JP4871722B2 - 固定試料からrnaを調製するための方法および組成物 - Google Patents
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Description
本発明は、一般的に、分子生物学の分野に関する。より具体的には、それは、固定組織から高品質および高収率のRNAを単離するための方法ならびに組成物に関係する。
RNAは、しばしば、固定組織から単離されるが、ホルムアルデヒドの使用のような組織を固定することに関与する過程のせいで、得られるRNAは断片化される。意味のあるRNA試料の研究のために、RNAの完全性が維持されることが必要である。従って、断片化RNAは、例えば、特定の遺伝子の発現レベルについて、分析されたRNAの解釈されるレベルを偏らせる可能性がある。
本発明は、固定された生体試料から核酸、特にRNAを得るための方法および組成物に関する。本発明は、ポリアニオンを含む消化緩衝液または溶液を用いて試料から、完全長および実質的に完全長RNAを含むRNAについて単離、抽出および濃縮することによりRNAを得るために有効である。
本発明は、固定組織から高品質(完全長RNAのような)および高収率でRNAを単離するためにポリカルボン酸の存在下でプロテイナーゼKを用いる最適化された手順を提供することにより、当技術分野において公知であるようなRNA単離の現行の手順の欠点を克服する。
本発明の手順として企図されているような組織試料は、固定組織試料である。用いられうる固定液は、限定されるわけではないが、沈殿剤、または非沈殿剤の固定液を含みうる。2つの一般に用いられる固定剤は、ホルムアルデヒドおよびパラホルムアルデヒドである。しかしながら、他の固定液が、組織試料を固定する際に用いられ、これらは、限定されるわけではないが、酢酸、ホルマリン、四酸化オスミウム、重クロム酸カリウム、三酸化クロム、エタノール、塩化第二水銀、メタノール、グルタルアルデヒド、およびピクリン酸を含む。固定液およびそれらの使用の例は、Sambrook et al. (2000); Maniatis et al. (1989); Ausubel et al. (1994); Jones et al. (1981); 米国特許第5,260,048号、第4,946,669号、第5,196,182号に見出され、それぞれ参照により本明細書に組み入れられている。
消化緩衝液は、細胞の構成要素を分解するために用いられる。固定組織試料は、RNAの抽出および分析の前に消化されうることが、本発明において企図される。これを達成するために、様々な消化緩衝液が用いられ、様々な濃度およびpHの様々な成分が、溶解産物を作製するために消化緩衝液に用いられうる。
本発明はさらに、パラフィン包埋組織からRNAを単離する方法を提供する。全RNAを単離するための多くの方法は、当業者に周知である。例えば、Chomczynski and Sacchi (1987)を参照されたい。この課題を達成するための方法は、全RNAを抽出しうるTrizol試薬(Gibco Life Technologies)の使用を用いる場合がある。Trizol手順は、ブレンダーにおける試料のホモジナイゼーション、続いてフェノールを主成分とするTrizol試薬での抽出を含む。その後、RNAは、イソプロピルアルコールで沈殿し、リボヌクレアーゼを含まない水または0.5% SDSに再溶解される前にエタノールで洗浄される。
A. 固定組織試料由来のRNAの定量化
固定組織試料から得られたRNAは、様々な方法により分析または定量化されて、完全長生成物が得られていることを確かめうる。RNAを定量化または分析する方法が、本明細書に提供されている。RNAを定量化または分析するための一般的な方法は、Sambrook et al. (2000)またはManiatis et al. (1989)に見出されうる。下記に提供されているのは、固定組織試料由来のRNAを用いることについての例であるが、これらの例は、限定を意味するものではない。
本発明は、試料におけるRNAを定量化するための定量的PCR−より具体的には、定量的RT-PCR−に頼る。方法は、半定量的または完全定量的でありうる。
