长时间加热))；3)使用含有异硫氰酸胍(“GITC”)的单次的苯酚提取的PK法；4)在第二次提取中使用含有GITC的两次苯酚提取的PK法；5)使用用Tris缓冲液代替GITC的两次苯酚提取的PK法。例如，在图中，标记“F4_1_100bp”指的是用高温离液剂法处理的样品F4；F4_2_100bp指的是用PK法处理的样品F4；F4_3_100bp指的是用使用含有GITC的单次苯酚提取的PK法处理的样品F4，等。在图的靠左边的5个柱表示NRT(无逆转录作用)，并且表示样品中的DNA量。

图6显示对命名为B5、D6和F5的从FFPE分离的RNA的量和纯度的比较。“PK”表示使用本发明的分离方法，(“RGI”)表示使用高温分离方法(在美国专利第6,248,535号描述)；以及“para”表示使用市售可得的Paradise

试剂盒。通过在280nm处的紫外吸收测量RNA的纯度。这些数据显示在3个测试样品中本发明分离出比Paradise试剂盒的更高产率的RNA和更纯(相对于DNA污染而言)的RNA。这些结果也显示PK法产生的RNA不如RGI法的多，却提供了更纯的RNA样品。

图7显示了对从FFPE样品B5、D6和F5中分离的100、300、400和1000bp的RNA片段的量的比较，其是通过PCR扩增各样品中的β-肌动蛋白测量的。“PK”表示使用本发明的分离方法，(“RGI”)表示使用高温分离方法(在美国专利第6,248,535号描述)；以及“para”表示使用市售可得的Paradise

试剂盒。这些数据显示使用PK的优选方法得到各种片段长度的最佳产率和最少DNA污染。在柱状图下面的表格中提供了柱状图中表示的数据。

图8显示对通过各种方法分离的RNA片段的大小分布的比较。在大小排阻柱上分馏RNA，并通过在280nm处的UV吸收来定量。在柱子中更小的片段比更大片段移动得更快。D5＝样品1；F5＝样品2；D6＝样品3。“PK”表示使用本发明的分离方法，(“RGI”)表示使用高温分离方法(在美国专利第6,248,535号描述)；以及“Paradise”表示使用市售可得的Paradise

试剂盒；且“冷冻”是从相应的新鲜冷冻组织中分离的RNA级分。在第五行中的单个点线图包含分子量标准。这个图显示：与其它方法相比，PK法提供更高质量更长片段的RNA。

图9显示了对使用本发明的方法从FFPE组织分离的RNA中β-肌动蛋白的表达水平与使用常规方法从冷冻新鲜组织分离的RNA中β-肌动蛋白的表达水平(通过PCR测定)的比较。这些数据显示使用从FFPE提取的RNA(特别是使用本发明的方法)得到的基因表达分析，与新鲜冷冻组织中的基因表达相关并且可靠地反映了新鲜冷冻组织的基因表达。例如，新鲜冷冻组织的结果与FFPE的结果之间的正相关性(direct correlation)会显示为一条斜线，并且R²值为1。R²值越接近1，性质越相近。因此，对于PK分离，R²值为.89，其优于通过Paradise试剂盒得到的R²值0.81或者RGI的R²值0.84。

图10图示了样品时间(sample age)对长片段RNA类物质的产率影响。该数据显示Ct值随着样品时间的增加而逐渐增加(更低的RNA产率)。因此，随着样品时间的增加，RNA产率和质量会降低(更少的长片段RNA)。样品1、2、3、4和5在1991年被固定；样品2在2000年被固定，以及样品D7、D9和F3在2005年被固定。标注有“RNA”的柱指的是无逆转录对照，即，DNA污染的量。

图11为显示接受顺铂/吉西他滨治疗的患者总生存率对修正的NSCLC中相对ERCC1表达的图示。修正的相对ERCC1表达水平低于6.7×10^-3的阈值的患者对应于显著更好的生存率。而修正的相对ERCC1表达水平高于6.7×10^-3的阈值的患者对应于显著更差的生存率。(P＝0.009时序检验(Log ranktest))。

图12为图示怎样相对于内部控制基因(internal control gene)计算修正的相对ERCC1表达的图表。该图表包含用两种测试样品得到的数据(未知1和2)，并说明了怎样测定未修正的基因表达数据(UGE)。该图表也说明了怎样通过使用预TaqMan

技术(pre-TaqMan

technology)测定的已知相对ERCC1值使通过TaqMan

仪器产生的UGE标准化。这是通过将UGE乘以修正因子K_ERCC1实现的。在图中的内部控制基因是β-肌动蛋白，并且校准物(calibrator)RNA为Human Liver Total RNA(人肝脏总RNA)(Stratagene，Cat.#735017)。

图13为显示在研究中的56个患者的人口统计详细信息(肿瘤期和细胞类型)的表格。接受的治疗周期的中间数为3(范围16)。14位患者(25％)曾经接受过化疗，大部分(9位患者)用紫杉烷单独治疗或者与DDP或卡铂组合治疗。56位患者中的3位已经接受放射治疗，并且5位患者已经手术切除原发性肿瘤。

图14为表格，其显示与具有在阈值以上的修正ERCC1水平的患者的20.4周(95％ C.I.6.9，33.9周)生存率相比，具有在阈值以下的修正ERCC1表达水平的患者具有显著更长的61.6周的生存率中值(95％ C.I.42.4，80.7周)。针对肿瘤阶段进行调整，低或高ERCC1表达与总生存率之间相关性的时序统计量(Log rank statistic)为3.97，以及P值为0.046。未调节的时序结果示于图中。也显示了与在使用卡普兰-迈耶生存率曲线和时序检验(1og rank test)的单变量分析中的总生存率紧密相关的因素。这些因素为预治疗重量损失和ECOG体力状态(performance status)的存在。患者年龄(P＝0.18)、性别(P＝0.87)、肿瘤阶段(P＝0.99)、肿瘤细胞类型(P＝0.63)，以及胸腔积液(pleural effusion)的存在(P＝0.71)并不是总生存率的重要的预后因素。在Cox比例风险回归模型多变量分析(Cox proportional hazards regression model multivariable analysis)中，修正的相对ERCC1表达水平、ECOG体力状态和体重损失仍然是生存率的重要的预后因素。据肿瘤阶段分层的(stratified)Cox回归模型的P值对ERCC1为0.038，对体重损失为0.017，以及对ECOG体力状态为0.02(PS 0对1或2)。

图15是显示怎样相对于内部控制基因计算DPD表达的图表。该图表包含用两种测试样品得到的数据(未知1和2)，并显示怎样测定未修正的基因表达数据(UGE)UCG。该图表也说明了怎样使用先前公布的DPD值使由Taqman仪器产生的UGE标准化。其是通过将UGE乘以修正因子K_DPD实现的。在图中的内部控制基因为β-肌动蛋白，以及校准物RNA为Universal PERNA；来自Applied Biosystems的Cat #4307281，lot # 3617812014。

图16显示各种组织学类型的样本的相对修正的DPD表达水平的框线图。这些框显示25和75百分位数(四分位距(interquartile))范围。在各个框中以水平线显示了中位值。伸出的线(whisker)显示在25和75百分位数之外的水平，其显示在框上面，但是排除那些远远偏离的值。

图17为显示接受5-FU和奥沙利铂治疗方案的具有高(高于大约7.5×10^-3倍β-肌动蛋白基因表达；n＝7)和低(低于大约7.5×10^-3倍β-肌动蛋白基因表达；n＝43)的修正TS表达水平的携带结肠直肠腺癌肿瘤的患者生存率的预期概率和生存的时间(月)的图。

图18为显示接受5-FU和奥沙利铂治疗方案的具有高(高于大约4.9×10^-3倍β-肌动蛋白基因表达；n＝10)和低(低于大约4.9×10^-3倍β-肌动蛋白基因表达；n＝40)的修正ERCC1表达水平的携带结肠直肠腺癌肿瘤的患者生存率的预期概率和生存的时间(月)图。

图19为显示接受5-FU和奥沙利铂治疗方案的具有高(TS表达高于大约7.5×10^-3倍β-肌动蛋白基因表达，并且ERCC1高于大约4.9×10^-3倍β-肌动蛋白基因表达；n＝14)和低(TS表达低于大约7.5×10^-3倍β-肌动蛋白基因表达，并且ERCC1低于大约4.9×10^-3倍β-肌动蛋白基因表达；n＝36)的修正TS和ERCC1表达水平的携带结肠直肠腺癌肿瘤的患者生存率的预期可能性和生存的时间(月)图。

图20为显示用奥沙利铂/5-FU治疗的结肠直肠癌患者生存率相对于紫外分析的ERCC1和TS表达的表。

图21为显示用奥沙利铂/5-FU治疗的结肠直肠癌患者生存率相对于分层分析的ERCC1和TS表达的表。

图22为显示用5-FU和奥沙利铂化疗方案治疗的携带结肠直肠腺癌肿瘤的患者的应答的图。患者分为进行性疾病(PD)、部分应答(PR)和稳定的疾病(SD)。同时具有低水平的TS和ERCC1表达的患者具有最佳的应答。

图23为说明怎样相对于内部控制基因计算ERCC1表达的图表。该图表包括用两种测试样品(未知1和2)得到的数据，并说明怎样测定未修正的基因表达数据(UGE)。该图表也说明了怎样用已知的通过预-TaqMan技术测定的ERCC1值使通过TaqMan

仪器产生的UGE标准化。其是通过将UGE乘以修正因子K_ERCC1实现的。在图中的内部控制基因是β-肌动蛋白，以及校准物RNA为人肝脏总RNA(Stratagene，Cat.#735017)。

图24为说明怎样相对于内部控制基因计算TS表达的图表。该图表包括用两种测试样品(未知1和2)得到的数据，并说明怎样测定未修正的基因表达数据(UGE)。该图表也说明了怎样用先前公开的TS值使通过TaqMan

仪器产生的UGE标准化。其是通过将UGE乘以修正因子K_TS实现的。在图中的内部控制基因是β-肌动蛋白，以及校准物RNA为来自Applied Biosystems的Universal PE RNA；Cat #4307281，lot #3617812014。

图25为说明怎样相对于内部控制基因计算EGFR表达的图表。该图表包括用两种测试样品(未知1和2)得到的数据，并说明怎样测定未修正的基因表达数据(UGE)。该图表也说明了怎样用已知的通过预-TaqMan

技术测定的相对EGFR值使通过TaqMar

仪器产生的UGE标准化。其是通过将UGE乘以修正因子K_EGFR实现的。在图中的内部控制基因是β-肌动蛋白，以及校准物RNA为人肝脏总RNA(Stratagene，Cat #735017)。

图26为说明怎样相对于内部控制基因计算HER2-neu表达的图表。该图表包括用两种测试样品(未知1和2)得到的数据，并说明怎样测定未修正的基因表达数据(UGE)。该图表也说明了怎样用之前公布的HER2-neu值使通过TaqMan

仪器产生的UGE标准化。其是通过将UGE乘以修正因子K_HER2-neu实现的。在图中的内部控制基因是β-肌动蛋白，以及校准物RNA为人肝脏总RNA(Stratagene，Cat #735017)。

发明详述

本发明提供了从固定组织样品分离长片段RNA的方法。本发明的方法适于包含多种核酸的生物样品。本发明的方法在从固定的肿瘤组织样本分离RNA时特别有用。生物样品通常用固定剂固定，例如福尔马林(甲醛)(包括Bouin固定剂)和戊二醛。使用其它固定技术(例如醇浸没(Battifora andKopinski，J.Histochem.Cytochem.(1986)34：1095))固定组织样品也是合适的。所述组织样品也可以包埋在石蜡中。最常见地。组织样品被保存为福尔马林固定-石蜡包埋(FFPE)样品。

在本发明中长片段RNA定义为长于100nt的RNA。优选地，RNA长度为大约150nt以上，更优选为长度大约200nt以上，以及最优选为长度300nt以上。在某些实施方式中，长片段RNA为大约400nt以上。长片段RNA也可以包括1000nt以上的RNA片段。

一般而言，持续某段指定时间以提高的温度进行温育对于从FFPE样本提取大分子(例如RNA)是必要的。实现从石蜡回收RNA存在两种通用的方法：或者在离液剂(例如胍盐)的存在下温育FFPE样品，或者在蛋白酶K的存在下温育，蛋白酶K为降解蛋白质并可能协助从蛋白质基质中释放RNA的酶。已知这些基本方法的多种变化形式。然而，到目前为止没有专门针对从FFPE样品提取更长的RNA片段的研究或方法。通常的概念认为RNA分子随着温度的升高和暴露在高温下的时间的增加而降解。然而，温度/时间与从FFPE提取的高质量/长片段RNA物质的最大产率之间的定量关系还是未知的或者没有受到广泛的关注。此外，还不知道是否存在阈值温度，在该阈值温度下，RNA不会仅仅因为热效应而出现可观的降解。

本发明的发明人已经测定了温度和时间都对RNA质量有影响，但是温度和时间对短片段RNA(100nt以下)的影响与温度和时间对长片段RNA(片段长度大于100nt，例如300nt长度的片段)的影响没有必然的相关性。图1A和1B提供了其中FFPE样品在不同的温度(92、82、72和62℃)下温育不同时间(0.5、1、2和8小时)的结果。Y轴为Ct值。Ct值与PCR产物的量相关，因此与存在于PCR反应中的靶的原始量相关。所述相关性是反比关系，即，更大的Ct值表示更少的原始存在的靶RNA。在图1中示出的结果确认了300ntRNA为温度敏感性的，因为即使在最短的时间点(30分钟)上，在92℃的产率低于在更低温度下的产率。然而，对于100nt RNA，在30分钟和1小时的温育时间，最低的产率出现在62℃，而非92℃。即使温育较短时间，300nt长度的类型远少于100nt的类型(大约6Ct循环；2⁶＝64倍)。此外，在82℃下从0.5小时至2小时的条件下300nt的类型(Ct循环增加6(产率降低至1/64(2⁶＝64-fold decrease)))与相同条件下的100nt RNA增加的2循环(降低至原来的1/4(2²＝4))相比对热更敏感。在所有的温育时间段均是在62℃时产率的变化最小，表明阈值温度的存在，在该阈值温度以下，RNA相对稳定，并且表明在更低的温度下温育更长时间将会更高产率地更好地分离更高分子量的RNA。高于62℃的温度引起RNA随着时间的更可观的降解，而在较高温度下RNA的总产率可能会有所增加，而长片段RNA的产率降低。

图2A和2B表明在50℃下加热时间对回收各种长度的RNA类型的RNA量(产率)的影响。这些图显示当温育更长时间时，所有大小的RNA的产率都提高。如图2所示，在50℃下，在蛋白酶K的存在下加热肿瘤组织的FFPE样品从0.5小时至16小时不等的一段时间。例如，F4_0.5_1X 100BP的标记表示将样品F4加热0.5小时，以及其为100nt长度片段。随着温育时间的增加所有大小的RNA片段的产率都增加。在从短温育时间增加至长温育时间时，100nt片段的产率增加超过10倍(约3.5个PCR循环)，而300nt片段增加几乎2⁶(对应于减少6个PCR循环)或者大约60倍。对于400nt片段也发现类似的情况。观察到1000nt片段的产率的增加相对较少(大约10倍)，其可能表明在长温育时间时，提取物的增加可能被对这种大小的降解所平衡。这些数据说明从石蜡基质提取RNA具有相当大的时间依赖性，也指出在这些条件下在50℃下所有RNA片段长度的稳定性(与图1所示的82℃的情况相反)。显而易见的是更低的温育温度实质提高了300nt以及更大的RNA类型的产率，不仅仅在绝对水平上，还在相对水平上(即，在16小时的温育时间时，100bp与300bp类型的Ct差异仅为2倍)。

因此，同时参照图1和2，数据显示在92℃下RNA为热不稳定的，并且升高温度对长片段RNA特别不利。这些图也显示升高的温度、更长的温育时间比在较低的温度下更多地降解RNA。然而，如图2所示，当温度降至更适中的温度时，不存在仍然期望看到的时间依赖的降解。

因此，本发明提供了从固定组织样品(例如FFPE组织)分离长片段RNA的方法，其中，在大约45至大约62℃范围内的温度下加热组织样品持续3小时以上的时间。在其它实施方式中，在大约44至大约60℃的范围内的温度下加热固定组织样品，在更优选的实施方式中，从大约48至大约58℃，在其它优选的实施方式中，从大约48至大约55℃，在其它优选的实施方式中，从48至52℃，以及在最优选的实施方式中，从大约50℃至大约56℃。本领域的技术人员将会理解术语“大约”是用来包括在热浴、加热块和PCR机器中可能发生的小的、非实质性的温度变化，并且这些设备与设备或者实验室与实验室之间小的变化可能不具有不利的影响或净正效应(net positiveeffect)，并且这些包括在权利要求的范围内。本领域的技术人员将会理解术语“大约”指的是将接近所述温度范围的温度变化包含在权利要求的范围内，只要这些方法可用于它们预期的用途(即，分离长片段RNA)。

在上述温度下加热组织样品一段时间，这段时间是从2小时至多达20小时(以及之间的任何时间)长的任何一段时间。例如，所述时间端可以落入2小时和多达20小时之间的任意时间，以及落入所述范围的任何时间段。例如，本发明提供了以大约4小时至大约19小时、大约5小时至大约17小时、从大约6小时至大约17小时、从大约7小时至大约16.5小时，大约8小时至大约16.5小时、从大约9小时至大约16.5小时，大约10小时至大约16.25小时等的时间段加热。在优选的实施方式中，所述时间段为大约12小时至17小时，以及在更优选的实施方式中，所述时间段为大约14至大约16小时。在最优选的实施方式中，所述时间段为大约16小时。本领域的技术人员将会理解术语“大约”指的是将接近所述小时数的时间变化包含在权利要求的范围内，只要该方法可用于它们预期的用途(即，分离长片段RNA)。

本发明特别优选的一个实施方式包括在大约50℃下加热固定的组织样品(例如FFPE)大约16小时，其使长片段RNA(特别是300nt以上的RNA)的产率最大化。如上所述和如图1和2所示，在这种温度下RNA长时间稳定，因为从石蜡中提取大分子也有时间依赖性，为了实现长片段RNA的最大产率大约16小时的温育时间是理想的(且在该温度下是可能的)。

