TW200911988A - Methods for isolating long fragment RNA from fixed samples - Google Patents

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200911988 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於自固定組織樣品中提取及分離高產率及高 、（長片^又）RNA之領域。本發明係關於使用該等新穎提 取方法提供s平估諸如固定或固定及石蝶包埋組織中癌症生 物私6己之基因之基因表現量的方法。本發明亦提供一種確 定基於化學療法之療法的方法，其係藉由量測患者腫瘤細 胞中特疋生物標記之量且將其與預定臨限表現量 〇 進行對比。 本申請案主張2007年6月22曰申請之臨時申請案 6〇/945,785之優先權，該中請案之全文以引用的方式併入 本文中。 【先前技術】

RNA物質之定量量測為實行分子生物學現代研究之中 ^ RNA物貝在（例如）製備表徵各種不同組織類型（諸如侵 襲性及非侵襲性腫瘤）之基因表現譜方面亦具有極其重要 之臨床重要性⑴。包括高靈敏度基於營光之實時rtpcr 程序及其他雜交依賴性方法之新近技料步現使得有可能 執行極少量mRNA(諸如由患者生檢標本獲得之抓财）之迅 速及特別定量。在大多數定量方法中，在獲得具有足夠品 質之：RNA用於最佳結果方面出現問題’尤其在將舰定量 應用於臨床研究_。 中相當穩定，且亦相 而’除少數研究特別 4吕息RNA(mRNA)在新鮮/冷來組織 對易於以基本上完整之形式分離。然 132488.doc 200911988 努力地收集新鮮冷来組織樣品之外，取自患者之生檢组 織樣品通常進行福馬林固定及石蠓包埋。此適用於常規在 醫Ρτο 療之患者以及主要臨床試驗參與者之組織標本。福 馬林固定及石壤包埋（FFPE)為最常用方法之主要原因為1 有助於組織之病理學檢查。經m溫n切片之新鮮-冷 康組織之形態學檢查為次最佳，_其使得分子組織^ 學難以具有相關性且使得藉由顯微切割純化腫瘤或其他組 織更加困難。相比之下，將組織樣品進行福馬林固定及石 躐包埋保持其形態且使得病理學檢查更為容易。通常使用 FFPE之第一原因為儲存新鮮_冷凍組織樣品之難度及費 用。獲取及確保足量組織樣品詩診斷分析及分子檢定之 物流（logistical)問題似乎難以克服。結果，全世界僅少數 (若存在）組織庫含有適合於大量遺傳分析或具有足夠長時 期患者追蹤及結果資料的足夠冷凍組織樣品。另一方面， FFPE組織仍為當前病理學實務之基礎。臨床醫師與研究者 均可易於購得及易於獲得進行長期追蹤之存檔FFpE組織， 且因此其代表用於臨床背景（clinical seUing)研究之遺傳物 質之廣泛來源（2)。 令人遺條地，福馬林固定過程雖然較佳地保持組織形 態，但對於組織中之RNA具有不利影響。RNA分子進行分 知* ’其裂解為較小片段’且可能由福馬林交聯（3_6p該等 兩個過程均大大提高將FFPE標本之RNA用於RNA定量程序 (諸如產生基因表現譜）之難度。較短長度之rNa使得較難 獲得用於定量實時rT_PCR之最佳引子探針組，而交聯阻 132488.doc 200911988 礙合成經分離RNA物質進行成功擴增所必需之新鏈RNA或 DNA的RNA或DNA聚合酶之進度。與新鮮冷凍組織相比， 使用FFPE組織之隨機分段RNA亦急速降低擴增RNA之產 率，而較短片段長度尤其降低後續雜交步驟之效能及特異 性。雜交特異性在避免PCR中假陽性結果及高背景擴增方 面極其重要。因此，開發自FFPE組織分離儘可能最高產 率、儘可能最高品質RNA之方法很重要。 自FFPE組織提取完整高分子量（長片段）RNA為困難且不 一致（inconsistent)之過程。自樣品提取RNA之各種技術為 此項技術中已知（7-17)。該等提取技術經測試具有不同成 效。一些研究提供優化自存檔FFPE組織提取DNA及RNA 之新方法（18-34)，而其他研究調查固定持續時間對定量 RT-PCR分析之作用（研究者一般不控制之因素）（10, 12, 13, 26)。迄今為止之研究展示，雖然有可能自FFPE提取可成 功進行PCR之RNA，但經提取RNA之分離產率與品質（長 度）之一致性仍存在問題。先前對於擴增長於200個核苷酸 (nt)之經提取RNA之片段的嘗試通常不成功，且通常僅擴 增60至120 nt範圍内之片段達成一點成功（2)。迄今為止之 提取方法的大多數研究之重點集中於自FFPE組織獲得最大 產率之RNA，而未必發現如何獲得高品質經提取RNA，亦 即藉由在提取過程中避免進一步降解來保持RNA之片段長 度。該等兩個目的並不總為一致的：獲得最大產率之RNA 可能需要進一步降低RNA長度之條件，而產生較多但具有 較短長度之RNA。 132488.doc 200911988 大多數先前研究中通常未認識到且通常未解決之另一因 素為RNA製品之DNA污染。由於DNA為比RNA穩定之分 子，故FFPE提取通常含有多於RNA之DNA。RNA與DNA 為化學上極類似分子，且在RNA中進行DNA鹼基序列之複 製。因此，在需要雜交技術之RNA分析中，由於DNA可與 RNA分子競爭與雜交位點結合，大量DNA污染可能產生虛 假結果。舉例而言，在PCR過程中，引子及探針可能與 DNA污染以及由RNA產生之cDNA結合且將其擴增。RT- O PCR之RNA分離中DNA之存在通常藉由使用所謂RNA特異 性引子，亦即與内含子-外顯子連接區相交且因此不應擴 增DNA中之相應基因序列之引子處理。然而，即使使用 RNA特異性引子，仍可能擴增DNA中之假基因。樣品製品 中無明顯DN A之一益處為在進行RT-PCR時不侷限於RNA 特異性引子，且因此大大增加引子結合位點之選擇。 因此，需要分離高品質（長片段）、高產率、具有可接受 之低DNA共分離/污染之RNA的方法。本發明滿足該需

C 1' 要。 分離RNA以測定癌症組織中之各種生物標記之表現量可 適用於診斷某些病狀或輔助醫師確定適當療程。舉例而 言，已確定適用於診斷癌症且適用於預測特定化學療法是 否有助於治療該疾病之生物標記。已知許多疾病生物標 記，且包括（例如）癌症生物標記£11(：0：1、丁8、〇?〇、《^2-neu、EGFR、GST-pi、k-ras及 RRM1 等。

此外，本文中所揭示之RNA分離方法可用於自任何FFPE 132488.doc 200911988 組織分離長片段RNA。一般而言，FFPE組織來自任何癌症 之腫瘤生檢組織。 ERCC1 切除修復交叉互補（ERCC1)基因為DNA加合物修復中所 必需。已選殖出人類ERCC1基因。Westerveld等人，

Nature (London) 310:425 428 (1984) ; Tanaka等人，Nature 348:73-76 (1990)。使用缺失該基因之突變人類及倉鼠細胞 株之若干研究及人類腫瘤組織研究表明由ERCC1編碼之產 〇 物與鉑-DNA加合物之切除修復有關。Dabholkar等人，J.

Natl. Cancer Inst. 84:1512-1517 (1992) ; Dijt等人，Cancer Res. 48:6058-6062 (1988) ; Hansson等人，Nucleic Acids

Res. 18:35-40 (1990)= 當轉染於DNA-修復缺失CHO細胞中時，ERCC1賦予細 胞對順鉑（cisplatin)之抗性以及修復鉑-DNA加合物之能 力。Hansson等人，Nucleic Acids Res. 18:35-40 (1990)。 目前接受之切除修復模型表明受損之識別/切除步驟限制 I 切除修復過程之速率。 已檢查來自接受基於鉑治療之癌症患者之惡性細胞中之 切除修復基因（諸如ERCC1)的表現相對含量。Dabholkar等 人，J. Natl· Cancer Inst· 84:1512-1517 (1992)。胃癌患者 中ERCC1過度表現已報導對於當以順鉑（DDP)/氟尿嘧咬化 學療法治療時之腫瘤反應及最終生存具有負面影響 (Metzger等人，J Clin Oncol 16:309，1998)。新近證據表明 吉西他濱（gemcitabine，Gem)可調節ERCC 1核苦酸切除修復 132488.doc 200911988 (NER)活性。因此，ERCC1表現之腫瘤内含量可為判定 DDP及GEM是否有效治療癌症患者之主要預後因素。 GST-pi 麩胱甘肽-S-轉移酶（GST)家族蛋白與細胞毒性藥物之解 毒有關。藉由催化毒性及致癌親電子分子與麩胱甘肽之共 輛作用，GST酶保護細胞大分子免於受損（Zakim D，Vessey D(編輯）Biochemical Pharmacology and Toxic〇l〇gy· New York，N.Y.: John Wiley and Sons，1985 中之Boyer等人，

Preparation, characterization and properties of glutathione S-transferases·)。該等蛋白之某種異構類型’麩胱甘肽s_ 轉移酶Pi(GST-pi，本文中亦可互換稱為GSTP1或GST-π)在 人類上皮組織中廣泛表現且已展示在若干腫瘤中過度表現 (Terrier等人，Am J Pathol 1990; 137:845-853 ; Moscow等 人，Cancer Res 1989; 49:1422-1428)。在耐藥腫瘤中已發 現增加之GST-pi含量，儘管確切機制仍不清楚（丁⑶仏丨心等 人 ’ Crit Rev Biochem Mol Biol 1992; 27:337-384)。先前 研究已表明GST蛋白（非mRNA)之低表現與對基於鉑化學 療法之反應相關（Nishimura專人 ’ Cancer. Clin Cancer Res 1996，2.1859-1865，Tominaga 等人，Am. J. Gastro· 94:1664-1668，1999 ; Kase等人，人<^匚>^〇1〇经1&.42:1397- 1 402，1 998)。然而，該等研究並未定量量測基因表現，而 使用半定量免疫組織化學染色法來量測蛋白含量。然而， 需要定量GST-pi基因表現量測來達成極有效之預後。

Her2 neu/EGFR 132488.doc 10 200911988 肺癌為西方國豕中男性及女性中癌症相關死亡之主要原 因。在美國，每年診斷約171，〇〇〇個肺癌新病例且16〇,〇〇〇 個個體死於該疾病。儘管在過去二十年内偵測及治療肺癌 方面已進行改良，但整個5年生存率仍然低於i 5%。 等人，Cancer: Principles in Practice of Oncology，第 5版， 第 858 910 頁。Philadelphia Lipincott-Raven Publishers， 1997中之Ginsberg等人。為進一步改良患者中非小細胞肺 癌（NSCLC)之生存率，其基於分子變化之預後分類至關重 ( 要。該分類將提供更精確且有用之診斷手段且最終產生更 有效之治療選擇。 受體赂胺酸激酶（RTK)在轉導有絲分裂信號中很重要。 RTK為大型跨膜蛋白，其具有生長因子（諸如表皮生長因 子，EGF)之細胞外配體結合域及充當激酶之細胞内部分以 磷酸化細胞溶質蛋白上之酪胺酸胺基酸殘基由此調節細胞 增殖。基於與不同受體酪胺酸激酶結合之生長因子家族已 知各種類別之受體酪胺酸激酶（Wilks，Advances in Cancer (j

Research， 1993， 60， 43-73)。 諸如EGF-R家族受體酪胺酸激酶之i類激酶包括EGF、 HER2-neu、erbB、Xmrk、DER及 let23 受體。該等受體通 常存在於一般人類癌症中，該等癌症諸如乳癌（Sainsbury 等人 ’ Brit. J· Cancer，1988，58，458 ; Guerin 等人， Oncogene Res·，1988，3，21)，鱗狀細胞肺癌（Hendler 等 人，Cancer Cells，1989，7，347)，膀胱癌（Neal等人， Lancet, 1985，366)，食道癌（Mukaida等人，Cancer，1991， 132488.doc • 11 - 200911988 68，1 42)，胃腸癌，諸如結腸、直腸或胃癌（B〇len等人，

Oncogene Res·，1987，1，149)，白血病（Konaka等人，Cell， 1984，3 7，1035)及卵巢、支氣管或胰腺癌（歐洲專利說明書 第0400586號）。隨著測試其他人類腫瘤組織之EGF家族受 體酪胺酸激酶，預期將在其他癌症（諸如曱狀腺及子宮癌） 中建立其廣泛流行率（prevalence)。 特定言之，EGFR酪胺酸激酶活性在正常細胞中罕有偵 測到，而其較常在惡性細胞中可偵測到（Hunter，CeU， 1987，50，823)。近年來已展示EGFR在許多人類癌症中過 度表現’該等癌症諸如腦、肺鱗狀細胞、膀胱、胃、乳 腺、頭部及頸部、食道、婦科及甲狀腺腫瘤。（w j Gullick，Brit. Med. Bull.，1991，47, 87)。受體酪胺酸激酶 在其他細胞增殖疾病（諸如牛皮癣）中同樣重要。EGFR病症 為由以下情況表徵之病症：通常不表現EGFR之細胞表現 EGFR，或增加之EGFR活化產生不當細胞增殖，及/或不當 EGFR含量 < 存在。已知EGFR由其配體EGF以及轉化生長 因子-a(TGF-a)活化。

Her2-neu蛋白亦為I類受體酪胺酸激酶（RTK)家族之成 員。Yarden及 Ullrich，Annu. Rev. Biochem. 57:443, 1988 ; Ullrich及 Schlessinger，Cell 61:203, 1990。Her2-neu蛋白與 EGFR 結構上相關。Carraway 等人，Cell 78:5，1994 ;

Carraway等人 ’ j· Bi〇1 chem· 269:14303，1994。該等受體 具有通用分子結構且在其細胞質域内含有兩個半胱胺酸富 集區且在其細胞質域内含有結構相關酶區。 132488.doc -12· 200911988

認為Her2-neu蛋白之配體依賴性活化由嗜中性活化因子 (neuactivating factor，NAF)所介導，該因子可直接與 pl65(Her2-neu)結合且刺激酶活性。Dougall等人， Oncogene 9:2109，1994 ; Samata等人，Proc. Natl· Acad. Sci· USA 91:1711，1994。Her2-neu蛋白之配體非依賴性均 二聚及所得受體活化由Her2-neu蛋白之過度表現來促進。 經活化Her2-neu複合物充當填酸激酶且填酸化不同細胞質 蛋白。HER2-neu病症由具有增加之HER2 -neu表現，產生 不當細胞增殖（諸如癌症）之HER2-neu之不當活性或過度活 性表徵。 受體絡胺酸激酶EGFR及HER2-neu之抑制劑係用作哺乳 動物癌細胞生長之選擇性抑制劑（Yaish等人，Science， 1988’242，933)。舉例而言’三經異黃_(61_|：)3加丨11)，即一 種EGF受體路胺酸激酶抑制劑，減少注入無胸腺裸鼠中之 EGFR表現人類乳房癌細胞之生長，而對未表現EGFR之腫 瘤之生長無影響。（T〇i等人，Eur j Cancer CHn 〇nc〇1， 1990，26，722。）苯乙烯之各種衍生物據說亦具有酪胺酸激 酶抑制特性（歐洲專利申請案第021 1363號、第0304493號 及第0322738號）且適用作抗腫瘤劑。兩種該等苯乙烯衍生 物為I類RTK抑制劑，其有效性已藉由使注人裸鼠中之人類 鱗狀細胞癌之生長減慢展示（Y〇neda等人，Canw

ReSearCh，1991，51，4430)。歐洲專利申請案第 0520722號 第0566226號亦已知某些4_苯胺基(衍生物適用作 ^體路胺酸激酶抑制劑。該等化合物所展示之極緊密構效 132488.doc •13· 200911988 關係表明一種經明確定義之結合模式，其中喹唑啉環結合 於腺嘌呤袋（pocket)中且苯胺基環結合於鄰接、獨特親脂 性袋中。三種4-苯胺基喹唑啉類似物（兩種可逆且一種不可 逆抑制劑）已臨床上評估為抗癌藥。Denny, Farmaco January-February 2001; 56(1-2):51-6。最近，美國 FDA批 准使用單株抗體曲妥珠單抗（trastazumab，Herceptin®)用於 治療HER2-neu過度表現轉移性乳腺癌。Scheurle等人， Anticancer Res 20:2091-2096，2000 ° 由於針對腫瘤之有效化學療法通常需要藥劑之組合，故 對各單一藥物具有抗性或敏感性之決定因素之鑑別及定量 已成為設計個別組合化學療法之重要手段。研究已失敗地 嘗試將癌症患者惡性細胞中之EGFR及/或HER2-neu表現之 相對含量與生存力準確相關。 NSCLC中EGFR之預後重要性迄今仍有爭議。使用結合 檢定之研究使EGFR表現增加與晚期NSCLC及整體生存縮 短相關，而使用量測EGFR mRNA或蛋白表現之半定量技 術之研究未能展示與臨床結果之一致相關性。Veale等 人，Br. J. Caner 68:162-165，1993 ; Fujino等人，Eur. Cancer 32:2070-2074，1996 ; Rusch 等人，Cancer Res 53:2379-2385, 1993 ; Pfeiffer等人，Br J Cancer 74:86-91， 1996 ; Pastorino 等人，J Clin Oncol 15:2858-2865, 1997。 使用免疫組織化學法研究NSCLC腫瘤中之EGFR表現已展 示在NSCLC腫瘤中介於32%與47%之間的EGFR過度表現之 頻率。Veale等人，Br. J. Caner 55:513-516, 1987 ; Veale等 132488.doc -14- 200911988 人，Br. J. Caner 68:162-165，1993 ; Fujino 等人，Eur. Cancer 32:2070-2074，1996 ; Rusch 等人，Cancer Res 53:2379-2385，1993 ; Pastorino 等人，J. Clin. One· 15:2858-2865, 1997 ； Tateishi# A > Eur J Cancer 27:1372-75，1991 ; Rachwal等人，Br J Cancer 72:56-64, 1995 ; Rusch等人，Cancer Res 15:2379-85，1993 ; Pfeiffer等人， Br J Cancer 78:96-9, 1998 ; Ohsaki等人，Oncol Rep 7:603-7，2000。此外，已就組織學亞型報導了 EGFR表現之顯著 差異，與AC及LC相比，通常SCC中EGFR表現較高。 Fujino 等人，Eur. Cancer 32:2070-2074, 1996 ； Veale 等 人，Br. J. Caner 55:5 13-5 16, 1987 ; Pastorino等人，J. Clin. One. 15:2858-2865，1997 ; Pfeiffer等人，Br J Cancer 78:96-9, 1998 ; Ohsaki 等人，Oncol. Rep. &:603-7，2000 ° 然而，該等研究報導EGFR過度表現與肺癌患者生存無一 致相關性。 一些非決定性研究中產生聲稱EGFR過度表現與患者生 存減少相關之觀察結果。Veale等人，1987 ; Ohsaki等人， 2000。然而，Veale等人，僅分析十九名NSCLC患者群 體。Ohsaki等人，使p53過度表現之NSCLC患者中EGFR蛋 白表現與不良預後相關（P=〇.024)。 如EGFR—般，NSCLC中HER2-neu之預後重要性迄今仍 有爭議。NSCLC中已展示HER2-neu蛋白過度表現，該等 NSCLC包括鱗狀細胞癌、腺癌及大細胞癌。Veale等人， 1987 ; Schneider等人，Cancer Res 49:4968-4971，1989 ; 132488.doc -15- 200911988

Kern 等人，Cancer Res. 50:5 1 84-5 191，1990 ; Weiner 等 人，Cancer Res 50:421425，1990 ; Scheurle 等人， Anticancer Res. 20:2091-2096, 2000。使用蛋白檢定之早期 研究報導肺腺癌（AC)中HER2-neu蛋白過度表現與較低整 體生存之相關性。Kern 等人，Cancer Res 50:5 1 84-5 191， 1990 ; Kern等人，J Clin Invest 93:5 16-20，1994。然而， 對立研究報導肺腺癌（AC)中HER2-neu蛋白過度表現與較 低整體生存無相關性。Pfeiffer等人，Br. J. Cancer 74:86-f' 91， 1996。 另一關鍵問題為作為癌症預後者之HER2-neu與EGFR共 過度表現之間的相互關係之評估。Tateishi等人（Eur. J. Cancer 27:1372-75，1991)在所分析AC之13%者中量測到 EGFR與HER2-neu蛋白共表現，且發現該等兩種基因之共 過度表現與較低五年生存率相關。然而，如僅HER2-neu過 度表現一般，尚未報導肺鱗狀細胞癌（SCC)及大細胞癌 (LCC)中Her2-neu及EGFR共表現與生存之間的相關性。 ( 測定EGFR及HER2-neu表現量之不一致之方法為判定該 等基因之表現可在何種程度上用於預後癌症患者生存力之 問題的根本。迄今為止，NSCLC中HER2-neu及EGFR表現 之研究就EGFR與HER2-neu表現均標記為陽性之NSCLC腫 瘤頻率已產生巨大變化。藉由使用光學顯微鏡載片上之石 蠟包埋組織及Her2-neu抗血清，定義為陽性蛋白染色之 HER2-neu之過度表現在腺癌（AC)中報導為13-80%，在鱗 狀細胞癌（SCC)中為2-45%，且在大細胞癌（LC)中為0- 132488.doc -16- 200911988 20%。Pfeiffer等人 ’ 1996 ; Kern等人，1990 ; Kern等人， 1994; Tateishi等人，1991 ; Shi等人，Mol Carcing 5:213-8，1992 ; Bongiorno 等人，J Thorac Cardiovasc Surg 107:590-5，1994 ; Harpole等人，Clin Cancer Res 1:659-64, 1995 ; Volm等人，Anticancer Res 12:11-20，1992。此外， 新近報導說明評估HER2-neu表現量之當前方案設計之非特 異性。用於侵襲性乳癌中HER2-neu表現量測之

HercepTest®經展示具有極高假陽性。jac〇bs等人，j ciin

Oncol 17:1983-1987， 1999 。 若存在精確、準確且一致之測定EGFR及HER2-neu表現 量之方法’可確定與患者生存力相關之表現量及受體酪胺 酸激酶靶向化學療法是否適當。使用標準化法進行NSclc 中EGFR及/或HER2-neu過度表現之一致證明為建立目前及 將來受體酪胺酸激酶靶向化學療法（例如化療劑、基於抗 體之藥物以治療過度表現該等受體之癌症）之臨床試驗中 所需。

DPD 5氣尿喷d定（5 -fU)為治療許多不同類型癌症極廣泛使用 之藥物’該等癌症包括諸如GI道及乳腺癌之主要癌症 (Moertel, C. G. New Engl. J. Med., 330:1136-1142, 1994) 〇 僅使用5-FU進行結腸直腸癌之標準第一線治療已超過4〇 年，但其藉由5-FU與CPT-11之組合替換為”標準護理” (SaltZ等人，Irin〇tecan Study Group. New England J0urnal 〇f Medlcine· 343:905-14，2000)。最近，5-FU與舆賽力鉑 132488.doc 200911988 (oxaliplatin)之組合已在結腸直腸癌令產生高反應率 (Raymond等人，Semin. 0ncol.，25:4·12, 1998)。因此，5_ FU將很可能多年用於癌症治療，因為其仍為當前化學療法 之中心組份。此外，單-藥劑5_FU治療繼續用於與抓⑴ 或奥賽力鉑之組合治療可能過度有毒之患者。 由於僅少數患者對治療存在有利反應，5刊為大多數抗 癌藥物之典型。大型隨機化臨床試驗已展示對於患有轉移 性結腸直腸癌之患者而言，腫瘤對單一藥劑形式之之