固定組織試料から抽出されたRNAは、変性ゲルシステムを用いるアガロースゲル電気泳動により定量化されうる。いずれの異常な結果も、ゲルに関する問題または分析中のRNAに関する問題に起因しうるため、陽性対照はゲル上に含まれるべきである。RNA分子量マーカー、無傷であることがわかっているRNA試料、または両方は、この目的のために用いられうる。濃縮手順に用いられた出発RNAの試料を含むこともいい考えである。
固定組織試料から抽出されたRNAはまた、キャピラリー電気泳動システムを用いる電気泳動の手順により分析されうる。本発明において、Caliper RNA 6000 LabChip KitおよびAgilent 2100 Bioanalyzerが用いられる。このシステムは、50 ng/μlと250 ng/μlの間の濃度におけるRNA溶液で最も良く実行する。典型的な濃縮されたRNA試料の1 μlを添加することが、通常、優良な実行のために適切である。RNA分析についてRNA 6000 LabChip Kitと共に提供されている使用説明書に従う。
RNAの濃度および純度は、調製物のアリコートをTE(10 mM Tris-HCl、pH 8、1 mM EDTA)または水に希釈し(通常は、1:50〜1:100希釈)、分光光度計において260 nmおよび280 nmで吸光度を読み取ることにより、測定されうる。
蛍光に基づいたアッセイ法もまた、RNAの定量化に用いられうる。例えば、Molecular ProbesのRiboGreen(登録商標)RNA定量化のための蛍光に基づいたアッセイ法は、RNA濃度を測定するために用いられうる。RiboGreen試薬は、核酸を結合するにおいて>1000倍の蛍光増感および高量子収量(0.65)を示し、フルオレセインに近い励起および発光極大値をもつ。結合されていない色素は、本質的に非蛍光性であり、大きな吸光係数をもつ(67,000 cm-1 M-1)。RiboGreenアッセイ法は、標準蛍光計、フィルター蛍光計、または蛍光マイクロプレートリーダーにおいて、1.0 ng/ml RNAほどの検出を可能にする−臭化エチジウムで達成される感度を200倍、上回る。RiboGreen試薬についての直線定量化範囲は、RNA濃度において3桁に及ぶ。
固定組織から得られたRNAは、マイクロアレイテクノロジーを用いて分析されうる。例えば、遺伝子アレイのようなアレイは、遺伝子特異的プローブのコレクションが定められた位置にスポットされている固体支持体である。プローブは、RNA試料のような核酸試料の集団からハイブリダイゼーションにより相補的な標識された標的を限局化する。遺伝子アレイについての最も一般的な使用の一つは、RNA集団の全体的な発現パターンの比較である。典型的には、2つまたはそれ以上の組織試料から単離されたRNAが用いられうる。RNAは、標識されたcDNA集団を産生するために、標識ヌクレオチドおよび標的特異的、オリゴdT、またはランダム配列のプライマーを用いて逆転写される。cDNAは、鋳型RNAから変性され、同一のアレイにハイブリダイズする。各アレイにおけるハイブリダイズしたシグナルは、検出および定量化される。各遺伝子特異的スポットから放射されるシグナルは、集団間で比較される。試料における異なるレベルで発現された遺伝子は、異なる量の標識cDNAを生成し、これは、結果として、異なる量のシグナルをもつアレイ上のスポットを生じる。
本発明のさらなる態様において、固定組織試料からの完全長RNAの単離のためのキットが提供されている。本明細書に記載された組成物のいずれかがキットに含まれうる。非限定的例において、組織試料を固定する、固定組織試料からRNAを消化および抽出するため、ならびに得られたRNAを分析または定量化するための試薬がキットに含まれうる。従って、キットは、適切な容器手段に、本明細書に開示された試薬のいずれかを含む。それはまた、消化緩衝液または抽出緩衝液のような1つまたは複数の緩衝液、および結果生じたRNAを単離するための成分を含みうる。組織を固定するための試薬および組織を包埋するための試薬もまた、キットに含まれうる。