本发明还包括在蛋白酶K的存在下加热固定的组织样品。如上所述，蛋白酶K可用于提取最大量的RNA。然而，如果在分离过程中使用过量的蛋白酶K，其也将从基质中释放更多的DNA，导致RNA制备物的更高的DNA污染。图4显示在从石蜡基质取出RNA的温育步骤中蛋白酶K的量的变化的效果。例如标记F4_16_1X_100bp的样品，其代表样品F4，加热16小时，使用1X(5μg)量的蛋白酶K，比F4_16_2X_100bp(2X＝10μg)和F4_16_4X_100bp(4X＝20μg)样品具有更低CT值。在300bp和400bp大小的RNA(参见对于那种大小的RNA具有最低CT阈值的样品F4_16_1X_300bp和F4_16_1X_400bp)中也观察到类似的情形。因此，优选5μg蛋白酶K/400μL(12.5μg蛋白酶K/mL)的浓度。然而，如实施例19所示，其它量的蛋白酶K可以成功地使用(即，0.5x、1x、2x、4x)。也可以使用蛋白酶K的替代物(alternatives)，包括但不限于，Qiagen

蛋白酶、brofasin(从Bromelia fastiasa中提取的植物蛋白酶)和从Carica candamarcensis中分离的半胱氨酸蛋白酶。

通常加入用于螯合二价以上的金属离子的EDTA(乙二酸四乙酸)作为提取缓冲液组分。然而，对在提取缓冲液中使用EDTA的已知方法的研究表明在FFPE提取操作中的EDTA浓度范围较宽，其表明其他人并没有认识到存在EDTA的某个特定浓度或防止二价金属离子对RNA分子的影响所必需的某个特定浓度。图3显示温育时间和EDTA浓度的影响。除了在蛋白酶K的存在下温育16小时的过程中将样品暴露于不同的温度(50、60和70℃)，根据在实施例1中描述的方法处理FFPE组织样品。此外，在提取溶液中使用四种不同的EDTA浓度(0.1、0.5、3.6和20mM)。图3A显示3.6mM的EDTA浓度得到更高产率的长片段RNA，通常产率增加到2倍以上。图3也说明了在50℃的温育温度下得到了所有大小的RNA的最高产率(比在60℃时高大约25％，并且比在70℃高大约4倍)。低浓度的EDTA(0.1mM)降低RNA的产率达2-3倍，与使用3.6mM相比，当使用20mM的高水平时，产率降低了大约25％。

因此，本发明的方法进一步提供了螯合剂(例如EDTA)在提取溶液中的用途。螯合剂为广为人知的能够形成多价金属离子络合物的有机化合物。同样地，除了EDTA外的其它螯合剂也可以用于本发明的方法中。所述螯合剂可以选自那些常用的螯合剂。例如，EDTA类、EGTA类、柠檬酸盐(柠檬酸钠)类、柠檬酸类、水杨酸类、水杨酸盐类、邻苯二甲酸类、2，4-戊二酮类、组氨酸类、二盐酸组氨醇类、8-羟基喹啉类、8-羟基喹啉类、柠檬酸盐类和邻羟基醌类为本领域内已知的代表螯合剂。在优选的实施方式中，采用EDTA或柠檬酸钠。参见实施例15。

所述螯合剂可以以大约0.1mM至大约15mM的浓度，以及在该范围内的任意浓度或浓度范围存在。优选的实施方式包括大约2.5mM至大约5.0mM浓度的螯合剂。优选的实施方式包括大约3.0mM至大约4.0mM浓度的螯合剂。更优选的实施方式包括大约3.25至大约3.75mM浓度的螯合剂。最优选地，所述螯合剂以大约3.6mM的浓度存在，以及在最优选的实施方式中，所述螯合剂为EDTA或柠檬酸钠，并且以大约0.6mM至大约3.6mM存在，或者以大约3.6mM存在。本领域的技术人员将会理解术语“大约”指的是将接近所述mM量的变化包含在权利要求的范围内，只要这些方法可用于它们预期的用途(即，分离长片段RNA)。

长温育时间(例如在本发明中所使用的)的缺点(与在较高温度下使用离液剂的短温育时间相对)为可观量的DNA能够与RNA一起被共提取，导致在技术背景部分中描述的有关RNA分析的潜在困难。通常在操作的提取后阶段通过用脱氧核糖核酸酶(DNA酶)处理样品从而处理DNA污染。而这种试剂可以有效地降低DNA的量，其也可以使分离的RNA量减少4-8倍，其可以给本来组织含量不充裕的样本分析造成严重的损失。因此，本发明也提供了一种分离方法，该分离方法不需要使用DNA酶，并且取而代之地在蛋白酶K步骤之后使用两次苯酚/氯仿提取法(double phenol/chloroformextraction method)。所述两次苯酚/氯仿提取法涉及使用特异性去除大多数DNA而保持RNA的产率的离液剂。

在优选的实施方式中，使用离液剂的两次苯酚/氯仿提取法共分离少于10％的DNA。

所述两次苯酚/氯仿提取步骤包括进行至少一次第一和第二苯酚/氯仿提取，其中所述第二苯酚/氯仿提取包含离液剂。可以使用任意的离液剂。离液剂通过抑制核酸酶活性而使核酸稳定。例如，已知的离液剂包括，但不限于尿素、异硫氰酸胍、硫氰酸钠(NaSCN)、盐酸胍(Guanidine HCl)、盐酸胍(guanidinium chloride)、硫氰酸胍、四氯乙酸锂、高氯酸钠、四氯乙酸铷、碘化钾和三氟乙酸铯等。

也可以采用去除DNA污染的其它方法(只要它们不显著地破坏长片段RNA即可)，包括，但不限于使用市售产品(例如Qiagen的纯化柱(使用或者不使用DNA酶)和Ambion Turbo无DNA酶的方法。

在去除DNA污染之后，使用已知的方法(例如醇或异丙醇沉淀)分离RNA。

人们似乎通常认为一旦被福尔马林固定并包埋在石蜡基质中RNA分子将会无限期地保持稳定，因而存档样品的时间不再是问题。然而，总RNA(所有大小和片段)确实随着时间减少，只是非常缓慢，本发明人已经测定更长片段的RNA并不是这样。在时间更久的FFPE样本中，300nt以上的RNA片段的丰度显著减少。图10显示在1991年固定的样品(样品1、2、3、4和5)比在2005年固定的样品(D7、D9和F3)得到更低产率和更低质量的RNA。因此，对于其中长片段RNA是重要的应用，FFPE组织样品应该为5年时间或更短的。然而，仍然在16年的样品中得到了长片段RNA(数据没有显示)。因此，在本发明的一个实施方式中，固定样品的时间少于5年。在更优选的实施方式中，样品的时间少于3年，并且在最优选的实施方式中，样品的时间少于2年。

通过本发明的方法分离的RNA适于多种目的和分子生物学流程，包括，但不限于：逆转录成cDNA；在基因芯片、寡核苷酸微阵列等上产生放射性标记、荧光标记或以其它方式标记的cDNA用于分析；通过丙烯酰胺的电泳或琼脂糖凝胶电泳；通过色谱法纯化(例如，离子交换、硅胶、反相或大小排阻色谱)；与核酸探针杂交；和通过机械、声波或其他手段片段化。

通常在癌症领域，生物标志物的表达是诊断的关键，也是确定治疗方案的关键。本发明的方法可以用于分离用于任何期望的生物标志物的RNA。实例包括但不限于，Kras、MMR1、ERCC1、DPD、Gst-pi、EGFR、TS和Her2-neu。

因此，本发明不仅提供了分离长片段RNA的方法，也提供了由本发明公开的方法分离的RNA。本发明的另一实施方式提供了通过复制本发明的分离的RNA制备的cDNA。本领域的技术人员将会理解cDNA可以容易地由分离并纯化的RNA制备。此外，本发明的另一方面提供了使用分离的RNA或由分离的RNA制备的cDNA制备微阵列或基因芯片。本发明也提供了本发明的分离的RNA在为了治疗或诊断目的分析基因表达或基因拷贝数中的用途，正如在癌症的检测/诊断中经常出现的，以及在基于基因表达水平或基因拷贝数确定适当的化疗方案的领域中。使用适当的PCR引物，任意信使RNA的表达水平可以通过本发明的方法测定。定量RT-PCR技术使得可以比较在石蜡包埋的蛋白表达水平(通过免疫组织化学)与相同样品的基因表达水平(使用RT-PCR)。

ERCC1

本发明的某些实施方式部分归属于如下发现，即发现肿瘤中的ERCC1mRNA的量与用DNA铂剂(platinating agent)治疗的患者的生存率相关。肿瘤表达高水平ERCC1 mRNA的患者被认为很有可能对基于铂的化疗具有抗性，因此具有较低水平的生存率。相反地，那些肿瘤表达少量ERCC1 mRNA的患者很可能对基于铂的化疗敏感，并具有更高水平的生存率。患者的肿瘤ERCC1 mRNA相对表达是通过将其与预先确定的阈值表达水平比较来判断的。

因此，本发明的一个实施方式提供了相对于内部控制的基因表达定量在固定并石蜡包埋(FPE)组织中ERCC1长片段mRNA表达量的方法。本发明人已经开发了寡核苷酸引物，其可以精确评估已经固定并包埋的组织中的ERCC1表达。本发明提供了寡核苷酸引物ERCC1-504F(SEQ ID NO：1)、ERCC1-574R(SEQ ID NO：2)或基本与之相同的寡核苷酸引物的用途，优选与从固定并石蜡包埋(FPE)的肿瘤样品中提取的长片段RNA一起使用(优选使用本发明的提取方法)。那么，ERCC1基因表达的这种测量可以用于基于铂的化疗的预后。参见实例，美国专利第6,573,052号，在此通过题述并入。

照这样，本发明的一个实施方式包括：首先，从FPE样品提取长片段RNA，和其次，通过使用一对寡核苷酸引物，优选寡核苷酸引物对ERCC1-504F(SEQ ID NO：1)和ERCC1-574R(SEQ ID NO：2)，或者与其基本相同的寡核苷酸，测定样品中的ERCC1 mRNA的含量以进行逆转录酶聚合酶链式反应。优选地，通过本发明中披露的任何方法从FPE细胞提取RNA。

本发明方法可以应用于来自患者的任何类型的组织。为了检验肿瘤组织的抗性，优选检查肿瘤组织。在优选的实施方式中，也检验从其中获得肿瘤的患者的正常组织的部分。预期其正常组织对基于铂的化疗的化合物具有抗性，即，显示高水平的ERCC1基因表达，但是预期其肿瘤对这种化合物敏感，即，显示低水平的ERCC1基因表达的患者，则可以用更大量所述化疗组合物处理。

显示低于阈值水平的ERCC1基因表达水平的患者可以用更大量的化疗组合物处理，因为他们预期比具有表达高于阈值水平的ERCC1基因表达水平的肿瘤的患者具有更大的生存率。或者，临床医师可以决定：假定他们的预期生存率低，肿瘤的ERCC1基因表达水平高于阈值水平的患者可能不会从化疗中获得显著的益处。

本发明的方法可以应用于广泛范围的肿瘤类型。这使得可以制备个体的“肿瘤表达谱”，由此测定个体患者样品中的ERCC1的表达水平，并预测对各种化疗的应答。优选地，将关于ERCC1的本发明的方法应用于实体瘤，最优选地，应用于非小细胞肺癌(NSCLC)肿瘤。为了将本发明的一些实施方式应用于特定肿瘤类型，优选通过编译数据组确认ERCC1基因表达水平与生存率之间的关系，所述数据组能够使特定ERCC1表达与临床对基于铂的化疗的抗性相关联。

在本发明中所定义的“预先确定的阈值水平”，如果其涉及ERCC1，为修正的相对ERCC1肿瘤表达水平，在该水平之上时，发现肿瘤很可能对基于铂的化疗方案有抗性。在所述阈值水平以下的肿瘤表达水平，很可能存在于对基于铂的化疗方案敏感的肿瘤中。修正的ERCC1的相对表达的范围，表示为ERCC1：β-肌动蛋白的比率，在对基于铂的化疗方案有应答的肿瘤中低于大约6.7×10^-3。对基于铂的化疗方案没有应答的肿瘤的ERCC1：β-肌动蛋白的相对表达比率高于大约6.7×10^-3。参见实施例7。

“预先确定的阈值水平”进一步定义为如涉及ERCC1时，作为肿瘤修正相对ERCC1表达水平，在该水平之上接受基于铂的化疗方案的患者很可能具有低生存率。接受基于铂的化疗方案的患者中肿瘤修正相对ERCC1表达水平低于该阈值水平对应于高的患者生存率。阈值修正相对ERCC1表达，表示为ERCC1：β-肌动蛋白的比率，为大约6.7×10^-3。参见图11，实施例7。然而，本发明并不限于将β-肌动蛋白用作内部控制基因。

如在本发明中所讨论的通过本发明的任意的方法从FPE组织提取RNA。在本发明中描述的固定并石蜡包埋的(FPE)组织样品指的是可存储或归档的组织样品。可以从归档病理样品或活检样品(首先去石蜡)分离RNA。例如，示例性的去石蜡的方法包括用有机溶剂(例如二甲苯)清洗涂有石蜡的样品。用低级醇的水溶液可以使去石蜡样品再水合。例如，合适的低级醇包括，甲醇、乙醇、丙醇类和丁醇类。连续用浓度依次降低的低级醇溶液清洗可以使去石蜡样品再水合。或者，使样品同时去石蜡和再水合。然后，从样品中提取RNA。

例如，使用本领域常用的逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)方法，优选对来自新鲜、冷冻或固定的样品的纯化总mRNA中的ERCC1 mRNA进行定量。定量ERCC1 mRNA的其它方法包括，例如，使用分子信标和在多重PCR中有用的其它标记探针。此外，本发明设想通过使用采用例如类似于Invader

Assay(Third Wave Technologies，Inc.)的荧光标记探针的无PCR体系(PCR-free system)来定量ERCC1 mRNA。最优选地，使用基于荧光的实时检测法(ABI PRISM 7700或7900 Sequence Detection System[TaqMan

]，Applied Biosystems，Foster City，Calif.)或者如Heid等人(Genome Res 1996；6：986 994)和Gibson等人(Genome Res 1996；6：995 1001)所述的类似体系完成ERCC1 cDNA和内部控制或管家基因(例如，β-肌动蛋白)的定量。ABI 7700(TaqMan

Instrument)的输出表示为Ct′s或“循环阈值”。使用TaqMan系统，在样品中具有更大量靶分子的高表达基因比具有更少的靶分子(更高的Ct)的较低相对表达的基因需要更少的PCR循环(更低的Ct)来产生信号。

如在本发明中所使用，“管家”基因或“内部控制”意味着包括任意组成型表达或全局表达的基因，它的存在使得能够评估靶mRNA水平(例如，但不限于ERCC1、TS、DPD、Her2-neu、Gst-pi、RRM1、Kras等)。这种评估包括对基因转录的全部组成性水平的测定和RNA回收时的变化的对照。“管家”基因或“内部控制”可以包括，但不限于亲环蛋白基因、β-肌动蛋白基因、转铁蛋白受体基因、GAPDH基因等。最优选地，所述内部控制基因为Eadset al.，Cancer Research 1999；59：2302 2306所述的β-肌动蛋白基因。

在RNA回收时的变化的对照需要使用“校准物RNA”。该“校准物RNA”指的是任意可得的精确预定量的对照RNA的来源。优选使用人肝脏总RNA(Stratagene，Cat.#735017)。

在本发明中所使用的“未修正的基因表达(UGE)”指的是靶基因表达相对于通过TaqMan

仪器产生的内部控制基因的数值输出。用于测定ERCC1的UGE的方程示于实施例6中，并用图12中的样品计算进行说明。

本发明的另一方面提供了使通过TaqMan

仪器使用来自非-TaqMan

技术的“已知的相对基因表达”值得到的未修正基因表达(UGE)值标准化的方法。优选地，将已知的非TaqMan

产生的ERCC1：β-肌动蛋白表达值用来自组织样品的由TaqMan

产生的ERCC1 UGE值标准化。

在本发明中使用的“修正的相对ERCC1表达”指的是标准化的ERCC1表达，其中将UGE乘以ERCC1特异性修正因子(K_ERCC1)，得到可以相对于内部控制基因与已知范围的ERCC1表达水平的相比较的值。实施例6和图12具体地阐明了这些计算。这些数值使得可以确定具体样品的“修正的相对ERCC1表达”是否落在“预先确定的阈值”水平之上或之下。对于β-肌动蛋白水平的修正相对ERCC1表达的预先确定阈值水平为大约6.7×10^-3。对于ERCC1、内部控制β-肌动蛋白和校准物人肝脏总RNA(Stratagene，Cat.#735017)的特定K_ERCC1为1.54×10^-3。

“已知相对基因表达”源自之前分析的组织样品，并且是以靶基因的RT-PCR信号与组成型表达的内部控制基因(例如，β-肌动蛋白，GAPDH等)的比率为基础的。优选地，这些组织样品为福尔马林固定并且石蜡包埋(FPE)样品，以及RNA是根据本发明中所述的方法从其中提取的。为了使基因表达相对于内部控制定量，使用本领域已知的标准定量RT-PCR技术。进行固定循环次数(即，30次)的预-TaqMan

技术PCR反应，并报告各样品的端点值。然后，将这些值作为ERCC1表达与β-肌动蛋白表达的比率报告。参见美国专利第5,705,336号(Reed等)。

可以测定除β-肌动蛋白外的内部控制基因和/或不同于人肝脏总RNA(Stratagene，Cat.#735017)的校准物RNA的K_ERCC1。为了进行这样的测定，必须同时将内部控制基因和校准物RNA对于组织样品进行校准，对于该组织样品，相对于特定的内部控制基因的ERCC1表达水平已经被测定(即，“已知的相对基因表达”)。优选地，这些组织样品为福尔马林固定并且石蜡包埋(FPE)的样品，并且使用在本发明中公开的方法提取RNA。可以使用本领域已知的标准的预-TaqMan

、定量RT-PCR技术进行这种测定。通过这样的测定，这些样品具有ERCC1的“已知的相对基因表达”水平，其可用于在测定如实施例6中所述的对新内部控制和/或校准物RNA特异性的新K_ERCC1。

一般而言，位于ERCC1基因侧翼区域的任意的寡核苷酸对可以用于实施本发明的方法。在严紧条件下与用于本发明的ERCC1基因的区域杂交的引物将会扩增20-1000碱基对，优选100-400碱基对，最优选大约200-400碱基对的产物。

本发明提供了特异性的寡核苷酸引物对和与其基本相同的寡核苷酸引物，其使得可以特别精确地评估FPE组织中的ERCC1表达。优选的寡核苷酸引物包括，ERCC1-504F(SEQ ID NO：1)和ERCC1-574R(SEQ ID NO：2)，(在本说明说中也称作寡核苷酸引物对ERCC1)和与其基本相同的寡核苷酸引物。在严紧条件下，所述寡核苷酸引物ERCC1-504F(SEQ ID NO：1)和ERCC1-574R，(SEQ ID NO：2)杂交至ERCC1基因，并显示对于使用RNA测量ERCC1 mRNA水平特别有效，所述RNA是通过任意分离mRNA的方法，特别是通过本发明公开的方法，从FPE细胞提取的。

如在本发明中所使用的在核酸环境中的“基本相同”指的是在严紧条件下杂交至靶，并且也指核酸区段，或者其互补链，进行比较时，当带有适当的核苷酸插入和删除进行恰当比对时，至少大约60％的核苷酸，典型地，至少大约70％，更典型地，至少大约80％，通常，至少大约90％，以及更通常为大约95％至98％的核苷酸相同。当杂交比完全缺乏特异性更具选择性时，存在选择性杂交。参见Kanehisa，Nucleics Res.，12：203 213(1984)。

本发明包括基本相同的寡核苷酸，其在严紧条件下(如在说明书中所定)杂交至ERCC1-504F(SEQ ID NO：1)、其补体或ERCC1-574R(SEQ ID NO：2)、或其补体的寡核苷酸引物序列的全部或部分。

在严紧杂交条件下，仅仅高度互补，即，基本相似的核酸序列杂交。优选地，这些条件防止在20个连续核苷酸中具有4个或更多个错配的核酸，更优选为在20个连续核苷酸中具有2个或更多个错配的核酸，最优选为在20个连续核苷酸中具有1个或多个错配的核酸杂交。

所述核酸的杂交部分长度通常为至少10(例如15)个核苷酸。杂交核酸的杂交部分与本发明中提供的寡核苷酸引物的部分或全部的序列或它们的补体为至少大约80％，优选至少大约95％，或者最优选大约至少98％相同的。

在严紧条件下寡核苷酸引物杂交至核酸样品的定义如下。核酸双链体或杂交体稳定性表示为解链温度(T_m)，其是探针从靶DNA中离解的温度。该解链温度用于定义所需的严紧条件。如果待鉴定的序列与探针基本相同，而非完全相同，那么要使其有用，首先要确立最低温度，在该最低温度下在特定的盐(例如SSC或SSPE)浓度下仅仅发生同源杂交。然后假设1％的错配导致T_m下降1℃，杂交反应中的最终清洗温度也相应降低(例如，如果寻求与探针具有＞95％的同一性的序列，那么最终的清洗温度降低5℃)。在实践中，T_m变化为每1％错配0.5℃～1.5℃。

严紧条件包括在68℃，5×SSC/5×Denhart′s溶液/1.0％ SDS中杂交，以及在室温下在0.2×SSC/0.1％ SDS中清洗。中等严紧条件包括在42℃下在3×SSC中清洗。改变盐浓度和温度的参数以实现引物与靶核酸之间的最佳同一度水平。关于这些条件的另外的手册在本领域易于获得，例如，Sambrook，Fischer and Maniatis，Molecular Cloning，a laboratory manual，(2nd ed.)，ColdSpring Harbor Laboratory Press，New York，(1989)and F.M.Ausubel等eds.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons(1994)。

在本发明中公开的寡核苷酸引物能够允许精确地评估在固定或固定并石蜡包埋的组织中，以及冷冻或新鲜组织中的ERCC1基因表达。尽管相对于从新鲜或冷冻的组织中得到的RNA，从FPE样品得到的RNA更碎。因此，本发明的方法适于在测定FPE组织中的ERCC1表达水平时使用，而以前没有办法使用固定组织测定ERCC1基因表达。

从测量在肿瘤中表达的ERCC1 mRNA的量中，熟练的开业医生可以做出关于肿瘤对特定基因毒素(genotoxin)的临床抗性或接受特定基因毒素的患者的生存率的预后。示例性的基于铂的化疗或诱导类型相似的DNA损伤的化疗为基因毒素。

基于铂的化疗导致DNA的“大加合物(bulky adduct)”，其中主要效果是使双螺旋的三维构象扭曲。这种化合物应该单独使用，或者与其他化疗(例如吉西他滨(Gem)或5-氟尿嘧啶(5-FU))一起使用。

基于铂的基因毒物(genotoxic agents)的化疗包括重金属配位化合物，其形成共价DNA加合物。一般而言，这些重金属化合物与DNA共价结合以在相关的部位形成顺式-1，2-链内二核苷酸加合物。一般而言，这类的代表为顺式二氯二氨合铂(II)(顺铂)，并包括顺式-二氨-(1，1-环丁烷二甲酸)铂(II)(cis-diammine-(1，1-cyclobutanedicarboxylato)platinum(II))(卡铂)、顺式-二氨-(1，2-环己基)二氯铂(II)(cis-diammino-(1，2-cyclohexyl)dichloroplatinum(II))和顺式-(1，2-乙二氨)二氯铂(II)(cis-(1，2-ethylenediammine)dichloroplatinum(II))。铂首选的药剂(first agents)包括前述代表性化合物的同型物或衍生物。

目前容易被铂配位化合物控制的肿瘤包括睾丸癌、子宫内膜癌、宫颈癌、胃的、鳞状细胞癌、肾上腺皮质癌和小细胞肺癌，以及成神经管细胞瘤和成神经细胞瘤。反式-二氯二氨合铂(II)(反式-DDP)由于其DNA加合物的快速修复，通常被认为是无用的。在此使用反式-DDP作为化疗剂可能将会提供这样的化合物，其在未选择的细胞中具有低毒性，而在选择的细胞中具有高相对毒性。在优选的实施方式中，所述铂化合物为顺铂。

许多化合物通常与基于铂的化疗剂一起提供。例如，BEP(博来霉素(bleomycin)、依托泊苷(etoposide)、顺铂(cisplatin))用于睾丸癌，MVAC(甲氨蝶呤(methotrexate)、长春花碱(vinblastine)、多柔比星(doxorubicin)、顺铂)用于膀胱癌，MVP(丝裂霉素C(mitomycin C)、长春花碱、顺铂)用于非小细胞肺癌治疗。大量研究已经证实含铂药剂之间的相互作用。例如，已经报道潜在地包括在基于铂的化疗中的许多药物具有治疗药物的协同作用。关于这些报道的一个非常简短的近期参考文献清单如下：Okamoto等，Urology 2001；57：188-192.；Tanaka等，Anticancer Research 2001；21：313-315；Slamon等，Seminars in Oncology 2001；28：13-19；Lidor等，Journal of Clinical Investigation1993；92：2440-2447；Leopold等，NCI Monographs 1987；99-104；Ohta等，Cancer Letters 2001；162：39-48；van Moorsel等，British Journal of Cancer 1999；80：981-990。

其它遗传毒物为形成永久基因组损伤的那些，以及在癌症的临床管控中优选用作化疗剂。基因毒素诱导的DNA损伤的细胞修复速率、以及通过细胞分裂周期的细胞生长速率，影响基因毒素治疗的结果。细胞基因组中的未修复的损伤会妨碍DNA复制，削弱新合成的DNA的复制保真度或妨碍细胞存活需要的基因表达。因此，基因毒物细胞毒性的一个决定因素(倾向促成细胞死亡)是其中形成的基因组损伤对细胞修复的抗性。形成永久基因损伤(例如，保持在基因组中至少直至细胞进行细胞周期的损伤)的基因毒物，通常比形成暂时的、容易修复的基因组损伤的药剂是更有效的细胞毒素。

用于治疗许多癌症以及受ERCC1表达水平影响的基因毒性化合物的一般类型为DNA烷化剂和DNA插入试剂(intercalating agent)。补骨脂素(psoralen)为已知的在皮肤病(cutaneous disease)(例如银屑病(psoriasis)、白癜风(vitiligo)、真菌感染和皮肤T细胞淋巴瘤(cutaneous T cell lymphoma))的光化疗处理中有用的基因毒性化合物。Harrison′s Principles of Internal Medicine，Part 2 Cardinal Manifestations of Disease，Ch.60(12th ed.1991)。基因毒性化合物的另一普通的类型，可以烷基化或插入DNA中的基因毒性化合物成员，包括合成和天然来源的抗生素。本发明中特别感兴趣的为抗肿瘤抗生素，其包括但不限于如下化合物代表的化合物种类：安吖啶(amsacrine)；放线菌素(actinomycin)A，C，D(或者称为更生霉素(dactinomycin))或F(或者称为KS4)；重氮丝氨酸(azaserine)；博莱霉素(bleomycin)；洋红霉素(carminomycin)(卡柔比星(carubicin))、道诺霉素(daunomycin)柔红霉素(daunorubicin))或14-羟基道诺霉素(14-hydroxydaunomycin)(阿霉素(adriamycin)或多柔比星(doxorubicin))；丝裂霉素(mitomycin)A、B或C；米托蒽醌(mitoxantrone)；普卡霉素(plicamycin)(光神霉素(mithramycin))；等。

常用的且烷基化DNA的基因毒物的又一类型为包括卤代乙基亚硝基脲类，特别是氯乙基亚硝基脲类的基因毒物。这一大类的代表性的成员包括卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)和链唑霉素(streptozotocin)。卤代乙基亚硝基脲类首选药剂可以为任意的前述代表性化合物的类似物或衍生物。

其中的成员可使DNA烷基化的基因毒物的另一常见类型包括硫和氮芥。这些化合物主要通过在鸟嘌呤的N7原子上形成共价的加合物损害DNA。这一大类的代表性的成员包括苯丁酸氮芥(chlorambucil)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、异环磷酰胺(ifosfamide)、美法仑(melphalan)、双氯乙基甲胺(mechloroethamine)、新氮芥(novembicin)、曲磷胺(trofosfmide)等。如果期望选择一个或多个预定义的基因组靶作为基因组损伤的基因座，那么在选择的细胞的基因组中与特定的序列共价或非共价地相互作用的寡核苷酸或其类似物也可以用作基因毒物。其中成员使DNA烷基化的另一类药物包括氮丙啶类(ethylenimines)和甲基三聚氰胺类(methylmelamines)。例如，这些种类包括六甲蜜胺(altretamine)(六甲蜜胺(hexamethylmelamine))、三亚乙基磷酰胺(triethylenephosphoramide)(TEPA)、三亚乙基硫化磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)(ThioTEPA)和三亚乙基三聚氰酰胺(triethylenemelamine)。

DNA烷化剂的另一种类包括烷基磺酸盐类，代表为白消安(busulfan)；azinidines类，代表为苯佐替派(benzodepa)；和其它，代表有例如，米托胍腙(mitoguazone)、米托蒽醌(mitoxantrone)和丙卡巴肼(procarbazine)。这些类型包括各代表性化合物的类似物和衍生物。

DPD

本发明人公开了寡核苷酸引物和与其基本相同的寡核苷酸引物，其允许精确地评估组织中的DPD表达。当将这些寡核苷酸引物，DPD3a-51F(SEQID NO：5)和DPD3a-134R(SEQ ID NO：6)(在本发明中也称作寡核苷酸引物对DPD3A)和寡核苷酸引物DPD3b-65IF(SEQ ID NO：7)和DPD3b-736R(SEQ ID NO：8)(在本发明中也称作寡核苷酸引物对DPD3B)(参见美国专利第7,005,278号，在此通过提述并入)用于测量在固定的石蜡包埋的(FPE)肿瘤样本中的DPD基因表达时特别有效。

本发明包括基本上相同的寡核苷酸，其在严紧条件(如在本发明中所限定)下与全部或部分寡核苷酸引物序列DPD3A-51F(SEQ ID NO：5)、其补体、DPD3A-134R(SEQ ID NO：6)或其补体杂交。此外，本发明还包括基本上相同的寡核苷酸，其在严紧条件(如在本发明中所限定)下与全部或部分寡核苷酸引物序列DPD3b-651F(SEQ ID NO：7)，其补体，DPD3b-736R(SEQ ID NO：8)，或其补体杂交。

所述核酸的杂交部分的长度通常为至少10个(例如15个)核苷酸。所述杂交的核酸的杂交部分与部分或全部的寡核苷酸引物DPD3A-51F(SEQ IDNO：5)，其补体，DPD3A-134R(SEQ ID NO：6)或其补体的序列至少大约80％，优选至少大约95％，或者最优选大约至少98％相同。此外，所述杂交的核酸的杂交部分与部分或全部的寡核苷酸引物DPD3b-651F(SEQ ID NO：7)，其补体，DPD3b-736R(SEQ ID NO：8)或其补体的序列至少大约80％，优选至少大约95％，或最优选大约至少98％相同。

本发明的这方面包括使用本发明中所述的方法从FPE样本中使用可靠的提取RNA的方法，然后，通过使用寡核苷酸引物寡核苷酸引物对DPD3A(DPD3a-51F(SEQ ID NO：5)和DPD3a-134R(SEQ ID NO：6))或与其基本相同的寡核苷酸，或者DPD3B(DPD3b-65 IF(SEQ ID NO：7)和DPD3b-736R(SEQID NO：8))或与其基本相同的寡核苷酸进行逆转录酶聚合酶链式反应来测定样本中的DPD mRNA的含量。参见美国专利申请序列号第09/469,338号，于1999年12月20日提交，在此通过提述并入。

DPD mRNA的表达与对基于5-FU的化疗的临床抗性相关。具体而言，DPD mRNA的高水平表达与对基于5-FU的化疗的临床抗性相关。

本发明的方法应用于大范围的肿瘤类型。这将允许制备个体的“肿瘤表达谱”，这就是为何在个体患者样品中可以测定DPD的表达水平，并可以预测对各种化疗的反应。最优选地，将本发明的方法用于支气管肺泡(bronchalveolar)、小肠或结肠肿瘤。为了将本发明的一些实施方式应用于特定的肿瘤类型，优选确认测量值与临床抗性的关系，其通过编译一份有关测得的特定DPD表达参数与对基于5-FU化疗的临床抗性之间的相关性的数据集来进行。

本发明的方法可以应用于任何类型的组织。例如，为了检查肿瘤组织的抗性，希望检查肿瘤组织。优选地，希望也检查从其身上获得肿瘤的患者的部分的正常组织。其正常组织对基于5-FU的化疗化合物有抗性，而预期其肿瘤对这种化合物敏感的患者则可以用更大量的化疗组合物处理。

本发明的方法包括从患者肿瘤得到细胞样品的步骤。从患者身上外科手术切下实体瘤或淋巴瘤，或其部分。如果不能在其切除之后不久从组织样品提取RNA，那么可以固定或冷冻该样品。其然后将用于得到RNA。通过本领域内的任意方法(例如，Sambrook，Fischer and Maniatis，Molecular Cloning，a laboratory manual，(2nd ed.)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，(1989)从切除组织的冷冻或新鲜样品提取或分离RNA。优选地，注意在提取过程中避免RNA的降解。

或者，例如，可以将从患者身上得到的组织固定，优选通过福尔马林(甲醛)或戊二醛处理。本发明中也考虑了用醇浸没固定生物样品。通常将固定的生物样品脱水并包埋在石蜡或本领域的技术人员已知的其它固体支持物上。这种固体支持物预期能够用有机溶剂去除，使得可以进行保存组织的后续的再水合。在本发明中所述的固定并且石蜡包埋(FPE)的组织样本是指可存储或归档的组织样品。通过本发明所述的任意方法从FPE细胞提取RNA。

例如，优选使用本领域常见的逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)方法进行从新鲜、冷冻或固定样品纯化的总mRNA定量DPD mRNA。定量DPDmRNA的其它方法包括，例如，使用分子信标和在多重PCR中有用的其它标记探针。此外，本发明设想通过使用无PCR体系(PCR-free system)来定量DPD mRNA，所述无PCR体系采用类似于Invader

Assay(Third WaveTechnologies，Inc.)的荧光标记探针。最优选地，使用基于荧光的实时检测方法(ABI PRISM 7700或7900 Sequence Detection System[TaqMan

]，AppliedBiosystems，Foster City，Calif.)或者由Heid等，(Genome Res 1996；6：986-994)和Gibson等(Genome Res 1996；6：995-1001)所述的类似体系进行DPD cDNA和内部控制或管家基因(例如β-肌动蛋白)的定量。ABI 7700(TaqMan

Instrument)的输出表示为Ct′s或“循环阈值”。使用TaqMan

体系，在样品中具有更多靶分子的高表达基因产生信号所用的PCR循环与具有更少靶分子的低相对表达的基因(较高Ct)相比更少(较低Ct)。

本发明的一个方面部分归功于发现DPD mRNA的相对量与对化疗剂5-FU的抗性相关。在本发明中已经发现表达高水平DPD mRNA的肿瘤很可能对5-FU有抗性。相反地，表达少量DPD mRNA的那些肿瘤很可能对5-FU敏感。通过将患者肿瘤的DPD mRNA的表达与DPD预先确定的阈值表达水平比较来对其进行评判。

在本发明中所使用的“未修正的基因表达(UGE)”如涉及DPD是指相对于由TaqMan仪器产生的内部控制基因的DPD表达的数值输出。用于测定UGE的方程示于实施例8中，并用图15的样品计算来示例。

本发明的另一方面提供了标准化未修正的基因表达(UGE)值的方法，该未修正的基因表达值是使用从非-TaqMan技术中得到的先前公开的相对基因表达值从TaqMan

仪器得到的。优选地，用从组织样品得到的DPD UGE标准化由非-TaqMan

得到的相对DPD：β-肌动蛋白表达值，其由Salonga等人先前公开，Clinical Cancer Research，6：1322-1327，2000，在此全部通过提述并入。

在本发明中使用的“未修正的相对DPD表达”指的是标准化的DPD表达，其中将UGE乘以DPD特异性修正因子(K_DPD)，所得的值可以与先前公开的数值范围比较。图15详细地示例了这些计算。