( 整體反應率介於15-20%範圍内（Moertel，C. G. New Engl J

Med.’ 330:1 136_1142, 1994)。與上述其他化療劑組合§，腫 瘤對基於5-FU之療法的反應率增加至幾乎4〇%。然而，大 多數經治療患者自接受基於5_FU之化學療法未獲得切實益 處，且經受相當大之風險、感覺不適且花費費用。由於在 治療之前無預測個體腫瘤反應性之可靠方法，故標準臨床 實務曾使所有患者進行基於5_FU之治療，充分認識到大多 數患者將遭受不令人滿意之結果。 ί ,； ' 多年來已對5-FU之作用機制及代謝途徑進行集中研究以 確定藥物抗腫瘤活性最重要之生物化學決定因素。最終目 的在於改良5-FU之臨床功效，其係藉由·· a)調節其細胞内 代謝及生物化學；及b)在治療之前量測患者腫瘤中之反應 決定因素以預測最可能對該藥物反應（或不反應）之患者。 該等研究中所存在之兩個主要決定因素為：丨）5_FU靶向 酶，即胸苷酸合成酶（TS)之特性及2) 5_FU分解代謝酶，即 二氫嘧啶脫氫酶（DPD)之特性。 132488.doc -18- 200911988 對基於5-FU療法之腫瘤反應預測領域中之第一研究集中 於結腸直腸癌中之靶向酶TS。Leichman等人（Leichman等 人，J. Clin Oncol.，15:3223-3229，1997)進行預期臨床試驗 而使結腸直腸癌之預處理生檢組織中對5之腫瘤反應與 如由RT-PCR所測定之TS基因表現相關。此研究展示·· υ 該等腫瘤中之較大的50倍範圍之TS基因表現量；及2)反應 與不反應腫瘤之間的TS基因表現之顯著差異含量。反應組 之TS含量範圍（0.5-4.1X1 〇·3，相對於内部對照）比不反應組 f 之範圍（1.6-23.0x1 (Γ3，相對於内部對照）窄。研究者確定 所得TS表現之”不反應界限”臨限值，其中當高於其時僅存 在不反應者。因此，TS表現高於該"不反應界限"臨限值之 患者可在治療之前明確確定為不反應者。”不反應”類別包 括腫瘤縮小<50%之所有治療反應，使腫瘤增大>25%之進 行性生長（progressing growth)，及腫瘤縮小<5〇%、不變化 或增大<25。/。之非進行性腫瘤。該等腫瘤具有最高TS含 量。因此，高TS表現尤其確定抗性腫瘤。高於特定臨限值 p k 之TS表現量確定對5_FU不反應之腫瘤亞群，而低於該數字 之TS表現量預測略高反應率但並不特別地確定反應腫瘤。 後續研究調查了作為腫瘤反應決定因素之DPd表現量與 TS表現量聯合對療之適用性。dPd為還原5_FU之 5,6雙鍵、使5-FU作為細胞毒性劑失活之分解代謝酶。先 月’J研究已展不正常組織中之DPC)含量可影響5_FU之生物可 用性’由此調節其藥物代謝動力學及抗腫瘤活性（Harris等 人 ’ CanCer Res.，50:197-201, 1990)。此外，已提供證據表 132488.doc -19- 200911988 明腫瘤中之DPD含量與對5-FU之敏感性相關（Etienne等 人，J. Clin. Oncol.，13:1663-1670，1995 ; Beck等人，Eur. J. Cancer，30:1517-1522，1994)。Salonga等人（Clin Cancer Res·，6:1322-1327，2000)研究TS表現已測定之腫瘤組中作 為5-FU/甲醯四氫葉酸治療之腫瘤反應決定因素之dPd 的基因表現。如TS —般，反應腫瘤中之DPD表現之範圍 (〇·6-2.5χ10_3，4.2倍；相對於内部對照）與不反應腫瘤 (0·2-16χ10·3，80倍；相對於内部對照）相比相對較窄。不 存在DPD表現大於約2.5χ10·3之臨限值的反應腫瘤。此 外，DPD與TS表現量彼此之間未展示相關性，表明其為獨 立調節基因。在TS與DPD表現量均低於其相應，，不反應界 限"臨限值之腫瘤組中’ 92〇/〇對5_Fu/LV反應。因此，反應 腫瘤可基於低表現量DPD及TS確定。 DPD亦為5-FU毒性之重要標記。進行基於5_FU治療之具 有極低DPD含量之患者（諸如DPD缺乏症候群；亦即胸腺嘧 咬尿唆啶尿症）遭受危急生命之毒性（Lyss等人，Cancer Invest” 1 1:2390240, 1993)。實際上，DPD 含量在 5_FU 治療 中之重要性可藉由由於5-FU與抗病毒化合物索立夫定 (Sorivudine)之不利藥物相互作用日本發生19人死亡來顯著 說明（Diasio等人 ’ Br· J. Clin. Pharmacol· 46, 1-4，1998)。 隨後發現索立夫定之代謝物為DPD之有效抑制劑。該治療 引起類DPD缺乏症候群之DPD含量抑制，此增m5_fu對患 者之毒性（Diasio等人，Br. J. Clin. Pharmacol. 46，1-4, 1998) 〇 ’ 132488.doc -20- 200911988 因此，由於：a) 5-FU方案在癌症治療中之廣泛使用；b) DPD表現在預測對5-FU之腫瘤反應中之重要作用；及c)患 有DPD缺乏症候群之個體對一般基於5_fu治療的敏感性， 故顯然在化學療法之前精確測定DPD表現量將向癌症患者 提供重要益處。 量測DPD酶活性需要含有活性酶之大量新鮮組織。令人 遺憾地，大多數預處理腫瘤生檢組織僅以固定石蠛包埋 (FPE)組織、尤其福馬林固定石蠟包埋組織形式獲得，該 等組織並不含有活性酶。此外，生檢組織通常僅含有極少 量異質組織。 RT-PCR引子及探針序列可用於分析冷柬組織或新鮮組 織中之DPD表現。然而’該等引子不適合於藉由rt pcr自 固定組織定量DPD mRNA。迄今為止，現有引子未產生結 果或產生錯誤結果。認為此係由於：a) DPD RNA之含量 固有較低；b)極少量組織包埋於石蠟中；及c)石蝶中之 RNA降解為< 1 〇〇 bp之短片段。因此，為獲得使得可進行 石蝶化組織中DPD表現之該定量的寡核苷酸引子組，其他 研究者進行共同但未成功之努力。因此，需要自固定組織 定量D P D m R N A之方法以提供所建議之癌症療法之早期預 後。由於已展示DPD酶活性與相應現量完全相關 (Ishikawa 等人，Clin. Cancer Res., 5:883_889，1999 ;

Johnson等人，Analyt. Biochem. 278:175-184, 2000)，故量 測FPE標本中之DPD mRNA表現提供評估患者之DpD表現 量情況之方法而不必測定新鮮組織中之酶活性。此外， 132488.doc 21 200911988 fpe標本易於進行顯微切割’因此可在未污染有基質組織 之腫瘤組織中測定DPD基因表現。

TS 胸苷酸合成酶（TS)為DNA生物合成中之整合酶，在DNA 生物合成中，其催化脫氧尿苷單磷酸（dUMP)還原性甲基 化為脫氧胸苷單填酸（dTMP)且提供細胞内嘴咬核苷酸全程 合成之唯一途徑（Johnston等人’ 1995)。胸苷酸合成酶為 化療藥物（最常見抗葉酸劑5-氟尿嘧啶（5-FU))之標靶。作 為治療結腸、頭部及頸部及乳癌之最有效單一藥劑，5_Fu 之主要作用在於抑制TS活性’引起細胞内胸腺嘧啶含量缺 乏且隨後導致細胞死亡。 原發性腫瘤（Johnston等人，1995 ; Lenz等人，1995)與 癌轉移（Farrugia等人，1997 ; Leichmann等人，1997)之臨 床腫瘤標本中已報導TS表現產生相當大之變化。在結腸直 腸癌中，例如’腫瘤組織中之TS表現相對於正常胃腸黏膜 組織之比率介於2至10之範圍内（Ardalan及Zang，1996)。 亦已知胸苷酸合成酶在腫瘤抗性產生中具有臨床重要 性’如由以下研究所展示，該等研究已展示暴露於5_FlJi 後贅生性細胞中緊急誘導TS蛋白且增加TS酶含量（Spears 等人，1982 ; Swain等人，1989)。腫瘤反應於細胞毒性劑 (諸如5-FU)緊急過度表現TS之能力可在產生氟尿嘧啶抗性 中發揮作用。先前研究已展示TS蛋白之含量與5-FU治療有 效性直接有關，蛋白與RNA表現之間存在直接相關性 (Jackman等人’ 1985) ’且TS表現為結腸直腸及乳癌中之 132488.doc -22- 200911988 有效預後標記（Jackman等人，1985 ; Horikoshi等人， 1992) 〇 在晚期轉移性疾病中，由RT-PCR定量之高TS mRNA及 向TS蛋白表現已展示預測對結腸直腸癌（j〇hnstoI1等人， 1995，Farrugia等人，1997，Leichman等人，1997)、胃癌 (Lenz等人’ 1995，Alexander等人，1995)及頭部及頸部癌 (Johnston等人’ 1997)之基於氟嘧啶之治療的不良反應。 低TS類型中通常存在反應者與不反應者之間的相當大的重 疊’但TS含量高於中值之患者主要為不反應者。若與其他 分子特徵’諸如二氫嘧啶脫氫酶（DpD)及胸苷磷酸化酶 (tp)表現ϊ、複製錯誤陽性（rer+)狀態（Khchens及Berger 1997)及p53狀態（Lenz等人，1997)組合，則可進一步增強 ts過度表現之預測價值（value)。迄今為止，評估人類腫瘤 中ts表現之研究表明基於人類腫瘤中TS表現預測反應及 結果之能力可在將來提供機遇來選擇最可能受益於以引導 治療之患者。 【發明内容】

本發明之一態樣在於提供一種自固定組織標本提取RNA 之方法本&明亦提供自福馬林固定石壤包埋組織分離 RNA之準確且可再現方法。 本發月提仏種自固定組織樣品分離長片段RNA之方 法’其包含將提取溶液中之固定組織樣品加熱至介於約44 至約62°C範圍内之溫度歷時3小時或3小時以上之時段，其 中該提取溶液包含約碰至物蝴濃度之螯合劑及蛋 132488.doc -23- 200911988 白酶Κ(較佳濃度為每400 約5 ng蛋白酶κ(每mL 12·5 μ§ 蛋白酶Κ));及移除DNA污染及自該提取溶液分離該 RNA。 在某些實施例中，加熱可在約45°C至約6〇t，約48。(：至 約58°C，約48°C至約55°C，約48T：至52°C範圍内或約5〇°C 之溫度下。尤佳加熱溫度為約5〇_56°C。 在某些實施例中，時段為大於4小時，大於8小時，大於 12小時，大於14小時或約16小時。在一較佳實施例中，時 段為約16小時。 螯δ劑可為任何螯合劑’諸如EDTA、EGTA、檸檬酸 鹽、檸檬酸、水揚酸、水楊酸鹽、鄰苯二甲酸、2,4_戊二 酮、組胺酸、組胺醇二鹽酸鹽、8_羥基喹啉（8_ hydT〇xyqUln()ilnes, 8 hydr〇xyquin〇line)、檸檬酸鹽或鄰羥 基酿。在一較佳實施例中，螯合劑為EDTA或檸檬酸鈉。 在某些實施例中’螯合劑為EDTA或檸檬酸鈉且以約2.5 mM至約5.0 mM之濃度存在。在某些實施例中，edta或檸 樣0义納以約2.5 mM至約5.0 mM之濃度，約3.0 mM至約4.0 mM之濃度’約3.25 mM至約3.75 mM之濃度存在。在一較 實施例中’ EDTA或檸檬酸納以約〇.6 mM至約3.6 mM之 /辰度存在。在另一較佳實施例中，edTa或擰檬酸鈉以約 3.6 mM存在。 DNA污染可藉由此項技術中已知之方法移除，該等方法 7如（但不限於）苯酚/氣仿/異戊醇（PCI)提取，藉由第一PCI 弟—PCIk取或兩者中存在離液劑（chaotropic agent) 132488.doc -24- 200911988 之雙苯酚/氯仿/異戊醇（二者均添加或不添MDNAse)，或 市售純化管柱（亦即Qiagen，使用或不❹麗㈣，或其他 產品）（亦即Ambicm之無Turb。DNase方法）。在—些實施例 t ’可使用該等方法之混合法。 離液劑可為任何已知離液劑，諸如尿素、異硫氰酸脈、 硫氰酸鈉(NaSCN)、鹽酸胍、氯化胍、硫氰酸胍、四氯乙 酸鋰、高氯酸納、四氯乙酸麵、埃化卸或三氣乙酸鉋。在 某些實施例中’離液劑為異硫氰酸胍。 在某些實施例中m福馬林固定石犧包埋組織樣品 為16年齡或小於16年齡。在—較佳實施例中，組織樣品為 5年齡或小於5年齡，且在較佳實施例中，組織樣品為二年 齡或小於2年齡。 在某些實施例中，長片段RNA之長度長於2〇〇個核苷 酸。在其他實施例中，長片段RNA為3〇〇個核苷酸或長於 300個核苷酸。在一較佳實施例中，長片段RNA之長度介 於約300至約400個核苷酸之間。 【實施方式】 本發明提供一種自固定組織標本分離長片段RNA之方 法。本發明之方法適合於多種含核酸生物樣品。本發明之 方法尤其適用於自固定腫瘤組織標本分離RNA^生物樣品 通常以固定劑固定，該等固定劑諸如福馬林（甲醛κ包括 Bonin固定劑）及戊二醛。使用諸如乙醇浸潰⑺抓价^及

Kopinski，J. Histochem. Cytochem. (1986) 34:1095)之其他 固疋技術固疋之組織樣品亦合適。組織樣品亦可包埋於石 132488.doc -25- 200911988 蠟中。最常見的，組織樣品保存為福馬林固定石蠟包埋 (FFPE)樣品。 本文中長片段RNA定義為長於100 nt之RNA。較佳地， RNA之長度為約150 nt或長於150 nt，更佳地長度為約200 nt或長於200 nt，且最佳地，長度為約300 nt或長於300 nt。在某些實施例中，長片段RNA為約400 nt或長於400 nt。長片段RNA亦可包括1000 nt或長於1000 nt之RNA片 段。 一般而言，歷時某給定時間之高溫培育為自FFPE標本 提取大分子（諸如RNA)所必需。存在兩種一般程序來達成 自石蠟回收RNA :在離液劑（諸如胍鹽）存在下培育FFPE樣 品或在蛋白酶K，即一種降解蛋白且可能有助於自蛋白基 質釋放RNA之酶存在下培育。已知該等基本方法之多種變 化。然而，先前研究或方法未特別針對自FFPE樣品提取較 長RNA片段。通常持有以下概念：RNA分子在提高之溫度 及暴露於高溫提高之時間的情況下降解。然而，未知或通 常未瞭解溫度/時間與自FFPE提取之高品質/長片段RNA物 質之最大產率之間的定量關係。此外，亦未知是否可能存 在RNA不會由於僅熱作用而明顯降解之臨限溫度。 本發明之發明者已確定溫度與時間均對RNA品質有影 響，但溫度及時間對短片段RNA(100 nt或短於100 nt)之影 響與溫度及時間對長片段RNA(長度超過100 nt之片段，諸 如300 nt長度之片段）之影響無必然相關性。圖1A及圖1B 提供FFPE樣品在各種溫度（92、82、72及62°C)下培育不同 132488.doc -26- 200911988 ( 1、2及8小時）之結果。Y軸為Ct值。Ct值係關於 PCR產物之量且因此係關於pcR反應物中所存在標靶之初 始夏。該關係為相反的，亦即較大Ct數值表明最初存在較 示靶RNA。圖1中所示之結果證實300 nt RNA對溫度敏 感，因為在92。(：下之產率即使在最短時間點3〇 min的情況 下仍低於較低溫度下之產率。然而，對於1〇〇加rna* 言，在30分鐘且培育時間為一小時的情況下，產率在62t 下為最低而非在92。〇下。3〇〇 nt長度之物質的豐度即使在 I 較紐培育時間的情況下仍大大少於1〇〇加之物質（約6個Ο 循核；26=64倍）。此外，3〇〇 nt物質在82T：下自0_5 hr開始 至2 hr ’與相同條件下1〇〇加RNA之增加2個循環（產率減 ^ 2 4倍）相比對熱較敏感（Ct循環增加ό個，產率減少 2 =64倍）。在62它下在所有培育時段產率變化為最小，表 明存在臨限溫度，低於該臨限溫度RNA相對穩定，且表明 在較低溫度下培育較長時間對於較高分子量RNA之最佳分 「 離將更向效。向於62。(：之溫度引起RNA隨時間顯著較多之 、降解，且雖然在較高溫度下RNA之總產率可能略微增加， 但長片段RNA之產率降低。 圖2A及圖2B說明加熱時間對5〇t下所回收之各長度rna 物質之RNA之量（產率）的影響。該等圖展示所有尺寸之 RNA的產率在培育較長時間時均增加。如圖2中所說明， 將腫瘤組織之FFPE樣品在蛋白酶尺存在下在5〇〇c下加熱 心至16 hr變化之時段。舉例而言，標示F4_〇5_lx ι〇〇Βρ 意謂將樣品F4加熱〇,5小時且該樣品為1〇〇价長度之片段。 I32488.doc -27- 200911988 f 所有尺寸之RNA片段之產率隨培育時間增加而增加。自較 短培育時間開始至較長培育時間，1〇〇 nt片段之產率增加 超過1〇倍(約3·猶R循環)，而3 —片段增加幾乎y(對 應於減少6個PCR循環）或約倍。彻㈣段可見該類似 結果。1〇00 _段可見略少產率增加(約H)倍)，此可能表 明在較長培育時間的情況下增加之提取物或許由該尺寸 RNA之某些降解平衡。該等數據說明自石蠘基質提取键 之相當大料間依驗1及指出在料條件下所有魏 片段長度在5(TC下之穩、定性（與如圖^中戶斤示在饥下相 :二顯然’較低培育溫度不僅在絕對含量上而且在相對 (亦即在1 6 hr培育時間的情況下i 〇〇 bp與3 〇〇 ^物質 1僅2倍Ct差異）均大體上增加3⑼加及更大物質之 產率。 、 因此，圖1與圖2-起之數據展示RNA在92。〇下熱不穩定 且=加溫度尤其對較長片段讓不利。該等圖亦展示與較 —八相比在同溫下，較長培育時間較多地降解RNA。 * ' 士圖2中所示，當溫度降低至較中等溫度時，不存 在預期仍可見之時間依賴性降解。 、此本發明提供一種自固定組織樣品（諸如FFPE組織） :離較長片段尺财之方法，I中將該組織樣品在約价至 、,’、 之/皿度範圍内加熱3小時或長於3小時之時段。在其 實^例中，將固定組織樣品在約44°C至約60。〇之溫度範 圍内加執，A a & …、在更佳實施例中，在約48°C至約58°C之溫度範 内在其他較佳實施例中，在約48°C至約55〇C之溫度範 132488.doc •28· 200911988 圍内’在其他較佳實施例中，在48<t至饥之溫度範圍 内，且在最佳實施例中在約50。。至約56。。之溫度範圍内。 熟習此項技術者應理解術語，，約，，係用於包涵加熱浴、加熱 塊及PCR機器中可能存在之較小非實質性溫度變化，且裝 置與裝置或實驗室與實驗室之該等較小變化可不具有不利 或淨積極影響（net positive effeet)，且包涵於中請專利範 圍之範4内。熟習此項技術者應理解，術語約意欲表明申 請專利範圍之範疇包涵所述溫度範圍附近之溫度變化，只 要該等方法用於其職料（㈣分離長片段舰）即可。 將組織樣品在上述溫度下加熱2小時或大於2小時至高遠 20小時之時段（及其間任何時間卜舉例而言，該時段可處 於2小時與高達2〇小時之間的任何時間，且可處於其間任 可範圍内舉例而5，本發明提供加熱約4小時至約丨9小 時，約5小時至約17小時，約6小時至約17小時，約7小時 至約16.5小時，約8小時至約16.5小時，約9小時至約16 5 小時，約1〇小時至約16.25小時等 <時段。在較佳實施例 中，該時段為約12小時至17小時，且在更佳實施例中該 時段為約14小時至約16小時。在最佳實施例中，該時段為 、’、勺1 6小時。热習此項技術者應理解，術語”約"意欲表明申 ""月專利範圍之範疇包涵所述小時量附近之時間變化，只要 °亥等方去用於其預期用途（亦即分離長片段RNA)即可。 本發明之一尤佳實施例包含在約5(rc下加熱固定組織樣 口口（諸如FFPE)約16小時，其使長片段RNA ’且尤其3〇〇加 或長於300 nt之RNA的產率最大化。如以上所述且如圖丨及 132488.doc -29· 200911988 圖2所不，在該溫度tRNa長時段内穩定，且由於自石 k取大分子亦為時間依賴性的，故約丨6 hr之培育時間為適 宜的（且可能在該溫度下）以達成長片段rNa之最大產率。 本發明之方法亦包含在蛋白酶反存在下加熱固定組織樣 品。如以上所述’蛋白酶尺適用於提取最大量之rNA。然 而，若在分離中使用過量蛋白酶K，則亦將自基質釋放較 多DNA，產生RNA製品之較高DNA污染。圖4展示在培育 步驟中改變蛋白酶κ之量對自石蠟基質移出RNA之影響。 舉例而言，標記為F4_16_lX_100bp(其代表樣品F4，加熱 16小時’使用1Χ(5 μβ)量之蛋白酶κ)之樣品具有低於 F4_16_2X_l〇〇bp(2X=l〇 μβ)A F4_l6_4X_100bp(4X=20 μδ) 樣之CT值。在尺寸為goo bp及400 bp之RNA中亦觀察到 此現象（可見樣品F4_16_1X—300bp及F4—16—lX_400bp具有 該尺寸RNA之最低CT臨限值）。因此，每4〇〇 5 μ蛋白 酶Κ(每mL 12.5 μ蛋白酶Κ)之濃度較佳。然而，如實例19 中所不，可成功地使用其他量炙蛋白酶κ(亦即〇 5χ、1χ、 2χ、4χ)。亦可使用以下蛋白酶替代蛋白酶κ，包括（但不 限於）：Qiagen®蛋白酶、布拉法辛（br〇fasin ’自華壯鳳梨 /«州似α)提取之植物蛋白酶）及自山番木瓜 (cwzca c狀心如⑷分離之半胱胺酸蛋白酶。 通常將用於螯合二價或更大價金屬離子之EDTA(乙二胺 四乙酸）作為提取緩衝液之組份添加。然而，在提取緩衝 液中使用EDTA之已知方法之研究揭示FFpE提取程序中之 各種/農度之EDTA ’其表明其他人並不瞭解存在或需要特 132488.doc •30· 200911988 定濃度之EDTA來防Α二價金屬離子對RNA分+之影響。 圖3展示培育時間及EDTA濃度之影響。根據實例i中所述 之方法處理FFPE組織樣品，其例外為將樣品在16心培育 期間在蛋白酶κ存在下暴露於不同溫度（5〇、6〇及7〇υ)。 此外，使用提取溶液中之四種不同濃度之EDTA(〇1、 0.5、3.6及20mM)β圖3A展示3·6mMEDTA之濃度產生較 高長片段RNA產率，通常使產率增加超過兩倍。圖3亦說 明所有尺寸之RNA的最高產率均在5〇〇c之培育溫度下獲得 (約25°/。大於60 C下且約4倍大於70。(：下）。低濃度之 EDTA(0.1 mM)使RNA產率減少2·3倍之多，而與3 6 mM相 比使用20 mM之高含量使產率減少約25〇/0。 因此，本發明方法另外提供使用螯合劑（諸如EDTA)於提 取溶液中。螯合劑為能夠形成多價金屬離子錯合物的熟知 有機化合物。因此，除EDTA之外，其他螯合劑亦可用於 本發明之方法中。螯合劑可選自通常所用者。舉例而言， EDTAs、EGTAs、擰檬酸鹽（諸如擰檬酸納）、檸檬酸、水 楊酸、水楊酸鹽、鄰苯二甲酸、2,4-戊二酮、組胺酸、組 胺醇二鹽酸鹽、8-羥基喹啉、檸檬酸鹽及鄰_羥基醌為此項 技術中已知之代表性螯合劑。在較佳實施例中，使用 EDTA或檸檬酸鈉。參見實例1 5。 螯合劑可以約0.1 mM至約1 5 mM之濃度及其間任何濃度 或範圍存在。較佳實施例包含約2.5 mM至約5.0 mM濃度 之螯合劑。較佳實施例包含約3.0 mM至約4.0 mM濃度之 螯合劑。更佳實施例包含約3.25 mM至約3.75 mM濃度之 132488.doc 31 200911988 螯合劑。最佳地’螯合劑以約3.6 mM之濃度存在，在最佳 實施例中，螯合劑為EDTA或檸檬酸鈉，且以約〇.6 mM至 約3.6 mM存在，或以約3.6 mM存在。熟習此項技術者應 理解，術語'’約，，意欲表明申請專利範圍之範疇包涵所述 mM量附近之變化’只要該等方法用於所欲用途（亦即分離 長片段RNA)。 長培育時間（諸如本發明所用）之缺點（與在較高溫度下與 離液劑之短培育時間相比）為少許DNA可與RNA —起共提 取’導致先前技術部分中所述之RN A分析之潛在問題。通 常在程序之後提取階段以脫氧核糖核酸酶（DNAse)處理樣 品來處理DNA污染。雖然該試劑可有效減少DNA之量，但 其亦可能使所分離RN A之量減少四至八倍，對於組織内容 物已不豐富之標本分析可能為重大損失。因此’本發明亦 提供一種分離方法，其無需使用DNAase，代之以在蛋白 酶K步驟之後使用雙苯酚/氣仿提取方法。該雙苯酚/氯仿 提取涉及使用離液劑，其特別移除大部份DNA而保持rna 之產率。 在較佳實施例中，使用離液劑之雙苯酚/氣仿提取共分 離低於10%之DNA。 雙苯盼/氣仿提取步驟包含執行至少第一及第三苯紛/氣 仿提取，纟中第二苯紛/氣仿提取包含離液劑。可使用任 何離液劑。離液劑藉由抑制核酸酶活性使核酸穩定。舉例 而言’已知離液劑包括（但不限於）尿素、異硫氛酸脈、硫 氰酸鈉（NaSCN)、鹽酸胍、氣化脈、硫氰酸脈、四氣乙酸 132488.doc •32- 200911988 鋰、高氯酸鈉、四氣乙酸铷、碘化鉀及三氟乙酸鉋。 可使用移除DNA污染之其他方法（只要其並不明顯破壞 長片段RNA即可），包括(但不限於)使用市售產品，諸如

Qiagen之純化管柱（使用或不使用職叫及Ambi〇n之無 Turbo DNase方法。 使用已知程序（諸如乙醇或異丙醇 移除DNA污染之後 沈澱）分離RN A。

現行看法似乎為，福馬林固定及包埋於石蠟基質中之 後，RNA分子對於無限之時段為穩定的，因此存擋樣品之 年齡不再為—個問題。雖然確實總RNA(所有尺寸及片段） 隨時間僅極緩慢地減少，但本發明之發明者已確定較長片 段RNA之情況並非如此。3⑽的及3⑽喊上之舰片段之 豐度在年長FF_本中顯著降低。圖Μ展示_年固定之 4及5)產生低於2〇〇5年固定之樣品 樣品（樣品 (D9及F3)產率及品質的RNA。因此，對於長片段RNA 較重要之應用而言，FFP_織樣品應為5年齡或小於5年 7 一然而，虽樣品為丨6年齡時已獲得長片段rna(數據未 展不）因此，在本發明之一實施例中，固定樣品之年齡 為小於5年齡。在-更佳實施例中，樣品為小於3年齡，且 在一最佳實施例中，樣品為小於2年齡。 =由本發明之方法分離之RNA適合於多種目的及分子生 予私序，包括（但不限於）：反轉錄為cDNA;產生放射 ^ :蟹光或以其他方式標記之eDNA用於基因晶片、寡核 苷S夂微陣列及其類似物分析；丙烯醯胺電泳或瓊脂糖凝膠 132488.doc -33- 200911988 電泳；層析純化（例如離子交換、矽膠、逆相或尺寸排阻 層析法）；與核酸探針雜交；及藉由機械、音波或其他方 法分段。 一般而言，在癌症領域，生物標記之表現為診斷以及確 定治療療法之關鍵。本發明之方法可用於分離任何所需生 物標記之RNA。實例包括（但不限於）Kras、MMR1、 ERCC1、DPD、Gst-pi、EGFR、TS及 Her2-neu。 因此，本發明不僅提供分離長片段RNA之方法，且提供 由本文中所揭示之方法分離之RNA。本發明之另一實施例 提供藉由複製本發明之經分離RNA製備之cDNA。熟習此 項技術者應理解cDNA可易於由經分離且純化之RNA製 備。此外，本發明之另一態樣提供使用經分離之RNA或由 經分離RNA製備之cDNA製備微陣列或基因晶片。本發明 亦提供本發明之經分離RNA在用於治療或診斷目的之基因 表現或基因複本數分析中之用途，如通常存在於基於基因 表現量或基因複本數之癌症偵測/診斷中及在確定適當化 學療法之領域中。使用適當PCR引子，可藉由本發明之方 法測定任何信息RNA之表現量。定量RT-PCR技術使得可 將石蠟包埋中之蛋白表現量（經由免疫組織化學）與同一樣 品中之基因表現量（使用RT-PCR)進行對比。 ERCC1 本發明之某些實施例部分基於以下發現：腫瘤中之 ERCC1 mRNA之量與以DNA在白化劑（platinating agent)治療 之患者之生存有關。認為具有表現高含量ERCC1 mRNA之 132488.doc -34 - 200911988 腫瘤的患者可能對基於鉑之化學療法具有抗性且因此具有 較低生存力值。相反地，腫瘤表現較低量ERCCl mRNA之 患者可能對基於翻之化學療法敏感且具有較大生存力值。 患者之腫瘤ERCC 1 mRNA相對表現係藉由將其與預定臨限 表現量對比來判斷。 因此，本發明之一實施例提供一種相對於内部對照之基 因表現定量固定及石蠟包埋（FPE)組織中ERCC1長片段 mRNA表現量的方法。本發明之發明者已開發出使得可準 確評估已固定及包埋之組織中ERCC1表現之寡核苷酸引 子。本發明提供寡核苷酸引子，ERCC1-504F(SEQ ID ΝΟ:1)、ERCC1-574R(SEQ ID NO:2)或大體上與其一致之 寡核苷酸引子之用途，其較佳與自固定及石蠟包埋（FPE) 腫瘤樣品提取（較佳使用本發明之提取方法）之長片段RNA 一起使用。ERCC 1基因表現之量測可隨後用於預後基於鉑 之化學療法。參看（例如）美國專利6,573,052，該專利係以 引用的方式併入。 因此，本發明之一實施例包括：首先，自FPE樣品提取 長片段RNA，及其次，藉由使用一對寡核苷酸引子，較佳 寡核苷酸引子對 ERCC1-504F(SEQ ID ΝΟ:1)及丑11(：(：1-5 74R(SEQ ID NO:2)，或大體上與其一致之募核苷酸進行 反轉錄酶聚合酶鏈反應來測定樣品中ERCC 1 mRNA含量。 較佳地，藉由本文中所揭示之方法中之任一者自FPE細胞 中提取RNA。 本發明之方法可應用於患者之任何類型之組織。為檢查 132488.doc -35- 200911988 腫瘤組織之抗性，較佳檢查腫瘤組織。在一較佳 中’亦檢查獲得該㈣之患者之正常組織之—部分。正常 組織預期對基於鉑之化療化合物具有抗性，亦即展示： ERCC1基因表現量’但腫瘤預期對該等化合物敏感亦： 展示低ERCC1基因表現量之患者可隨後以較高量之該化療 組合物治療。

展示低於臨限值之ERCC1基因表現量之患者可以較高量 之化療組合物治療，因為其與具有表現高於該臨限值之 ERCC1基因表現量之腫瘤之患者相比預期具有較大生存 力。或者，臨床醫師可確定具有表現高於臨限值之ercci 基因表現量之腫瘤的患者在其預期生存力較低之情況下可 能不會自化學療法獲得任何顯著益處。 本發明之方法可應用於各種腫瘤類型。此使得可製出個 體”腫瘤表現譜，，，由此測定個別患者樣品中之ERCC1表現 $且預測對不同化療劑之反應。較佳地，就ERCC 1而言， 本發明之方法適用於實體腫瘤，最佳地，非小細胞肺癌 (NSCLC)腫瘤。為將本發明之一些實施例應用於特定腫瘤 類型’較佳藉由編譯使特定ERCC1表現與對基於鉑之化學 療法的臨床抗性相關之數據集來證實ErcCI基因表現量與 生存力之關係。 如本文中所定義，當關於ERCC1時，”預定臨限值”為 ERCC1腫瘤表現之校正相對含量，其中已發現當高於其時 腫瘤可能對基於鉑之化學療法具有抗性。在對基於鉑之化 學療法敏感之腫瘤中可能發現低於該臨限值之腫瘤表現 132488.doc -36- 200911988 量。在對基於銘之化學療法反應之腫瘤中，表示為 ERCC1:P-肌動蛋白之比率的校正ERCC1相對表現範圍為小 於約6.7x10_3。對基於鉑之化學療法不反應之腫瘤的相對 表現-ERCClj-肌動蛋白比率為高於約6.7xl0-3。參見實例 Ί。 當關於ERCC1時，”預定臨限值”另外定義 對ERCC I表現量，若高於該含量，則接受基於鉑之化學療 法之患者可能具有低生存力。接受基於鉑之化學療法的患 者中低於該臨限值之腫瘤校正相對ERCC丨表現量與高患者 生存力相關。表示為ERCC1:卜肌動蛋白之比率的臨限校正 相對ERCC1表現量為約6 7xl〇-3。參見圖n，實例7。然 而本發明並不限於使用β-肌動蛋白作為内部對照基因。 e藉由本X中所述之本發明之方法中之任一者自F ρ ε組織 提取RNA。如本文所述之固定及石堰包埋卿）組織樣品 係指可儲存或存檔組織樣品。可將RNA自存檔病理學樣品 或生檢樣品分離，首先將該樣品進行去石蠟化。例示性去 。纖化方去包括以有機溶劑（諸如二甲苯）洗滌石壤化樣 ^可將去石蠟化樣品以低級醇水溶液復水。合適低級薛 包括(例如）甲醇、？ M m ^ 乙％、丙醇及丁醇。可將去石蠟化樣。 :⑼如)具有降低之濃度的低級醇溶液連續洗滌來復水： 二A將樣品同時進行去石壞化及復水。隨後自該樣品提 新鮮、♦滚或固定樣品中經純化總mRNA之 抓财之定量較佳使用此項技術中通用之（例如）反轉錄酶 I32488.doc •37- 200911988 聚合酶鏈反應（RT-PCR)法進行。定量ERCCl mRNA之其他 方法包括（例如）使用適用於多重PCR之分子信標及其他標 記探針。此外，本發明設想經由使用非PCR系統，使用（例 如）類似於 Invader® Assay(Third Wave Technologies, Inc·) 之螢光標記探針來定量ERCCl mRNA。最佳地，使用基於 螢光之實時偵測法（ABI PRISM 7700或7900 Sequence Detection System [TaqMan®], Applied Biosystems, Foster City，Calif.)或 Heid 等人（Genome Res 1996; 6:986-994)及 (' Gibson 等人（Genome Res 1 996; 6:995-1 001)所述之類似系 統進行ERCCl cDNA及内部對照或看家基因（例如β-肌動蛋 白）之定量。ABI 7700(TaqMan® Instrument)之輸出係以 Ct 或”循環臨限值π表示。對於TaqMan®系統，樣品中具有較 高數目之標靶分子的高度表現基因與具有較少標靶分子之 較低相對表現之基因（較高Ct)相比產生具有較少PCR循環 之信號（較低Ct)。 如本文中所使用之"看家”基因或"内部對照”意欲包括任 I 何組成性或全範圍表現之基因，其之存在使得可評估標靶 mRNA含量（諸如（但不限於择110：(：1、丁8、0?0、1^。-neu、Gst-pi、RRM1、Kras等）。該評估包含測定基因轉錄 之整體組成含量及控制RNA回收變化。”看家”基因或”内 部對照”可包括（但不限於）親環蛋白基因、β-肌動蛋白基 因、運鐵蛋白受體基因、GAPDH基因及其類似基因。最 佳地，内部對照基因為由Eads等人，Cancer Research 1999; 59:2302-2306所述之β-肌動蛋白基因。 132488.doc -38- 200911988 控制RNA回收變化需要使用”校準子RNA”。”校準子 RNA”意欲為具有經精確預定量之對照RNA的任何可用來 源。較佳地，使用人類肝臟總RNA(Stratagene，目錄號 #735017)。 如本文中所使用之”未校正基因表現（UGE)"係指標靶基 因表現相對於内部對照基因由TaqMan®儀器產生之數值輸 出。用於求出ERCC 1之UGE的方程式如實例6中所示，且 以圖1 2中之樣品計算說明。 本發明之另一態樣提供一種將TaqMan®儀器所獲得之未 校正基因表現（UGE)值以來源於非TaqMan®技術之"已知相 對基因表現''值標準化之方法。較佳地，將已知非 TaqMan®產生相對ERCC1 :β-肌動蛋白表現值以組織樣品之 TaqMan®產生ERCC1 UGE值標準化。 如本文中所使用之”校正相對ERCC 1表現”係指經標準化 之ERCC1表現，其係藉由將UGE乘以ERCC1特異性校正因 子（K ERCCl) J 產生可與相對於内部對照基因之已知範圍之 ERCCl表現量相比之值。實例ό及圖12詳細地說明該等計 算。該等數值使得可判定特定樣品之'’校正相對ERCC1表 現π是否高於或低於”預定臨限”值。與β-肌動蛋白之校正相 對ERCC1表現之預定臨限值為約6·7χ10·3。對於ERCC1、 内部對照β-肌動蛋白及校準人類肝臟總RNA(Stratagene， 目錄號#73 5 01 7)具有特異性之1^1^〇1為1.54/10_3。 ”已知相對基因表現’’值來源於先前分析之組織樣品且基 於標靶基因之RT-PCR信號與組成性表現之内部對照基因 132488.doc -39· 200911988 例如β肌動蛋白、^醜等)之比率。較佳地，該等組織 為福馬林固^及石蟻包埋（咖)樣品且根據本文所述 方法自八提取RNA。為相對於内部對照標準定量基因表 見使用此項技術中已知之定量RT_pcR技術。進行固定 循環數（亦即30)之預_TaqMan⑧㈣pcR反應且報導各樣品 之終點值。隨後aERCC1表現與卜肌動蛋白表現之比率形 式報導該等值。參見Reed等人之美國專利第5,705,336號。 可測定不同於β_肌動蛋白之内部對照基因及/或不同於人 類肝臟總RNA(Stratagene，目錄號#735〇17)之校準子尺^^八 之KERCC1。為如此進行，必須將内部對照基因舆校準子 NA以已測疋相對於特定内部對照基因之ERCC丨表現量 (亦即，已知相對基因表現之組織樣品校準。較佳地，該 等組織樣品為福馬林固定及石蠟包埋（FpE)樣品且使用本 文中所揭示之方法提取RNA。該測定可使用此項技術中所 熟知之標準預_TaqMan®，定量RT_pcR技術進行。該測定 之後如實例6中所述’該等樣品具有適用於測定對新内 部對照及/或校準子RNA具有特異性之新Kercci的ERcc】 "已知相對基因表現”量。 一般而言，側接ERCC1基因區之任何寡核苷酸對均可用 於進行本發明之方法。適用於本發明的在嚴格條件下與 ERCC1基因區雜交之引子將擴增20-1 〇〇〇個鹼基對，較佳 100-400個鹼基對，最佳約200-400個鹼基對之間的產物。 本發明提供特異性寡核苷酸引子對及大體上與其一致之 寡核苦酸引子，其使得可尤其準確評估FPE組織中之 132488.doc •40· 200911988 ERCC1表現。較佳寡核苷酸引子包括ERCC1-504F(SEQ ID ΝΟ:1)及ERCC1-574R(SEQ ID N〇:2)(本文中亦稱為寡核苷 酸引子對ERCC1)及大體上與其一致之寡核苷酸引子。募 核苷酸引子 ERCC1-504F(SEQ ID ΝΟ:1)及 ERCC1-574R (SEQ ID NO:2)在嚴格條件下與ERCC1基因雜交，且已展 示尤其有效用於藉由mRN A分離方法中之任一者，尤其藉 由本文中所揭示之方法使用自FPE細胞提取之RNA量測 ERCC1 mRNA含量。 f' 如本文中所使用，在核酸情形下，"大體上一致”意謂與 標靶在嚴格條件下雜交，以及當對比時核酸片段或其互補 鏈在適當比對時具有適當核苷酸插入及缺失，且至少約 60%核苷酸，通常至少約70%，更通常至少約80%，通常 至少約90%，且更通常至少約95至98%核苷酸相同。當雜 交比完全缺乏特異性具有選擇性時存在選擇性雜交。參見 Kanehisa，Nucleic Acids Res·，12:203-213 (1984)。 本發明包括與寡核苷酸引子序列ERCC1-504F(SEQ ID ΝΟ:1)、其互補序列，或 ERCC1-574R(SEQ ID NO:2)或其 互補序列之全部或一部分大體上一致的在嚴格條件（如本 文中所定義）下雜交之寡核苷酸。 在嚴格雜交條件下，僅高度互補，亦即大體上類似核酸 序列雜交。較佳地，該等條件防止雜交20個鄰接核苷酸中 具有4個或4個以上錯配，更佳20個鄰接核苷酸具有2個或2 個以上錯配，最佳20個鄰接核苷酸具有一或多個錯配之核 酸0 132488.doc • 41 · 200911988 核酸之雜交部分通常核苷酸長度為至少10個（例如15 個）。雜交核酸之雜交部分與本文所提供之寡核苷酸引子 或其互補序列之部分或全部序列至少約8〇%，較佳至少約 95°/。’或最佳約至少98%一致。 寡核苷酸引子與核酸樣品在嚴格條件下之雜交係如下所 定義。核酸雙鏈體或雜交體穩定性表示為熔融溫度， 其為探針與標靶DNA分離之溫度。該熔融溫度係用於定義 所需嚴格條件。若待確定序列與探針大體上一致而非一 致，則首先在具有特定濃度鹽（例如ssc或sspE)的情況下 建立僅進行同源雜交之最低溫度較適用。隨後假定1%錯 配使丁„降低rc，則雜交反應中之最終洗滌溫度相應地減 低（例如，若發現序列與探針具有>95%一致性，則最終洗 ;條/m度降低5 C )。實際上’ T m變化可介於每1 %錯配〇 . 5 與1.5°C之間。 嚴格條件包括在68°C下於5xSSC/5xDenhart溶液/1.0% SDS中雜交’及在室溫下於〇.2xSSC/0.1% SDS中洗滌。中 等嚴格條件包括在42°C下於3xSSC中洗滌。改變參數-鹽濃 度及溫度以達成引子與標靶核酸之間的最佳一致性值。關 於該等條件之其他指導在此項技術中易於獲得，例如

Sambrook，Fiseher 及 Maniatis, Molecular Cloning，實驗手 冊（第 2版）’ Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York，（1989)及 F. M. Ausubel 等人編輯，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons (1994)。 本文中所揭示之寡核苷酸引子能夠準確評估固定或固定 132488.doc -42- 200911988 及石蠘包埋組織以及冷束或新鮮組織中之ERCC 1基因表 現。儘管來源於FPE樣品之RNA相對於新鮮或冷凍組織之 RNA較易分段。因此’本發明之方法適用於檢定FpE組織 中之ERCC1表現量’其中先前無使用固定組織檢定ercCI 基因表現之方法。 由量測表現於腫瘤中之ERCC1 mRNA之量，熟習此項技 術者可進行關於腫瘤對特定基因毒素（gen〇t〇xin)之臨床抗 性或接受特定基因毒素之患者生存力之預後。例示性基於 翻之化學療法或誘導類似類型DNA損傷之化學療法為基因 毒素。 基於鉑之化學療法產生DNA之”大塊加合物"，其中主要 作用在於扭曲雙螺旋之立體構形。該等化合物意欲單獨或 與其他化學療法（諸如吉西他濱（Gem)或5-氟尿嘧啶（5_FU)) 一起投與。 基於始之基因毒性化學療法包含形成共價DnA加合物之 重金屬配位化合物。一般而言，該等重金屬化合物與PNA 共價結合以在相關部分形成順-1，2_鏈内二核苷酸加合物。 一般而言，該類別以順-二胺二氣鉑（11)(順鉑）為代表，且 包括順-二胺-(1，1·環丁烷二羧根基）鉑（11)(卡波鉑， carboplatin)、順-二胺基_(1，2_環己基）二氣鉑（π)、及順_ (I，2-伸乙基二胺）二氣鉑。鉑第一藥劑（platinum first agent)包括上述代表性化合物中任一者之類似物或衍生 物。 目前可由鉑配位化合物控制之腫瘤包括睪丸癌、子宮内 132488.doc • 43· 200911988 膜癌、子宮頸癌、胃癌、鱗狀細胞癌、腎上腺皮質癌及小 細胞肺癌以及成神經管細胞瘤及神經母細胞瘤。由於認為 反-二胺二氯鉑（Π)(反_DDp)能迅速修復其〇1^加合物，故 其在臨床上無效。在本文中使用反-DDP作為化療劑將可 倉b在非所選細胞中提供具有低毒性之化合物且在所選細胞 中提供具有高相對毒性之化合物。在一較佳實施例中，细 化合物為順鉑。 多種化合物通常與基於鉑之化療劑一起給予。舉例而言 BEP(博來黴素（bleomyCin)、依託泊_ (et〇p〇以以）、順始）用 於睪丸癌/台療’ MVAC(甲胺蝶呤（methotrexate)、長春花驗 (vinblastine)、阿黴素（d〇x〇rubicin)、順鉑）用於膀胱癌治 療，MVP(絲裂黴素c(mitomyein C)、長春花鹼、順鉑）用 於非小細胞肺癌治療。多種研究記載含鉑藥劑之間的相互 作用。舉例而言，已報導基於鉑之化學療法中所可能包括 之多種藥物的治療藥物協同作用。極短列表之用於此用途 之新近參考文獻包括以下參考文獻：〇kam〇t〇等人， Urology 2001; 57:188-192 ; Tanaka 等人，Anticancer Research 2001; 21:313-315 ; Slamon 等人，Seminars in Oncology 2001; 28:13_19 ; Lid〇r等人，J〇umal 〇f CHnical

Investigation 1993; 92:2440-2447 ; Leopold 等人，NCI Monographs 1987; 99_104 ; 〇hta 等人，Cancer Letters 2001; 162:39-48 ; van M〇〇rsel 等人，仏出讣 J〇_ai 〇f Cancer 1999; 80:981-990 。 其他基因毒性劑為形成持久性基因組病變之藥劑，且較 132488.doc •44- 200911988 佳適用作臨床控制癌症中之化療劑。基因毒素誘導DNA損 傷之 '.、田胞修復速率以及經由細胞分裂循環達成之細胞生長 速率影響基因毒素治療之結果。細胞基因組中之未修復病 變可阻礙DNA複製，損害新近合成之DNA的複製精確度或 阻礙細胞生存所需之基因表現。因此，基因毒性劑細胞毒 性（促使細胞死亡之傾向）之一決定因素為由此形成之基因 組病變對細胞修復之抗性。形成持久性基因組病變（例如 ”留於基因、、且中至少至細胞投入細胞週期之病變）之基因 毒性劑通常為比形成暫時、易於修復基因組病變之藥劑有 效之細胞毒素。 適用於治療多種癌症且受ERCC1表現量影響之一般類別 之基因·#•性化合物為DNA烧化劑及DNA插入劑。補骨脂素 為已知適用於光化學治療皮膚病（諸如牛皮癬、白斑症、 真菌感染及皮膚T細胞淋巴瘤）之基因毒性化合物。

Harrison 之 principles 〇f Internal Medicine，第 2 部分，

Cardinal Manifestations of Disease，第 60 章（1991 年第 12 版）。成員可烷基化DNA或插入DNA中之另--般類別基 因毒性化合物包括合成及天然來源之抗生素。本文中備受 關注者為抗腫瘤抗生素，其包括（但不限於）以以下各物為 代表之以下類別化合物：安吖啶（amsacrine);放線菌素 (actinomycin)A、C、D(或稱為更生黴素（dactin〇mycin))或 F(或KS4);重氮絲胺酸；博來黴素；洋紅黴素 (carminomycin)(卡柔比星 ’ carubicin)、道諾黴素 (daunomycin)(道諾紅菌素’ daunorubicin)或14-經基道諸黴 132488.doc -45· 200911988 素（阿德力黴素（adriamycin)或阿黴素）；絲裂黴素 (mitomycin) A、B 或 C ;米托蒽醌（mitoxantrone);普卡黴 素（plicamycin)(光神黴素，mithramycin);及其類似物。 通常所用且烷基化DNA之另——般類別基因毒性劑為包 括鹵基乙基亞硝基尿素，尤其氯己基亞硝基尿素之藥劑。 s亥寬廣類別之代表性成員包括卡莫司汀（carmustine)、氣脲 黴素（chlorozotocin)、福莫司汀（fotemustine)、洛莫司汀 (lomustine)、尼莫司汀（nimustine)、雷諾莫司；丁 (ranimustine)及鏈尿黴素（streptozotocin)。鹵基乙基亞硝 基尿素第一藥劑可為上述代表性化合物中任一者之類似物 或衍生物。 成員烧基化DNA之另 --般類別基因毒性劑包括硫及氮 芥。該等化合物主要藉由在鳥嘌呤N7原子處形成共價加合 物損害DNA。該寬廣類別之代表性成員包括笨丁酸氮齐 (chlorambucil)、環磷醯胺、異環磷醯胺（ifosfamide)、美 法侖（melphalan)、曱基氣乙基胺（mechl〇roethamine；|、新生 Μ素（novembicin)、曲填胺（trofosfamide)及其類似物。若 需要選擇一或多個預定基因組標靶作為基因組病變位點， 則與所選細胞之基因組中特定序列共價或非共價相互作用 之募核苷酸或其類似物亦可用作基因毒性劑。成員烷基化 DNA之另一類別藥劑包括伸乙基亞胺及甲基三聚氰胺。該 等類別包括（例如）六甲密胺（六曱基三聚氰胺）、三伸乙基 鱗醯胺（ΤΕΡΑ)、三伸乙基硫代磷醯胺（塞替派，Thi〇TEPA) 及三伸乙基三聚氰胺。 I32488.doc -46- 200911988 其他類別之DNA烧化劑包括烧基項酸醋，以白消安 (busulfan)為代表；氮丙咬，以苯佐替派（benzodepa)為代 表；及其他，以（例如）米托胍腙（mitoguazone)、米托蒽酿； 及丙卡巴肼（procarbazine)為代表。該等類別中之每一者包 括相應代表性化合物之類似物及衍生物。

DPD 本發明之發明者揭示寡核苷酸引子及大體上與其一致之 寡核苷酸引子，其使得可準確評估組織中之DPD表現。該 等寡核苷酸引子，DPD3a-51F(SEQ ID NO:5)及 DPD3a-134R(SEQ ID NO:6)(本文中亦稱為寡核苷酸引子對 DPD3A)及寡核苷酸弓1 子 DPD3b-651F(SEQ ID NO:7)及 0卩031)-73 611(8£(5 10>10:8)(本文中亦稱為寡核苷酸引子對 DPD3B)(參見美國專利7,005,278，該專利係以引用的方式 併入）當用於量測固定石蠟包埋（FPE)腫瘤標本中之DPD基 因表現時尤其有效。 本發明包括與募核苷酸引子序列DPD3A-51F(SEQ ID NO:5)、其互補序列，或DPD3A-134R(SEQ ID NO:6)或其 互補序列之全部或一部分大體上一致的在嚴格條件（如本 文中所定義）下雜交之寡核苷酸。此外，本發明亦包括與 寡核苷酸引子序列DPD3b-651F(SEQ ID NO:7)、其互補序 列，DPD3b-736R(SEQ ID NO:8)或其互補序列之全部或一 部分大體上一致的在嚴格條件（如本文中所定義）雜交之寡 核普酸。 核酸之雜交部分通常核苷酸長度為至少10個（例如1 5 132488.doc -47- 200911988 個）。雜交核酸之雜交部分與寡核苷酸引子DPD3A-

51F(SEQ ID NO:5)、其互補序列，DPD3A-134R(SEQ ID NO:6)或其互補序列之一部分或全部序列至少約8〇%，較 佳至少約95°/。’或最佳約至少98%—致。此外，雜交核酸 之雜交部分與募核苷酸引子DPD3b-651F(SEQ ID NO:7：)、 其互補序列，DPD3b-736R(SEQ ID NO:8)或其互補序列之 一部分或全部序列至少約80%，較佳至少約95%或最佳約 至少98%—致。 本發明之該態樣包括使用本文所述之方法自FPE標本準 確提取RNA ’及其次，藉由使用寡核苷酸引子寡核苷酸引 子對 DPD3A(DPD3a-51F(SEQ ID NO:5)及 DPD3a-134R(SEQ ID ΝΟ’·6))或大體上與其一致之寡核苷酸或DPD3B(DPD3b-651F(SEQ ID NO:7)及 DPD3b-736R(SEQ ID NO:8))或大體 上與其一致之寡核苷酸進行反轉錄酶聚合酶鏈反應來測定 標本中DPD mRNA含量。參見1999年12月20曰申請之美國 專利申請案第09/469,338號，該專利係以引用的方式併入 本文中。 DPD mRNA之表現與對基於5-FU之化學療法的臨床抗性 有關。詳言之，表現高含量DPD mRNA與對基於5-FU之化 學療法之抗性有關。 本發明之方法適用於各種腫瘤類型。此使得可製出個體 ”腫瘤表現譜”，由此測定個別患者樣品中之DPD表現量且 可預測對不同化療劑之反應。最佳地，本發明之方法適用 於支氣管肺泡、小腸或結腸腫瘤。為將本發明之一些實施 132488.doc -48- 200911988 例應用於特定腫瘤類型，較佳藉由編譯所量測之特定D阳 表現參數與對基於5_FU之化學療法的臨床抗性之相關性的 數據集來證實量測值與臨床抗性之關係。 、 Γ' 本發明之方法可應用於任何類型之組織。舉例而令，為 檢查腫瘤組織之抗性，檢查腫瘤組織較適宜。較佳地，，‘'、、 檢查獲得該腫瘤之患者之正常組織之一部分較適宜。正^ 組織對基於5.之化療化合物具有抗性但預期腫瘤對該等 化合物敏感之患者可隨後以較高量之該化療組合物治療。 本發明之方法包括自患者腫瘤獲得細胞樣品之步驟。將 實體或淋巴瘤或其部分以手術方式自患者切除。若在其切 除之後不久不可能自組織樣品提取RNA，則可將樣品固定 或冷凍。隨後將其用於獲得RNA。自切除組織之冷凍或新 鮮樣品提取及分離RNA係藉由此項技術中已知之任何方法 提取，該方法例如 Sambrook，Fischer 及 Maniatis，M〇lecular Cloning，實驗手冊，（第 2版），c〇ld Spdng

Laboratory Press, New York，（1989)。較佳地，在提取過程 中需小心以避免RNA降解。 或者，可將自患者獲得之組織固定，較佳藉由（例如）福 馬林（甲醛）或戊二醛處理。本發明亦涵蓋藉由乙醇浸漬固 定之生物樣品。通常將固定生物樣品脫水且包埋於石蠟或 熟習此項技術者已知之其他固體載體中。該等固體载體預 計可以有機溶劑移除，使得可將所保存組織進行後續復 水。如本文所述之固定及石蠟包埋（FPE)組織標本係指可 儲存或存播組織樣品。藉由本文所述之方法中之任一者自 132488.doc -49- 200911988 FPE細胞中提取RNA。 新鮮、冷凍或固定樣品中經純化總mRNA之DPD mRNA 之定量較佳使用此項技術中通用之（例如）反轉錄酶聚合酶 鏈反應（RT-PCR)法進行。定量DPD mRNA之其他方法包括 (例如）使用適用於多重PCR之分子信標及其他標記探針。 此外，本發明設想經由使用非PCR系統，使用（例如）類似 於 Invader® Assay(Third Wave Technologies，Inc.)之螢光標 記探針來定量DPD mRNA。最佳地，使用基於螢光之實時 ( 偵測法（ABI PRISM 7700 或 7900 Sequence Detection System [TaqMan®], Applied Biosystems, Foster City, Calif·)或 Heid等人（Genome Res 1996; 6:986-994)及 Gibson 等人（Genome Res 1996; 6:995-1001)所述之類似系統進行 DPD cDNA及内部對照或看家基因（例如β-肌動蛋白）之定 量。ABI 7700(TaqMan® Instrument)之輸出係以 Ct或"循環 臨限值"表示。對於TaqMan®系統，樣品中具有較高數目 之標靶分子的高度表現基因與具有較少標靶分子之較低相 ( 對表現之基因（較高Ct)相比產生具有較少PCR循環之信號 (較低Ct)。 本發明之一態樣部分基於以下發現：DPD mRNA之相對 量與對化療劑5-FU之抗性有關。本文中已發現表現高含量 DPD mRNA之腫瘤可能對5-FU具有抗性。相反地，表現較 低量DPD mRNA之腫瘤可能對5-FU敏感。患者之腫瘤DPD mRNA表現係藉由將其與DPD表現之預定臨限表現量對比 來判斷。 132488.doc -50- 200911988 如本文中所使用，當關於DPD時，’，未校正基因表現 (UGE)"係指DPD表現相對於内部對照基因之由TaqMan®儀 器產生之數值輸出。用於求出UGE之方程式如實例8中所 示，且以圖1 5中之樣品計算說明。 本發明之另一態樣提供一種將TaqMan⑧儀器所獲得之未 权正基因表現（UGE)值以來源於非TaqMan®技術之先前公 開相對基因表現值標準化之方法。較佳地’將先前由

Salonga專人，Clinical Cancer Research, 6:1322-1327, 2000 (該參考文獻之全文係以引用的方式併入本文中）公開之非

TaqMan®產生相對DPD:p_肌動蛋白表現值以組織樣品之 DPD UGE標準化。 如本文中所使用之”校正相對DPD表現"係指經標準化之 DPD表現，其係藉由將UGE乘以DpD特異性校正因子 (K〇Pd)產生可與先前公開之範圍之值相比之值。圖15詳 細說明該等計算。 "先前公開"之相對基因表現結果係基於標靶基因之RT_ PCR信號與組成性表現基因（卜肌動蛋白）之比率。在預_ TaqMan®技術研究中，進行固定循環數（亦即3〇)之pcR反 應且報導各樣品之終點值。隨後以DpD表現與卜肌動蛋白 表現之比率形式報導該等值。Salonga等人，Clinical

Cancer Research，6:1322-1327，2000，該參考文獻之全文 係以引用的方式併入本文中。 如本文中所定義之相對015〇表現之，，預定臨限"值為DpD 表現ΐ，其中已發現當高於其時腫瘤可能對5_fu具有抗 132488.doc -51 - 200911988 性。對5-FU敏感之腫瘤中可能發現低於該臨限值之表現 量。對基於5-FU之化學療法反應之腫瘤中相對DpD表現之 範圍為小於約〇.6><1〇-3至約2.5><1〇-3(約4.2倍範圍）。對基於 5_FU之化學療法不反應之腫瘤具有約0.2χ10·3至約ι6χ1〇-3 (約80倍範圍）之相對DPD表現。若存在大於約2.〇χ ι〇·3，較 佳大於約2.5Χ10·3之相對DPD表現，則腫瘤通常對 療不反應。該等數值使得可判定特定樣品之"校正相對 OPD表現”是否高於或低於"預定臨限，，值。校正相對表 現量之臨限值為約2.0x10_3至約2,5xlO·3。 本發明之方法適用於各種組織及腫瘤類型，因此可用於 評估患者中之治療且作為多種癌症（包括乳腺癌、頭部及 頸部癌、肺癌、食道癌、結腸直腸癌及其他癌症）中之診 斷或預後手段。較佳地’本發明之方法適用於預後支氣管 肺泡癌、小腸癌或結腸癌。 由量測表現於腫瘤中之DPD mRNA之量，熟習此項技術 者可進行關於腫瘤對基於5-FU之化學療法的臨床抗性的預 後。”基於5-FU之化學療法”包含單獨或與其他化療劑（諸 如甲醯四氫葉酸）一起或與DPD抑制劑（諸如尿嘧啶、5_乙 炔基尿》密咬、溴乙稀基尿嘴咬、胸腺D密咬、苯甲基氧基笨 曱基尿嘴。定（BBU)或5-氣·2,4-二經基η比咬）一起投與5_FU、 其衍生物。此外，已發現與5_FU或其衍生物與dpD抑制劑 5-乙炔基尿嘧啶之組合相比，將式⑴之5ι_脫氧_胞苷衍生 物與5 -FU或其初生物共投與顯著改良對腫瘤組織具有選擇 性之化療劑之傳遞’且在人類癌症異種移植模型中展示顯 132488.doc -52· 200911988 著地改良之抗瘤活性。

ERCC1/TS 本發明部分基於以下發現：TS及ERCC1 mRNA之量分別 與對5-FU及奥賽力鉑藥之抗性有關。認為表現高含量TS及 ERCC1 mRNA之腫瘤可能對基於鉑之化學療法具有抗性。 相反地，表現較低量TS及ERCC1 mRNA之腫瘤可能對基於 鉑之化學療法敏感。患者之腫瘤TS及ERCC1 mRNA表現情 況係藉由將其與預定臨限表現量對比來判斷。 本發明提供一種相對於内部對照之基因表現定量固定或 固定及石蠟包埋（FPE)組織中TS及ERCC1 mRNA表現量的 方法。除上述ERCC 1引子之外，本發明之發明者已開發出 使得可準確評估已固定或固定及包埋之組織中TS基因表現 之寡核苷酸引子。本發明亦提供寡核苷酸引子，丁8-763F(SEQ ID NO:9)、TS-825R(SEQ ID NO:10)，或大體上 與其一致之寡核苷酸引子，較佳將其與自固定及石蠟包埋 (FPE)腫瘤樣品提取之RNA —起使用。參見美國專利 7,049,059，該專利係以弓|用的方式併入。TS及ERCC1基因 表現之量測可隨後用於預後基於鉑之化學療法。 本發明之該實施例包括：第一，自如本文所述之FPE樣 品準確提取RNA之方法，及第二，藉由使用上述ERCC1及 TS寡核苷酸引子對或大體上與其一致之寡核苷酸進行反轉 錄酶聚合酶鏈反應來測定樣品中TS及ERCC1 mRNA含量。 本發明之方法可應用於患者之任何類型之組織。為檢查 腫瘤組織之抗性，較佳檢查腫瘤組織。在一較佳實施例 132488.doc -53· 200911988 中，亦檢查獲得該腫瘤之患者之正常組織之一部分。正常 組織預期對基於鉑之化療化合物具有抗性，亦即展示高ts 及ERCC1基因表現量，但腫瘤預期對該等化合物敏感，亦 即展示低TS及ERCC1基因表現量之患者可隨後以較高量之 該化療組合物治療。 本發明之方法可應用於各種腫瘤類型。此使得可製出個 體”腫瘤表現譜"’由此測定個別患者樣品中之TS及/或 ERCC 1表現量且預測對不同化療劑之反應。較佳地，本發 明之方法適用於實體腫瘤’最佳適用於結腸直腸腺癌腫 瘤。 如本文中關於TS所定義之”預定臨限值"為TS表現量，其 中已發現當高於其時腫瘤可能對5-FU及基於5-FU及奥赛力 翻之化學療法具有抗性《對5-FU或基於5-FU及奥賽力鉑之 化學療法敏感之腫瘤中可能發現低於該臨限值之表現量。 在對5-FU或基於5-FU及奥赛力鉑之化學療法反應之腫瘤 中，表不為TS:p-肌動蛋白之比率的之相對表現範圍為 小於約7.5xl〇-3。對5-FU或基於5-FU及奥賽力鉑之化學療 法不反應之腫瘤的相對表現·丁8:0_肌動蛋白比率為高於約 7·5χ 10·3。 在執行本發明之方法時’在患者腫瘤樣品中檢定ERCC1 表現量及TS表現量以預後基於5_FU及奥賽力鉑之化學療法 之功效。此外，在患者腫瘤樣品中檢定丁8表現量以預後基 於5-FU之化學療法之功效。此外，在本發明之方法中，在 患者腫瘤樣品中檢定ERCC1表現量以預後基於奥赛力鉑之 132488.doc -54· 200911988 化學療法之功效。或者，在患者腫瘤樣品中僅檢定具有ts 表現量之表現量以預後基於5-FU與奥賽力鉑之組合化學療 法之功效。 在執行本發明之該實施例之方法時，腫瘤細胞較佳自患 者分離。將實體或淋巴瘤或其部分以手術方式自患者切除 或藉由常規生檢獲得。自冷凍或新鮮樣品分離之RNA係藉 由此項技術中典型方法中之任一者自細胞提取，該等方法 例如 Sambrook，Fischer 及 Maniatis，Molecular Cloning，實 驗手冊，（第 2版），Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York，（1989)。較佳地，在提取過程中需小心以避免 RNA降解。 藉由如上所述方法中之任一者自FPE細胞提取RNA。新 鮮、冷凍或固定樣品中經純化總mRNA之TS及ERCC1 mRN A之定量較佳使用此項技術中通用之（例如）反轉錄酶 聚合酶鏈反應（RT-PCR)法進行。定量TS或ERCC1 mRNA之 其他方法包括（例如）使用適用於多重PCR之分子信標及其 他標記探針。此外，本發明設想經由使用非PCR系統，使 用（例如）類似於 Invader® Assay(Third Wave Technologies， Inc·)之螢光標記探針來定量TS及/或ERCC1 mRNA。最佳 地，使用基於螢光之實時偵測法（ABI PRISM 7700或7900 Sequence Detection System [TaqMan®]， Applied Biosystems，Foster City，Calif,)或 Heid 等人（Genome Res 1996; 6:986-994)及 Gibson 等人（Genome Res 1996; 6:995-1001)所述之類似系統進行TS及/或ERCC1 cDNA及内部對 132488.doc -55- 200911988 照或看家基因（例如β_肌動蛋白）之定量。ΑΕΙ 7700 (TaqMan® Instrument)之輸出係以Ct或”循環臨限值”表 示。對於TaqMan®系統，樣品中具有較高數目之標靶分子 的高度表現基因與具有較少標靶分子之較低相對表現之基 因（較尚ct)相比產生具有較少PCR循環之信號（較低Ct)。 如本文中所使用之，，未校正基因表現係指丁8及/或 ERCC1表現相對於内部對照基因之由TaqMan®儀器產生之 數值輸出。用於求出UGE之方程式如實例10及η中所示， f 且以圖23及24中之樣品計算說明。 如本文中所使用之"校正相對TS表現"係指經標準化之TS 表現，其係藉由將UGE乘以TS特異性校正因子（KTS)，產 生可與相對於内部對照基因之已知範圍之TS表現量相比之 值。實例10及圖24詳細地說明該等計算。該等數值使得可 判定特定樣品之”校正相對TS表現"是否高於或低於”預定 臨限"值。與β_肌動蛋白含量之校正相對TS表現之預定臨 限值為約7.5 XI Ο.3。對TS、内部對照卜肌動蛋白及校準子 〇 Universal PE RNA(目錄號 #4307281，批號 #36mi2〇14 ’

Applied Biosystems)具有特異性之KTsgi2.6xl(r3。 可測定不同於β-肌動蛋白之内部對照基因及/或不同於 Universal ρε RNA(目錄號料3〇7281，批號#36ΐ78ΐ2〇ΐ4，

Applied Bi0systems)之校準子rNA之Krs。為如此進行，必 須將内部對照基因與校準子RNA以已測定相對於特定内部 對照基因之TS表現量（亦即”已知相對基因表現，，或,,先前公 開者”）之組織樣品校準。較佳地，該等組織樣品為福馬林 I32488.doc •56· 200911988 固定及石蠟包埋（FPE)樣品且根據本文所述之方案自其提 取RNA ^該測定可使用此項技術中所熟知之標準預_ TaqMan®，定量RT-PCR技術進行。該測定之後，如實例1 〇 中所述，該等樣品具有適用於測定對新内部對照及/或校 準子RNA具有特異性之新Kts的TS ”已知相對基因表現" 量0

"先前公開"之相對基因表現結果係基於標靶基因之rt. PCR信號與組成性表現基因（β_肌動蛋白）之比率。在預 TaqMan®技術研究中，進行固定循環數（亦即3〇)之pcR反 應且報導各樣品之終點值。隨後將該等值以ercc〗或以表 現與β-肌動蛋白表現之比率形式報導。Salon#等人，

Clinical Cancer Research，6:1322 1327, 2〇〇〇，該參考文獻 腫瘤類型，因此可用於 症（包括乳腺癌、頭部 腸癌及其他癌症）之诊 ’本發明之方法適用於 之全文係以引用的方式併入本文中 本發明之方法適用於各種組織及 評估患者之臨床治療且作為多種癌 及頸部癌 '肺癌、食道癌、結腸直 斷或預後手段。在一較佳實施例中 預後結腸直腸腺癌。 旦 ^网恧贾僅以通常僅含有極少

組織之固定石蟻包埋(FpE)組織形式獲得。該等FPE ==顯微切割，因此可在未污染有基質組織之腫 揭口由^ 衣現此外，可將生檢組織 品通當八女 織之間進仃比較，因為該等樣 口0通常含有兩種類型之組織。 I32488.doc •57- 200911988 側接ts基因區之任何寡核苷酸對均可用於進行本發明之 方法。適用於本發明的在嚴格條件下與TS基因區雜交之引 子將擴增20-1000個鹼基對，較佳100-400個鹼基對，最佳 200-400個鹼基對之間的產物。