以下の実施例は、本発明の好ましい態様を実証するために含まれる。後に続く実施例に開示された技術は、本発明の実施において十分機能しうる、本発明者らにより発見された技術を代表しており、従って、その実施についての好ましい様式を構成するとみなされうることは、当業者により理解されるべきである。しかしながら、当業者は、本開示を鑑みれば、多くの変化が、開示されている特定の態様においてなされ、かつなお、本発明の真意および範囲から逸脱することなく、同様のまたは類似した結果を得ることができることは、認識すべきである。
手順
RNAを含む組織の固定化
2つの固定剤、ホルムアルデヒドおよびパラホルムアルデヒドが試験された。パラホルムアルデヒドは、リン酸緩衝食塩水(PBS、50 mM リン酸Na緩衝液、pH 7.5、150 mM NaCl)中に4% 最終濃度で用いられ、ホルムアルデヒドは、類似した緩衝液(「10% 中性緩衝ホルマリン」、NBF、Protocol(商標)Formalin(カタログ番号305-510)、Fisher Diagnostics, Middletown, VAから)中に3.7% 最終濃度で用いられた。いずれの固定液についても、用いられた固定手順は、特定された時間の間、0〜8℃で、屠殺されたばかりのマウスから切除された組織の試料を浸漬することを必要とした。固定の時間は、各試料において特定される。試料は、固定液中に保存されるか、または標準方法においていくつかの変化のエタノールおよびキシレンの通過後、パラフィンブロックへ移されるかのいずれかであった。組織試料は、以下の溶液において脱水された:
i) 70% エタノール 1時間、
ii) 80% エタノール 1時間、
iii) 90% エタノール 1時間、
iv) 100% エタノール(I) 2時間、
v) 100% エタノール(II) 2時間、
vi) 100% エタノール(III) 一晩。
この手順後に、以下の溶液中における組織のクリアリングおよび包埋の段階が続いた:
i) エタノール/キシレン(1:1) 1時間、
ii) キシレン 2時間、
iii) キシレン 2時間、
iv) キシレン/パラフィン(1:1、55〜60℃) 2時間、
v) パラフィン;55〜60℃ 2時間、
vi) パラフィン;55〜60℃ 2時間、
vii) パラフィン;55〜60℃ 1時間。
最終段階は、パラフィン型におけるパラフィンでのブロックの包埋を含んだ。これは、試料が少なくとも半年間、安定であることを可能にした。
パラフィンからの抽出について、組織は、50℃で5分間、2つの変化のキシレンに浸漬され、その後、試料は、消化緩衝液中に置かれた。固定液にまだ保存された組織について、試料は、以下のとおり、一連のエタノール溶液に浸漬された:組織は、氷上であらかじめ冷却された30% EtOHの2〜5 ml中へ置かれ(より大きい組織は5 mlを必要とする)、氷上で10 min、インキュベートされ、その後、氷上であらかじめ冷却された40% EtOHの同じ容量へ移され、さらに10 min、氷上でインキュベートされた。この過程は、10%増加していく増加量のEtOHで、100%に達するまで繰り返された。組織は、4℃で少なくとも一晩、100% EtOHに浸漬された。最終段階において、組織は、溶液(EtOH、ホルマリン、またはキシレン)から取り出され、ペーパータオル上で乾燥させられた。その後、組織試料は、200 mM TrisCl、pH 7.5、200 mM NaCl、10 mM クエン酸Na、2% SDSおよび0.5 mg/ml PKを含む消化緩衝液へ移された。
電気泳動によるRNAの分析
RNA試料は、2つの異なる電気泳動手順により調べられた。第一は、エチジウム染色パターン、および特定のmRNA(具体的には、GAPDHおよびβ-アクチン)についての目立たないバンドの存在について探索しうるノーザンブロットを作成する能力の両方を提供するアガロースゲルシステム(NorthernMax Gly, Ambion)であった。第二は、キャピラリー電気泳動システム(2100 Bioanalyzer, Agilentで用いられるRNAチップ、Caliper Technologies Corp.)であった。この分析は、下記で考察された実施例に関して適用された。