“先前公开的”相对基因表达结果以靶基因的RT-PCR信号与组成型表达基因(β-Actin)的比率为基础。在预-TaqMan

技术研究中，进行固定次数的(即，30次)循环的PCR反应，并报告各样品的端点值。然后，这些值作为DPD表达与β-肌动蛋白表达的比率报告。Salonga，等，Clinical Cancer Research，6：1322-1327，2000，在此全部通过提述并入。

如在本发明中所定义的相对DPD表达的“预先确定的阈值”水平为DPD表达水平，发现在该水平之上时肿瘤很可能对5-FU有抗性。该阈值水平以下的表达水平很可能存在于对5-FU敏感的肿瘤中。在对基于5-FU化疗方案应答的肿瘤中，相对DPD表达的范围为小于大约0.6×10^-3至大约2.5×10^-3(大约4.2倍的范围)。对基于5-FU的化疗方案无应答的肿瘤具有大约0.2×10^-3至大约16×10^-3(大约80倍的范围)的相对DPD表达。如果相对DPD表达大于大约2.0×10^-3，优选大于大约2.5×10^-3，那么肿瘤通常对5-FU的治疗无应答。这些数值使得可以测定特定样品的“修正的相对DPD表达”是否落入“预先确定的阈值”水平之上或之下。修正的相对DPD表达水平的阈值水平为大约2.0×10^-3至大约2.5×10^-3。

本发明的方法可适用于宽范围的组织和肿瘤类型，因而可以用于评估患者的治疗，以及作为包括乳腺癌、头颈癌、肺癌、食管癌、结肠直肠癌和其它癌症的一系列癌症的诊断或预后手段。优选地，将本发明的方法应用于支气管肺泡癌、小肠癌或结肠癌的预后。

基于测量肿瘤中表达的DPD mRNA的量，熟练的开业医师可以做出关于肿瘤对基于5-FU化疗的临床抗性的预后。“基于5-FU的化疗”包括单独或与其他化疗剂(例如亚叶酸钙)一起施用5-FU、其衍生物，或者与DPD抑制剂(例如尿嘧啶、5-乙炔尿嘧啶、溴代乙烯尿嘧啶、胸腺嘧啶、苯甲氧基苯甲基尿嘧啶(benzyloxybenzyluracil)(BBU)或5-氯-2，4-二羟基嘧啶)一起施用。此外，已经发现，与5-FU或其衍生和DPD抑制剂5-乙炔尿嘧啶的组合相比，共施用式(I)的5′-脱氧-胞苷衍生物与5-FU或其衍生物显著地改善了化疗剂向肿瘤组织的选择性递送，并且在人癌症异种移植模型中显示出显著改善的抗肿瘤活性。

ERCC1/TS

本发明部分依赖于发现TS和ERCC1 mRNA的量分别与对5-FU和奥沙利铂药物的抗性相关。表达高水平的TS和ERCC1 mRNA的肿瘤被认为很有可能对基于铂的化疗有抗性。相反地，那些表达少量的TS和ERCC1 mRNA的肿瘤很有可能对基于铂的化疗敏感。通过将患者的肿瘤的TS和ERCC1mRNA表达状态与预先确定的阈值表达水平比较来对其进行评判。

本发明提供了相对于内部对照的基因表达定量固定或固定并石蜡包埋(FPE)的组织中TS和ERCC1 mRNA表达量的方法。除了上述讨论的ERRCC1引物外，本发明的发明人开发了允许准确评估在已经固定或固定并包埋的组织中TS基因表达的寡核苷酸引物。本发明还提供了寡核苷酸引物，TS-763F(SEQ ID NO：9)、TS-825R(SEQ ID NO：10)，或者与其基本上相同的寡核苷酸引物，优选与从固定并石蜡包埋的(FPE)肿瘤样品中提取的RNA一起使用。参见美国专利第7,049,059号，在此通过提述并入。然后这种对TS和ERCC1基因表达的测量可以用于对基于铂的化疗的预后。

本发明的这个实施方式包括，首先，如在本发明中所述的从FPE样品可靠地提取RNA的方法，以及其次，通过使用上述的ERCC1和TS寡核苷酸引物对或者与其基本相同的寡核苷酸用于进行逆转录酶聚合酶链式反应来测定样品中的TS和ERCC1 mRNA的含量。

本发明可以应用于来自患者的任意类型的组织。为了检查肿瘤组织的抗性，优选检查肿瘤组织。在优选的实施方式中，也对来自从其身上获得肿瘤的患者的部分的正常组织进行检查。其正常组织预期对基于铂的化疗化合物有抗性(即，显示高水平的TS和ERCC1基因表达)，而其肿瘤预期对这种化合物敏感(即，显示低水平的TS和ERCC1基因表达)的患者，那么可以使用更高量的化疗组合物治疗。

本发明的方法可以用于大范围的肿瘤类型。这将允许制备个体的“肿瘤表达谱”，由此可以测定个体患者样品中的TS和/或ERCC1的表达水平，并可以预测对各种化疗的应答。优选地，将本发明的方法应用于实体瘤，最优选地用于结肠直肠腺癌肿瘤。

如在本发明中定义的涉及TS的“预先确定的阈值水平”为如下TS表达水平，发现高于该表达水平肿瘤很可能对基于5-FU和基于5-FU和奥沙利铂的化疗方案有抗性。在所述阈值水平以下的表达水平很可能存在于对基于5-FU或基于5-FU和奥沙利铂的化疗方案敏感的肿瘤中。在对基于5-FU或基于5-FU和奥沙利铂的化疗方案有应答的肿瘤中，表示为TS：β-肌动蛋白的比率的TS相对表达的范围为小于大约7.5×10^-3。对基于5-FU或基于5-FU和奥沙利铂的化疗方案无应答的肿瘤具有高于大约7.5×10^-3的TS：β-肌动蛋白比率的相对表达。

在实施本发明的方法时，测定患者的肿瘤样品中的ERCC1表达水平和TS表达水平以预测基于5-FU和奥沙利铂的化疗方案的效力。此外，在本发明的方法中，测定患者肿瘤样品中的TS表达水平以预测基于5-FU的化疗方案的效力。此外，在本发明的方法中，测定患者肿瘤样品中的ERCC1表达水平以预测基于奥沙利铂的化疗反感的效力。或者，仅仅测定患者肿瘤样品中TS表达水平的表达水平以预测基于5-FU和奥沙利铂的联合化疗方案的效力。

在实施本发明这种实施方式的方法时，优选从患者身上分离肿瘤细胞。从患者身上通过外科手术切下实体瘤或者淋巴瘤或其部分，或者通过常规活检得到。通过本领域内任意的典型方法(例如，Sambrook，Fischer and Maniatis，Molecular Cloning，a laboratory manual，(2nd ed.)，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York，(1989))从细胞提取分离自冷冻或新鲜样品的RNA。优选地，注意在提取过程中避免RNA的降解。

通过如上所述的任意的方法从FPE细胞提取RNA。例如，优选使用本领域内常用的逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)方法进行对来自纯化的总mRNA中TS和ERCC1 mRNA的定量，所述纯化的总mRNA来自新鲜、冷冻或固定样品。定量TS或ERCC1 mRNA的其它方法包括，例如，使用分子信标和在多重PCR中有用的其它标记探针。此外，本发明设想通过使用采用例如类似于Invader

Assay(Third Wave Technologies，Inc.)的荧光标记探针的无PCR体系定量TS和/或ERCC1 mRNA。最优选地，使用基于荧光的实时检测法(ABI PRISM 7700或7900 Sequence Detection System[TaqMan

]，Applied Biosystems，Foster City，Calif.)或者如Heid等人(Genome Res 1996；6：986 994)和Gibson等人(Genome Res 1996；6：995 1001)所述的类似体系完成TS和/或ERCC1 cRNA和内部控制或管家基因(例如，β-肌动蛋白)的定量。ABI 7700(TaqMan

Instrument)的输出表示为Ct′s或“循环阈值”。使用TaqMan

系统，在样品中具有更多靶分子的高表达基因产生信号使用的循环比具有较少的靶分子(较高Ct)的较低相对表达的基因少(较低Ct)。

在本发明中所使用的“未修正的基因表达(UGE)”指的是TS和/或ERCC1表达相对于通过TaqMan

仪器产生的内部控制基因的数值输出。用于测定UGE的方程示于实施例10和11中，并用在图23和24示例了样品计算。

如在本发明中使用的“修正的相对TS表达”指的是标准化的TS表达，其中将UGE乘以TS特异性修正因子(K_TS)，得到可以相对于内部控制基因与已知范围的TS表达水平相比较的值。实施例10和图24详细地示例了这些计算。这些数值允许测定特定样品的“修正的相对TS表达”是否落在“预先确定的阈值”水平之上或之下。修正的相对TS表达与β-肌动蛋白水平之比的预先确定的阈值水平为大约7.5×10^-3。TS、内部控制β-肌动蛋白和校准物Universal PE RNA；(Cat #4307281，lot #3617812014，来自Applied Biosystems)的K_TS为12.6×10^-3。

可以测定除β-肌动蛋白之外的内部控制基因和/或不同于Universal PERNA(Cat #4307281，lot #3617812014，来自Applied Biosystems)的校准物RNA的K_TS。为了进行这样的测定，必须同时将内部控制基因和校准物RNA对于组织样品进行校准，对于该组织样品，相对于特定的内部控制基因的TS表达水平已经被测定(即，“已知的相对基因表达”或“之前已公开”)。优选地，这些组织样品为福尔马林固定并石蜡包埋(FPE)的样品，并且根据本发明中的反感从它们提取RNA。可以使用本领域公知的标准的预-TaqMan

、定量RT-PCR技术进行这种测定。通过这样的测定，这些样品具有TS的“已知的相对基因表达”水平，其可用于测定对新的内部控制和/或校准物RNA特异性的新K_TS，如实施例10中所述。

“先前公开”的相对基因表达结果为基于靶基因RT-PCR信号与组成型表达基因(β-肌动蛋白)的比率。在预-TaqMan技术研究中，进行固定循环次数(即，30次)的PCR反应，并报告各样品的端点值。然后将这些值报道为ERCC1或TS表达与β-肌动蛋白表达的比率。Salonga，等，Clinical Cancer Research，6：1322 1327，2000，在此通过提述以其整体并入。

本发明的方法可应用于大范围的组织和肿瘤类型，所以可以用于评估患者的临床治疗，并作为包括乳腺癌、头颈癌、肺癌、食管癌、结肠直肠癌和其它癌症的一系列癌症的诊断或预后手段。在优选的实施方式中，本发明的方法应用于结肠直肠腺癌的预后。

预-化疗治疗肿瘤活检通常只能作为固定石蜡包埋(FPE)组织获得，通常仅含非常少量的非均质组织。这种FPE样品易于进行显微切割，从而可以在没有被间质组织污染的肿瘤组织中测定TS和ERCC1基因表达。此外，在活检组织样品内对间质和肿瘤组织进行比较，因为这些样品通常同时包含这两种类型的组织。

位于TS基因区侧翼的任意寡核苷酸对可以用于实施本发明的方法。在严紧条件下与本发明中使用的TS基因区杂交的引物将扩增20-1000碱基对，优选100-400碱基对，最优选地为200-400碱基对的产物。

HER2-neu/EGFR

表达高水平HER2-neu和/或EGFR mRNA的肿瘤被认为很可能对受体酪氨酸激酶靶向性化疗敏感。相反地，表达少量HER2-neu和EGFR mRNA的那些肿瘤不太可能对受体酪氨酸激酶靶向性化疗敏感。患者的差异性HER2-neu和EGFR mRNA的表达状态是通过将其与预先确定的阈值表达水平进行比较来判断的。

本发明提供了相对于内部控制的基因表达对在新鲜、冷冻、固定或固定并石蜡包埋(FPE)的组织中的HER2-neu和/或EGFR mRNA表达量进行定量的方法。本发明人开发了允许精确评估新鲜、冷冻、固定或固定并包埋的组织中HER2-neu和EGFR基因表达的寡核苷酸引物。所述寡核苷酸引物，EGFR-1753F(SEQ ID NO：11)、EGFR-1823R(SEQ ID NO：12)，或者与其基本上相同的寡核苷酸引物，优选与从新鲜、冷冻、固定或固定并石蜡包埋(FPE)的肿瘤样品中提取的RNA一起使用。本发明也提供了寡核苷酸引物，HER2-neu 2671F(SEQ ID NO：13)、HER2-neu 2699R(SEQ ID NO：14)(参见美国专利第6,582,919号，在此通过提述并入)，或者与其基本上相同的寡核苷酸引物，优选与从新鲜、冷冻、固定或固定并石蜡包埋(FPE)的肿瘤样品提取的RNA一起使用。然后可以将HER2-neu和/或EGFR基因表达的这种测量用于受体酪氨酸激酶靶向性化疗的预后。

本发明的这个实施方式包括从新鲜、冷冻、固定或FPE样品中可靠地提取RNA的方法，和使用本发明中所述的方法并通过使用寡核苷酸引物对，优选寡核苷酸引物对EGFR-1753F(SEQ ID NO：11)和EGFR-1823R(SEQ IDNO：12)，或与其基本上相同的寡核苷酸进行逆转录酶聚合酶链式反应来测量样品中的EGFR mRNA含量。

本发明的另一实施方式包括从新鲜、冷冻、固定或FPE样品可靠地提取RNA的方法，和使用本发明中所述的方法并通过使用寡核苷酸引物对，优选寡核苷酸引物对HER2-neu 2671F(SEQ ID NO：13)、HER2-neu 2699R(SEQID NO：14)，或者与其基本上相同的寡核苷酸引物对进行逆转录酶聚合酶链式反应来测量样品中的HER2-neu mRNA含量。

本发明的方法可应用于大范围的肿瘤类型。这使得可以制备个体的“肿瘤表达谱”，由此测定个体患者样品中HER2-neu和/或EGFR的表达水平，并预测对各种化疗的应答。优选地，本发明的方法可以应用于实体瘤，最优选地NSCLC肿瘤。

在本发明中所定义的“差异性表达水平(differential expression level)”指的是在肿瘤中或者EGFR或者HER2-neu的表达水平分别相对于在匹配的非恶性组织样品中的或者EGFR或者HER2-neu表达水平的差异。通过将来自肿瘤样品的特定基因的UGE除以来自匹配的非恶性组织样品的相同基因的UGE来测定差异性表达水平。

如在本发明中定义的涉及EGFR表达的“预先确定的阈值水平”为这样的差异性EGFR表达水平，高于该差异性EGFR表达水平(即，高)时，肿瘤很可能对受体酪氨酸激酶靶向性化疗方案敏感。高差异性EGFR表达水平是较低的患者生存率的预后。具有低于这种阈值水平的表达水平的肿瘤不太可能受到受体酪氨酸激酶靶向性化疗方案的影响。低的差异性EGFR表达水平为较高患者生存率的预后。通过Mafune等人(Clin Cancer Res 5：4073-4078，1999)使用的方法测定差异性表达是否高于或低于“预先确定的阈值水平”，Mafune等人计算了在从患有食管鳞状上皮细胞癌的患者得到的匹配的非恶性组织中个体的差异性肿瘤/正常(T/N)表达比。Mafune等，Clin Cancer Res5：4073-4078，1999。基于获得自匹配的非恶性组织的个体背景表达，该分析方法产生针对各患者的精确表达值。如果在肿瘤样品中的EGFR：β-肌动蛋白的UGE除以在匹配的非恶性组织样品中的EGFR：β-肌动蛋白的UGE高于大约1.8的预先确定的阈值，则EGFR的差异性表达被认为是“高”的，并且指示低的生存率。如果在肿瘤样品中的EGFR：β-肌动蛋白的UGE除以在匹配的非恶性组织样品中的EGFR：β-肌动蛋白的UGE低于大约1.8的预先确定的阈值，则EGFR的差异性表达被认为是“低”的，并且指示高的生存率。

如在本发明中定义的设计差异性HER2-neu表达的“预先确定的阈值水平”为这样的HER2-neu表达水平，高于该水平(即，高)，肿瘤很可能对受体酪氨酸激酶靶向性化疗方案敏感。高的差异性HER2-neu表达水平为较低的患者生存率的预后。具有低于该阈值水平的表达水平的肿瘤不太可能受到受体酪氨酸激酶靶向性化疗方案的影响。低差异性HER2-neu表达水平为较高的患者生存率的预后。如果在肿瘤样品中的HER2-neu：β-肌动蛋白的UGE除以在匹配的非恶性组织样品中的HER2-neu：β-肌动蛋白的UGE高于大约1.8的预先确定的阈值，则HER2-neu的差异性表达被认为是“高”的，并且指示低的生存率。如果在肿瘤样品中的HER2-neu：β-肌动蛋白的UGE除以在相应的非恶性组织样品中的HER2-neu：β-肌动蛋白的UGE低于大约1.8的预先确定的阈值，则HER2-neu的差异性表达被认为是“低”的，并且指示高的生存率。

使用如下的结果和方法测定HER2-neu的阈值水平。表示为HER2-neu与β-肌动蛋白PCR产物的比率的修正的HER2-neu mRNA表达，在正常的肺中为4.17×10^-3(范围0.28-23.86×10³)，而在肿瘤组织中为4.35×10^-3(范围：0.21-68.11×10^-3)(P＝0.019 Wilcoxon检验)。由Miller和Siegmund(Miller等，Biometrics 38：1011-1016，1982)和Halpern(Biometrics 38：1017-1023，1982)的最大的卡方法(maximal chi-square method)测定了1.8的阈值将患者分为低和高差异性HER2-neu表达者。依照该标准，29位(34.9％)患者具有高差异性HER2-neu表达，54位(65.1％)具有低差异性HER2-neu表达。

使用下面的结果和方法测定的EGFR的“阈水平”。中位数的修正EGFRmRNA表达，在正常的肺中为8.17×10^-3(范围：0.31-46.26×10^-3)，而在肿瘤组织中为7.22×10^-3(范围：0.27-97.49×10^-3)(P＝n.s.)。由最大卡方法(Miller(1982)；Halpern(1982))测定了1.8的阈值将患者分为低和高差异性EGFR表达者。依照该标准，28位(33.7％)患者具有高差异性EGFR表达，和55位(66.3％)具有低差异性EGFR表达。

在实施本发明的方法的过程中，测定患者的或者差异性EGFR表达水平或者差异性HER2-neu表达水平以预测受体酪氨酸激酶靶向性化疗方案的效力。此外，在本发明的方法中，测定患者的差异性HER2-neu表达水平以预测受体酪氨酸激酶靶向性治疗方案的效力。此外，在本发明的方法中，测定患者的差异性EGFR表达水平以预测受体酪氨酸激酶靶向性治疗方案的效率。或者，同时测定患者的差异EGFR表达水平和差异性HER2-neu表达水平以预测受体酪氨酸激酶靶向治疗性方案的效力。

在本发明中定义的“匹配的非恶性样品”指的是源自与用于差异性EGFR和/或差异性HER2-neu表达分析的肿瘤样品相同的个体的非癌组织的样品。优选地，匹配的非恶性样品与肿瘤样品源自相同的器官。最优选地，所述匹配的非恶性肿瘤样品与肿瘤样品来自相同的器官组织层次。此外，优选在取匹配的非恶性组织样品的同时进行肿瘤样品的活检。在优选的实施方式中，分析来自下面的两个位置的组织：肺肿瘤和取自距离肿瘤尽可能地最远的非恶性肺组织，或者结肠肿瘤和在该情形下距离肿瘤尽可能地最远的非恶性结肠组织。

在实施本发明这种实施方式的方法中，优选从患者分离肿瘤细胞。从患者身上外科手术切下或者通过常规的活检得到实体瘤或淋巴瘤或其部分。通过本领域任意典型的方法(例如，Sambrook，Fischer and Maniatis，MolecularCloning，a laboratory manual，(2nd ed.)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，(1989))从细胞提取从冷冻或新鲜肿瘤样品中分离的RNA。优选地，在提取过程中，注意避免RNA的降解。

然而，通常将活检后从患者身上得到的组织固定，例如通常被福尔马林(甲醛)或戊二醛，或者通过醇浸没固定。固定的生物学样品通常被脱水并包埋在石蜡或本领域的技术人员已知的其它固体支持物上。参见Plenat等，AnnPathol January 2001；21(1)：29-47。未包埋的、固定组织和固定并包埋的组织也可用于本发明的方法。例如，设想用于包埋固定的组织的固体支持物可以用有机溶剂去除，使得可以对保存的组织进行后续的再水合。

RNA通过本发明中所述的任意方法从石蜡包埋(FPE)的组织细胞提取。例如，优选使用本领域常见的逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)方法对来自纯化的总mRNA的HER2-neu或EGFR mRNA进行定量，所述纯化的总mRNA来自新鲜、冷冻或固定的组织。定量HER2-neu或EGFR mRNA的其它方法包括，例如，使用分子信标和在多重PCR中有用的其它标记探针。此外，本发明设想通过使用无PCR系统来定量HER2-neu和/或EGFR mRNA，所述无PCR系统采用，例如，类似于Invader

Assay(Third Wave Technologies，Inc.)的荧光标记的探针。最优选地，使用基于荧光的实时检测方法(ABIPRISM 7700或7900 Sequence Detection System[TaqMan]，AppliedBiosystems，Foster City，Calif.)或由Heid等，(Genome Res 1996；6：986-994)和Gibson等(Genome Res 1996；6：995-1001)所述的类似系统进行HER2-neu和/或EGFR cDNA和内部控制或管家基因(例如，β-肌动蛋白)的定量。ABI 7700(TaqMan

Instrument)的输出表示为Ct′s或“循环阈值”。使用TaqMan

系统，在样品中具有更多的靶分子的高表达基因产生信号所用的PCR循环比具有较少的靶分子(较高Ct)的较低相对表达的基因少(较低Ct)。

如在本发明中使用的“未修正基因表达(UGE)”指的是HER2-neu和/或EGFR表达相对于由TaqMan

仪器产生的内部控制基因的数值输出。用于测定UGE的方程示于实施例12和13中，并用在图25和26中实例了样品计算。

这些数值允许测定差异性基因表达(即，“UGE”或者特定肿瘤样品“UGE”除以匹配的非肿瘤样品的“UGE”)是否落在所述“预先确定的阈值”水平之上或之下。EGFR和HER2-neu的预先确定的阈值水平为大约1.8。

该本发明的另一方面提供了标准化未修正的基因表达(UGE)值的方法，该值是使用自非-TaqMan

技术得到的“已知的相对基因表达”值从TaqMan

仪器得到的。优选地，将通过TaqMan

从组织样品得到HER2-neu和/或EGFRUGE值相对于样品用从非TaqMan

得到的相对HER2-neu和/或EGFR：β-肌动蛋白表达值标准化。

在本发明使用的“修正相对EGFR表达”指的是标准化的EGFR表达，其中将UGE乘以EGFR特异性修正因子(K_EGFR)，得到可以相对于内部控制基因与已知范围的EGFR表达相比的值。实施例12和图25示例了这些计算的细节。对于EGFR、内部控制β-肌动蛋白和校准物人肝脏总RNA(Stratagene，Cat #735017)特异性的K_EGFR为26.95×10^-3。这些数值也允许测定特定肿瘤样品的“修正的相对表达”除以匹配的非肿瘤样品的“修正的相对表达”(即，差异性表达)是否落在“预先确定的阈值”水平之上或之下。HER2-neu或EGFR的预先确定的阈值水平为大约1.8。在测定肿瘤样品中的或者EGFR或者HER2-neu的差异性表达是否大于匹配的非肿瘤样品的1.8倍，将容易认识到可以使用或者UGE值或者修正的相对表达值。例如，如果将肿瘤的修正的相对表达水平除以匹配的非肿瘤样品，那么K-因子相互抵消并得到的与使用UGE值相同的比率。

从先前分析的组织样品得到“已知相对基因表达”值，并且该值是基于靶基因的RT-PCR信号与组成型表达内部控制基因(例如，β-肌动蛋白，GAPDH等)的比率。优选地，这些组织样品为被福尔马林固定并石蜡包埋(FPE)样品，并且根据在本发明的方案从其中提取RNA。为了定量相对于内部控制的基因表达，使用本领域已知的标准定量RT-PCR技术。进行固定次数循环(即，30)的预-TaqMan技术PCR反应，并报道各样品的端点值。然后将这些值作为EGFR表达与β-肌动蛋白表达的比率报告。

可以测定除β-肌动蛋白之外的内部控制基因和/或不同于人肝脏总RNA(Stratagene，Cat #735017)的校准物RNA的K_EGFR。为了进行这种测定，必须同时相对于组织样品校准内部控制基因和校准物RNA，对于该组织样品，已经测定了相对于特定内部控制基因的EGFR表达水平(即，“已知的基因表达”)。优选地，这些组织样品为被福尔马林固定并石蜡包埋(FPE)样品，并且根据在实施例1中描述的方案从其中提取RNA。使用本领域公知的标准预-TaqMan

定量RT-PCR技术可以进行这种测定。通过这种测定，这些样品具有EGFR的“已知相对基因表达”水平，其可用于测定对新的内部控制和/或校准物RNA特异性的新K_EGFR，如实施例12中所述。

如在本发明中使用的“修正相对HER2-neu表达”指的是标准化的HER2-neu表达，其中UGE乘以HER2-neu特异性修正因子(K_HER2-neu)，得到可以相对于内部控制基因与已知范围的HER2-neu表达水平比较的值。实施例13和图26详细地说明了这些计算。对HER2-neu、内部控制β-肌动蛋白和校准物人肝脏总RNA(Stratagene，Cat #735017)特异性的K_HER2-neu为13.3×10^-3。

可以测定除β-肌动蛋白之外的内部控制基因和/或不同于人肝脏总RNA(Stratagene，Cat #735017)的校准物RNA的K_HER2-neu。为了进行这样的测定，必须同时相对于组织样品校准内部控制基因和校准物RNA，对于该组织样品，已经测定了相对于具体内部控制基因的HER2-neu表达水平(即，“已知的基因表达”)。优选地，这些组织样品为福尔马林固定并石蜡包埋(FPE)样品，并且根据本发明描述的方案从其中提取RNA。例如，使用本领域公知的标准预-TaqMan

，定量RT-PCR技术可以进行这种测定。通过这种测定，这些样品具有HER2-neu的“已知相对基因表达”水平，其可用于测定对新的内部控制和/或校准物RNA特异性的K_HER2-neu，如实施例13中所述。

本发明的方法可以应用于大范围的组织和肿瘤类型，因而可以用于评估患者的临床治疗，并且作为一系列的癌症(包括乳腺癌、头颈癌、肺癌、食管癌、结肠直肠癌和其它癌症)的诊断或预后手段。在优选的实施方式中，本发明应用于NSCLC肿瘤的预后。

预-化疗治疗肿瘤活检通常仅可作为固定石蜡包埋(FPE)样品获得，其通常仅含非常少量的非均质组织。这种FPE样品容易进行显微切割，因此可以在未被非恶性间质组织污染的肿瘤组织中测定HER2-neu和/或EGFR基因表达。此外，可以在活检组织样品中对非恶性间质和肿瘤组织进行比较，因为这些样品通常同时包含所述两种类型组织。

一般而言，位于EGFR基因区侧翼的任意寡核苷酸对，如SEQ ID NO：10中所示，可以用于实施本发明的方法。在严禁条件下与EGFR基因区杂交的引物将扩增大约20-1000个碱基对，优选100-400个碱基对，最优选200-400碱基对的产物。

而且，在HER2-neu基因区侧翼的任意寡核苷酸对可以用于进行本发明的方法。在严紧条件下与HER2-neu基因区杂交的引物可以扩增20-1000个碱基对，优选100-400个碱基对，最优选200-400个碱基对的产物。

HER2-neu的过度活性指的是与细胞增殖病症相关的编码HER2-neu的基因的扩增或HER2-neu活性水平的产生(即，随着HER2-neu水平的增加，细胞增殖病症的一种或多种症状的严重度增加)。

通过下面提供的实验实施例示例本发明的做法，从而描述本发明。本领域的从业人员将会理解的是在所述示例性的实施例中使用的材料和方法可以以多种方式修改。这些修改被认为是落入本发明的范围内。

实施例

实施例1：长片段RNA的提取步骤

I.组织制备

使用标准的实验流程在没有盖玻片的载玻片上封固包含FFPE组织的10微米截面的石蜡块。为了去石蜡并进行核坚牢红(nuclear fast red)(NFR)染色，将载玻片如下处理：

将载玻片用二甲苯清洗两次，每次5分钟，接着用乙醇(“EtoH”)清洗。使用标准的实验流程用NFR染色所述载玻片。

用手工或用激光捕获显微切割器(laser capture microdissector)(取决于切去的面积大小)切下目标区域(例如，肿瘤组织或间质组织)。

II.RNA提取

制备包含Tris/HCL、EDTA、SDS和水的提取溶液。向离心管中的提取溶液加入肿瘤组织和蛋白酶K。然后为得到最大产率的长片段RNA，在适当的温度下加热样品适当的时间，例如，在50℃下加热大约16小时。在加热步骤后，将样品转移至更大的试管中，并加入2M乙酸钠(NaOAC)。进行苯酚/氯仿/异戊醇(PCI)提取。将上层水相转移至新的干净的试管中，并加入糖原。用异丙醇(iPrOH)沉淀RNA。将沉淀的RNA(pelleted RNA)与离液剂(例如0.5％的肌氨酸-胍-异硫氰酸盐(GITC))混合。还向试管中加入二硫苏糖醇(DTT)。加入5mM Tris并混合。然后，加入2M NaOAc和PCI，涡旋震荡，并在冰上温育试管。旋转离心(spin)试管，并将上层水相转移至包含糖原的新试管中。再次沉淀RNA(使用iPrOH)，并用乙醇清洗。将RNA悬浮在5mMTris中。

III.PCR定量

使用通过本发明的方法得到的提取RNA，按照前人所述(36，37)进行cDNA制备(35)和实时RT-PCR定量(36，37)。对于每个提取物进行一式三份PCR。将该数据作为β-肌动蛋白基因的Ct值报告。该Ct值表明PCR产物的量，而因此涉及存在于PCR反应中的靶的原始量。所述关系为反比关系，即，Ct数越大表明原始存在的靶cDNA越少。各PCR循环表明在数量上的两倍差异，因而，例如，两次PCR反应之间4-循环Ct差异意味着在cDNA含量上的16倍差异(2⁴＝16)。

实施例2：测定分离的RNA的长度分布的方法

为了测定从FFPE组织中分离的各种RNA片段长度的相对量，使用如下的策略。使用寡聚dT引物将使用本发明和其它已知的提取方法从FFPE样本中分离的RNA转化为cDNA。这意味着只有包含3’-寡聚A尾的mRNA片段将会被延伸并转化为cDNA，从而为测量片段长度提供起点。β-肌动蛋白mRNA的PCR扩增用来表示总mRNA群体。选择引物以扩增代表距mRNA的3’-端100、300、400和1000bp位置的β-肌动蛋白基因的大约100-120bp的区段(图2)。使用这种策略，会使扩增的长度依赖性效力上的任何差异最小化，而非实际尝试扩增100、300、400和1000bp片段。因此，各引物组的PCR产物的Ct应该几乎代表了各片段大小的量的真实比率。

表1：用于测定RNA片段的长度的策略，该RNA片段是通过扩增定位于距编码区3’-端大约100-300、400和1000bp的β-肌动蛋白区段而从FFPE组织分离的。

	扩增
	扩增	100bp	距离3’端21-105
300bp	距离3’端206-293	100bp	距离3’端21-105
300bp	距离3’端206-293	400bp	距离3’端322-407
1000bp	距离3’端1050-1110	400bp	距离3’端322-407

实施例3：蛋白酶K的效果

本实施例示例蛋白酶K浓度对RNA产率和DNA污染的效果。在50℃，在0.5、2、3和16小时的温育时间下，在4倍范围内(5-20μg，如在图中表示的1X-4X)改变蛋白酶K浓度。如图4所示，1X(5μg)的蛋白酶K得到更大的量好大约2倍(1Ct)的RNA产率，然而更重要的是，大于1X的蛋白酶K的量得到可见的较高的DNA污染(2-3Ct循环)。该实验也示例了温育时间对提取的DNA量的影响，16小时温育时间比较短的温育时间好3至7个Ct循环。在没有首先进行逆转录反应将RNA转化为cDNA(“无逆转录或NRT对照”)的情况下通过实施PCR检测提取物中的DNA。这样，仅仅发生对共提取的DNA的PCR扩增，如果其太高则可能在RNA的PCR定量中有高背景值，因而导致数据不可信。

实施例4：DNA共提取的最小化

本实施例示例从FFPE提取物选择性地去除DNA而使RNA的损失最小的流程。在去除更多DNA的尝试中，进行实验以测试包含离液剂，GITC的第二苯酚/氯仿提取步骤的效率。比较下面的提取方法的RNA产率和DNA污染：

1.在92℃下温育FFPE组织30分钟，并用苯酚/氯仿/异戊醇(“PCI”)提取(“RGI”法)，或者也称作“高温离液剂法”。其为快速短温育高温法，其之前开发用来从FFPE中提取RNA用于进行基因表达的高通量RT-PCR定量。在美国专利第6,248,535号中描述了在此用于比较目的的这种方法，并且其包括用PCI的一次提取，接着用异丙醇(“iPrOH”)沉淀并用乙醇(“EtOH”)清洗。将本发明的一个实施方式与RGI法比较，并将该方法称作“PK”。

2.PK(50℃，16小时，使用蛋白酶K)+PCI+iPrOH+EtOH(即，单次的苯酚/氯仿提取)；

3.PK+GITC和PCI+iPrOH+EtOH(在单次苯酚/氯仿提取步骤中加入GITC)；

4.PK+PCI+iPrOH+EtOH+GITC+PCI+iPrOH+EtOH(使用两次苯酚/氯仿提取，并在第二苯酚/氯仿提取中包括GITC)；

5.PK+PCI+iPrOH+EtOH+加入Tris+PCI+iPrOH+EtOH(使用两次苯酚/氯仿提取，并在第二苯酚/氯仿提取中用Tris代替GITC)。

图5显示这些实验的结果。高温(RGI)法产生最少的DNA污染，因为温育时间短，但是RNA的产率也低(各系列的第一条柱子)。长温育PK法产生更多的RNA，但是具有高DNA污染(第二条柱子)。在第一提取步骤中加入GITC的效果导致DNA更少，但是也导致RNA产率的降低(第三条柱子)。在第二苯酚/氯仿提取步骤中使用GITC的效果为仅比单次苯酚/氯仿提取的RNA产率稍低(大约1Ct循环)(第四条柱子)。然而，与单次苯酚/氯仿提取相比，DNA也减少了7Ct循环(NRT系列的第四条柱子)。当使用Tris代替第二苯酚/氯仿提取中的GITC时，RNA的产率保持不变，但是DNA仅仅减少3Ct循环(第五条柱子)，说明在第二苯酚/氯仿提取步骤中离液剂是理想的。从上面的结果可以得出结论：包含离液剂GITC的第二苯酚/氯仿提取步骤就RNA产率和最低DNA污染而言是最有效的。

实施例5：通过PK提取法提取的RNA与通过两种其它提取法提取的RNA的比较

根据几种不同的标准，本实施例评估通过本发明的方法(“PK”法)提取的RNA。

图6显示对通过PK法、RGI法(如上所述)和Paradise试剂盒(Arcturus，Co.，Mountain View，CA)从肿瘤样品B5、D6和F5分离的RNA总量进行的分光光度计定量，所述Paradise试剂盒为使用柱纯化步骤从FFPE样品分离RNA的市售可得的方法。如较高的UV吸收所表明的，在测试的3种样品中PK法得到比Paradise试剂盒更高产率的总RNA，但是却不如RGI法的总RNA产率高。对于2/3的通过PK法分离的样品，表明RNA纯度的260/280吸光度比接近于1.8(纯RNA的该比值为1.8)。

图7比较了在肿瘤样品F5、D5和D6中通过PK法、RGI法和Paradise试剂盒分离的100、300、400和1000bp RNA片段的量。通过PCR扩增测定了各片段的定量的量。数据显示PK法就RNA产率和DNA污染而言给出了最佳结果。通过图7中较高的UV吸收表明的RGI法明显较高的RNA产率与在本实验中通过PCR表明的较低产率之间存在明显矛盾，这可能是因为高温方法产生很多非常短的片段，其促成了在260nm处的总体光吸收，但是由于它们较短的长度而不能被PCR的引物-探针组扩增。

图8比较了通过PK法、RGI法和Paradise试剂盒分离的RNA片段的大小分布。在Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies，Palo Alto，CA)上根据制造商的说明书使用RNA 6000 Nano Assay并使用Agilent 2100Bioanalyzer软件分析通过所述三种方法提取的RNA。该分析仪通过在大小排阻柱上的洗脱时间分离寡核苷酸，长度越短的RNA流出更快，并因此在点线图中更接近y轴。RGI法主要得到短片段，而通过本发明的方法(PK法)分离的RNA给出了一系列片段大小，其中较长片段的产率比Paradise法更高。

图9显示使用本发明的方法(PK法)从FFPE组织分离的RNA中β-肌动蛋白的基因表达与使用常规酸性硫氰酸胍苯酚氯仿(AGPC)法(Chomczynskiand Saachi，Anal Biochem(1987)162：156-159)从匹配的新鲜冷冻组织组分离的RNA中β-肌动蛋白的基因表达的比较。用分离自新鲜-冷冻和FFPE匹配样本组的RNA获得了相关性优异的β-肌动蛋白基因表达(R＝0.89)。

实施例6：测定ERCC1的未修正的基因表达(UGE)

进行两对平行反应，即，“测试”反应和“校准”反应。ERCC1扩增反应和β-肌动蛋白内部控制扩增反应为测试反应。在校准物RNA模板上进行单独的ERCC1和β-肌动蛋白的扩增反应，并称作校准反应。所述TaqMan

仪器将会得到四个不同的循环阈(Ct)值：从测试反应中得到的Ct_ERCC1和Ct_β- _肌动蛋白和从校准反应中得到的Ct_ERCC1 and Ct_{β-肌动蛋白}。根据下面的方程测定两种反应的Ct值的差异：

ΔCt_测试＝Ct_ERCC1-Ct_{β-肌动蛋白}(来自“测试”反应)

ΔCt_校准物＝Ct_ERCC1-Ct_{β-肌动蛋白}(来自“校准反应”)

接下来的步骤包括根据以下方程进行以2为底数的-ΔCt次方的幂运算。

2^-ΔCt _测试(来自“测试反应”)

2^-ΔCt _校准物(来自“校准反应”)

为了从TaqMan

仪器得到ERCC1的未修正的基因表达，进行下面的计算。

ERCC1的未修正基因表达(UGE)＝2^-ΔCt _测试/^-ΔCt _校准物

使用已知的相对ERCC1表达水平使UGE标准化

标准化计算需要用UGE乘以对ERCC1和具体的校准物RNA特异性的修正因子(K_ERCC1)。也可以测定任何内部控制基因和任何精确预定量的校准物RNA的修正因子K_ERCC1。优选地，使用内部控制基因β-肌动蛋白和精确预-定量的校准物RNA人肝脏总RNA(Stratagene，Cat.#735017)。设定这些反应物的修正因子K_ERCC1等于1.54×10^-3。

使用由TaqMan

的制造商Applied Biosystems在User Bulletin #2中描述并在上文描述的ΔCt法的修正形式进行标准化。为了实施该过程，使用前面所述的TaqMan

方法针对ERCC1表达分析了6种不同测试组织的UGE。使用内部控制基因β-肌动蛋白和校准物RNA人肝脏总RNA(Stratagene，Cat.#735017)。

将各样品AG221、AG222、AG252、成人肺、PC3、AdCol的已知相对ERCC1表达水平除以其相应的由TaqMan

得到的UGE以得到未被平均的修正因子K。

K_未被平均＝已知的值/UGE

接下来，平均所有的K值以测定对ERCC1、校准物RNA人肝脏总RNA(Stratagene，Cat.#735017)和β-肌动蛋白特异性的单一K_ERCC1修正因子。

因此，为了在与预-TaqMan

ERCC1表达研究相一致的规格内测定未知组织样品中的修正的相对ERCC1表达，假定使用相同的内部控制基因和校准物RNA，只需要将来自TaqMan

仪器的未修正的基因表达数据(UGE)乘以K_ERCC1特异性相关因子。

修正的相对ERCC1表达＝UGE×K_ERCC1

可以使用任何精确预-定量的校准物RNA或内部控制基因测定K_ERCC1。可以将其它来源的(future sources of)精确的预-定量的RNA相对于具有已知相对ERCC1表达水平的样品如前述方法所述进行校准，或者现在可以针对之前校准的校准物RNA，例如上述的人肝脏总RNA(Stratagene，Cat.#735017)进行校准。

例如，如果针对不同的内部控制基因和/或不同的校准物RNA测定后续K_ERCC1，就必须同时将所述内部控制基因和校准物RNA针对组织样品进行校准，对于所述组织样品，已经相对于这特定内部控制基因测定了ERCC1表达水平。可以使用本领域内公知的标准预-TaqMan

、定量RT-PCR技术进行这种测定。这些样品的已知的表达水平将除以其相应的UGE水平以测定样品的K值。然后，根据已知样品的数目使K值平均化以测定对不同的内部控制基因和/或校准物RNA特异性的新K_ERCC1。

实施例7

所有的患者登记在预测性多中心三组随机试验(prospective multicenterthree arm randomized trial)(GEPC/98-02，在晚期NSCLC中关于顺铂/吉西他滨(CG)对顺铂/吉西他滨/长春瑞滨(Vinorelbine)(CGV)对顺序成对的吉西他滨/长春瑞滨继之以异环磷酰胺/长春瑞滨(GV/IV)的西班牙肺癌组III期试验)的顺铂/吉西他滨组(arm)中。所有患者每三周在第1日、第8日接受Gem 1250mg/m²，并在第1日接受CDDP 100mg/m²。GEPC/98-02的合格标准为可测量的阶段IV(符合条件的脑部转移，如果没有症状)或者阶段IIIB(恶性胸膜和/或心包积液和/或锁骨上腺病(supraclavicular adenopathy))NSCLC和EasternCooperative Group(ECOG)体力分值02。在参与研究之前，对所有的患者进行胸部X-射线和对胸部和上腹部的计算机层析X射线照相术(CT)扫描，并至少每6周进行重复评估。根据WHO标准将肿瘤应答评定为完全应答、部分应答、稳定疾病和进展性疾病。在治疗期间使用相同的成像方法再评估肿瘤以建立肿瘤测量的基线。

从显微切割的FPE预处理肿瘤样品分离了总mRNA，并使用定量RT-PCR测量了修正的相对ERCC1表达。本发明和在美国专利申请序列号09/469,338中(于1999年12月20日提交，将其在此通过提述并入)描述了从这些样品分离mRNA的一种方法。

统计分析

使用曼-惠特尼U检验来检验连续检验变量(continuous test variable)修正的相对ERCC1表达与两分法变量(患者性别、年龄低于和高于中位年龄、是否存在体重损失、是否存在胸腔积液、肿瘤阶段)之间的显著关联。使用克鲁斯卡尔-瓦利斯二氏检验(Kruskal-Wallis test)在多个组(ECOG体力状态、组织病理学)中检验修正的相对ERCC1表达的显著差异。Fisher氏精确检验(Fisher’s exact test)用于分析分类的临床病理学(categorical clinicopathological)值，其包括应答和二分的修正的相对ERCC1表达值。

从开始研究追踪所有的患者直至死亡或至数据被删失(censor)。使用卡普兰-迈耶生存曲线(Kaplan-Meier survival curves)和时序检验(log rank test)来分析生存率和无疾病生存率(disease-free survival)的单变量分布。将Miller和Siegmund的最大的卡方法(maximal chi-square method)(Biometrics 1982；38：1011-1016 and Halpern(Biometrics 1982；38：1017-1023)适用于测定将患者分为差和好预后亚类(根据生存的可能性)的最佳表达值，将时序检验(log-rank test)作为统计方法用来测量分组的强度。为了基于最大卡方分析测定被解释为关联的强度量度的P值，使用1000次类自举模拟(boot-strap-likesimulation)评估在假设没有关联的情况下最大的卡方统计的分布。(Biometrics1982；38：1017-1023)对在单变量分析中重要的因素进行Cox′s比例风险建模(Cox′s proportional hazards modeling)以鉴定哪些因素可能对生存率有显著影响。使用SPSS版本10.0.5软件(SPSS Inc.，Chicago Ill.)进行所有统计分析。所有的P值均为双向的(two-sided)。

修正的相对ERCC1表达水平

在所有的56个分析的样品中都可检测到ERCC1mRNA表达。相对于内部控制管家基因β-肌动蛋白的表达，修正的相对ERCC1表达的中位数为6.7×10^-3(范围：0.8×10^-3至24.6×10^-3)。修正的相对ERCC1表达水平与如下的任意因素没有显著的关联，这些因素为年龄(P＝0.66)、性别(P＝0.18)、在随机取样之前六个月内是否存在体重损失(P＝0.74)、肿瘤阶段(IIIB相对于IV，P＝0.39)或者是否存在胸腔积液(P＝0.25，均为曼-惠特尼U检验)。具有不同的体力状态级别(P＝0.48，克鲁斯卡尔-瓦利斯二氏检验)或者不同的肿瘤细胞类型(所有的四种肿瘤类型，P＝0.10，克鲁斯卡尔-瓦利斯二氏检验)的患者之间的修正的相对ERCC1表达水平也没有显著性差异，但是SCC肿瘤中的修正的相对ERCC1表达水平(中位数8.6×10^-3)明显比腺癌的高(中位数5.2×10^-3，P＝0.015，曼-惠特尼U检验)。

对化疗的应答

47个可评价的患者的总应答率为44.7％。完全应答和部分应答，即，“应答”肿瘤中的修正的相对ERCC1表达水平(中位数：4.3×10^-3，范围：1.2×10^-3至24.6×10^-3)与稳定的疾病和进展性疾病，即，“无应答”肿瘤中的水平(中位数：7.85×10^-3，范围：0.8×10^-3至24.3×10^-3，P＝0.31曼-惠特尼U检验)没有显著差异。修正的相对ERCC1表达值高于和低于任何ERCC1水平的应答和无应答肿瘤的比率之间也没有显著差异(所有均为Fisher′s精确检验)。具有低于阈值的修正的相对ERCC1表达的肿瘤中的应答率(“低”表达，52％应答者)高于具有高于阈值的修正的相对ERCC1表达的肿瘤(“高”表达，36.4％应答者，Fisher′s精确检验，P＝0.38)。

患者总体生存率与修正的相对ERCC1表达水平之间的关联

中位数总生存率为36.6周(范围0-113.4周)，而中位数进展时间(time toprogression)为24.4周(范围0-102.9周)。使用时序检验和最大卡方统计鉴定修正的相对ERCC1表达水平的阈值，该阈值可以将患者分为差和好的预后亚类，其显示包含中位数的差别值的范围，因此将其用作生存率分析的阈值。因此，用于NSCLC的修正的相对ERCC1表达值的阈值测定为6.7×10^-3。图1显示患者的卡普兰-迈耶生存曲线，所述患者具有高于和低于修正的相对ERCC1表达水平的阈值的瘤内的修正的相对ERCC1表达水平。如图14所示，与具有高于阈值的修正的相对ERCC1表达水平的患者具有20.4周的生存中值(95％ C.I.6.9，33.9周)相比，具有低于阈值的修正的相对ERCC1表达水平的患者具有61.6周的显著的更长的生存中值(95％ C.I.42.4，80.7周)。针对肿瘤阶段进行调整，在低或高的修正的相对ERCC1表达与总生存率之间的相关性的时序统计为3.97，P值为0.046。未调整的时序结果示于图14中。

检验5.8×10^-3的单独的(separate)修正的相对ERCC1表达阈值，因为之前的研究中显示该值与患有胃癌的患者的总生存率相关(Metzger等，J ClinOncol 1998；16：309316)。尽管更高的6.7×10^-3的修正的相对ERCC1表达阈值水平是更有效的鉴别标准(more powerful discriminator)，但是与ERCC1水平低于5.8×10^-3的患者相比，在所述研究中修正的相对ERCC1表达水平低于5.8×10^-3的NSCLC患者组的总生存率明显更高(时序统计6.37，P＝0.011)。

在使用卡普兰-迈耶生存曲线和时序检验的单变量分析中与总生存率显著相关的其它因素为预处理的体重损失的存在和ECOG体力状态。患者年龄(P＝0.18)、性别(P＝0.87)、肿瘤阶段(P＝0.99)、肿瘤细胞类型(P＝0.63)和胸腔积液的存在(P＝0.71)对于总体生存率不是显著的预后因素。修正的相对ERCC1表达水平、ECOG体力状态和重量损失仍然为Cox比例风险回归模型多变量分析中的重要的预后因素(图14)。按肿瘤阶段来分层的Cox回归模型的P值，其对于ERCC1为0.038，对于体重损失的为0.017，而对于ECOG体力状态为0.02(PS 0对1或2)。

此研究发现了对于患有癌症的患者而言较低的ERCC1 mRNA表达水平与用基于铂的化疗处理之后的生存率改善相关。

实施例8：测定DPD的未修正的基因表达(UGE)

进行了两对平行反应。“测试”反应和“校准”反应。DPD扩增反应和β-肌动蛋白内部控制扩增反应为测试反应。对校准物RNA模板进行单独的β-肌动蛋白和DPD扩增反应，并称作校准反应。TaqMan仪器将会得到四个不同的循环阈(Ct)值：从测试反应中得到的Ct_DPD和Ct_{β-肌动蛋白}和从校准反应中得到的Ct_DPD和Ct_{β-肌动蛋白}。

根据下面的方程测定两种反应的Ct值的差异：

ΔCt_测试＝Ct_DPD-Ct_{β-肌动蛋白}(来自“测试”反应)

ΔCt_校准物＝Ct_DPD-Ct_{β-肌动蛋白}(来自“校准”反应)

2^-ΔCt _测试(来自“测试”反应)

2^-ΔCt _校准物(来自“校准”反应)

为了得到来自Taqman仪器的DPD的未修正的基因表达，进行下面的运算：

DPD的未修正的基因表达(UGE)＝2^-ΔCt _测试/2^-ΔCt _校准物

用之前公开的值标准化UGE

标准化计算需要将UGE乘以对DPD和特定校准物RNA特异性的修正因子(K_DPD)。可以使用任意内部控制基因和任意精确预定量的校准物RNA测定修正因子K_DPD。优选使用内部控制基因β-肌动蛋白和精确预定量的校准物RNA，来自Applied Biosystems的Universal PE RNA；Cat #4307281，lot #3617812014。

使用由Taqman制造商Applied Biosystems在User Bulletin #2中描述并在前述部分描述的ΔCt方法的修改形式进行标准化。为了实施该过程，使用前面所述的Taqman法针对DPD表达分析之前公开的6种不同测试组织的UGE。使用内部控制基因β-肌动蛋白和校准物RNA，即Universal PE RNA(来自Applied Biosystems的Cat #4307281，lot #3617812014)。

用Salonga等(在此全部通过提述并入)先前描述的各样品L7、L91、L121、L150、L220和L164的相对DPD表达水平(PV)除以其对应的来自Taqman的UGE以得到未平均的修正因子K。

K_来平均＝PV/UGE

接下来，平均所有的K值以测定对DPD、Universal PE RNA；Cat#4307281，lot #3617812014的校准物RNA和β-肌动蛋白特异性的单一K_DPD修正因子。

因此，为了测定与之前公开的预-Taqman DPD表达的研究的规模相一致的未知组织样品的修正的相对DPD表达，在假设使用相同的内部控制基因和校准物RNA的情况下，只需将从Taqman设备中得到的未修正的基因表达数据(UGE)乘以K_DPD特异性修正因子。

修正的相对DPD表达＝UGE×K_DPD

可以使用任何精确的预-定量的校准物RNA测定K_DPD。可以将其它来源的精确预-定量的RNA相对于公开样品如上述方法中所述进行校准，或者现在可以针对之前校准的校准物RNA进行校准，所述校准物RNA例如如上所述的Universal PE RNA；Cat #4307281，lot #3617812014。

实施例9：FPE结肠直肠肿瘤样品中的DPD表达

使用上述方法分析来自患有晚期结肠直肠癌的34个患者的34份肿瘤样品。作为预测性多中心欧洲5-FU/CPT11交叉试验V239(prospectivemulticenter European 5-FU/CPT11 crossover trial V239)的一部分，用静脉内5-FU/LV联合方案处理所有的患者。将所有患者用连续5天由历时15分钟的输注提供的静脉内5-FU 425mg/m²，以及也通过输注在连续5天内提供的亚叶酸钙20mg/m²进行处理。将该治疗方案提供作为一线或二线姑息治疗。

9位患者(25.5％)对5-FU/LV有应答，将应答定义为任意的应答，包括完全应答、部分应答和最低限度应答。将患有进展性疾病或稳定疾病的患者归为无应答者(25位患者，73.5％)。如上所述，从显微切割的FPE预处理肿瘤样品分离总mRNA，并使用定量PCR测量DPD/β-肌动蛋白的相对mRNA表达水平。

应答组和无应答患者组的平均修正的DPD：β-肌动蛋白水平分别为0.87×10^-3和2.04×10^-3。将比较两个独立样品组内值的等级的曼-惠特尼U检验用于比较应答组和无应答组中修正的相对DPD表达水平。应答者组中的相0对DPD水平明显著低于无应答者组(P＝0.02)。这些患者中DPD mRNA表达与对5-FU/LV的应答之间的相关性示于图16中。这些数据显示DPD表达为对基于5-FU的化疗的应答的预后因素。

实施例10：测定TS的未修正的基因表达(UGE)

进行了两对平行反应。“测试”反应和“校准”反应。参见图24。TS扩增反应和β-肌动蛋白内部控制扩增反应为测试反应。对校准物RNA模板进行单独的TS和β-肌动蛋白扩增反应，并称作校准反应。TaqMan仪器将会得到四个不同的循环阈(Ct)值：从测试反应中得到的Ct_TS和Ct_{β-肌动蛋白}和从校准反应中得到的Ct_TS和Ct_{β-肌动蛋白}。根据下面的方程测定两种反应的Ct值的差异：

ΔCt_测定＝Ct_TS-Ct_{β-肌动蛋白}(来自“测试”反应)

ΔCt_校准物＝Ct_TS-Ct_{β-肌动蛋白}(来自“校准”反应)

2^-ΔCt _测试(来自“测试”反应)

2^-ΔCt _校准物(来自“校准”反应)

