CN114426970A - 一种适合杨树rna的提取方法 - Google Patents
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Abstract
一种适合杨树RNA的提取方法，涉及一种适合杨树RNA的提取方法。为了解决现有的杨树的RNA的提取方法无法获得高质量杨树RNA的问题。本发明适合杨树RNA的提取方法按照以下步骤进行：石英砂加入液氮预冷并加入新鲜杨树嫩叶，迅速用液氮充分研磨粉碎，加入裂解缓冲液，加入抽提缓冲液A或抽提缓冲液B，剧烈震荡、冰浴、离心，取上清液，加入沉淀液，丢弃上清液，乙醇洗沉淀，离心，挥发乙醇，DEPC水溶解沉淀，即完成。本发明能够显著提高细胞破碎率，提高RNA的产率，保证了提取的RNA质量。
Description
技术领域
本发明涉及一种适合杨树RNA的提取方法。
背景技术
杨树为高大乔木，是我国主要的造林树种，全球共有100余种，我国约50种(不包括人工杂种和引入种)。在我国分布广泛具有抗逆性强，丰产性强，木材成熟期早生长迅速等优点。近年来大们对杨树的研光越来越深入，随着杨树基因组全学列的公布，人们开始着眼于从分子水平上进上研究杨树功能基因，杨树也就成了树木研究的模式植物，对于cDNA文库构建，RACE、DDRT-PCR、基因芯片研究来说，从杨树中分离出高质量的RNA 就显得尤为重要。
杨树细胞壁内含大量的木质素，纤维素，导致材料坚硬不易破碎；细胞内多酚，单宁，蛋白含量高，多糖等次生代谢物质丰富。这些特征对RNA提取造成不利影响，如细胞破碎不彻底会影响RNA的产率，多酚的氧化产物能与RNA形成不可逆结合，并与RNA形成共沉淀，多糖与RNA理化性质相似容易与RNA共沉淀，蛋白和次生代谢物质不彻底去除将影响RNA提取的质量，这些都干扰后续实验正常进行，这就为杨树RNA提取带来了巨大困难，用常规的方法和经典的进口试剂盒都无法达到分离高质量杨树RNA的目的。
发明内容
本发明为了解决现有的杨树的RNA的提取方法无法获得高质量杨树RNA的问题，提出一种从杨树材料中得到高质量的RNA的适合杨树RNA的提取方法。
本发明适合杨树RNA的提取方法按照以下步骤进行：
一、称取0.1g石英砂放入的研钵中，加入液氮预冷；
二、取0.1g新鲜杨树嫩叶，迅速用液氮充分研磨粉碎，加入700μL裂解缓冲液，加入500μL抽提缓冲液A或抽提缓冲液B，在振荡器中剧烈震荡5-10s，至充分混匀，冰浴 15min，在12000rpm下离心10min，取上清液，加入上清液1/4体积的沉淀液，进行沉淀 20min，在10000rpm下离心10min，丢弃上清液；
三、用1ml 70％乙醇洗沉淀，在13000rpm下离心5min，丢弃上清液；
四、静置挥发乙醇24min，用DEPC水溶解沉淀，即完成，所得产物即可进行电泳检测。
本发明能够显著提高细胞破碎率，高效的分离杨树RNA，提高RNA的产率，细胞内多酚、单宁、蛋白和次生代谢物质能够彻底去除，避免了干扰，保证了提取的RNA质量。本发明杨树RNA的提取工艺操作方便、成本低、周期短、实用性强、效果好等优势。
附图说明
图1是实施例1中的琼脂糖凝胶电泳图片。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意合理组合。
具体实施方式一：本实施方式适合杨树RNA的提取方法按照以下步骤进行：
一、称取0.1g石英砂放入的研钵中，加入液氮预冷；
二、取0.1g新鲜杨树嫩叶，迅速用液氮充分研磨粉碎，加入700μL裂解缓冲液，加入500μL抽提缓冲液A或抽提缓冲液B，在振荡器中剧烈震荡5-10s，至充分混匀，冰浴 15min，在12000rpm下离心10min，取上清液，加入上清液1/4体积的沉淀液，进行沉淀 20min，在10000rpm下离心10min，丢弃上清液；
三、用1ml 70％乙醇洗沉淀，在13000rpm下离心5min，丢弃上清液；
四、静置挥发乙醇24min，用DEPC水溶解沉淀，即完成，所得产物即可进行电泳检测。