定量的RT-PCR(リアルタイムまたはQRT-PCR)によるRNAの分析
特定のmRNAの存在は、定量的またはリアルタイムRT-PCRの使用を通して定量化された(Higuchi et al., 1993; Bustin, 2000)。実際の増幅反応中に特定のmRNAについて最初に鋳型にされたPCR産物の存在をモニターすることにより、異なる試料におけるこれらの特定のmRNAの相対的レベルが確かめられた。本研究について、4つのmRNA、GAPDH、Recc1、FASおよびDDPKが標的にされた。それぞれについて、以下のRT-PCRプライマーおよびプローブが用いられた。
;プライマー−フォワード:
およびリバース:
Recc1−マウス複製因子C(Recc1)、mRNA;アクセッション番号NM_011258;単位複製配列−83 nt;mRNAサイズ−4.68 kb;mRNAにおける標的領域:2122〜2204;プローブ2156〜2176
;プライマー−フォワード:
およびリバース:
FAS−マウス脂肪酸シンターゼ(Fasn)、mRNA;アクセッション番号NM_007988;単位複製配列−122 nt;mRNAサイズ−8.36 kb;mRNAにおける標的領域:6857〜6978;プローブ6915〜6937
;プライマー−フォワード:
およびリバース:
DDPK−マウスプロテインキナーゼ、DNA活性化、触媒ポリペプチド(protein kinase, DNA activated, catalytic polypeptide)(Prkdc)、mRNA;アクセッション番号NM_011159;単位複製配列−127 nt;mRNAサイズ−12.65 kb;mRNAにおける標的領域:3101〜3227;プローブ3157〜3179
;プライマー−フォワード:
およびリバース:
固定マウス肝臓の消化の経時変化
消化は、27日間固定されたマウス肝臓試料上で行われた。消化は、50℃で標準条件に従って行われ、200 μl アリコートがさまざまな時間に取り出され、前に記載されているようにRNAについて抽出された。各時点からの等価量のRNA試料が、その後、Agilent Bioanalyzer 2100 RNAチップ上で電気泳動により分析され、分光光度法で定量化された。2100 RNAチップデータは、全RNA質量の定量化を可能にし、それは、各試料のOD260から計算されたものと比較された。図1は、両方のこれらの手順により測定されている質量のゆるやかな増加を示している。試料の質量は、2時間まで急速に上昇し、その後、3〜5時間、よりずっとゆるやかに増加した。7時間および一晩(o/n)消化時間の両方は、RNAの余分の量を与えているように思われる。しかしながら、これらの試料の等価量(増加する質量入力を示す)が、GAPDH、FAS、Recc1およびDDPKについてqRT-PCRにかけられた場合、サイクル閾値が各試料について消化の時間に対してプロットされている図2に示されているように、サイクル閾値は、それに応じて下降しなかった。消化の経過中、生存可能な鋳型mRNAの収量における漸増的増加のみが3時間後に得られることは明らかである。この平坦相中、遺伝子間のΔCtが比較的一定にとどまっていることも注目され、消化の時間は、様々な遺伝子の集団的表示にほとんど影響を及ぼさなかったことを示している。
手順の比較
Masuda et al. (1999)は、MgCl2を含むプロテイナーゼK消化溶液を含み、有機抽出およびエタノール沈殿を用いて終結させた、それらの手順を用いて固定試料から完全長RNA(電気泳動ゲル上のrRNAバンドの存在から判断される)を得ることができることを報告した。従って、14週間、固定されていたマウス肝臓について、上記のようにクエン酸Naの存在下でタンパク分解性消化を行い、固相抽出段階で終わる本発明の手順は、Masuda et al. (1999)に記載された寸分違わない手順と比較された。組織は、切り刻まれて、消化溶液においてホモジナイズされ、消化条件は、各手順により特定されているように従った−Masuda手順について45℃で1時間、および本発明について50℃で4時間。