然后，为了得到来自TaqMan

.仪器的TS的未修正的基因表达，进行下面的运算：

TS的未修正的基因表达(UGE)＝2^-ΔCt _测试/2^-ΔCt _校准物

用已知的相对TS表达水平标准化UGE

标准化计算需要将UGE乘以对TS和特定校准物RNA特异性的修正因子(K_TS)。可以针对任意内部控制基因和任意精确预-定量的校准物RNA测定修正因子K_TS。优选使用内部控制基因β-肌动蛋白和精确预定量的校准物RNA，即Universal PE RNA(来自Applied Biosystems的Cat #4307281，lot#3617812014)。设定这些反应物的修正因子K_TS等于12.6×10^-3。

使用由Taqman制造商Applied Biosystems在User Bulletin #2中描述并在前述部分描述的ΔCt方法的修改形式进行标准化。为了实施该过程，使用前面所述的Taqman

.法针对TS表达分析之前公开的6种不同测试组织的UGE。这些组织样品记载在Salonga，等，Clinical Cancer Research，6：1322 1327，2000中，在此将其全部通过提述并入。使用内部控制基因β-肌动蛋白和校准物RNA，即Universal PE RNA(来自Applied Biosystems的Cat#4307281，lot#3617812014)。

将之前公开的L7、L91、L121、L150、L220、L164各样品的相对TS表达水平除以其相应的来自TaqMan

的UGE得到未平均的修正因子K。Salonga，等，Clinical Cancer Research，6：1322 1327，2000，在此将其全部通过提述并入。

K_未平均＝已知值/UGE

接下来，平均所有的K值以测定对TS、Applied Biosystems Universal PERNA(Cat #4307281、lot #3617812014)的校准物RNA和β-肌动蛋白特异性的单一K_ERCC1修正因子。

因此，为了测定与预-Taqman

.TS表达研究的规模相一致的未知组织样品的修正的相对TS表达，在假设使用相同的内部控制基因和校准物RNA的情况下，只需将从Taqman

.设备中得到的未修正的基因表达数据(UGE)乘以K_TS特异性修正因子。

修正的相对TS表达＝UGE×K_TS

可以使用任意的精确预-定量的校准物RNA或内部控制基因测定K_TS。可以将其它来源的精确预-定量的RNA相对于具有已知的相对ERCC1表达水平的样品如上述方法中所述进行校准，或者现在可以针对之前校准的校准物RNA，例如上述Universal PE RNA(来自Applied Biosystems的Cat#4307281，lot #3617812014)，进行校准。

例如，如果测定不同的内部控制基因和/或不同的校准物RNA的后续K_TS，必须将内部控制基因和校准物RNA二者针对组织样品进行校准，对于该组织样品，相对于特定的内部控制基因的TS表达水平已经被测定或公开。可以使用本领域内已知的标准预-TaqMan

定量RT-PCR技术进行这种测定。这些样品的已知的表达水平将除以其相应的UGE水平以测定该样品的K值。然后根据已知样品数平均K值以测定对不同的内部控制基因和/或校准物RNA特异性的新K_TS。

实施例11：患者的选择和化疗方案

所有的患者都登记在1998-2000年的南加州大学医疗中心(University ofSouthern California Medical Center)的慈善协议(compassionate protocol)3C-98-3中，这些患者接受了如下的奥沙利铂/5-FU联合治疗方案：130mg/m²的奥沙利铂加上连续输注的5-FU。所有的病人在此之前用5-FU的治疗均告失败，且60％(30/50)用伊立替康(CPT-11)进行额外的二线治疗失败。在登入协议(protocol entry)时所有的患者均显示出IV期结肠直肠癌的活动性疾病。

临床评估和应答标准

在化疗期间，记录关于体力状态、重量、腹痛、全血细胞计数和血清肌酸酐和血液尿素氮水平的每周评估。使用计算机层析X射线照相术(CT)测量肿瘤的负荷(Tumor burden)。在登入协议时要求在二维上可以测量的肿瘤量。在至少6周肿瘤负荷减少了50％或以上的患者归为对治疗的应答者。无应答者包括患有稳定的疾病或具有癌症进展的患者。生存率计算如下：从用5-FU/奥沙利铂的化疗开始至任何原因导致死亡时的天数。将在最后的随访评估时仍然存活的患者在当时删失。

统计分析

TaqMan

分析得到表示为两种绝对测量值之间的比率的水平(目的基因：内部参考基因(internal reference gene))。使用曼-惠特尼检验和克鲁斯卡尔-瓦利斯二氏检验评估TS和ERCC1表达(作为连续变量)与患者人口统计学之间的相关性。分别见Zar，Biostatistical Analysis.Prentice-Hall，IncEnglewood Cliffs，N.J.(1974)，109-114和139-142页。修改适用Miller和Sigmund(Biometrics 38：1011-1016，1982)和Halpern(Biometrics 38：1017-1023，1982)的最大卡方法测定最佳地将患者二分为低和高TS和ERCC1表达亚组的截止阈值水平。使用Pearson卡方检验评定二分分子标记与对化疗的应答之间的相关性，Zar，Biostatistical Analysis.Prentice-Hall，IncEnglewood Cliffs，N.J.(1974)，pp.59-68。使用风险比(Hazard ratio)计算死亡的相对风险。Schulman，Infection Control & Hospital Epidemiology，18：65-73，1997。这些计算基于Pike估计(Pike estimate)，其中利用在时序检验统计中计算出的事件的观察值和期望值(Pike，J R Stat Soc Series A 135：201-203，1972)。为了测定基于最大卡方法分析将会被解释为关联强度的量度的P值，使用1000次类自举模拟估算在假设没有关联的情况下的最大卡方统计分布。(Halpern，Biometrics 38：1017 1023，1982)。显著水平设定为p＜0.05。

可用于应答和生存率评估的人口统计和患者

在本研究中一共评估了年龄中值为59(最小值：34，最大值：83)的50位患者，其由14位(28％)女性和36位(72％)男性组成。该组的种族背景包括39位高加索人(Caucasians)、6位西班牙人(Hispanics)、3位亚洲人(Asians)和2位非裔美国人(African-Americans)。所有的50位患者可以进行TS表达和ERCC1表达水平与生存率之间相关性的评估。按照前面所述的标准，45位(90％)可以进行检验该分子参数与应答之间的相关性的评估。

TS表达水平和ERCC1表达水平

从显微切割的FPE预处理肿瘤样品分离了总mRNA，并使用定量RT-PCR测量ERCC1：β-肌动蛋白和/或TS：β-肌动蛋白的相对mRNA表达水平。在本发明中和在美国专利申请序列号第09/469,338号(于1999年12月20日提交，在此全部通过提述并入)中描述了从这些样品分离mRNA的方法。如先前所述，使用基于逆转录/聚合酶链式反应(RT/PCR)的测定系统测定ERCC1和β-肌动蛋白的表达水平。如上所述测定修正的相对ERCC1和/或TS表达。

在所有分析的50个样品中可检测到TS基因表达。相对于管家基因β-肌动蛋白，修正的TS表达的中位值为3.4×10^-3(最小值：0.18×10^-3；最大值：11.5×10^-3)。在47个(94％)分析的样品中可检测到修正的ERCC1基因表达。该修正的ERCC1表达的中位值为2.53×10^-3(最小值：0.00；最大值：14.61×10^-3)。当按照性别、年龄和种族血统分析时，发现在修正的TS和ERCC1 mRNA表达没有显著的差异。

与TS表达相关的生存率

在本研究中，随访期中位值为10.5个月(95％ C.I.：1.8，21.2)的50位患者，生存率中位值为8.4个月(95％ C.I.：6.4，12.3)。使用7.5×10^-3的TS阈值，43位(86％)患者具有低的修正的TS表达水平，7位(14％)患者具有高的修正的TS表达水平。使用时序检验评估修正的TS基因表达与生存率之间的相关性。图17呈现了各自的生存率曲线，并显示在低的修正的TS表达者组中生存率中位值为10.2个月(95％ C.I.：7.4，15.1)，且在高的修正的TS表达组中生存率中位值为1.5个月(95％ C.I.：1.1，2.1)(P＜0.001；时序检验)。与高表达组的0.00相比，修正的TS表达大于等于(.ltoreq.)7.5×10^-3的患者6个月的生存机率为0.77。在单变量分析中，与TS水平大于等于7.5×10^-3的患者相比，修正的TS水平＞7.5×10^-3的患者死亡的相对风险增加了8.4倍(95％ CI：2.63，27.13)，(p＜0.001，图17)。

与ERCC1表达相关的生存率

当使用4.9×10^-3作为阈值，40位(80％)具有低的修正的ERCC1表达而10位(20％)具有高的修正的ERCC1表达。图22显示了估计的生存机率对修正的ERCC1表达水平的卡普兰-迈耶曲线，并显示低表达者组的生存率中位值为10.2个月(95％ C.I.：7.8，15.1)，高表达者组的为1.9个月(95％ C.I.：1.1，4.9)(P＜0.001；时序检验)。修正的ERCC1表达＞4.9×10^-3的患者的6个月生存机率为0.16，与其相比，修正的ERCC1表达大于等于4.9×10^-3的患者的6个月生存机率为0.76。在单变量分析中，与修正的ERCC1水平＞4.9×10^-3的患者相比，修正的ERCC1水平＞4.9×10^-3的患者死亡的相对风险增加了4.8倍(95％ CI：2.09，15.88)，(p＜0.001；图20)。

与ERCC1和TS联合表达相关的生存率

在36位患者(72％)中检测到低的修正的TS和ERCC1表达水平，14位(28％)患者具有高的修正的TS和/或ERCC1表达水平。这两种基因的表达水平都低的患者具有显著更高的生存率。低的修正的TS和ERCC1表达者的生存率中位值为11.1个月(95％ C.I.：8.4，17.5)，而高的修正的TS和/或ERCC1表达者的为1.9个月(95％ C.I.：1.1，4.9)(P＜0.001，时序检验；图19)。至少一种基因(TS或ERCC1)的修正的表达水平高的患者的6个月的生存机率为0.10，与其相比，两种基因的修正的表达水平都低的患者的6个月的生存机率为0.85。与肿瘤中两种基因都显示低表达水平的患者相比，至少一种基因(TS或ERCC1)的修正的表达增加的患者的死亡相对风险为7.12(95％CI：2.60，19.52)(P＜0.001；图20)。如由分层分析(图24)所显示，TS和ERCC1mRNA表达是相互独立的。

应答与TS和ERCC1基因表达水平的相关性

45位可测量的患者的修正的TS表达水平的中位值为3.4×10^-3(最小值：0.18×10^-3；最大值：11.50×10^-3)，这与整个50位患者群组(patient-cohort)是一致的。当通过将肿瘤分为低-和高TS表达者对应答进行分析时，四分之三(75％)的部分应答者，27位疾病稳定的患者中的26位(96％)，以及14位患有进展性疾病的患者中的9位(64％)具有低的修正TS表达(P＝0.02；Fisher氏精确检验)。

45位可测量的患者的修正的ERCC1表达水平的中位值为2.7×10^-3(最小值：0.00：最大值：14.61×10^-3)，并且与整个50位患者群组没有显著区别。然而，ERCC1表达水平与对化疗的应答的统计学相关性不显著(p＝0.29，Fisher氏精确检验)。

实施例12：测定EGFR的未修正的基因表达(UGE)

进行两对平行反应。“测试”反应和“校准”反应。图29。EGFR扩增反应和β-肌动蛋白内部控制扩增反应为测试反应。对校准物RNA模板进行单独的EGFR和β-肌动蛋白扩增反应，并称作校准反应。TaqMan

仪器将会得到四个不同的循环阈(Ct)值：从测试反应中得到的Ct_EGFR和Ct_{β-肌动蛋白}和从校准反应中得到的Ct_EGFR和Ct_{β-肌动蛋白}。根据下面的方程测定两种反应的Ct值的差异：

ΔCt_测试＝Ct_EGFR-Ct_{β-肌动蛋白}(来自“测试”反应)

ΔCt_校准物＝Ct_EGFR-Ct_{β-肌动蛋白}(来自“校准”反应)

接下来的步骤包括根据下面的方程进行以2为底数的-ΔCt次方的幂运算。

2^-ΔCt _测试(来自“测试”反应)

2^-ΔCt _校准物(来自“校准”反应)

然后为了从TaqMan

仪器获得EGFR的未修正的基因表达，进行如下计算：

EGFR的未修正的基因表达(UGE)＝2^-ΔCt _测试/2^-ΔCt _校准物

使用已知的相对EGFR表达水平使UGE标准化

标准化计算需要将UGE乘以对EGFR和特定校准物RNA特异性的修正因子(K_EGFR)。也可以测定任意的内部控制基因和任意的精确预定量的校准物RNA的修正因子K_EGFR。优选使用内部控制基因β-肌动蛋白和精确预定量的校准物RNA，即人肝脏总RNA(Stratagene，Cat #735017)。假定这些反应物的修正因子K_EGFR等于1.54。

使用由TaqMan

制造商Applied Biosystems在User Bulletin #2中描述并在上文描述的ΔCt法的修正形式进行标准化。为了实施该过程，使用前面所述的TaqMan

方法针对EGFR表达分析了6种不同测试组织的UGE。使用内部控制基因β-肌动蛋白和校准物RNA，人肝脏总RNA(Stratagene，Cat.#735017)。

将AG221、AG222、AG252、成人肺、PC3、AdCol各样品的已知的相对EGFR表达水平除以其相应的来自TaqMan

的UGE得到未平均的修正因子K。

K_未平均＝已知值/UGE

接着，平均所有的K值以测定对EGFR、来自Stratgene人肝脏总RNA(Stratagene，Cat #735017)的校准物RNA和β-肌动蛋白特异性的单一K_EGFR修正因子。

因此，为了测定与预-Taqman

.EGFR表达的研究的规模相一致的未知组织样品中修正的相对EGFR表达，在假设使用相同的内部控制基因和校准物RNA的情况下，只需将从Taqman

.设备中得到的未修正的基因表达数据(UGE)乘以K_EGFR特异性修正因子。

修正的相对EGFR表达＝UGE×K_EGFR

可以使用任意的精确预-定量的校准物RNA或内部控制基因测定K_EGFR。可以将其它来源的预-定量的RNA相对于相对EGFR表达水平已知的样品如上述方法中所述进行校准，或者现在可以针对之前校准的校准物RNA，例如上述的人肝脏总RNA(Stratagene，Cat #735017)进行校准。

例如，如果测定不同的内部控制基因和/或不同的校准物RNA的后续K_EGFR，必须将内部控制基因和校准物RNA二者相对于组织样品进行校准，对于该组织样品，相对于特定的内部控制基因的EGFR表达水平已经被测定。可以使用本领域内已知的标准预-TaqMan

定量RT-PCR技术进行这种测定。这些样品的已知的表达水平将除以其相应的UGE水平以测定样品的K值。然后根据已知样品数，平均K值以测定对不同内部控制基因和/或校准物RNA特异性的新K_EGFR。

实施例13：测定HER2-neu的未修正的基因表达(UGE)

进行了两对平行反应。“测试”反应和“校准”反应。图26。HER2-neu扩增反应和β-肌动蛋白内部控制扩增反应为测试反应。对校准物RNA模板进行单独的HER2-neu和β-肌动蛋白扩增反应，并称作校准反应。TaqMan

仪器将会得到四个不同的循环阈(Ct)值：从测试反应中得到的Ct_HER2-neu和Ct_β- _肌动蛋白和从校准反应中得到的Ct_HER2-neu和Ct_{β-肌动蛋白}。根据下面的方程测定两种反应的Ct值的差异：

ΔCt_测试＝Ct_Her2-neu-Ct_{β-肌动蛋白}(来自“测试”反应)

ΔCt_校准物＝Ct_Her2-neu-Ct_{β-肌动蛋白}(来自“校准”反应)

ΔCt_测试＝Ct_Her2-neu-Ct_{β-肌动蛋白}(来自“测试”反应)

ΔCt_校准物＝Ct_Her2-neu-Ct_{β-肌动蛋白}(来自“校准”反应)

2^-ΔCt _测试(来自“测试”反应)

2^-ΔCt _校准物(来自“校准”反应)

然后为了从TaqMan

仪器获得HER2-neu的未修正的基因表达，进行如下计算：

Her2-neu的未修正的基因表达(UGE)＝2^-ΔCt _测试/2^-ΔCt _校准物

使用已知的相对HER2-neu表达水平使UGE标准化

标准化计算需要将UGE乘以对HER2-neu和特定校准物RNA特异性的修正因子(K_HER2-neu)。也可以测定任意的内部控制基因和任意的精确预定量的校准物RNA的修正因子K_HER2-neu。优选使用内部控制基因和精确预定量的校准物RNA，即人肝脏总RNA(Stratagene，Cat #735017)。使用β-肌动蛋白和精确预-定量的校准物RNA，人肝脏总RNA(Stratagene，Cat #735017)时，修正因子K_HER2-neu等于12.6×10^-3。

使用由TaqMan制造商Applied Biosystems在User Bulletin #2中描述并在前面部分描述的ΔCt法的修改形式进行标准化。为了实施该过程，使用前面所述的TaqMan

方法针对HER2-neu表达分析了6种不同的FPE测试组织的UGE。使用内部控制基因β-肌动蛋白和校准物RNA，即人肝脏总RNA(Stratagene，Cat.#735017)。

将AG221、AG222、AG252、成人肺、PC3、AdCol各样品的已知的相对HER2-neu表达水平除以其相应的来自TaqMan

的UGE得到未平均的修正因子K。

K_未平均＝已知值/UGE

接下来，平均所有的K值以测定对HER2-neu、人肝脏总RNA(Stratagene，Cat #735017)校准物和β-肌动蛋白特异性的单一K_EGFR修正因子。

因此，为了测定与预-Taqman

.HER2-neu表达研究的规模相一致的未知组织样品的修正的相对HER2-neu表达，在假设使用相同的内部控制基因和校准物RNA的情况下，只需将从Taqman

.设备得到的未修正的基因表达数据(UGE)乘以K_HER2-neu特异性修正因子。

修正的相对EGFR表达＝UGE×K_EGFR

可以使用任意的精确预-定量的校准物RNA或内部控制基因测定K_HER2-neu。可以将其它来源的精确地预-定量的RNA相对于相对EGFR表达水平已知的样品进行校准，或者现在可以针对之前校准的校准物RNA，例如上述的人肝脏总RNA(Stratagene，Cat #735017)进行校准。