HER2-neu/EGFR 認為表現高含量HER2-neu及/或EGFR mRNA之腫瘤可能 對受體赂胺酸激酶把向化學療法敏感。相反地，表現較低 量HER2-neu及/或EGFR mRNA之腫瘤可能對受體酷·胺酸激 f 酶靶向化學療法不敏感。患者之差異HER2-neu及ERCC1 mRNA表現情況係藉由將其與預定臨限表現量對比來判 斷。 本發明提供一種相對於内部對照之基因表現定量新鮮、 冷凍、固定或固定及石蠟包埋（FPE)組織中HER2-neu及/或 EGFR mRNA表現量的方法。本發明之發明者已開發出使 得可準確評估新鮮、冷凍、固定或固定及包埋組織中之 HER2-neu及EGFR基因表現之寡核苷酸引子。募核苷酸引 ( 子，EGFR-1753F(SEQ ID NO:ll)、EGFR-1823R(SEQ ID NO: 12)，或大體上與其一致之募核苷酸引子，較佳與自新 鮮、冷凍、固定或固定及石蠟包埋（FPE)腫瘤樣品提取之 RNA —起使用。本發明亦提供寡核苷酸引子，HER2-neu 2671F(SEQ ID NO:13) ' HER2-neu 2699R(SEQ ID NO:14) (參見美國專利6,582,919，該專利係以引用的方式併入）或 大體上與其一致之寡核苷酸引子，其較佳與自新鮮、冷 凍、固定或固定及石蠟包埋（FPE)腫瘤樣品提取之RNA — 132488.doc • 58 - 200911988 起使用。量測HER2-neu及/或EGFR基因表現可隨後用於預 後受體酪胺酸激酶靶向化學療法。 本發明之該實施例包括自新鮮、冷凍、固定或FPE樣品 準確提取RNA之方法，及使用本文所述之方法且藉由使用 寡核苷酸引子對，較佳募核苷酸引子對EGFR-1753F(SEQ ID ΝΟ:11)及 EGFR-1823R(SEQ ID NO:12)或大體上與其一 致之寡核苷酸進行反轉錄酶聚合酶鏈反應來測定樣品中 EGFR mRNA含量。 本發明之另一實施例包括自新鮮、冷凍、固定或FPE樣 品準確提取RNA之方法，及使用本文所述之方法且使用寡 核苷酸引子對，寡核苷酸引子HER2-neu 2671F(SEQ ID >^0:13)、1^112-1^11 2699尺（8丑(5 10 1^0:14)或大體上與其一 致之寡核苷酸測定樣品中HER2-neu mRNA含量。 本發明之方法可應用於各種腫瘤類型。此使得可製出個 體”腫瘤表現譜"，由此測定個別患者樣品中之HER2-neu及/ 或EGFR表現量且預測對不同化療劑之反應。較佳地，本 發明之方法適用於實體腫瘤，最佳適用於NSCLC腫瘤。 如本文中所定義之”差異表現量”係指腫瘤中EGFR或 HER2-neu表現量分別相對於相應非惡性組織樣品中EGFR 或HER2-neu表現量之差異。差異表現量係藉由將腫瘤樣品 之特定基因之UGE除以相應非惡性組織樣品之相同基因之 UGE求出。 如本文中關於EGFR表現所定義之”預定臨限值”為差異 EGFR表現量，其中當高於其時（亦即較高），腫瘤可能對受 I32488.doc -59- 200911988 體酪胺酸激酶靶向化學療法敏感。較高之差異EGFR表現 量預示患者生存力較低。表現量低於該臨限值之腫瘤可能 不受受體酪胺酸激酶靶向化學療法的影響。較低之差異 EGFR表現量預示患者生存力較高。藉由Mafune等人所用 之方法判定差異表現是否高於或低於"預定臨限值"，其計 算出自患有食道鱗狀細胞癌之患者獲得之相應非惡性組織 中個別差異腫瘤/正常（T/N)表現率。Mafune等人，Clin Cancer Res 5:4073-4078，1999。該分析方法產生各患者之 ί 基於由相應非惡性組織獲得之個體背景表現的精確表現 值。若腫瘤樣品中之UGE-EGFR:p-肌動蛋白除以相應非惡 性組織樣品中之UGE-EGFR:P-肌動蛋白高於為約1.8之預 定臨限值，則認為EGFR之差異表現”較高”且表明較低生 存力。若腫瘤樣品中之UGE-EGFR:p_肌動蛋白除以相應非 惡性組織樣品中之UGE-EGFR:P-肌動蛋白低於為約1.8之 預定臨限值，則認為EGFR之差異表現”較低”且表明較高 生存力。 I 如本文中關於差異HER2-neu表現所定義之”預定臨限值” 為HER2-neuEGFR表現量，其中當高於其時（亦即較高）， 腫瘤可能對受體赂胺酸激酶粗向化學療法敏感。較高之差 異EGFR表現量預示患者生存力較低。表現量低於該臨限 值之腫瘤可能不受受體酪胺酸激酶靶向化學療法的影響。 較低之差異HER2-neu表現量預示患者生存力較高。若腫瘤 樣品中之UGE-HER2-neu:P-肌動蛋白除以相應非惡性組織 樣品中之UGE-HER2-neu:P -肌動蛋白面於為約1.8之預定臨 132488.doc -60- 200911988 限值，則認為HER2-neu之差異表現”較高”且表明較低生存 力。若腫瘤樣品中之UGE-HER2-neu:p_肌動蛋白除以相應 非惡性組織樣品中之UGE-HER2-neu:β-肌動蛋白低於為約 1.8之預定臨限值，則認為HER2-neu之差異表現"較低"且 表明較高生存力。 HER2-neu之”臨限值"係使用以下結果及方法確定。表示 為HER2-neu與β-肌動蛋白PCR產物之間的比率之校正 HER2-neu mRNA表現在正常肺中為4.17χ10-3(範圍：0.28-23.86Χ103)且在腫瘤組織中為4.35Χ10-3(範圍：0.21-68.11χ10·3)(Ρ=0.019 Wilcoxon 測試）。Miller 及 Siegmund (Miller 等人，Biometrics 38:1011-1016，1982)及 Halpern (Biometrics 3 8:1017-1023, 1982)之最大卡方法（maximal chi-square method)確定1.8之臨限值以將患者分為較低及 較高差異1^112-1^11表現者。藉由該標準，29名（34.9%)患 者具有較高差異HER2-neu表現且54名（65.1%)患者具有較 低差異HER2-neu表現。 EGFR之”臨限值”係使用以下結果及方法確定。中值校 正EGFR mRNA表現在正常肺中為8 17xl〇-3(範圍·· 〇 31_ 46.26χ1(Γ3)且在腫瘤組織中為7 22xl〇-3(範圍：〇.27_ 97.49xl(T3)(P=n.s.)。最大卡方法（MiUer (1982); Haipern (1982))確定1.8之臨限值以將患者分為較低及較高差異 EGFR表現者。藉由該標準，28名（33 7%)患者具有較高差 異EGFR表現且55名（66.3%)患者具有較低差異EGFR表現情 況。 132488.doc -61 - 200911988 在執行本發明之方法時，在患者中檢定差異egfr表現 量或差異HER2-neU表現量以預後受體酪胺酸激酶靶向化學 療法之功效。此外，在本發明之方法中，在患者中檢定差 異HER2-neu表現量以預後受體酪胺酸激酶靶向化學療法之 功效。此外，在本發明之方法中，在患者中檢定差異 EGFR表現量以預後受體酪胺酸激酶靶向化學療法之功 效。或者，在患者中檢定差異EGFR表現量與差異her2_ neu表現量以預後受體酪胺酸激酶靶向化學療法之功效。 如本文中所定義之"相應非惡性樣品”係指來源於與待分 析用於差異EGFR及/或差異HER2_neu表現之腫瘤樣品相同 之個體的非癌組織樣品。較佳地，相應非惡性樣品來源於 與產生該腫瘤樣品之器官相同之器官。最佳地，相應非惡 性腫瘤樣品來源於產生該腫瘤樣品之相同器官組織層。 又，較佳在生檢腫瘤樣品同時採集相應非惡性組織樣品。 在一較佳實施例中，分析以下兩個位置之組織：肺腫瘤及 取自距腫瘤在該等條件下儘可能最大距離之非惡性肺組 織，或結腸腫瘤及取自距腫瘤在該等條件下儘可能最大距 離之非惡性結腸組織。 在執行本發明之該實施例之方法時，腫瘤細胞較佳自患 者分離。將實體或淋巴瘤或其部分以手術方式自患者切除 或藉由常規生檢獲得。自冷;東或新鮮腫瘤樣品分離之rna 係藉由此項技術中典型方法中之任_者自細胞提取，該等 方法例如 Sambrook，Fischer 及 μ〇1_13γ

Cloning，實驗手冊，（第2版），c〇M Spdng此⑹ 132488.doc -62. 200911988

Laboratory Press，New York, (1989)。較佳地，在提取過程 中需小心以避免RNA降解。 然而，自患者獲得之組織在生檢之後通常進行固定，通 常（例如）藉由福馬林（甲醛）或戊二醛，或藉由乙醇浸潰。 通常將固定生物樣品脫水且包埋於石蠟或熟習此項技術者 已知之其他固體載體中。參見Plenat等人，Ann Pathol January 2001; 21(1):29-47。在本發明之方法中亦可使用未 經包埋、固定組織以及固定及包埋組織。用於包埋固定組 織之固體載體預計可以（例如）有機溶劑移除，使得可將所 保存組織進行後續復水。 藉由本文所述之方法中之任一者自石蠟包埋（FPE)組織 細胞提取RNA。新鮮、冷凍或固定樣品中經純化總mRNA 之HER2-neu或EGFR mRNA之定量較佳使用此項技術中通 用之（例如）反轉錄酶聚合酶鏈反應（RT-PCR)法進行。定量 HER2-neu或EGFR mRNA之其他方法包括（例如）使用適用 於多重PCR之分子信標及其他標記探針。此外，本發明設 想經由使用非PCR系統，使用（例如）類似於Invader® Assay (Third Wave Technologies, Inc.)之螢光標記探針來定量 HER2-neu及/或EGFR mRNA。最佳地，使用基於螢光之實 時 4貞測法（ABI PRISM 7700 或 7900 Sequence Detection System [TaqMan®], Applied Biosystems, Foster City, Calif.)或 Heid等人（Genome Res 1996; 6:986-994)及 Gibson 等人（Genome Res 1996; 6:995-1001)所述之類似系統進行 HER2-neu及/或EGFR cDNA及内部對照或看家基因（例如β- 132488.doc -63- 200911988 肌動蛋白）之定量。ABI 7700(TaqMan® Instrument)之輸出 係以Ct或"循環臨限值”表示。對於TaqMan®系統，樣品中 具有較高數目之標靶分子的高度表現基因與具有較少標靶 分子之較低相對表現之基因（較高Ct)相比產生具有較少 PCR循環之信號（較低Ct)。 如本文中所使用之”未校正基因表現（UGE)”係指HER2-neu及/或EGFR表現相對於内部對照基因之由TaqMan®儀器 產生之數值輸出。用於求出UGE之方程式如實例12及13中 所示，且以圖25及26中之樣品計算說明。 該等數值使得可判定差異基因表現（亦即特定腫瘤樣品 之"UGE，，除以相應非腫瘤樣品之”UGE”）是否高於或低於 ”預定臨限值”。EGFR及HER2-neu之預定臨限值為約1,8 ° 本發明之另一態樣提供一種將TaqMan®儀器所獲得之未 校正基因表現（UGE)值以來源於非TaqMan®技術之"已知相 對基因表現"值標準化之方法。較佳地，將組織樣品之 TaqMan®產生HER2-neu及/或EGFR UGE值以具有已知非 TaqMan®產生相對HER2-neu及/或EGFR:p-肌動蛋白表現值 之樣品標準化。 本文中所用之"校正之相對EGFR表現”係指經標準化之 EGFR表現，其係藉由將UGE乘以EGFR特異性校正因子 (kegfr)，產生可與相對於内部對照基因之已知範圍之· EGFR表現量相比之值。實例12及圖25詳細地說明該等3十 算。對於EGFR、内部對照β-肌動蛋白及校準子人類肝臟 總RNA(Stratagene，目錄號#73 5017)具有特異性之1^(}1；11為 I32488.doc •64- 200911988 26.95 χ 1 0 3。該等數值亦使得可判定特定腫瘤樣品之"校正 相對表現除以相應非腫瘤樣品之"校正相對表現"（亦即差 異表現）是否高於或低於”預定臨限值"。HER2-neu或EGFR 之預定臨限值為約1 ·8。在判定腫瘤樣品中Egfr* HER2_ neu之差異表現是否1.8倍大於相應非腫瘤樣品者時，應易 於認識到UGE值或校正相對表現值均可使用。舉例而言， 若將腫瘤之校正相對表現量除以相應非腫瘤樣品之校正相 對表現量，則κ引子抵消且留下與若使用UGE值相同之比 率。 ”已知相對基因表現"值來源於經預先分析之組織樣品且 基於標靶基因之rT_PCR信號與組成性表現内部對照基因 (例如β-肌動蛋白、GAPDH等）之比率。較佳地，該等組織 樣品為福馬林固定及石|包埋（FpE)樣品且㈣本文所述 之方案自其提取RNA。為相對於内部對照標準定量基因表 現:使用此項技術中已知之定量RT_pcR技術。進行固定 循環數（亦㈣）之預TaqMan⑧技術pcR反應聽導各樣品 之終點值。隨後將該等值以咖汉表現與卜肌動蛋白表現 之比率形式報導。 可測定不同於β-肌動蛋白之内部對照基因及/或不同於人 類肝贓總RNA(Stratagene，目錄號#735〇⑺之校準子麗 rxtaEGFR為如此進行’必須將内部對照基因與校準子 ，，已相對於特定内部對照基因之EGFR表現量（亦 ^已知相對基因表現”）之組織樣品校準。較佳地，該等組 為福馬林固定及石壤包埋㈣）樣品且根據實例！中 132488.doc -65^ 200911988 所述之方案自其提取rna。該測定可使用此項技術中所熟 知之標準預-TaqMan® ’定量RT-PCR技術進行。該測定之 後，如實例12中所述，該等樣品具有適用於測定對新内部 對照及/或杈準子RNA具有特異性之新kegfr的EGFR"已知 相對基因表現”量。

本文中所用之"校正之相對HER2-neu表現”係指經標準化 之HER2-neu表現，藉由將UGE乘以HER2-neu特異性校正 因子（KHER2-neu)產生一個值，其可與相對於一個内部對照 基因之已知範圍之HER2-neu表現量相比。實例13及圖26詳 細地說明該等計算。對HER2-neu、内部對照β_肌動蛋白及 校準子人類肝臟總1^八（8卜&1&§61^，目錄號#73 5017)具有 特異性之KHER2_neu為 I3.3x 1〇·3 〇 可測定不同於β-肌動蛋白之内部對照基因及/或不同於人 類肝臟總RNA(Stratagene，目錄號#735017)之校準子RNa 之KHER2_neu。為此，必須將該内部對照基因與該校準子 RNA對於已測定相對於特定内部對照基因之HER2_neu表 現量（亦即”已知相對基因表現”）之組織樣品校準。較佳 地，該等組織樣品為福馬林固定及石蠟包埋（FpE)樣品， 且根據本文中所述之方案自彼等提取RNA。該測定可使用 此項技術中所熟知之（例如）標準預_TaqMan⑧，定量RT_ PCR技術進行。該測定之後，該等樣品具有HER2_neui 已知相對基因表現，，量，可用於測定對於新内部對照及/或 校準子RNA具有特異性之新κ HER2-neu 如實例1 3中所述。 本發明之方法適用於廣泛範圍之組織及腫瘤類型，因此 132488.doc •66- 200911988 可用於評估患者之臨床治療，且作為多種癌症（包括乳 癌、頭部及頸部癌、肺癌、食道癌、結腸直腸癌及其他癌 症）之診斷或預後手段。在一個較佳實施例中，本發明方 法適用於NSCLC腫瘤之預後。 化療治療前腫瘤生檢組織通常僅以固定石蠟包埋（FpE) 組織獲得，一般僅含有極少量異質組織。該等FpE樣品易 於顯微切片，因此可在未污染有非惡性基質組織之腫瘤組 織中測定HER2_neu及/或EGFR基因表現。此外，可將生檢 、、且織樣品内之非惡性基質組織與腫瘤組織之間進行比較， 因為該等樣品通常含有兩種類型之組織。 一般而言，如SEQ ID NO:1〇所示之側接£(}叹基因區之 任何寡核苷酸對均可用於進行本發明之方法。適用於本發 明的在嚴格條件下與EGFR基因區雜交之引子將擴增2〇_ 1〇〇〇個鹼基對，較佳100-400個鹼基對，最佳2〇〇_4〇〇個鹼 基對之間的產物β 此外，側接HER2-neu基因區之任何募核苷酸對均可用 於進行本發明之方法。適用於本發明的在嚴格條件下與 HER2-neu基因區雜交之引子將擴增約2〇1〇〇〇個鹼基對， 較佳100-400個鹼基對，最佳200-400個鹼基對之間的產 物。 HER2-neu之過度活性係指增加編碼HER2_neu之基因或 產生可與細胞增殖病症有關之HER2-neu活性量（亦即，隨 著HER2_neu之量增加，細胞增殖病症之一或多種症狀的嚴 重程度增加）。 132488.doc -67- 200911988 由此描述本發明時，本發明之實踐係藉由以下所提供之 實驗性實例來說明。熟習此項技術者應認識到說明性實例 中所用之材料及方法可以多種方式改變。認為該等改變屬 於本發明之範疇内。 實例 實例1 :長片段RNA提取程序 I. 組織製備 使用標準實驗室程序將含有FFpE組織之石蠟塊之丨❽微 (#切片置於無蓋玻片之玻璃載片上。為進行去石堰化及核 快紅（NFR)染色，將載片如下進行處理： 將載片在二甲笨中洗滌兩次歷時5分鐘，繼而乙醇 (EtOH )洗滌。使用標準實驗室程序將載片以nfr染色。 將所關注區域（例如腫瘤組織或基質組織）手動或以雷射 捕獲顯微切割儀（視待切除區域之尺寸而定）切除。 II. RNA提取 製備含有Tris/HCl、EDTA、SDS及水之提取溶液。將腫 瘤組織添加至離心管中之提取溶液及蛋白酶K中。隨後將 樣品在適當溫度及時間下加熱以獲得最大產率之長片段 RN A舉例而5 ’將樣品在5 〇。〇下力口熱約五6小日夺。加熱步 驟之後，將樣品轉移至較大管_且添加2 μ乙酸鈉 (NaOAC)。執行苯酚/氯仿/異戊醇（pci)提取。將上部水相 轉移至新清潔官中且添加糖原。將RNA以異丙醇（ipr〇H) 沈澱。將經粒化之汉!^八與離液劑（諸如〇·5%肌胺酸_異硫氰 酸胍（GITC))混合。亦將二硫蘇糖醇（dtt)添加至管中。添 132488.doc •68- 200911988 加5 mM Tris且混合。隨後，添加2 M NaOAc及PCI，渦 旋，且將管在冰上培育。將管旋轉且將上部水相轉移至含 有糖原之新管中。將RNA再次粒化（使用iPrOH)且以乙醇 洗蘇。將RNA懸浮於5 mM Tris中。 III. PCR定量 使用本發明之方法所獲得之經提取RNA，如先前所述執 行cDNA製備（35)及實時RT-PCR定量（36，37)。各提取物之 PCR均進行三次。將數據以β-肌動蛋白基因之Ct值形式報 ( 導。Ct值指示PCR產物之量且因此係關於PCR反應物中所 存在標靶之初始量。該關係為相反的，亦即較大Ct數值表 明最初存在較少標靶cDNA。每一 PCR循環表明量相差兩 倍，因此，（例如）兩個PCR反應之間的4個循環之Ct差異意 謂cDNA含量相差16倍（24= 16)。 實例2 :測定經分離RNA之長度分布之方法 為測定自FFPE組織分離之不同RNA片段長度之相對量， 使用以下策略。使用寡dT引子將使用本發明及其他已知提 取方法自FFPE標本分離之RNA轉化為cDNA。此意謂僅含 有3'-寡A尾之mRNA片段延伸且轉化為cDNA，由此提供量 測片段長度之起始點。使用β-肌動蛋白mRNA之PCR擴增 代表mRNA之全部群體。引子經選擇以擴增代表距mRNA 3'端位置100、300、400及1000 bp之β-肌動蛋白基因之約 100-120 bp片段（圖2)。與實際上試圖擴增100、3 00、400 及1 000 bp片段相比，使用該策略，將使擴增之任何長度 依賴性效能差異最小化。因此，各引子組之PCR產物之Ct 132488.doc -69- 200911988 應幾乎代表各片段尺寸量之真實比率。 表1 :藉由擴增位於距編碼區3'端約100-300、400及1000 bp之β-肌動蛋白cDNA片段測定自FFPE組織分離之RNA片 段長度之策略。 擴增子 100 bp 距 3'端 21-105 300 bp 距 y 端 206-293 400 bp 距 3’端 322-407 1000 bp 距 3’端 1050-1110 實例3 :蛋白酶K之影響 該實例說明蛋白酶K濃度對RN A產率及DN A污染之影 響。在50°C下在0.5、2、3及16 hr之培育時間下將蛋白酶K 濃度在4倍範圍（5-20 pg，在圖中表示為1X-4X)内變化。如 圖4中所示，1Χ(5 μδ)蛋白酶K與較高量相比產生約2倍（1 個Ct)較佳RNA產率，但更重要地，大於IX之蛋白酶Κ之量 產生顯著較高DNA污染（2-3個Ct循環）。該實驗亦說明培育 時間對所提取DNA之量的影響，在1 6 hr培育時間下比在較 短培育時間下大3至7個Ct循環。藉由在不首先進行反轉錄 反應將RNA轉化為cDNA的情況下執行PCR在提取物中偵 測DNA(”無反轉錄或NRT對照"）。由此，所進行之唯一 PCR擴增具有共提取DNA，在RNA之PCR定量中若其過高 則可產生較高背景值且因此產生不準確之數據。

實例4 :最小化共提取DNA 該實例說明自FFPE提取物選擇性移除DNA而使RNA損 失最小之程序。為儘量移除更多DNA，實驗經執行以測試 132488.doc -70- 200911988 包括離液劑GITC之第二苯酚/氣仿提取程序之有效性。將 以下提取方法就RNA產率及DNA污染進行對比： 1. 在92°C下培育FFPE組織30 min且進行苯酚/氣仿/異戊 醇（"PCI")提取（"RGI”法）或亦稱為"高溫離液劑法"。此為先 前開發用於自FFPE提取RNA以供高通量RT-PCR定量基因 表現之用的迅速短培育高溫法。此處用於對比之目的的該 方法係描述於美國專利6,248,535中且包括以PCI提取繼而 異丙醇（"iPrOH")沈澱及乙醇（"EtOH")洗滌。將本發明之一 實施例與RGI法對比且將其表示為”ρκ” ； 2. PK(50°C，16 hr，使用蛋白酶K)+PCI+iPrOH+EtOH(亦 即單一苯酚/氯仿提取）； 3. PK+GITC及PCI+iPrOH+EtOH(在單一苯酚/氣仿提取 程序中添加GITC); 4. PK+PCI + iPrOH+EtOH+GITC+PCI+iPrOH+EtOH(雙苯 酚/氣仿提取，其中第二苯酚/氯仿中包括GITC); 5. PK+PCI+i_PrOH+EtOH+添力口 Tris+PCI+iPrOH+EtQH(雙 苯酚/氣仿提取，其中第二苯酚/氯仿中以Tris代替GITC)。 圖5展示該等實驗之結果。高溫（RGI)法由於培育時間較 短而產生最小DNA污染’但亦產生較低產率之rnA(各組 之第一條塊）。長培育PK法產生較多RNA但具有較高DNA 污染（第二條塊）。在第一提取步驟中添加GITC之影響產生 較少DNA，但亦使得RNA產率降低（第三條塊）。在第二苯 酚/氣仿提取步驟中使用GITC之影響為，與單一苯盼/氣仿 提取相比，僅RNA產率略少（約1個Ct循環）（第四條塊）。然 132488.doc • 71· 200911988 而，與單一苯酚/氣仿提取相比，DNA減少7個Ct循環（NRT 組之第四條塊）。當在第二苯酚/氯仿提取中使用Tris代替 GITC時，RNA產率仍相同但DNA減少僅3個Ct循環（第五條 塊），說明在第二苯酚/氯仿提取步驟中需要離液劑。由該 等結果推斷，含有離液劑GITC之第二苯酚/氯仿提取步驟 就RNA產率及最低DNA污染而言最有效。 實例5 :藉由PK提取法所提取之RNA與藉由兩種其他提取 法所提取之RNA之對比 該實例藉由數種不同標準評估藉由本發明之方法（"PK” 法）所提取之RNA。 圖6展示分光光度法定量藉由PK法、RGI法（上述）及 Paradise套組（Arcturus, Co·, Mountain View, CA，其市售使 用管柱純化步驟自FFPE樣品分離RNA之方法）自腫瘤樣品 B5、D6及F5分離之RNA總量。如較高UV吸光度所表明， 在所測試之3個樣品中，與Paradise套組相比，PK法產生較 高總RNA產率，但不如RGI法之總RNA產率高。對於藉由 PK法分離之2/3樣品，表明RNA純度之260/280吸光度比率 接近1.8(純RNA比率為1.8)。 圖7對比腫瘤樣品F5 ' D5及D6中由PK法、RGI法及 Paradise套組分離之 100、300、400及 1000 bp RNA 片段之 量。各片段之定量之量係藉由PCR擴增測定。數據展示就 RNA產率與DNA污染而言，PK法均產生最佳結果。圖7中 較高UV吸光度所表明之RGI法之RNA的似乎較大產率與該 實驗中藉由PCR表明之較低產率之間存在明顯差異，此可 132488.doc -72- 200911988 能因為尚溫法產生許多極短片段，該等極短片段有利於 260 nm下之整體光學吸光度但由於其長度較短而不能藉由 pCR之引子-探針組擴增。 圖8對比藉由ρκ法、rgi法及paracjise套組分離之rna片 段的尺寸分布。在 Agilent 21〇〇 Bi〇analyzer(Agilent

Technologies，pai〇 Alt〇，CA)上’根據製造商之說明使用 RNA 6000 Nano Assay 且使用 Agilent 21〇〇 Bi〇analyzer 8〇尺评3^對藉由三種方法提取之rna進行分析。該分析器 ( 藉由溶離時間在尺寸排阻管柱上分離寡核苷酸分子，其中 較短長度之RNA較早離開且因此接近該等圖中之y軸定 位。RGI法主要產生短片段，而藉由本發明之方法（ρκ法） 分離之RNA產生多種片段尺寸，其中與paradisy^相比， 較長片段之產率較高。 圖9展示使用本發明之方法自FFpE分離之rNA中 肌動蛋白基因表現與使用習知酸硫氰酸胍苯酚氣仿 (AGPC)法（Chomczynski 及 Saachi，Anal Biochem (1987) ^ 1 62:1 56-1 59)自相應新鮮冷凍組織組分離者之對比。使用 自新鮮冷凍及FFPE相應標本組分離之RNA獲得卜肌動蛋白 基因表現之極佳相關性（R=〇.89)。 實例6 : ERCC1之未校正基因表現（UGE)之測定 進行兩對平行反應，亦即”測試"反應及"校準"反應。 ERCC1擴增反應及β-肌動蛋白内部對照擴增反應為測試反 應。獨立ERCC1及β-肌動蛋白擴增反應係在校準子rna模 板上執行且稱為校準反應。TaqMan⑧儀器將產生四種不同 132488.doc -73- 200911988 循環臨限（ct)值：來自測試反應之ctER 及 机動蛋白I & 自校準反應之CtERCC丨及Ctp·肌動* 6 〇根據以下方程气托 個反應之Ct值之差值： 、出兩 △ Ct測试=CtERCC1-Ctp_肌動蛋白（來自”測試”反應） △ Ct校準子一CtERCCl-Ctp·肌動蛋白（來自"校準"反鹿）〇 隨後該步驟包括根據以下方程式使數字2乘^〇次方. 2·Λ%«(來自”測試"反應） 2_ACt校準子（來自’’校準”反應）。 為隨後自TaqMan®儀器獲得ERCC1之未校正基因表現、 行以下計算： $ ERCC1之未校正基因表現。

以已知相對ERCC1表現量標準化UGE 標準化計算需要將UGE乘以對ERCC1及特定校準子rna 具有特異性之校正因子（KERCC〇。亦可求出任何内部對照 基因及任何精確預定量校準子RNA之校正因子Kercci。較 佳地，使用内部對照基因β-肌動蛋白及精確預定量校準子 RNA人類肝臟總RNA(Stratagene，目錄號#735〇17)。若為 該等試劑，則校正因子KERCC丨等於i.Muo·3。 使用 User Bulletin #2 中 Applied Biosystems，TaqMan⑧製 造商所述及上述之ACt方法之修改實現標準化。為進行該 程序，使用上述TaqMan®方法對於ERCC1表現分析6種不 同測試組織之UGE。使用内部對照基因卜肌動蛋白及校準 子RNA人類肝臟總RNA(Stratagene，目錄號#73 5017)。 各樣品 AG221、AG222、AG252、成人肺、PC3、AdCol 132488.doc •74- 200911988 之已知相對ERCC1表現量除以其相應TaqMan®產生UGE產 生未平均化校正因子K : K未平均化=已央口值/ U G E。 隨後，將所有K值平均化以求出對ERCC 1、校準子RNA 人類肝臟總RNA(Stratagene，目錄號#73501 7)及β-肌動蛋 白具有特異性的單一 KERCC1校正因子。 因此，為測定規模上與預-TaqMan® ERCC1表現研究一 致之未知組織樣品中之校正相對ERCC 1表現，僅需將來源 於TaqMan®裝置之未校正基因表現數據（UGE)乘以KERCC丨 特異性校正因子，若其使用相同内部對照基因及校準子 RNA ： 校正相對ERCC1表現=UGExKERCci。 可使用任何精確預定量校準子RNA或内部對照基因求出 Kercci ° 精確預定量RNA之將來來源可以具有上述方法中 所述之已知相對ERCC1表現量之樣品校準，或現可以上述 經預先校準之校準子RNA(諸如人類肝臟總RNA， Stratagene，目錄號 #73 501 7)校準。 舉例而言，若求出不同内部對照基因及/或不同校準子 RNA之後續K ERCC1 ? 則必須將該内部對照基因與該校準子 RNA以已測定相對於特定内部對照基因之ERCC 1表現量之 組織樣品校準。該測定可使用此項技術中所熟知之標準 預-TaqMan® ,定量RT-PCR技術進行。該等樣品之已知表 現量將除以其相應UGE量以求出該樣品之K。隨後將K值 視已知樣品數目而平均化以求出對不同内部對照基因及/ 132488.doc -75- 200911988 或校準子RNA具有特異性之新Κ ERCC1 0 實例7 使所有患者加入前瞻性多中心三臂隨機化試驗（晚期 NSCLC中順鉑/吉西他濱（CG)與順鉑/吉西他濱/長春瑞賓 (Vinorelbine)(CGV)與依次雙重吉西他濱/長春瑞賓繼而異 環磷醯胺/長春瑞賓（GV/IV)之西班牙人肺癌組III期試驗 (GEPC/98-02))之順鉑/吉西他濱臂中。每3週使所有患者每 1.8 日接受 Gem 1250 mg/m2，加上每日 CDDP 100 mg/m2。 GEPC/98-02之合格標準為可量測之階段IV(若無症狀則腦 癌轉移合格）或階段ΙΠΒ(惡性胸膜及/或心包積液及/或鎖骨 上腺病）NSCLC 及 Eastern Cooperative Group(ECOG)表現分 0-2。在進入研究之前，對所有患者進行胸部X射線及胸部 及上腹電腦斷層（CT)掃描，且至少每6週進行重複評估。 根據WHO標準評估腫瘤反應為完全反應、部分反應、穩定 疾病及進行性疾病。在治療期間使用用於建立基線腫瘤量 測之相同成像方法對腫瘤進行再評估。 將總mRNA自顯微切割FPE預處理腫瘤樣品分離，且使 用定量RT-PCR量測校正相對ERCC1表現。自該等樣品分 離mRNA之一方法描述於本文及1999年12月20日申請之美 國專利申請案第〇9/469,338號中，且該案係以引用的方式 併入本文中。 統計分析 使用Mann-Whitney U測試測試連續測試變數校正相對 ERCC1表現與二分變數（患者性別、年齡高於及低於中值 132488.doc -76- 200911988 年齡、體重減輕之存在、胸膜積液之存在、腫瘤階段）之 間的顯著相關性。使用Kruskal-Wallis測試來測試多組内校 正相對ERCC1表現之顯著差異（ECOG表現情況，組織病理 學）。使用Fisher碟切測試（Fisher's exact test)來分析分類臨 床病理學值’包括反應及二分校正相對ERCC1表現值。 所有患者自第一研究治療開始跟蹤’直至死亡或直至數 據檢刪。使用Kaplan-Meier生存曲線及對數等級測試（i〇g rank test)分析生存及無病生存（disease-free survival)之單 變量分布。將 Miller 及 Siegmund(Biometrics 1982; 38:1011-1016)及 Halpern(Biometrics 1982; 38:1017-1023)之最大卡 方法經調適以確定最佳將患者分為不良及優良預後亞組 (就生存可能性而言）之表現值，其中使用對數等級測試作 為統計手段來用於量測分組強度（strength)。為確定解釋為 基於最大卡方分析之相關性強度量測值之P值，在假設無 相關性的情況下使用1000次拔靴樣模擬（b00t_strap_Hke simulation)來估异最大卡方統計分布（Bi〇rnetrics 1982; 38:1017-1023)。執行單變量分析中重要因素之c〇x比例危 險模型以確定可能對生存具有顯著影響之因素。使用spss 10.0.5版本軟體（SPSS Inc.，Chicago in.)進行所有統計分 析。所有P值為雙側P值。 校正相對ERCC1表現量： 在所分析之所有56個樣品中可偵測到ERCC1 mRNA表 現。相對於内部對照看家基因β_肌動蛋白之表現的中值校 正相對 ERCC1 表現為 6.7xl〇-3(範圍：〇8><1〇-3至24 6><1〇-3)。 132488.doc •77· 200911988 校正相對ERCC1表現量與以下因素中之任一者之間不存在 顯著相關性：年齡（P=〇.66)、性別（P = 〇18)、隨機化之前 /、個月中體重減輕之存在（Ρ=〇·74)、腫瘤階段⑴把與…， PU9)或胸膜積液之存在（ρ = 〇 25，全部使用驗⑽-Whitney U測試）。具有不同表現情況等級（p=〇 48 , Kruskal-Wallis測試）或不同腫瘤細胞類型（所有四種腫瘤類 型，P=0.10，Kmskal-Wallis測試）之患者中，校正相對 ERCC1表現量之間亦無顯著差異，但與腺癌（中值5 2><1〇·3， P=0.015，Mann-Whitney測試）相比，scc腫瘤（中值 8 6χ1〇-3) 中校正相對ERCC1表現量顯著較高。 對化學療法之反應 可評估之47名患者之總反應率為44.7%。完全反應及部 分反應（亦即"反應"）腫瘤中校正相對ERCC丨表現量（中值 4.3 X 10·3，範圍1.2XI 〇·3至24.6x1 〇_3)並非顯著不同於穩定 疾病及進行性疾病（亦即"不反應"）腫瘤中之量（中值 7·85χ103，範圍 〇.8xl〇-3 至 24.3x10·3，P=〇.31，Mann-

Whltney測試）。具有大於及小於任何ERCC1量之校正相對 ERCC 1表現值的反應與不反應腫瘤之比例之間亦無顯著差 異（全部使用Fisher確切測試）。校正相對ercCI表現低於 臨限值之腫瘤中之反應率（"較低”表現，52%反應者）高於 校正相對ERCC 1表現高於該臨限值之腫瘤（"較高”表現， 36.4。/。反應者，Fisher確切測試，p=〇.3 8)。 患者整體生存與校正相對ERCC 1表現量之間的相關性 中值整體存活時間為36.6週（範圍：0-113.4週）且進展中 132488.doc -78· 200911988 值時間為24.4週（範圍：〇-102.9週）。使用對數等級測試及 最大卡方統計以確定將患者分為不良及優良預後亞組之臨 限校正相對ERCC1表現量展示鑑別值之範圍包括中值，因 此將其用作生存分析之臨限值。因此，NSCLC之臨限校正 相對£此(：1表現值經測定為6^1〇-3。圖1展示腫瘤内校正 相對ERCC1表現量高於及低於該臨限校正相對ercC 1表現 量之患者的Kaplan-Meier生存曲線。如圖14中所示，與校 正相對ERCC1表現量高於該臨限值之患者之2〇·4週之中值 生存（95% C.I. 6.9週，33_9週）相比，校正相對ERCC1表現 量低於該臨限值之患者具有61.6週之顯著較長中值生存 (95% C.I. 42.4週，80.7週）。調整為腫瘤階段，用於較低 或較高校正相對ERCC1表現與整體生存之間的相關性之對 數等級統計為3.97且Ρ值為0.046。未調整對數等級結果如 圖14所示。 測試一獨立校正相對ERCC1表現臨限值5·8χΐ〇-3，因為 在一先前研究中該值展示與患有胃癌之患者的整體生存有 關（Metzger等人，J Clin Oncol 1998; 16:309-316)。在該研 究中，校正相對ERCC1表現量小於5.8χ1(Γ3之NSCLC患者 組與ERCC1量高於5.8 X 1 (Γ3者相比整體生存顯著較佳（對數 等級統計6.37，P=0.011)，儘管較高6.7χ1(Γ3校正相對 ERCC 1表現臨限值為更有效鑑別者。 使用Kaplan-Meier生存曲線及對數等級測試之單變數分 析中與整體生存顯著相關之其他因素為治療前體重減輕之 存在及ECOG表現情況。患者年齡（png)、性別 I32488.doc •79- 200911988 (P=0.87)、腫瘤階段（p=〇,99)、腫瘤細胞類型（p=〇 63)及胸 膜積液之存在（P=0.71)並非為整體生存之顯著預後因素。 在Cox比例風險回歸模型多變數分析中，校正相對ercci 表現量、ECOG表現情況及體重減輕仍為生存之顯著預後 因素（圖14)。在腫瘤階段分層之c〇x回歸模型之p值對於 ERCCl為 0.038，對於體重減輕為00l7，且對於ECoG表現 情況（PS 0與1或2)為〇.〇2。 該研究發現對於患有癌症之患者而言，較低ERCC1 mRNA表現里與以基於轴之化療劑治療後改良生存之間的 相關性。 實例8 : DPD之未校正基因表現（UGE)之測定

進行兩對平行反應。"測試"反應及"校準，，反應。DpD擴 增反應及β-肌動蛋白内部對照擴增反應為測試反應。獨立 β-肌動蛋白及DPD擴增反應係在校準子rnA上執行且稱為 校準反應。TaqMan儀器將產生四種不同循環臨限（Ct)值： 來自測試反應之CtDPD及Ct卜wi j»*6及來自校準反應之ctDPD & Ctp-肌動蛋白。 根據以下方程式求出兩個反應之Ct值之差值： △ Ct测试=Ct〇PD - Ctp_肌動蛋白(來自π測試”反應) △ Ct校準子= CtDPD - Ctp·肌動蛋白(來自”校準"反應)〇 隨後該步驟包括根據以下方程式使數字2乘-ACt次方： 2·Δ0:ι测试（來自"測試"反應） 2·Δεί校準子（來自”校準”反應）。 為隨後自TaqMan儀器獲得DPD之未校正基因表現，進行 132488.doc -80- 200911988 以下計算： DPD之未校正基因表現（UGE)=2-ACt測试/2-ACt校"。

以先前公開值標準化UGE 標準化計算需要將UGE乘以對DPD及特定校準子RNA具 有特異性之校正因子（KDPD)。可使用任何内部對照基因及 任何精確預定量校準子RNA求出校正因子Kdpd。較佳地， 使用内部對照基因β_肌動蛋白及精確預定量校準子rna Universal PE RNA(目錄號#43〇7281，批號#36l78i2〇i4， Applied Biosystems)。 使用 User Bulletin #2 中 Applied Biosystems，TaqMan製 造商所述及上述之ACt方法之修改實現標準化。為進行該 程序，使用上述TaqMan方法對於DPD表現分析6種不同先 前公開測試組織之UGE。使用内部對照基因ρ·肌動蛋白及 校準子RNA Universal PE RNA(目錄號#4307281，批號 #3617812014，Applied Biosystems)。 各樣品 L7、L91、L121、L150、L220及 L164之相對 DPD 表現量（PV)(先前描述於Salonga等人中，該參考文獻之全 文係以引用的方式併入本文中）除以其相應Taqman產生 UGE以產生未平均化校正因子κ : 1C未平均化= PVVUGE 〇

隨後，將所有K值平均化以求出對DPD、Universal PE RNA(目錄號 #4307281，批號 #3617812014)校準子 RNA 及 β· 肌動蛋白具有特異性之單一Kdpd校正因子。 因此，為測定規模上與先前公開之預_τ叫Man DpD表現 132488.doc -81 - 200911988 研九致之未知組織樣品中之校正相對DPD表現，僅需將 來源於TaqMan裝置之未校正基因表現數據（UGE)乘以Kdpd 特異性校正因子，若其使用相同内部對照基因及校準子 RNA ： 校正相對DPD表現=UGExKDPD。 可使用任何精確預定量校準子RNA求出Kdpd。精確預定 量RNA之將來來源可以如以上方法中所述之公開樣品校 準’或現可以上述經預先校準之校準子RNA(諸如 Γ Universal pe RNA，目錄號 #43〇7281，批號 #3617812〇1句 校準。 實例9 . FPE結腸直腸腫瘤樣品中之dpd表現 將上述方法用於分析來自患有晚期結腸直腸癌之34名患 者的34個腫瘤樣品。將所有患者以靜脈内5_fu/lv組合療 法治療作為前瞻性多中心歐洲5-FU/CPT11交叉試驗V239 之部分。將所有患者以15分鐘靜脈内輸注5個連續日給予 之5-FU 425 mg/m2以及亦藉由輸注5個連續日給予之2〇 I- mg/m甲醯四氫葉酸治療。該療法係作為第一或第二線緩 解性治療給予。 9名（25.5°/。）患者對5411/1^反應，其中反應定義為任何 反應’包括完全反應、部分反應及最小反應。具有進行性 疾病或穩定疾病之患者歸類為不反應者（25名患者， 73.5%)。將總mRNA自顯微切割fpE預處理腫瘤樣品分 離，且使用所述定量PCR量測DPD/β-肌動蛋白之相對 mRNA表現量。 132488.doc •82· 200911988 反應及不反應患者組之平均校正dpd:p-肌動蛋白量分別 為0.87><10_3及2,04><10-3。將對比兩個獨立樣品組内值之等 級的Mann-Whitney U測試用於對比反應及不反應患者組中 之校正相對DPD表現量。與不反應者相比，在反應者組中 相對DPD量顯著較低（p=〇.02)。該等患者中dpd mRNA表 現與對5-FU/LV反應之間的相關性如圖丨6所示。該等數據 展不DPD表現為對基於5-FU之化學療法反應之預後因素。 實例1 0 : TS之未校正基因表現（uge)之測定 進行兩對平行反應。”測試，，反應及，，校準”反應。圖24。 TS擴增反應及β-肌動蛋白内部對照擴增反應為測試反應。 獨立TS及β-肌動蛋白擴增反應係在校準子尺]^八模板上執行 且稱為校準反應。TaqMan®儀器將產生四種不同循環臨限 (Ct)值：來自測試反應之CtTsA Ctpm ό及來自校準反應 之CtTS及Ctp^動*白。根據以下方程式求出兩個反應之〇值 之差值： ACt測域=CtTS _ Ctp_肌動蛋白(來自"泪試"反應) △ Ct校準子=Ct；Ts - Ctp·肌動蛋白(來自&應)。 隨後該步驟包括根據以下方程式使數字2乘_△〇次方. 來自”測試”反應） 2_Δ(：ί校準子（來自”校準"反應）。 為隨後自TaclMan⑧儀器獲得TS之未校正基因表現，進行以 下計算： TS之未校正基因表現（UGE)=2MC^/2-ACt^+。

以已知相對TS表現量標準化UGE 132488.doc -83 - 200911988 標準化計算需要將脳乘以對Ts及特定校準子進且有 特異性之校正因子（Kts)。亦可求出任何内部對照基因隸 何精確預定量校準子RNA之校正因子Kts。較佳地，使用 内部對照基因β-肌動蛋白及經精確預定量校準子rna lWersal PE RNA(目錄號#43〇7281，批號#36i78i2叫，

Applied Bi〇systems)。若為該等試劑，則校正因子等於 12.6X10'3 〇 ' 使用 User BuUetin #2 中之 Applied Biosystenis，TaqMa_

製造商所述及上述ACt方法之修改實現標準化。為進行該 程序’使用上述TaqMan®方法對於TS表現分析6種不同先 前公開之測試組織之UGE。該等組織樣品係描述於Sai〇nga 等人 ’ Clinical Cancer Research，6:1322-1327，2000中，該 參考文獻之全文係以引用的方式併入本文中。使用内部對 照基因β-肌動蛋白及校準子RNAUniversal PE RNA(目錄號 #4307281，批號 #3617812014，Applied Biosystems)。 各樣品L7、L91、L121、L150、L220及L164之先前公開 相對TS表現量除以其相應Taqman®產生UGE以產生未平均 化校正因子 K。Salonga 等人，Clinical Cancer Research， 6:1322-13 27，2000，該參考文獻之全文係以引用的方式併 入本文中： K未平均化=已知值/IJGE。 隨後，將所有K值平均化以求出對TS、Applied Biosystems Universal PE RNA(目錄號 #4307281，批號 #3 61781201 4)校準子RNA及β-肌動蛋白具有特異性之單一 132488.doc »84 · 200911988

Kercci校正因子。 因此，為測定規模上與預_TaqMan⑧丁8表現研究一致之 未知組織樣品中之校正相對Ts表現，僅需將來源於 TaqMan®裝置之未校正基因表現數據（uge)乘以特異性 校正因子，若其使用相同内部對照基因及校準子rna ·· 校正相對ts表現=UGExKts。 f

可使用任何精確預定量校準子RNA或内部對照基因求出 Κ τ s。精確預定量R N A之將來來源可以如以上方法中所述 之已知相對ERCC1表現量校準，或現可以上述經預先校準 之校準子 RNA(諸如 Universai PE RNA，目錄號 #43〇7281， 批號 #3617812014 ’ Applied Biosystems)校準。 舉例而言，若求出不同内部對照基因及/或不同校準子 RNA之後續KTS，則必須將該内部對照基因與該校準子 RNA以已測定或公開相對於特定内部對照基因之Ts表現量 之組織樣品校準。該測定可使用此項技術中所熟知之標準 預-TaqMan® ’定量灯-取技術進行。該等樣品之已知表 現量將除以其相應UGE量以求出該樣品之隨後將反值 視已知樣品數目而平均化以求出對不同内部對照基因及/ 或校準子RNA具有特異性之新kts。 實例11 :患者選擇及化學治療 使所有患者加入1998-2000年Univershy 〇f〜她⑽

California Medical Center體恤方宏 丄 ν木中，且接受以

下奥賽力鉑/5-FU組合療法：130 mg/m2盔堂丄A g/m吳賽力鉑加上連續 輸注5-FU。以5-FU預先治療對所有串、去生 ，心考失效且以伊立替康 132488.doc •85, 200911988 (irinotecan, CP1M1)再進行第

失效。所有患者在加入方案時均展 活性疾病。 治療對6 0 % ( 3 0 / 5 0 )患者 示階段IV結腸直腸癌之 臨床評估及反應標準 化學治療期間，對於表現情 衣現It况、重量、腹部疼痛、全血

、田胞》十數及血^肌gf及A尿素氮量記錄每週評估。使用電 腦斷層（CT)量測腫瘤負荷。在進入方案時需要二維可量測 腫瘤質量。對治療反應者歸類為經至少6週腫瘤負荷減少 50%或50%以上之患者。 不反應者包括具有穩定疾病或癌 症進展之患者。以制5_FU/奥赛力在自進行化學治療開始 至由於任何原因死亡之日數形式計算生存。在最終追縱評 估時仍生存之患者在彼時檢刪。 統計分析

TaqMan®刀析產生表示為兩個絕對量測值之間的比率 (所關注之基因：内部參考基因）之值。使用Mann_Whitney測 試及Kruskal-Wallis測試以患者人口統計資料評估丁s與 ERCC1表現（作為連續變數）之相關性。Zar，Bi〇statistical Analysis. Prentice-Hall, Inc Englewood Cliffs, N.J (1974) ’分別在第109-114頁及第i39_142頁。將Miller及

Sigmund(Biometrics 38:1011-1016, 1982)及 Halpern (Biometrics 38:1017-1023，1982)之最大卡方法經調適以確 定最佳將患者二分為較低及較高TS及ERCC1表現亞組之臨 限值。使用Pearson卡方測試評估經二分分子標記與對化學 治療反應之間的相關性。Zar，Biostatistical Analysis. 132488.doc -86- 200911988

Prentice-Hall，Inc Englewood Cliffs，NJ (1974)，第冰⑽ 頁。使用風險比率計算相對死亡風險。Schulman， Infection Control & Hospital Epidemiology, 18:65-73, 1997。該等計算係基於借助於所觀察及對數等級測試統計 中所計算之期望事件值之Pike估算（pike，j R Stat s〇c