消化後、RNAは、各手順により特定されているように、有機または固相抽出により抽出され、Masuda調製物からのエタノールペレットは、本発明の手順において溶出するために用いられたのと同じ容量(60 μl)に再溶解された。各試料について、等容積量(組織の等価質量からの)を用いる、エチジウム染色ゲル上およびAgilent Bioanalyzer 2100 RNAチップ電気泳動方法により、二連で調べられた。Bioanalyzerエレクトロフェログラムは、図3に示されている。RNAqueous方法により得られた組織の非固定試料由来のRNAのプロファイルが、参照を提供するために同様に示されている。上方の分子量範囲における物質の存在が、非固定および本発明の試料の両方において明らかであり、標準プロファイルに見られたrRNAピークに類似しているピークが試料にあることを見ることができる。
異なる温度におけるクエン酸塩対Mg ++ の効果
同一の成分を含む2つの消化緩衝液(200 mM TrisCl、pH 7.5;200 mM NaCl;2% SDS;0.5 mg/ml PK)は、さらに、1.5 mMでのMgCl2かまたは10 mMでのクエン酸Naのいずれかを有するように作製された。同じ固定されたマウス肝臓の別々の小片が、これらの緩衝液のいずれかへ入れられ、ホモジナイズされ、その後、それぞれは、3つの部分に分割され、3つの異なる温度、42℃、50℃および65℃、で4時間、インキュベートされた。消化段階後、RNAは、上記の固相方法により抽出された。
異なるpHにおける消化の効果
TrisCl以外のすべての成分が標準緩衝液(200 mM TrisCl、pH 7.5;200 mM NaCl;10 mM クエン酸Na、2% SDS;0.5 mg/ml PK)におけるのと同じである、2つの追加の消化緩衝液が作製された。これらの2つは、pH 7.5での200 mM TrisClを、pH 9.0での200 mM TrisClまたはpH 6.0での200 mM MES(Na+)と置き換えられ、pH 6、pH 7.5、またはpH 9における選択的消化緩衝液を供給した。同じ固定されたマウス腎臓試料の3つの小片が分けられ、これらの3つの消化溶液のそれぞれへホモジナイズされ、その後、50℃でインキュベートされた。試料は、4時間目および一晩のインキュベーション後、取り出され、RNAは、記載されているようにガラス繊維フィルターを通して抽出された。試料は、質量収量のアガロースゲル、Bioanalyzer 2100 RNAチップおよびOD260測定により調べられた。pH 6試料はすぐに分解したが、pH 7.5およびpH 9の試料は、4時間目において同程度であったが、一晩インキュベーション後、pH 9は、目に見えるほど、より分解された。OD260およびAgilent Bioanalyzerデータからの質量収量もまた、pH 7.5が最適であることを示した(図5)。
消化におけるNaClの効果
NaCl以外のすべての成分が標準緩衝液(200 mM TrisCl、pH 7.5;200 mM NaCl;10 mM クエン酸Na、2% SDS;0.5 mg/ml PK)におけるのと同じである、3つの追加の消化緩衝液が作製された。追加の緩衝液は、200 mM NaClを100 mM、400 mM、または塩なしと置き換えられた。固定されたマウス肝臓試料の4つの小片が、これらの消化緩衝液のそれぞれにおいて別々にホモジナイズされ(同じ最終の組織:緩衝液比で)、試料は50℃でインキュベートされた。特定の時間において、各消化物の等しいアリコートが取り出され、RNAが記載されているようにガラス繊維フィルターを通して抽出された。試料は、アガロースゲル電気泳動により調べられ、RNAの品質は、試料間で有意に異なるようには思われなかったが、ゼロの塩の試料は、可視の生成物を示さなかった。すべての試料は、組織の1グラムあたりのRNAの質量収量を導き出すOD260測定により定量化された。これは、図6に示され、いくらかのNaClはRNAの優れた抽出に必須であるが、塩含有緩衝液のいずれについても収量間の差は極小であることを示している。得られたRNAの品質への可能性のある効果を見るために、2つの最良の濃度、0.2 Mおよび0.4 M NaClが選択され、2時間、3時間、および4時間の時点が、上記のようにqRT-PCRにより測定されているように、Recc1およびFAS RNAのレベルについて調べられた。このデータは、図7に示されており、これらの2つの濃度間の効果をほとんど示さないが、0.2 Mが、わずかに有利である可能性がある。
クエン酸塩の代替
クエン酸Naは、トリカルボン酸、クエン酸のナトリウム塩である。複数の酸性基の存在を有する他の一般的に用いられる試薬もまた、それらもまたこの増強を与えうるかどうかを見るために試験された。9つの化合物が選択された:トランス-アコニット酸;1,2,4-ブタントリカルボン酸;1,4-シクロヘキサンジカルボン酸;1,2,3,4,5,6-シクロヘキサンヘキサカルボン酸;1,3,5-シクロヘキサントリカルボン酸;イソクエン酸;トリカルバリル酸;コハク酸;およびグルタル酸。消化溶液は、クエン酸Naなしに作製され(200 mM TrisCl、pH 7.5;200 mM NaCl;2% SDS;0.5 mg/ml PK)、固定されたマウス肝臓の小片が、この溶液にホモジナイズされた。ホモジネートは、その後、10個のアリコートへ分割され、それぞれの10分の1容量が、試験されるべきポリ酸の1 M ストックを添加された。すべての試料は、50℃で4時間、インキュベートされ、その後、通常の手順においてのようにRNAについて準備された。これらの試料のそれぞれは、Bioanalyzer 2100において収量および出現の両方について調べられた。以下の表は、クエン酸塩試料と比較したそれらの出現の評価、加えてそれぞれの質量収量を与える。
パラフィン包埋組織
3ヶ月間、固定されたマウス肝臓および腎臓組織の試料は、上記のようにパラフィンブロックへ変えられた。これらの試料は、かみそりで切り刻まれ、以下の3つの異なる方法で消化溶液にホモジナイズされた:パラフィンで覆われた小片の直接的ホモジナイゼーションによる;50℃でのキシレンの2回の5 min 浸漬で脱パラフィンされた小片のホモジナイゼーションによる;および50℃で20 min キシレン浸漬での脱パラフィン、続いて無水エタノール中での3 min 浸漬でのエタノールへの移動による。すべての3つの手順は、各組織についての分析を受け入れられるRNAを与える。マウス心臓、脳、精巣、肺、骨格筋、および脾臓の固定試料も、上の実施例で実証されている肝臓および腎臓と同様に、この手順に用いることに成功した。
クエン酸塩濃度およびSDSの効果
標準プロトコールのとおり、4つのマウス肝臓が採取され、NBF中に24時間、固定され、パラフィンに包埋された。パラフィンでの1週間後、各肝臓は、過剰パラフィンを削り取り、その後液体窒素下で徹底的に破砕された。パラフィン/組織粉末は、完全にパラフィンを除去するために、2回のキシレン浸漬および2回のエタノール浸漬を受け、その後、第二のエタノールスラリーが、チューブあたり〜100 mg 組織で9つのチューブへ分配され、組織はペレットにされて、過剰なエタノールは、消化媒体を添加する前に除去された。消化は、pH 7.5での200 mM TrisClを加えた上の緩衝液のそれぞれにおける0.5 mg/ml プロテイナーゼKで、50℃で3時間であった。
Claims (23)
- 以下の段階を含む、固定組織試料からRNAを単離するための方法:
(a)固定組織試料を、溶解産物を作製するために、タンパク質を消化する時間の間、ポリアニオンおよびプロテアーゼを含む消化緩衝液と接触させる段階;
(b)最大2Mのグアニジニウム濃度を得るために溶解産物にグアニジニウムを添加する段階;ならびに
(c)グアニジニウムを含む溶解産物からRNAを抽出する段階、