例如，如果测定不同的内部控制基因和/或不同的校准物RNA的后续K_HER2-neu，必须将内部控制基因和校准物RNA二者相对于组织样品校准，对于该组织样品，相对于特定内部控制基因的HER2-neu表达水平已经被测定或公开。可以使用本领域内已知的标准预-TaqMan

定量RT-PCR技术进行这种测定。这些样品的已知的表达水平将除以其相应的UGE水平以测定样品的K值。然后根据已知样品的数目，平均K值以测定对不同的内部控制基因和/或校准物RNA为特异性的新K_HER2-neu。

实施例14：测试不同浓度的EDTA和不同的温育温度

在提取溶液中使用四种不同浓度的EDTA(0.1mM、0.6mM、3.6mM和20mM)并使用四种不同的温育温度(44、50、56和62℃)来实施实施例1所述的流程。用两种不同的FFPE样品评估这些变量。使用四种不同的引物组-100、300、400和1000bp引物(指的是所述引物距离RNA的3’(多聚A)端100、300、400或1,000bp)。施用寡聚dT逆转录酶。在不同的温度下，提取过程使用Tris/EDTA/PK缓冲液(如上所述)16小时。进行一次苯酚/氯仿/异戊醇(PCI)提取以去除DNA污染。将分离的RNA再悬浮在50μl Tris中。

数据显示尽管所有的温育温度和不同的EDTA浓度都起作用，但是得到长片段RNA的优选的参数为使用3.6mm EDTA和50-56℃范围的温度(参见最低Cts)。参见下面的表2。

表2 EDTA浓度/温度

M1 100bp 44oC 50oC 56oC 62oC M1 300bp 44oC 50oC 56oC 62oC

0.1mM 23.1101 22.196 22.3712 22.9834 0.1mM 26.4604 24.9523 25.0977 25.2382

0.6mM 23.3616 22.3673 22.5973 22.6378 0.6mM 26.5112 24.8636 25.1074 24.9243

EDTA 3.6mM 22.7179 22.2331 21.8783 21.9587 EDTA 3.6mM 25.8619 24.9501 24.5143 24.6931

20mM 23.0952 22.1579 21.8366 21.9461 20mM 26.7892 25.3186 25.0386 25.3433

M1 400bp 44oC 50oC 56oC 62oC M1 1000bp 44oC 50oC 56oC 62oC

0.1mM 28.0654 27.0076 27.3271 27.6107 0.1mM 29.9852 27.9539 27.8691 27.3389

0.6mM 28.1851 26.8109 27.0736 26.9763 0.6mM 30.3583 27.8463 28.1046 27.3479

EDTA 3.6mM 27.3316 26.4201 26.2641 26.8206 EDTA 3.6mM 29.6949 28.4397 27.9215 27.5779

20mM 20mM 30.2612 28.8745 28.6416 28.5171

M2 100bp 44oC 50oC 56oC 62oC M2 300bp 44oC 50oC 56oC 62oC

0.1mM 21.4018 21.4633 21.4504 21.6834 0.1mM 23.9609 23.8571 23.9106 24.3064

0.6mM 21.4292 21.0563 21.1044 21.47 0.6mM 23.9403 23.4637 23.7906 24.2977

EDTA 3.6mM 21.6286 20.9075 20.9972 20.7812 EDTA 3.6mM 24.5158 23.5704 23.7666 23.7389

20mM 21.027 21.0579 21.0027 21.2553 20mM 24.3286 23.9254 24.2174 24.5737

M2 400bp 44oC 50oC 56oC 62oC M2 1000bp 44oC 50oC 56oC 62oC

0.1mM 26.5268 25.8475 25.9314 26.5978 0.1mM 30.0974 27.9908 27.5454 27.673

0.6mM 25.854 25.1882 25.6386 26.0809 0.6mM 29.7021 27.7281 27.5899 27.2548

EDTA 3.6mM 26.1936 24.9937 25.1652 25.3845 EDTA 3.6mM 28.7475 27.6364 27.2434 26.9735

20mM 25.7346 25.183 20mM 28.582 27.7993 28.078 27.9715

实施例15：使用柠檬酸钠或EGTA代替EDTA作为螯合剂

在本实验中，测试了三种不同的螯合剂：EDTA、EGTA和柠檬酸钠。测试与3.6mM EDTA一起的0.1、0.6、3.6和20mM的EGTA和柠檬酸钠。在50℃下温育样品16小时。使用单次苯酚/氯仿步骤去除污染DNA。将分离的RNA再悬浮在50μl Tris中。结果显示0.6和3.6mM的柠檬酸钠为良好的螯合剂，其甚至在高达20mM的浓度下仍然起作用。参见下面的表3.

表3

100bp 300bp

M1 0.1 0.6 3.6 20 M1 0.1 0.6 3.6 20

EGTA 22.05584 21.91483 22.14477 21.32523 EGTA 26.4581 26.09962 26.25091 25.07969

柠檬酸钠 21.26925 20.75951 20.68721 20.97618 柠檬酸钠 24.72144 22.69152 22.93418 23.24895

EDTA 20.97683 EDTA 23.95666

M2 0.1 0.6 3.6 20 M2 0.1 0.6 3.6 20

EGTA 20.95042 21.02856 21.50124 20.75807 EGTA 25.16278 25.05163 25.61697 24.87095

柠檬酸钠 20.43178 20.03613 20.35514 20.25602 柠檬酸钠 24.38187 22.76978 22.86453 22.9773

EDTA 20.01918 EDTA 23.09989

400bp 1000bp

M1 0.1 0.6 3.6 20 M1 0.1 0.6 3.620

EGTA 28.26457 27.55415 28.0468 26.84575 EGTA 29.19289 29.04155 29.78311 28.69869

柠檬酸钠 26.77297 25.08387 25.27766 25.49137 柠檬酸钠 27.47323 25.47567 25.64558 25.9896

EDTA 26.43221 EDTA 26.5681

M2 0.1 0.6 3.6 20 M2 0.1 0.6 3.6 20

EGTA 27.03514 26.65384 27.32611 26.27913 EGTA 28.37434 28.50888 29.09281 27.69427

柠檬酸钠 25.89327 24.67949 24.87163 25.08208 柠檬酸钠 27.28292 25.09847 25.18052 25.41669

EDTA 25.00621 EDTA 25.68557

实施例16：PK浓度和温育时间

除了提取溶液包含0.5×，1×，2×和4×PK浓度的Tris/EDTA/PK缓冲液之外，如前所述进行RNA提取。1×PK浓度＝500μg/ml。评估3、6、12、16和20小时的温育时间，并进行单次苯酚/氯仿/异戊醇(PCI)提取。将RNA再悬浮在50μl Tris中。施用寡聚dT逆转录酶。结果显示在50℃下优选的温育时间为16小时。不同浓度的PK都起作用，并且似乎1×与更高的浓度起的作用一样好。参见表4。

表4

样品 M3 100bp

3hrs 6hrs 12hrs 16hrs 20hrs

0.5 28.31861 26.58241 25.46082 24.74091 24.36967

1 28.73512 26.28547 24.97916 24.44251 25.0303

2 28.03614 25.97902 25.04817 24.51852 24.82751

4 29.53969 26.86962 25.82528 24.64906 26.06563

300bp

3hrs 6hrs 12hrs 16hrs 20hrs

0.5 31.91504 30.79285 29.34402 28.86285 28.53668

1 32.02502 30.62955 29.29224 28.61764 28.96055

2 30.01775 30.23354 28.37638 28.20503 28.61338

4 33.19733 31.13701 29.4218 28.05663 29.63655

400bp

3hrs 6hrs 12hrs 16hrs 20hrs

0.5 32.87424 32.41137 30.89621 30.70137 30.3052

1 33.28026 32.20423 31.00278 28.61866 30.58809

2 32.45806 31.61768 30.20251 29.87417 30.30267

4 34.42826 32.35595 31.04639 29.15671 31.08682

1000bp

3hrs 6hrs 12hrs 16hrs 20hrs

0.5 33.11692 32.76052 30.58482 31.28069 30.60988

1 33.10397 32.08092 30.74326 31.22962 30.76994

2 31.63774 31.48734 30.37366 30.01824 30.33966

4 34.11372 32.5022 30.43215 29.4997 31.24582

样

品

M4 100bp

3hrs 6hrs 12hrs 16hrs 20hrs

0.5 27.50618 26.33205 24.90162 24.11188 24.08716

1 27.4682 26.733 24.70451 24.20879 24.15328

2 27.23042 26.39459 24.51051 24.34997 24.89759

4 27.87524 27.06252 25.15285 24.34653 24.96841

300bp

3hrs 6hrs 12hrs 16hrs 20hrs

0.5 31.97025 30.67854 28.66794 27.46286 27.86116

1 31.51245 30.91859 28.21581 27.52881 27.74868

2 31.29552 30.24914 28.07282 27.54162 27.36115

4 31.53427 30.60247 28.67055 27.59484 27.97908

400bp

3hrs 6hrs 12hrs 16hrs 20hrs

0.5 33.43846 32.34631 30.33808 29.74591 30.02667

1 33.10722 32.62965 30.38408 29.86639 29.84286

2 32.72484 32.17758 30.1776 29.86035 29.58862

4 32.81466 32.15597 30.64189 29.74172 30.08539

1000bp

3hrs 6hrs 12hrs 16hrs 20hrs

0.5 33.69785 32.728 30.44111 30.24496 30.44284

1 33.38166 32.99974 30.4358 30.20776 30.32836

2 33.33786 32.39023 30.4802 30.16997 30.18674

4 33.47508 32.55459 30.54346 30.12733 29.94782

实施例17：从FFPE胰腺导管腺癌(PDA)组织分离mRNA和gDNA

使用本发明的方法，从FFPE胰腺导管癌(PDA)组织样品分离RNA。从单显微切割的样本获得全局mRNA表达和gDNA拷贝数数据，并与来自在相似平台上分开处理的组织的数据相比较。发现mRNA和gDNA数据可以与高质量的冷冻的、非显微切割的肿瘤组织相当，如重叠探针(overlappingprobes)(对于gDNA)和有力的拷贝数/mRNA表达的一致性所证明的。

很大程度上由于难以从这种腹膜后器官获得组织且获得的核酸质量低劣，关于胰腺导管腺癌(PDA)原发性肿瘤的表达和拷贝数模式知之甚少。另外，严重的结缔组织增生导致间质的污染(Chu，G.C.，等，Stromal biology ofpancreatic cancer.J Cell Biochem，2007.101(4)：p.887-907)，而器官的极端的自消化性质(autodigestive properties)经常导致核酸质量的降低。

使用手工或激光切割技术进行肿瘤组织的显微切割。显微切割后，使用Response Genetics(Los Angeles，CA)中专有的提取程序分离gDNA。使用本发明的方法分离总RNA。如前所述进行两轮RNA扩增和cDNA制备。(Lord，R.V.，等，Telomerase reverse transcriptase expression is increased early in theBarrett′s metaplasia，dysplasia，adenocarcinoma sequence.J Gastrointest Surg，2000.4(2)：p.135-42)。合成cRNA并杂交到Affymetrix Hu133Plus2芯片上。如(Wang，Y.，等，Analysis of molecular inversion probe performance for allelecopy number determination.Genome Biol，2007.8(11)：p.R246)所述对共-提取的gDNA(70ng)在分子倒置探针(molecularinversion probe)(PIM)平台上进行基因组范围的等位基因特异性拷贝数分析。

发现基因组DNA和mRNA能够从PDA中的单显微切割FFPE样品中成功且连贯地共-分离并且分析在基因组范围对其进行表达和等位基因特异性拷贝数分析。FFPE MIP数据比非-显微切割、冷冻肿瘤组织样本有利。基因表达反映了单独提取的样品中的拷贝数。这种核酸(mRNA和gDNA)的显微切割和共-提取的方法使得归档的FFPE组织在多个平台上可用于基因组范围的分析，并开始使存在于可用于基因组分析的大量病理学档案中的有价值患者样品中的数据最大化，其尤其与很少有新鲜材料可用的遗传疾病研究和临床试验相关。

实施例18：上述的引物的序列：

ERCC1-504F SEQ ID NO：1 gggaatttgg cgacgtaatt c

ERCC1-574R SEQ ID NO：2 gcggaggctg aggaacag

GST-F SEQ ID NO：3 cctgtaccag tccaatacca tcct

GST-R SEQ ID NO：4 tcctgctggt ccttcccata

DPD3A SEQ ID NO：5 aggacgcaag gagggtttg

DPD3a-13R SEQ ID NO：6 gtccgccgag tccttactga

DPD3b-651F SEQ ID NO：7 gaagcctatt ctgcaaagat tgc

DPD3b-736R SEQ ID NO：8 gagtacccca atcgagccaa a

TS-763F SEQ ID NO：9 ggcctcggtg tgccttt

TS-825R SEQ ID NO：10 gatgtgcgca atcatgtacg t

EGFR-1753F SEQ ID NO：11 tgcgtctctt gccggaat

EGFR-1823R SEQ ID NO：12 ggctcaccct ccagaagctt

Her2-neu 2671F SEQ ID NO：13 ctgaactggt gtatgcagat tgc

Her2-neu 2699R SEQ ID NO：14 ttccgagcggccaagtc

引用的所有参考文献在此通过提述整体并入。整篇说明书，参考的用参考序号表示。这些参考文献如下所列举。

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Claims

1.从固定组织样品分离长片段RNA的方法，该方法包括如下步骤：

a)将提取溶液中的固定组织样品加热至范围在大约44至大约62℃的温度持续3个小时以上的时间，其中所述提取溶液包含浓度为大约0.1mM至大约20mM的螯合剂，和蛋白酶K；和

b)去除DNA污染；和

c)从所述的提取溶液分离所述RNA。

2.权利要求1所述的方法，其中所述加热选自下组：范围在大约45至大约60℃，大约48至大约58℃，大约48至大约55℃，大约48至大约52℃和大约50℃的温度。

3.权利要求1所述的方法，其中所述加热为大约50-56℃。

4.权利要求1所述的方法，其中所述时间长于4小时。

5.权利要求4所述的方法，其中所述时间长于8小时。

6.权利要求5所述的方法，其中所述时间长于12小时。

7.权利要求6所述的方法，其中所述时间长于14小时。

8.权利要求7所述的方法，其中所述时间为大约16小时。

9.权利要求3所述的方法，其中所述时间为大约16小时。

10.权利要求1所述的方法，其中所述螯合剂选自下组：EDTA、EGTA、柠檬酸盐类、柠檬酸类、水杨酸、水杨酸盐类、邻苯二甲酸类、2，4-戊二酮类、组氨酸类、二盐酸组氨醇类、8-羟基喹啉类、8-羟基喹啉、柠檬酸盐类和邻羟基醌类。

11.权利要求1所述的方法，其中所述螯合剂为EDTA。

12.权利要求1所述的方法，其中所述螯合剂为柠檬酸钠。

13.权利要求1所述的方法，其中所述螯合剂以大约0.6mM至大约5.0mM的浓度存在。

14.权利要求1所述的方法，其中所述螯合剂以大约0.6mM至大约3.6mM的浓度存在。

15.权利要求1所述的方法，其中所述螯合剂以3.6mM的浓度存在。

16.权利要求11所述的方法，其中所述EDTA以大约3.6mM存在。

17.权利要求12所述的方法，其中柠檬酸钠以大约0.6mM至大约3.6mM存在。

18.权利要求1所述的方法，其中使用第一和第二苯酚提取进行DNA污染的去除，其中所述第二苯酚提取包含离液剂。

19.权利要求1所述的方法，其中所述离液剂选自下组：尿素、异硫氰酸胍、硫氰酸钠(NaSCN)、盐酸胍(Guanidine HCl)、盐酸胍(guanidiniumchloride)、硫氰酸胍、四氯乙酸锂、高氯酸钠、四氯乙酸铷、碘化钾和三氟乙酸铯。

20.权利要求1所述的方法，其中所述离液剂为异硫氰酸胍。

21.权利要求1所述的方法，其中所述固定样品为福尔马林固定、石蜡包埋的组织样品。

22.权利要求21所述的方法，其中所述固定的福尔马林固定、石蜡包埋的组织样品为5年或更短时间的。

23.权利要求1所述的方法，其中没有使用DNA酶。

24.分离长片段RNA的方法，该方法包括如下步骤：

a)将提取溶液中的固定组织样品加热至范围在大约50℃至大约56℃的温度持续大约16小时的时间；和

b)进行至少第一和第二苯酚提取，其中所述第二苯酚提取包含离液剂，并从所述提取溶液分离所述RNA。

25.分离长片段RNA的方法，该方法包括如下步骤：

a)将提取溶液中的福尔马林固定、石蜡包埋的组织样品加热至范围在大约45至大约62℃的温度持续3小时以上的时间；其中所述提取溶液包含浓度为2.5mM至大约5.0mM的螯合剂和浓度为12.5μg蛋白酶K/mL的蛋白酶K；

26.从福尔马林固定、石蜡包埋的组织提取长片段RNA的方法，该方法包括如下步骤：

a)将提取溶液中固定的石蜡包埋的组织样品加热至大约50℃-56℃的温度持续大约16小时的时间，所述提取溶液包含浓度为大约3.6mM的EDTA或柠檬酸钠和浓度为12.5μg蛋白酶K/mL的蛋白酶K；和

27.权利要求1所述的方法，其中所述长片段RNA的长度长于200个核苷酸。

28.权利要求1所述的方法，其中所述长片段RNA为300个核苷酸或更长。

29.权利要求1所述的方法，其中所述提取方法共分离低于10％的DNA。

30.通过权利要求1所述的方法分离的长片段RNA。

31.从权利要求30所述的长片段RNA生成的cDNA。

32.权利要求30所述的RNA在基因表达分析中的用途。

33.测定固定的石蜡包埋的组织样品中靶基因表达水平的方法，该方法包括：

(a)通过权利要求1所述的方法从组织样品分离长片段RNA；

(b)使用能够扩增靶基因区域的寡核苷酸引物对所述mRNA进行扩增，以得到扩增的mRNA；和

(c)相对于内部控制基因的mRNA的量确定靶基因mRNA的量。

34.权利要求33所述的方法，其中所述靶基因为ERCC1、TS、DPD、Her2neu、Gst-pi、RRM1或Kras。