Series A 135:201-203，1972)。為確定解釋為基於最大卡方 分析之相關性強度量測值之p值，在假設無相關性的情況 下使用1 000次拔靴樣模擬來估算最大卡方統計分布 (Halpem，Biometrics 38·· 1017-1023, 1982)。顯著性水準設 為 p<0.05 〇 人口統計及反應及生存評估之有效患者 在該研究中總共評估50名患者，其係由14名（28%)女性 及36名（72%)男性組成，其中中值年齡為59歲（最小：34 歲；最大：83歲）。該組之人種背景包括39名高加索人' 6 名西班牙人、3名亞洲人及2名美國黑人。所有50名患者均 可經評估以使TS表現及ERCC1表現量與生存相關。四十五 名（90%)患者可經評估以藉由以上所引用之標準測試分子 參數與反應之相關性。 TS表現量及ERCC1表現量 將總mRNA自顯微切割FPE預處理腫瘤樣品分離，且使 用定量RT-PCR量測ERCC1:P-肌動蛋白及或TS:p-肌動蛋白 之相對mRNA表現量。自該等樣品分離mRNA之一方法描 述於本文及1999年12月20日申請之美國專利申請案第 09/469,338號中，且該案之全文係以引用的方式併入本文 132488.doc -87- 200911988 中。使用基於反轉錄/聚合酶鏈反應（rt/PCr)之檢定系統 以如前述測定ERCC1及β-肌動蛋白之表現量。如上所述求 出校正相對ERCC1及/或TS表現。 在所分析之所有50個樣品中可偵測到Ts基因表現。相對 於看家基因β_肌動蛋白之中值校正TS表現為3.4χ1〇-3(最 小.0.18Χ10.3 ;最大：u 5χ1〇-3)。在所分析之47個（94%) 樣品中可偵測到校正ERCC 1基因表現。中值校正ERCC 1基 因表現為2.53xl〇_3(最小：〇,〇〇 ;最大：14 61 χ1〇-3)。當藉 由性別、年齡及人種來源分析時，校正Ts及ERCC1 mRNA 表現未發現顯著差異》 與TS表現有關之生存 在该研究中所分析之50名患者之中值追蹤期為105個月 (95% C.I.:1.8,21.2)的情況下，中值生存為8 4個月（95% CH4，12.3)。使用 TS 臨限值 7.5χ1(Τ3，43 名（86%)患者具 有較低校正TS表現量，且7名（14%)患者具有較高校正TS 表現量。使用對數等級測試以評估校正TS基因表現與生存 之間的相關性。相應生存曲線係如圖1 7中所呈現，且展示 較低校正ts表現者組中中值生存為1〇.2個月（95% C.I.:7.4，15.1)，且較高校正TS表現組中為15個月（95% C-HlJ.lKPUiH ; Logrank測試）。6個月之生存概率對 於ts表現小於或等K(horeq)7 5χ1〇-3之患者為〇 77，相比 之下，對於較高表現者組為0.00。在單變量分析 (ρ<0·001，圖17)中，與TS量小於或等於7 5χΐ〇·3之患者相 匕校正TS 1 >7.5χ10 3之患者之死亡相對風險增加 132488.doc • 88 - 200911988 8.4(95% CI : 2.63, 27·13)倍。 與ERCC1表現有關之生存 使用4·9Χ10-3作為臨限值，4〇名（8〇%)患者具有較低校正 ERCC1表現’且10名（2〇%)患者具有較高校正现⑽表 現。圖22展示所估算生存概率與校正ERCC1表現量之 Kaplan-Meier圖，且展示較低表現者組之中值生存為1〇2 個月（95% C.I.:7.8，15.1)，且較高表現者組為i 9個月（95% C.I’：l，l，4.9)(P<0.〇〇l ; Logrank測試）。6個月之生存概率對 於校正ERCC1表現小於或等於4·9χ1〇-3之患者為〇 76，相 比之下，對於校正ERCC1表現> 4.9Χ10-3之患者為0.16。在 單變量分析（ρ<0.001 ;圖20)中，與校正ERCd<4 9χ1〇·3 之患者相比，校正ERCC1量>4.9Μ0·3之患者之死亡相對風 險增加 4.8(95%CI:2_09，15.88)倍。 與組合ERCC1及TS表現有關之生存 在36名（72%)患者中偵測到較低校正TS及ERCC1表現 里’且14名（28%)患者具有較面权正T s及/或ERC C1表現 量。兩種基因表現量均較低之患者具有顯著優良之生存。 較低校正TS及ERCC1表現者之中值生存為1M個月（95% C.I.:8.4，17.5)，且較高校正TS及/或ERCC1表現者為19個 月（95% C.I.:1.1，4.9)(P<0.001，Logrank測試；圖 19)。兩種 基因之校正表現量均較低之患者6個月之生存概率為 0.85，相比之下，至少一種基因（TS或ERCC1)之校正表現 量較高的患者為0.10。與腫瘤中兩種基因之表現量均較低 之患者相比，至少一種基因（TS或ERCC1)之校正表現增加 132488.doc -89- 200911988 之患者之死亡相對風險為7.12(95% CI:2.60,19.52) (P<0.001 ;圖 20)。分層分析（圖 24)揭示 TS 與 ERCC1 mRNA 表現彼此獨立。 反應與TS及ERCC1基因表現量之相關性。 45名可量測患者之中值校正TS表現量為3 4x1〇-3(最小： 0.1 8χ 1 (T3 ;最大：ιι.5〇χΐ〇-3)，且與全部5〇名患者群體相 同°當藉由將腫瘤分為較低及較高TS表現者來分析反應 時，3/4(75%)部分反應者、26/27(96%)具有穩定疾病之患 者及9/1 4(64%)具有進行性疾病之患者具有較低校正TS表 現（P=0_02 ; Fisher確切測試）。 45名可量測患者之中值校正ercCI表現量為2·7χ1〇-3(最 小· 0.00，最大：14.61 X 1〇·3)，且與全部5〇名患者群體並 非顯著不同。然而，ERCC 1表現量並非與對化學治療之反 應統計上顯著相關（ρ=〇.29，Fisher確切測試）。 實例12 : EGFR之未校正基因表現（Uge)之測定 進行兩對平行反應。"測試"反應及”校準"反應。圖29。 EGFR擴增反應及β-肌動蛋白内部對照擴增反應為測試反 應。獨立EGFR及β-肌動蛋白擴增反應係在校準子Rna模 板上執行且稱為校準反應。TaqMan⑧儀器將產生四種不同 循環臨限（ct)值：來自測試反應之CtEGFR及Ctp㈣“及來 自校準反應之(^⑽心及Ctp_肌動蛋白。根據以下方程式求出兩 個反應之Ct值之差值： △ Ct*j試^。(^-(^-㈣蛋自八來自”測試丨丨反應） △ Ct校準子=CtEGFR-Ctp·肌動* 6 (來自"校準"反應）。 132488.doc -90- 200911988 隨後該步驟包括根據以下方程式使數字2乘-ACt次方： 2·Δ€：1μ(來自"測試”反應） 2·Δ(：ι"子（來自"校準”反應）。 為隨後自TaqMan儀器獲得EGFR之未校正基因表現，進 行以下計算： EGFR之未校正基因表現（UGE)=2_ACt測试/2·Δ(：ί校準子。

以已知相對EGFR表現量標準化UGE 標準化計算需要將UGE乘以對EGFR及特定校準子RNA 具有特異性之校正因子（KEGFR)。亦可求出任何内部對照基 因及任何精確預定量校準子RNA之校正因子KEGFR。較佳 地，使用内部對照基因β-肌動蛋白及精確預定量校準子 RNA人類肝臟總RNA(Stratagene，目錄號#735017)。若為 該等試劑則校正因子KEGFR等於1.54。 使用 User Bulletin #2 中 Applied Biosystems，TaqMan® 製 造商所述及上述ACt方法之修改實現標準化。為進行該程 序，使用上述TaqMan®方法對於EGFR表現分析6種不同 FPE測試組織之UGE。使用内部對照基因β-肌動蛋白及校 準子RNA人類肝臟總RNA(Stratagene，目錄號#735017)。 各樣品 AG221、AG222、AG252、成人肺、PC3、AdCol 之已知相對EGFR表現量除以其相應TaqMan®產生UGE產 生未平均化校正因子K: K未平均化=已去口值/UGE。 隨後，將所有K值平均化以求出對EGFR、校準子RNA Stratgene 人類肝臟總 RNA(Stratagene，目錄號 #735017)及 132488.doc 91 200911988 β-肌動蛋白具有特異性之單一Kegfr校正因子。 因此，為測定規模上與預矸叫河抓⑧EGFR表現研究一致 之未知組織樣品中之校正相對EGFR表現，僅需將來源於 TaqMan®裝置之未校正基因表現數據（UGE)乘以特異 性校正因子，若其使用相同内部對照基因及校準子: 校正相對EGFR表現=UGExKEGFR。 可使用任何精痛預定量校準子RNA或内部對照基因求出 KEGFR。精確預定量RNA之將來來源可以具有上述方法中 所述之已知相對EGFR表現量之樣品校準，或現可以上述 經預先校準之校準子RNA(諸如人類肝臟總rna，

Stratagene，目錄號 #735017)校準。 舉例而言，若求出不同内部對照基因及/或不同校準子 RNA之後續KEGFR，則必須將該内部對照基因與該校準子 RNA以已測定相對於特定内部對照基因之egfr表現量之 組織樣品校準。該測定可使用此項技術中所熟知之標準 預-TaqMan®，定量RT_PCR技術進行。該等樣品之已知表 現量將除以其相應UGE量以求出該樣品之κ。隨後將尺值 視已知樣品數目而平均化以求出對不同内部對照基因及/ 或校準子RNA具有特異性之新尺郎以。 實例13 : HER2-neU之未校正基因表現（UGE)之測定 進行兩對平行反應。"測試"反應及"校準"反應。圖％。 HER2-neu擴增反應及β_肌動蛋白内部對照擴增反應為測試 反應。獨立HER2-neU及β-肌動蛋白擴增反應係在校準子 RNA模板上執行且稱為校準反應。TaqMan⑧儀器將產生四 132488.doc •92· 200911988 種不同循環臨限（Ct)值：來自測試反應之CtHER2.neu及ctp^蛋白 及來自校準反應之CtHer2_neu及Ctp_肌動*白。根據以下方程式 求出兩個反應之ct值之差值： △ Ct測试=CtHer2_neu-Ctp-肌動蛋白（來自”測試”反應） △ Ct校準子=ctHer2-neu-Ctp·肌動蛋白(來自"；準"反應)〇 隨後該步驟包括根據以下方程式使數字2乘·次方： 來自"測試”反應） (來自"校準"反應）。 為隨後自TaqMan儀器獲得HER2-neu之未校正基因表 現’進行以下計算：

Her2-neu之未校正基因表現（UGE卜2-ACt測试/2-^Ct校丰子

以已知相對HER2-neu表現量標準化UGE 標準化計算需要將UGE乘以對HER2-neu及特定校準子 RNA具有特異性之校正因子（KHER2neu)。亦可求出任何内 部對照基因及任何精確預定量校準子rNA之校正因子 KHER2-neil。較佳地，使用内部對照基因動蛋白及精確 預疋篁校準子RNA人類肝臟總RNA(Stratagene，目錄號 #735017)。使用β-肌動蛋白及精確預定量校準子RNA人類 肝臟總RNA(Stratagene，目錄號#735017)，校正因 等於 12.6χ10·3。 使用 User Bulletin #2 中之 Applied Biosystems，TaqMan⑧ 製造商所述及上述ACt方法之修改實現標準化。為進行該 程序，使用上述TaqMan®方法對sHER2_neu表現分析6種 不同FPE測試組織之UGE。使用内部對照基因卜肌動蛋白 132488.doc -93· 200911988 及校準子RNA人類肝臟總RNA(Stratagene，目錄號 #735017)。 » 各樣品 AG221、AG222、AG252、成人肺、PC3、AdCol 之已知相對HER2-neu表現量除以其相應TaqMan®產生UGE 產生未平均化校正因子K : K未平均化=已去口值/UGE。 隨後，將所有K值平均化以求出對HER2-neu、人類肝臟 總RNA(Stratagene，目錄號#73501 7)校準子及β-肌動蛋白 具有特異性之單一 KEGFR校正因子。 因此，為測定規模上與預-TaqMan® HER2-neu表現研究 一致之未知組織樣品中之校正相對EGFR表現，僅需將來 源於TaqMan®裝置之未校正基因表現數據（UGE)乘以 KHER2-neu 特異性校正因子，若其使用相同内部對照基因及 校準子RNA : 校正相對EGFR表現=UGExKegfr。 可使用任何精確預定量校準子RNA或内部對照基因求出 K-HER2-neu 0 精確預定量RNA之將來來源可以具有上述方法 中所述之已知相對EGFR表現量之樣品校準，或現可以上 述經預先校準之校準子RNA(諸如人類肝臟總RNA， Stratagene，目錄號#735017)校準。 舉例而言，若求出不同内部對照基因及/或不同校準子 RNA之後續KHER2_neu，則應將該内部對照基因與該校準子 RNA以已測定或公開相對於特定内部對照基因之HER2-neu 表現量之組織樣品校準。該測定可使用此項技術中所熟知 132488.doc -94- 200911988 之標準預-TaqMan®，定量RT-PCR技術進行。該等樣品之 已知表現量將除以其相應UGE量以求出該樣品之K。隨後 將K值視已知樣品數目而平均化以求出對不同内部對照基 因及/或校準子RNA具有特異性之新KHER2_neu。 實例1 4 :測試不同濃度之EDTA及不同培育溫度 在提取溶液内使用四個不同濃度之EDTA(0.1 mM、0.6 mM、3.6 mM及20 mM)及4個不同培育溫度（44、50、56及 62°C )進行實例1中所述之程序。使用兩個不同FFPE樣品評 估該等變數。使用四種不同引子組-100、300、400及1000 bp引子（意謂該等引子距RNA之3彳多聚A)端100、300、400 或1,000 bp)。執行寡dT反轉錄。提取過程在不同溫度下使 用Tris/EDTA/PK緩衝液（如上所述）。執行單一苯酚/氯仿/ 異戊醇（PCI)提取以移除DNA污染。將所分離之RNA再懸 浮於50 μΐ Tris中。 數據展示儘管所有培育溫度均有效且不同濃度EDTA均 有效，但獲得長片段RNA之較佳參數使用3.6 mm EDTA及 50-56°C之溫度範圍（如由最低Ct可見）。參見下表2。 132488.doc -95 - 200911988 表2 EDTA濃度/溫度

Ml 100 bp 44〇C 50°C 56〇C 62〇C Ml 300bp 44〇C 50°C 56〇C 62〇C 0.1 mM 23.1101 22.196 22.3712 22.9834 0.1 mM 26.4604 24.9523 25.0977 25.2382 0.6 mM 23.3616 22.3673 22.5973 22.6378 0.6 mM 26.5112 24.8636 25.1074 24.9243 EDTA 3.6 mM 22.7179 22.2331 21.8783 21.9587 EDTA 3.6 mM 25.8619 24.9501 24.5143 24.6931 20 mM 23.0952 22.1579 21.8366 21.9461 20 mM 26.7892 25.3186 25.0386 25.3433 Ml 400 bp 44〇C 50°C 56〇C 62〇C Ml 1000 bp 44°C 50°C 56〇C 62〇C 0.1 mM 28.0654 27.0076 27.3271 27.6107 0.1 mM 29.9852 27.9539 27.8691 27.3389 0.6 mM 28.1851 26.8109 27.0736 26.9763 0.6 mM 30.3583 27.8463 28.1046 27.3479 EDTA 3,6 mM 27.3316 26.4201 26.2641 26.8206 EDTA 3.6 mM 29.6949 28.4397 27.9215 27.5779 20 mM 20 mM 30.2612 28.8745 28.6416 28.5171 M2 100 bp 44〇C 50°C 56°C 62°C M2 300bp 44°C 50°C 56〇C 62〇C 0.1 mM 21.4018 21.4633 21.4504 21.6834 0.1 mM 23.9609 23.8571 23.9106 24.3064 0.6 mM 21.4292 21.0563 21.1044 21.47 0.6 mM 23.9403 23.4637 23,7906 24.2977 EDTA 3.6'mM 21.6286 20.9075 20.9972 20.7812 EDTA 3.6 mM 24.5158 23.5704 23.7666 23.7389 20 mM 21.027 21.0579 21.0027 21.2553 20 mM 24.3286 23.9254 24.2174 24.5737 M2 400 bp 44〇C 50°C 56〇C 62〇C M2 lOOObp 44〇C 50°C 56°C 62〇C 0.1 mM 26.5268 25.8475 25.9314 26.5978 0.1 mM 30.0974 27.9908 27.5454 27.673 0.6 mM 25.854 25.1882 25.6386 26.0809 0.6 mM 29.7021 27.7281 27.5899 27.2548 EDTA 3.6 mM 26.1936 24.9937 25.1652 25.3845 EDTA 3.6 mM 28.7475 27.6364 27.2434 26.9735 20 mM 25.7346 25.183 20 mM 28.582 27.7993 28.078 27.9715 實例1 5 :使用檸檬酸鈉或EGTA代替EDTA作為螯合劑 在該實驗中，測試三種不同螯合劑：EDTA、EGTA及擰 檬酸鈉。將丑0丁八及檸檬酸鈉在0.1、0.6、3.6及2〇111]^下與 3.6 mM EDTA—起測試。將樣品在50°C下培育16小時。使 用單一苯酚/氣仿步驟以移除DNA污染。將所分離之RNA 再懸浮於50 μΐ Tris中。結果展示0.6及3.6 mM下之擰檬酸 鈉為優良螯合劑，且其甚至在高達20 mM之濃度下仍有 效。參見下表3。 96- 132488.doc 200911988 表3 100 bp Ml 0.1 0.6 3.6 20 300 bp Ml 0.1 0.6 3.6 20 EGTA 22.05584 21.91483 22.14477 21.32523 EGTA 26.4581 26.09962 26.25091 25.07969 檸樣酸鈉 21.26925 20.75951 20.68721 20.97618 檸樣酸鈉 24.72144 22.69152 22.93418 23.24895 EDTA 20.97683 EDTA 23.95666 M2 0.1 0.6 3.6 20 M2 0.1 0.6 3.6 20 EGTA 20.95042 21.02856 21.50124 20.75807 EGTA 25.16278 25.05163 25.61697 24.87095 檸樣酸納 20.43178 20.03613 20.35514 20.25602 檸樣酸鈉 24.38187 22.76978 22.86453 22.9773 EDTA 20.01918 EDTA 23.09989 400 bp Ml 0.1 0.6 3.6 20 lOOObp Ml 0.1 0.6 3.6 20 EGTA 28.26457 27.55415 28.0468 26.84575 EGTA 29.19289 29.04155 29.78311 28.69869 檸樣酸納 26.77297 25.08387 25.27766 25.49137 檸樣酸納 27.47323 25.47567 25.64558 25.9896 EDTA 26.43221 EDTA 26.5681 M2 0,1 0,6 3.6 20 M2 0.1 0,6 3.6 20 EGTA 27.03514 26.65384 27.326Π 26.27913 EGTA 28.37434 28.50888 29.09281 27.69427 檸樣睃納 25.89327 24.67949 24.87163 25.08208 檸樣酸鈉 27.28292 25.09847 25.18052 25.41669 EDTA 25.00621 EDTA 25.68557 實例16 : PK濃度及培育時間 如上所述進行RNA提取，其例外為提取溶液包含具有 0·5χ、lx、2χ 及 4χ ΡΚ 濃度之 Tris/EDTA/PK 緩衝液。lx ΡΚ 濃度=5 00 pg/ml。評估3、6、12、16及20 hr之培育時間且 執行單一苯酚/氯仿/異戊醇（PCI)提取。將RNA再懸浮於50 μΐ Tris中。執行寡dT反轉錄。結果展示較佳培育時間為在 5 0°C下16小時。PK之不同濃度均有效且似乎lx與較高濃度 同樣有效。參見表4。 表4 樣品M3 3 hr 6 hr 100 bp 12 hr 16 hr 20 hr 0.5 28.31861 26.58241 25.46082 24.74091 24.36967 1 28.73512 26.28547 24.97916 24.44251 25.0303 2 28.03614 25.97902 25.04817 24.51852 24.82751 4 29.53969 26.86962 25.82528 24.64906 26.06563 3 hr 6 hr 300 bp 12 hr 16 hr 20 hr 0.5 31.91504 30.79285 29.34402 28.86285 28.53668 1 32.02502 30.62955 29.29224 28.61764 28.96055 2 30.01775 30.23354 28.37638 28.20503 28.61338 4 33.19733 31.13701 29.4218 28.05663 29.63655 -97 132488.doc 200911988 400 bp 3 hr 6 hr 12 hr 16 hr 20 hr 0.5 32.87424 32.41137 30.89621 30.70137 30.3052 1 33.28026 32.20423 31.00278 28.61866 30.58809 2 32.45806 31.61768 30.20251 29.87417 30.30267 4 34.42826 32.35595 31.04639 29.15671 31.08682 3 hr 6 hr 1000 bp 12 hr 16 hr 20 hr 0.5 33.11692 32.76052 30.58482 31.28069 30.60988 1 33.10397 32.08092 30.74326 31.22962 30.76994 2 31.63774 31.48734 30.37366 30.01824 30.33966 4 34.11372 32.5022 30.43215 29.4997 31.24582 樣品M4 3 hr 100 bp 6 hr 12 hr 16 hr 20 hr 0.5 27.50618 26.33205 24.90162 24.11188 24.08716 1 27.4682 26.733 24.70451 24.20879 24.15328 2 27.23042 26.39459 24.51051 24.34997 24.89759 4 27.87524 27.06252 25.15285 24.34653 24.96841 3 hr 6 hr 300 bp 12 hr 16 hr 20 hr 0.5 31.97025 30.67854 28.66794 27.46286 27.86116 1 31.51245 30.91859 28.21581 27.52881 27.74868 2 31.29552 30.24914 28.07282 27.54162 27.36115 4 31.53427 30.60247 28.67055 27.59484 27.97908 3 hr 6 hr 400 bp 12 hr 16 hr 20 hr 0.5 33.43846 32.34631 30.33808 29.74591 30.02667 1 33.10722 32.62965 30.38408 29.86639 29.84286 2 32.72484 32.17758 30.1776 29.86035 29.58862 4 32.81466 32.15597 30.64189 29.74172 30.08539 3 hr 6 hr 1000 bp 12 hr 16 hr 20 hr 0.5 33.69785 32.728 30.44111 30.24496 30.44284 1 33.38166 32.99974 30.4358 30.20776 30.32836 2 33.33786 32.39023 30.4802 30.16997 30.18674 4 33.47508 32.55459 30.54346 30.12733 29.94782

實例17 :自FFPE胰腺導管腺癌（PDA)組織分離mRNA及 gDNA 使用本發明之方法，將RNA自FFPE胰腺導管腺癌（PDA) 組織樣品分離。自單一顯微切割樣品獲得全範圍mRNA表 現及gDNA複本數數據，且將其與分別在類似平台上處理 132488.doc -98 - 200911988 之組織之數據相比。如由重疊探針（對於gDNA而言）之中 值比例及穩固的複本數/mRNA表現一致所證實，發現 mRNA及gDNA數據具有與冷凍、未經顯微切割腫瘤組織 相當之優良品質。 關於胰腺導管腺癌（PDA)原發腫瘤之表現及複本數模式 所知甚少，此在很大程度上係由於自該腹膜後器官獲得組 織之難度及所獲得核酸之不良品質所致。此外，嚴重的結 締組織生成引起基質污染（Chu，G.C.等人，Stromal biology of pancreatic cancer· J Cell Biochem，2007. 101 (4):第 887-907頁）且器官之極端自消化特性經常使得核酸品質下降。 使用手動或雷射切割技術執行腫瘤組織之顯微切割。顯 微切割之後，藉由 Response Genetics(Los Angeles, CA)之 專屬提取程序分離gDNA。使用本發明之方法分離總 RNA。如先前所述（Lord, R.V.等人，Telomerase reverse transcriptase expression is increased early in the Barrett's metaplasia, dysplasia, aden°C arcinoma sequence. J Gastrointest Surg，2000. 4(2):第 135-42 頁）執行兩輪 RNA擴 增及cDNA製備。合成cRNA且使其與Affymetrix Hu 133Plus2 晶片雜交。如所述（Wang，Υ·等人，Analysis of molecular inversion probe performance for allele copy number determination. Genome Biol, 2007. 8 (1 1):第 R246 頁）將共提取之gDNA(70 ng)在分子倒置探針（molecular inversion probe，MIP)平台上進行全基因組（genome wide) 等位基因-特異性複本數分析。 132488.doc -99- 200911988 發現基因組DNA及mRNA可自PDA之單一顯微切割FFPE 樣品中成功且一致地共分離，且在全基因組規模上進行表 現及等位基因特異性複本數分析。與未經顯微切割、冷凍 腫瘤樣品相比，FFPE MIP數據較有利。基因表現反映分 別提取之樣品中之複本數。顯微切割及共提取核酸（mRNA 及gDNA)之方法使得存檔FFPE組織可用以在多平台上進行 全基因組分析，且開始最大化可用於基因組分析之大型病 理學存檔室（archives)中所存在之有價值患者樣品之資料， ( 該方法尤其適合於新鮮材料難以獲得之遺傳性疾病研究及 臨床試驗。 實例18 :上述引子之序列： ERCC1-504F SEQ ID NO:l ： gggaatttgg cgacgtaatt c ERCC1-574R SEQ ID NO:2 ： gcggaggctg aggaacag GST-F SEQ ID NO:3 : cctgtaccag tccaatacca tcct GST-R SEQ ID NO:4 ·· tcctgctggt ccttcccata DPD3A SEQ ID NO:5 ： aggacgcaag gagggtttg ( - DPD3a-13R SEQ ID NO:6 · gtccgccgag tccttactga DPD3b-651F SEQ ID NO:7 ·' gaagcctatt ctgcaaagat tgc DPD3b-736R SEQ ID NO:8 : gagtacccca atcgagccaa a TS-763F SEQ ID NO:9 · ggcctcggtg tgccttt TS-825R SEQ ID NO:10 : gatgtgcgca atcatgtacg t EGFR-1753F SEQ ID NO:ll ： tgcgtctctt gccggaat EGFR-1823R SEQ ID NO:12 : ggctcaccct ccagaagctt Her2-neu 267 IF SEQ ID NO: 13 *· ctgaactggt gtatgcagat tgc 132488.doc -100- 200911988

Her2-neu 2699R SEQ ID NO:14 ： ttccgagcggccaagtc 本文中所引用之所有參考文獻之全文係以引用的方式併 入本文中。在整個說明書中，使用參考數字提及該等參考 文獻。該等參考文獻係如下提供。 參考文獻 1. Ross JS. The impact of molecular diagnostic tests on patient outcomes. Clin Lab Med. 1999; 19:815-831. 2. Lewis F, Maughan NJ, Smith V, Hillan K, Quirke P: Unlocking the archive: gene expression in paraffin-embedded tissue. J Pathol 2001, 195:66-71. 3. Srinivasan M, Sedmak D, Jewell S. Effects of fixative and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. Am J Pathol. 2002; 161:1961-1971. 4. Masuda N, Ohnishi T, Kawamoto S 等人。Analysis of chemical modification of RNA from formalin-fixed samples and optimization of molecular biology applications for such samples. Nucleic Acids Res. 1999; 27:4436-4443. 5. Gillespie JW, Best CJ, Bichsel VE等人。Evaluation of non-formalin tissue fixation for molecular profiling studies. Am J Pathol. 2002; 160:449-457. 6. Stanta G, Schneider C:RNA extracted from paraffin-embedded human tissues is amenable to analysis by PCR amplification. Biotechniques 1991, 1 1:304-308. 132488.doc -101 - 200911988 7. Rupp GM, Locker J: Purification and analysis of RNA from paraffin-embedded tissues. Biotechniques 1988, 6:56-60. 8. Von Weizsacker F, Labeit S, Koch HK, Oehlert W, Gerok W, Blum HE: A simple and rapid method for the detection of RNA in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues by PCR amplification. Biochem Biophys Res Commun 1991, 174:176-180. 9. Ben-Ezra J, Johnson DA, Rossi J, Cook N, Wu A: Effect of fixation on the amplification of nucleic acids from paraffin-embedded material by the polymerase chain reaction. J Histochem Cytochem 1991, 39:351-354. 10. Finke J，Fritzen R, Ternes P, Lange W, Dolken G: An improved strategy and a useful housekeeping gene for RNA analysis from formalin-fixed, paraffin-embedded tissues by PCR. Biotechniques 1993, 14:448-453. 11. Mies C: A simple, rapid method for isolating RNA from paraffin-embedded tissues for reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). J Histochem Cytochem 1994, 42:811-813. 12. Foss RD, Guha-Thakurta N, Conran RM, Gutman P: Effects of fixative and fixation time on the extraction and polymerase chain reaction amplification of RNA from paraffin-embedded tissue: comparison of two 132488.doc -102- 200911988 housekeeping gene mRNA controls. Diagn Mol Pathol 1994, 3:148-155. 13. Stanta G, Bonin S: RNA quantitative analysis from fixed and paraffin-embedded tissues:membrane hybridization and capillary electrophoresis. Biotechniques 1998, 24:271-276. 14. Godfrey TE, Kim S-H, Chavira M, Ruff DW, Warren RS, Gray JW, Jensen RH: Quantitative mRNA expression analysis from formalin-fixed, paraffin-embedded tissues using 5' nuclease quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction. J Mol Diagn 2000, 2:84-91. 15. Specht K, Richter T, Muller U, Walch A, Werner M, Hofler H: Quantitative gene expression analysis in microdissected archival formalin-fixed and paraffin-embedded tumor tissue. Am J Pathol 2001, 158:419-429. 16. Karbler T, Grskovic M, Dominis M, Antica M: A simple method for RNA isolation from formalin-fixed and paraffin-embedded lymphatic tissues. Exp Mol Pathol 2003, 74:336-340. 17. Gillespie JW, Best CJ, Bichsel VE, Cole KA, Greenhut SF, Hewitt SM, Ahram M, Gathright YB, Merino MJ, Strausberg RL, Epstein JI, Hamilton SR, Gannot G, Baibakova GV, Calvert VS, Flaig MJ, Chuaqui RF, Herring JC, Pfeifer J, Petricoin EF, Linehan WM, Duray 132488.doc -103 - 200911988 PH, Bova GS, Emmert-Buck MR: Evaluation of nonformalin tissue fixation for molecular profiling studies. Am J Pathol 2002, 160:449-457. 18. De Andres B, del Pozo V, Gallardo S, de Arruda-Chaves E, Cardaba B, Martin-Orozco E, Posada M, Palomino P, Lahoz C: Improved method for mRNA extraction from paraffin-embedded tissues. Biotechniques 1995, 18:42-44.

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出RNA之影響。數據展示5 (在圖中為IX)對於最大RNA 產率以及最小DNA污染而言為較佳濃度。 圖5Α及5Β展示使用以下五種提取方法之RNA產率及 DNA污染之對比結果：1)高溫離液劑法；2) ΡΚ法（本發明 之方法，其包含（蛋白酶Κ、低溫及長加熱時間））；3)使用 具有異硫氰酸胍（"GITC”）之單一苯酚提取的ΡΚ法；4)使用 雙苯酚提取之ΡΚ法，其中在第二提取中具有GITC ; 5)使 I 用雙苯酚提取之ΡΚ法，其中以Tris緩衝液代替GITC。舉例 而言，在該圖中，”F4_l_100bp”之標示意謂以高溫離液劑 法處理之樣品F4 ; F4_2_100bp意謂以PK法處理之樣品 F4 ; F4_3_100bp意謂以使用具有GITC之單一苯酚提取之 PK法處理之樣品F4等。該圖左邊最後5個條塊表示為 NRT(無反轉錄）且表明樣品中DNA之量。 圖6展示自表示為B5、D6及F5之FFPE樣品分離之RNA之 量及純度的對比。’TK"表明使用本發明之分離方法， 132488.doc •108- 200911988 (RGI")表明使用高溫分離法（美國專利my”中所述）； P a表明使用市售Paradise⑧套会且。a·之純度係藉由 280 nm~F之紫外吸光度量測。該等數據展示在3個測試樣 中^ Paradlse®套組相比，本發明分離較高產率之RNA 及較純（與DNA污染相比）之RNA。結果亦展示，ρκ法所產 生之RNA不如RGI法多，但提供較純rna樣品。 圖7展示自FFPE樣品B5、加及”分離之1〇〇、3〇〇、4〇〇 及1000 bp RNA片段由在各樣品中PCR擴增卜肌動蛋白所 量測之量的對比。”PK"表明使用本發明之分離方法， (RGI )表明使用咼溫分離法（美國專利6,248,535中所述）； 且para表明使用市售Paradise⑧套組。數據展示使用ρκ之 較佳方法產生各片段長度之最佳產率以及最小DNA污染。 條开> 圖下方之表格提供條形圖中所代表之數字資料。 圖8展示由各方法分離之RNA片段尺寸分布的對比。將 RNA在尺寸排阻管柱上分級分離且藉由28〇 nm下之UV吸 光度定量。與較大片段相比，較小片段經管枉遷移越快。 D5 =樣品1 ; F5 =樣品2 ; D6=樣品3。"PK”表明使用本發明 之分離方法’（"RGI”）表明使用高溫分離法（美國專利 6,248,535中所述）·’ ”paradise”表明使用市售paradise⑧套 組；且”冷凍”為自相應新鮮冷凍組織分離之RNA的分級分 離。第五列之單個圖式含有分子量標準。該圖展示，與其 他方法相比，PK法提供較佳品質、較長片段之rna。 圖9展示使用本發明自ffpe組織分離之rnA中β-肌動蛋 白表現量（由PCR所測定）與使用習知方法自新鮮冷凍組織 132488.doc -109- 200911988 分離之RNA的對比。該等數據展示由（尤其）使用本發明之 方法自FFPEk取之RN A獲得之基因表現之分析準確與新鮮 冷凍組織中之基因表現相關且反映新鮮冷凍組織中之基因 表現。舉例而言，新鮮冷凍組織之結果與FFPe之結果之間 直接相關將展示為1之斜率及R2值。R2值愈接近1，品質愈 接近。因此’對於PK分離而言，R2值為0.89，其優於獲得 0·81之R2值的Paradise套組或0.84之R2值的RGI。 圖10說明樣品年齡對長片段尺^八物質之提取產率的影 響。數據展示ct值隨樣品老化而遞增（較低RNA產率）。因 此，隨樣品老化，RNA產率及品質下降（較少長片段 RNA)。樣品1、2、3、4及5固定於1991年；樣品2固定於 2000年，且樣品D7、D9及F3固定於2005年。標記為” RNA ” 之柱條指示無反轉錄對照，亦即，DnA污染之量。 圖11為展示接受順鉑/Gem治療之患者整體生存與nsclc 中杈正相對ERCC1表現之曲線。低於臨限值6 7χ1〇·3之患者 校正相對ERCC1表現量與顯著較佳生存相關。而高於臨限 值6·7χ 10·3之患者校正相對ERCC1表現量與顯著較差生存 相關。（Ρ=0·009，對數等級測試）。 圖12為說明如何計算相對於内部對照基因之校正相對 ERCC1表現之圖。該圖含有由兩個測試樣品（未知丨及2)獲 知·數據且說明如何求出未校正基因表現數據（uge)。 該圖亦說明如何將TaqMan®儀器所產生之UGE以由預-TaqMan®技術測定之已知相對ercc 1值標準化。此係藉由 將UGE乘以校正因子Kercc〗實現。在圖中，内部對照基因 132488.doc -110- 200911988 為β-肌動蛋白，且校準子RNA為人類肝臟總RNA (Stratagene，目錄號#735017)。 圖1 3為展示研究中56名患者之人口統計細節、腫瘤階段 及細胞類型之表。所接受之治療循環之中值數為3(範圍： 1-6)。十四名患者（25%)先前接受化學治療，大多數（9名患 者）單獨或與DDP或卡波鉑組合進行紫杉烷治療。56名患 者t 3名接受放射治療且5名患者進行原發腫瘤手術切除。 圖14為展示以下結果之表：與校正ercC 1量高於臨限值 之患者之20.4週之中值生存（95% C.I. 6.9週，33.9週）相 比’校正ERCC1表現量低於該臨限值之患者具有61.6週之 顯著較長中值生存（95% C.I· 42.4週，80.7週）。調整為腫 瘤階段’用於較低或較高ERCc 1表現與整體生存之間的相 關性之對數等級統計為3.97且P值為0.046。未調整對數等 級、’Ό果如該圖所示。亦展示使用Kapian_Meier生存曲線及 對數等級測試之單變數分析中與整體生存顯著相關之因 素。其為治療前體重減輕弋存在及ECog表現情況。患者 年齡（P=0.18)、性別（p=〇.87)、腫瘤階段（P=〇 99)、腫瘤細 胞類型（P=0.63)及胸膜積液之存在（p=〇 71)並非為整體生 存之顯著預後因素。在c〇x比例風險回歸模型多變數分析 中杈正相對ERCC1表現量、EC〇G表現情況及體重減輕 生存之顯著預後因素。在腫瘤階段分層之回歸模 型之p值對於ERCC14〇 〇38，對於體重減輕為〇⑴，且對 於ECOG表現情況（PS 〇與丨或幻為❹〇2。 圖15為說明如何計算相對於内部對照基因之〇叩表現之 132488.doc 200911988 圖。該圖含有由兩個測試樣品（未知1及2)獲得之數據，且 說明如何求出未校正基因表現數據（UGE)UCG。該圖亦說 明如何將由Taqman儀器產生之UGE以先前公開之DpD值標 準化。此係藉由將1；(3£乘以校正因子Kdpd完成。該圖中内 邛對照基因為β_肌動蛋白，且校準子rNA為universal pE RNA(Cat #4307281 ，批號 #3617812〇14 ，AppUed

Biosystems) ° 圖1 6展示各組織類型之標本的相對校正DPD表現量之箱 圖。該等箱展示第25及第75百分位數（四分位數）間距。中 值在各箱中以橫條展示。須展示第25及第75百分位數之外 之含量（但排除邊遠值），該等含量係展示於箱上方。 圖17為展示接受5_FU及奥賽力鉑療法之具有較高（大於 約7.5><1〇3倍爲_肌動蛋白基因表現；n=7)及較低（小於約 7.5x10 3倍β_肌動蛋白基因表現；n=43)校正ts表現量的結 腸直腸腺癌腫瘤攜帶患者之所估算生存概率及生存（以月 計）的曲線。 圖18為展示接受5-FU及奥賽力鉑療法之具有較高（大於 約4.9x10 3倍β-肌動蛋白基因表現；n=1〇)及較低（小於約 4.9x10倍β-肌動蛋白基因表現；n=4〇)校正erccI表現量 的結腸直腸腺癌腫瘤攜帶患者之所估算生存概率及生存 (以月計）的曲線。 圖19為展示接受5-FU及奥赛力鉑療法之具有較高（Ts表 現大於約7.5xl0·3倍β-肌動蛋白基因表現且ErCC1大於約 4.9x10 3倍β-肌動蛋白基因表現；及較低（Ts表現小 132488.doc •112· 200911988 於7.5x1 (Γ3倍β-肌動蛋白基因表現且ERCC1小於約4.9x1 Ο·3 倍β-肌動蛋白基因表現；η=36)校正TS及ERCC1表現量的 結腸直腸腺癌腫瘤攜帶患者之所估算生存概率及生存（以 月計）的曲線。 圖20為展示藉由單變量分析分析的關於ERCC1及TS表現 之奥賽力鉑/5-FU治療結腸直腸癌患者之生存之表。 圖21為展示藉由分層分析分析的關於ercc 1及TS表現之 奥賽力麵/5-FU治療結腸直腸癌患者之生存之表。 圖22為展示以5-FU及奥賽力鉑化學療法治療之結腸直腸 腺癌腫瘤攜帶患者之反應關於ERCC1及TS表現之曲線。將 患者分為具有進行性疾病（PD)、部分反應（PR)及穩定疾病 (SD)之患者。TS與ERCC1表現量均較低之患者具有最佳反 應。 圖23為說明如何計算相對於内部對照基因之ercc 1表現 之圖。該圖含有由兩個測試樣品（未知1及2)獲得之數據， 且說明如何求出未校正基因表現數據（UGE)。該圖亦說明 如何將TaqMan®儀器所產生iUGE以由預_τ叫Man⑧技術測 疋之已知相對ERCC1值標準化。此係藉由將UGE乘以校正 因子KERCC1完成。該圖t内部對照基因為卜肌動蛋白且校 準子RNA為人類肝臟總⑽八⑼如吨㈣，目錄號 #735017)。 圖24為說明如何計算相對於内部對照基因之表現之 圖。該圖含有由兩個測試樣品（未知1及2)獲得之數據，且 說月如何求出未校正基因表現數據（uge)。該圖亦說明如 132488.doc 113· 200911988 何將由Taqman®儀器產生之UGE以先前公開之值標準 化。此係藉由將UGE乘以校正因子&完成。該圖中内部 對”、、基因為β-肌動蛋白且校準子rna為pE RNA(目錄號 #4307281，批號 #3617812〇14，Appiied Biosystems)。 圖25為況明如何计算相對於内部對照基因之表現 之圖Θ圖含有由兩個測試樣品（未知i及2)獲得之數據， 且說月如何求出未杈正基因表現數據（uge)。該圖亦說明 ^何將TaqMan®儀器所產生之刪以自預⑧技術測 疋之已知相對EGFR值標準化。此係藉由將UGE乘以校正 因子KEGFR完成。該圖中内部對照基因為卜肌動蛋白且校 準子RNA為人類肝臟總⑽八⑼如叫㈣，目錄號 #735017)。 圖26為說明如何計算相對於内部對照基因之HER2_n⑶ 表現之圖。該圖含有由兩個測試樣品（未知丨及2)獲得之數 據’且1¾明如何求出未校正基因表現數據㈣幻。該圖亦 說明如何將由Taqman儀器產生iUGE以先前公開之her2_ neU值標準化。此係藉由將UGE乘以校正因子KheR2_完 成。該圖中内部對照基因為p_肌動蛋白且校準子rna為 類肝臟總1^八（81以1&861^，目錄號#73 5017)。 I32488.doc -114- 200911988 序列表

<no>美商雷斯邦司遺傳學公司 <120>自固定樣品中分離長片段RNA之方法 <130> R137 1010PCT <140> 097123508 <141> 2008-06-23 <150> 60/945,785 <151> 2007-06-22 <160> 14 <170〉Patent In Ver‘ 3.3 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213>人工序列 <220> <22.3>人工序列：合成引子之描述 <400> 1 gggaatttgg cgacgtaatt c 21 <210> 2 <211> IS <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列：合成引子之描述 <400> 2 gcggaggctg aggaacag 18 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列：合成引子之描述 <400> 3 cctgtaccag tccaatacca tcct 24 <210〉4 <2Π> 20 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列：合成引子之描述 <400> 4 tcctgctggt ccttcccata 20 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213>人工序列 132488-序列表.doc 200911988 <220> <223>人工序列：合成引子之描述 <400> 5 aggacgcaag gagggtttg <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列：合成引子之描述 <400> 6 gtccgccgag tccttactga <210> 7 <211> 23 <212> DNA <2]3>人工序列 <220> <223>人工序列：合成引子之描述 <400> 7 gaagcctatt ctgcaaagat tgc <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列：合成引子之描述 <400> 8 gagtacccca atcgagccaa a <210> 9 <211> 17 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列：合成引子之描述 <400> 9 ggcctcggtg tgccttt <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213:>人工序列 <220> <223>人工序列：合成引子之描述 <400> 10 gatgtgcgca atcatgtacg t <210> 11 132488-序列表.doc 200911988 <211> 18 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列：合成引子之描述 <400> Π tgcgtctctt gccggaat <210> 12 <2Π> 20 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列：合成引子之描述 <400> 12 ggctcaccct ccagaagctt <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列：合成引子之描述 <400> 13 ctgaactggt gtatgcagat tgc <210> 14 <211> 17 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列：合成引子之描述 <400> 14 ttccgagcgg ccaagtc ί 132488-序列表.doc

Claims (1)

1. 200911988 十、申請專利範圍·· 1 · 一種自固定組織樣品分離長片段RNA之方法，其包含以 下步驟： a) 將該固定組織樣品在提取溶液中加熱至介於約44。〇 至約62 C範圍内之溫度歷時3小時或3小時以上之時段， 其中該提取溶液包含約〇· 1 mM至約20 mM濃度之螯合劑 及蛋白酶K ;及 b) 移除DNA污染；及 f、 c)自該提取溶液分離該RNA。 2. 如凊求項1之方法，其中該加熱係選自由以下溫度範圍 組成之群：自約45°C至約60。(：，自約48°C至約58°C ,自 約48°C至約55t：，自約48t至52°C，及約5(TC。 3. 如凊求項1之方法，其中該加熱係自約5〇_56。〇。 4. 如請求項丨之方法，其中該時段為大於4小時。 5. 如請求項4之方法，其中該時段為大於8小時。 6. 如請求項5之方法，其中該時段為大於12小時。 7. 如請求項ό之方法，其中該時段為大於14小時。 8. 如請求項7之方法，其中該時段為約16小時。 9. 如請求項3之方法，其中該時段為約丨6小時。 1 〇.如明求項丨之方法，其中該螯合劑係選自由以下組成之 =:EDTA、EC5TA、檸檬酸鹽、檸檬酸、水楊酸、水揚 11鄰苯二甲酸、2,4-戊二_、組胺酸、組胺醇二鹽 酸鹽、8-羥基喹啉（8-hydr〇Xyquin〇lines，8_hydr〇xyquin〇_ line)、檸檬酸鹽及鄰_羥基醌。 132488.doc 200911988 11 ·如請求項丨之方法，其中該螯合劑為edta。 12. 如請求項丨之方法，其中該餐合劑為擰檬酸鈉。 13. 如請求項丨之方法，其中該整合劑係以約〇6 mM至約5 〇 mM之濃度存在。 14. 如請求項丨之方法，其中該螯合劑係以約〇 6 mM至約3.6 mM之濃度存在。 15. 如請求項丨之方法，其中該螯合劑係以3 6爪河之濃度存 在。 Γ 16.如請求項11之方法，其中EDTA係以約3,6mM存在。 17. 如請求項12之方法，其中檸檬酸鈉係以約〇6mM至約3 6 mM存在。 18. 如請求項丨之方法，其中移除DNA污染係使用第—及第 本盼心取執行，其中該第二苯紛提取包含離液劑 (chaotr〇pic agent)。 19. 如凊求項i之方法’其中該離液劑係選自由以下組成之 群·尿素、異硫氰酸胍、硫氰酸鈉（NaSCN)、鹽酸胍、 氣化胍、硫氰酸胍、四氯乙酸鋰、高氯酸鈉、四氣乙酸 伽、碟化鉀及三氟乙酸铯。 20. 如請求項丨之方法’其中該離液劑為異硫氰酸胍。 21 ·如請求項丨之方法，其中該固定樣品為經福馬林固定之 石蠟包埋組織樣品。 22.如β求項21之方法，其中該固定福馬林固定之石徵包埋 組織樣品為5年齡或5年齡以下。 23·如凊求項1之方法，其中不使用DNAse。 132488.doc 200911988 24. —種分離長片段rna之方法，其包含以下步驟： a) 將固定組織樣品在提取溶液中加熱至介於約50°C至 約56°C範圍内之溫度歷時約16小時之時段，及 b) 執行至少第一及第二苯酚提取’其中該第二苯酚提 取包含離液劑，及自該提取溶液分離該RNA。 25. —種分離長片段rna之方法，其包含以下步驟： a) 將福馬林固定之石蠟包埋組織樣品在提取溶液中加 熱至介於約45。(：至約62°C範圍内之溫度歷時3小時或3小 時以上之時段；其中該提取溶液包含2.5 mM至約5.0 mM 濃度之螯合劑及每mL 12.5 pg蛋白酶K濃度之蛋白酶κ ; b) 執行至少第一及第二苯酚提取，其中該第二苯酚提 取包含離液劑，及自該提取溶液分離該RNA。 26. —種自福馬林固定之石蠟包埋組織提取長片段rNA之方 法’其包含以下步驟： a) 將固定之石蠟包埋組織樣品在包含約3 · 6 mM濃度之 EDTA或檸檬酸鈉及每mL 12.5 μδ蛋白酶κ濃度之蛋白酶 Κ之提取溶液中加熱至約50°C-56°C之溫度歷時約16小時 之時段；及 b) 執行至少第一及第二苯酚提取，其中該第二苯酚提 取包含離液劑’及自該提取溶液分離該RNA。 27. 如請求項丨之方法，其中該長片段rna之長度長於200個 核苦酸。 28. 如請求項1之方法，其中該長片段rna為300個核苦酸或 300個核苷酸以上。 132488.doc 200911988 29. 如睛求項丨之方法，其中該提取法共分離少於之 DNA。 30. 種長片段RNA，其係由如請求項丨之方法分離。 31. 種cDNA，其係自如請求項3 0之長片段RNA產生。 32_ —種如請求項3〇之RNA之用途，其係用於基因表現分 析。 33. 種測定固疋之石纖包埋組織樣品中標把基因表現量之 方法’其包含： ( 藉由如凊求項1之方法自該組織樣品分離長片段 RNA ； (b)使用能夠擴増料標基因之―區之―對寡核皆酸引 子使該mRNA進行擴增，以獲得擴增之mRNA ;及 W測定該標基因mRNA之量㈣於内部對照基因 mRNA之量。 34. 如請求項33之方法’其中該標乾基因為、μ、 DPD、Hedneu、Gst-pi、RRMwKras。 132488.doc