ここで、ポリアニオンはポリカルボキシレートを含み、かつポリカルボキシレートは、クエン酸ナトリウム、1,4-シクロヘキサンジカルボン酸、1,3,5-シクロヘキサントリカルボン酸、イソクエン酸、およびコハク酸からなる群より選択される。 - 消化緩衝液が、500 μg/mlのプロテイナーゼKと共に、5%までのSDS、200 mM TrisCl、pH 7.5、200 mM NaCl、および100 mMまでのクエン酸ナトリウムを含む、請求項1記載の方法。
- 消化緩衝液におけるポリアニオンの濃度が1 mMと100 mMの間である、請求項1記載の方法。
- 消化緩衝液がNaCl、LiCl、またはKClをさらに含む、請求項1記載の方法。
- 消化緩衝液におけるプロテアーゼがプロテイナーゼKを含む、請求項1記載の方法。
- 消化緩衝液のpHが7.0と9.5の間である、請求項1記載の方法。
- 固定組織試料および消化緩衝液の比率が、1グラムの組織/5 ml 消化緩衝液から1グラムの組織/25 ml 消化緩衝液までである、請求項1記載の方法。
- 接触させる段階が40℃と55℃の間の温度である、請求項1記載の方法。
- グアニジニウムを含む溶解産物からRNAを抽出する段階が以下の段階を含む、請求項1記載の方法:
(d)グアニジニウムを含む溶解産物へアルコール溶液を添加する段階;
(e)アルコールを含む溶解産物を無機物支持体に適用する段階;および
(f)RNAを無機物支持体から溶出溶液で溶出する段階。 - 溶解産物が適用された後、無機物支持体を洗浄する段階をさらに含む、請求項9記載の方法。
- 無機物支持体がガラス繊維フィルターまたはガラス繊維カラムを含む、請求項9記載の方法。
- 溶出溶液がEDTAを含む、請求項9記載の方法。
- 溶出溶液が80℃と100℃の間の温度である、請求項9記載の方法。
- アルコールを含む溶解産物へ1つまたは複数の塩を添加する段階をさらに含む、請求項9記載の方法。
- ナトリウム塩をグアニジニウムを含む溶解産物へ添加する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
- RNAが、フェノールを含む溶液を用いて溶解産物から抽出される、請求項1記載の方法。
- 増幅反応を用いて溶解産物から抽出されたRNAの量を定量化する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 抽出されたRNAからcDNA分子を生成する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 固定組織試料がパラフィンに包埋される、請求項1記載の方法。
- 試料からパラフィンを抽出する段階をさらに含む、請求項19記載の方法。
- 以下の段階を含む、固定組織試料由来の完全長RNAの量を測定するための方法:
(a1)固定組織試料を、溶解産物を作製するために、タンパク質を消化する時間の間、クエン酸ナトリウム、1,4-シクロヘキサンジカルボン酸、1,3,5-シクロヘキサントリカルボン酸、イソクエン酸、およびコハク酸からなる群より選択されるポリカルボキシレートおよびプロテアーゼを含む消化緩衝液と接触させる段階;
(a2)最大2Mのグアニジニウム濃度を得るために溶解産物にグアニジニウムを添加する段階;ならびに
(b)グアニジニウムを含む溶解産物へアルコール溶液を添加する段階;
(c)アルコールを含む溶解産物を無機物支持体に適用する段階;
(d)完全長RNAを無機物支持体から溶出溶液で溶出する段階;ならびに
(e)溶出されたRNAを増幅する段階。 - 以下のものを含む、固定組織試料から完全長RNAを単離するためのキット:
(a)溶解産物を作製するための、クエン酸ナトリウム、1,4-シクロヘキサンジカルボン酸、1,3,5-シクロヘキサントリカルボン酸、イソクエン酸、およびコハク酸からなる群より選択されるポリカルボキシレートおよびプロテアーゼを含む消化緩衝液;ならびに
(b)ガラス繊維フィルターまたはガラス繊維カラム。 - 消化緩衝液が以下のものを含む、請求項22記載のキット:5%までのSDS、200 mM TrisCl、pH 7.5、200 mM NaCl、100 mMまでのクエン酸ナトリウム、および500 μg/mlのプロテイナーゼK。
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