本实施方式能够显著提高细胞破碎率，高效的分离杨树RNA，提高RNA的产率，细胞内多酚、单宁、蛋白和次生代谢物质能够彻底去除，避免了干扰，保证了提取的RNA 质量。本实施方式杨树RNA的提取工艺操作方便、成本低、周期短、实用性强、效果好等优势。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：所述裂解缓冲液由4M异硫氢酸胍、1M醋酸钾、0.05M硼砂、1％十二烷基肌酸钠、2％p-羟基乙醇，10mMEDTA 组成。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：所述抽提缓冲液A的制备方法为：将苯酚、氯仿、异戊醇以摩尔比为25:24:1的比例混合，然后加入2％质量的CTAB。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：所述抽提缓冲液 B的制备方法为：：将氯仿、异戊醇以摩尔比为49:1比例混合，然后加入2％质量CTAB。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：所述沉淀液为10M的LiCl。本申请中M为mol/L。
实施例1：
本实施例适合杨树RNA的提取方法按照以下步骤进行：
一、称取0.1g石英砂放入的研钵中，加入液氮预冷；
二、取0.1g新鲜杨树嫩叶，迅速用液氮充分研磨粉碎，加入700μL裂解缓冲液，加入500μL抽提缓冲液A，在振荡器中剧烈震荡5-10s，至充分混匀，冰浴15min，在12000rpm 下离心10min，取上清液，加入上清液1/4体积的沉淀液，进行沉淀20min，在10000rpm 下离心10min，丢弃上清液；所述裂解缓冲液由4M异硫氢酸胍、1M醋酸钾、0.05M硼砂、1％十二烷基肌酸钠、2％p-羟基乙醇，10mMEDTA组成。所述抽提缓冲液A的制备方法为：将苯酚、氯仿、异戊醇以摩尔比为25:24:1的比例混合，然后加入2％质量的CTAB。
三、用1ml 70％乙醇洗沉淀，在13000rpm下离心5min，丢弃上清液；所述沉淀液为10M的LiCl。
四、静置挥发乙醇24min，用DEPC水溶解沉淀，即完成，所得产物即可进行电泳检测。
本实施例能够显著提高细胞破碎率，高效的分离杨树RNA，提高RNA的产率，细胞内多酚、单宁、蛋白和次生代谢物质能够彻底去除，避免了干扰，保证了提取的RNA质量。本发明杨树RNA的提取工艺操作方便、成本低、周期短、实用性强、效果好等优势。图1是实施例1中的琼脂糖凝胶电泳图片。将获得的RNA进行微量紫外分光光度计测定 OD值以及琼脂糖凝胶电泳检测。从分光光度计测定的结果及琼脂糖凝胶电泳结果进行比对，本实施例结果提取到的RNA量在1200μg/mL以上，同时A260/A230进行测定，结果为1.9。A260/A280结果为1.8。
Claims (5)
1.一种适合杨树RNA的提取方法，其特征在于：适合杨树RNA的提取方法按照以下步骤进行：
一、称取0.1g石英砂放入的研钵中，加入液氮预冷；
二、取0.1g新鲜杨树嫩叶，迅速放入研钵中用液氮充分研磨粉碎，加入700μL裂解缓冲液，加入500μL抽提缓冲液A或抽提缓冲液B，在振荡器中剧烈震荡5-10s，至充分混匀，冰浴15min，在12000rpm下离心10min，取上清液，加入上清液1/4体积的沉淀液，进行沉淀20min，在10000rpm下离心10min，丢弃上清液；
三、用1ml 70％乙醇洗沉淀，在13000rpm下离心5min，丢弃上清液；
四、静置挥发乙醇24min，用DEPC水溶解沉淀，即完成，所得产物即可进行电泳检测。
2.根据权利要求1所述的适合杨树RNA的提取方法，其特征在于：所述裂解缓冲液由4M异硫氢酸胍、1M醋酸钾、0.05M硼砂、1％十二烷基肌酸钠、2％p-羟基乙醇，10mMEDTA组成。
3.根据权利要求1所述的适合杨树RNA的提取方法，其特征在于：所述抽提缓冲液A的制备方法为：将苯酚、氯仿、异戊醇以摩尔比为25:24:1的比例混合，然后加入2％质量的CTAB。
4.根据权利要求1所述的适合杨树RNA的提取方法，其特征在于：所述抽提缓冲液B的制备方法为：：将氯仿、异戊醇以摩尔比为49:1比例混合，然后加入2％质量CTAB。
5.根据权利要求1所述的适合杨树RNA的提取方法，其特征在于：所述沉淀液为10M的LiCl。本申请中M为mol/L。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20220503 |
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |