CN102115742A

CN102115742A - 一种植物中总核酸的同步提取方法

Info

Publication number: CN102115742A
Application number: CN 201010585828
Authority: CN
Inventors: 章镇; 张计育; 乔玉山; 王三红; 高志红; 渠慎春; 陶建敏; 蔡斌华; 徐长宝
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2010-12-14
Filing date: 2010-12-14
Publication date: 2011-07-06

Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了一种植物中总核酸的同步提取方法。将生物材料粉碎后与CTAB裂解液混合，水浴45-60min，加入与CTAB裂解液等体积的由氯仿和异戊醇组成的混合试剂，混匀；离心，取上清，加入等体积的由水饱和酚、氯仿及异戊醇组成的混合试剂，混匀；离心，取上清，加入1/30体积的NaAc和1/10体积的无水乙醇，混匀，在冰上静置5min后，再加入等体积的由氯仿和异戊醇组成的混合试剂；离心，取上清，加入1/10体积的NaAc和两倍体积的无水乙醇，-20℃静置1h；离心，弃上清，用70％的乙醇洗涤沉淀1～5次，干燥得到包含基因组DNA和总RNA的总核酸。该发明同步提取烟草总核酸，对于今后开展基因克隆、表达分析等一系列分子生物学研究具有非常重要的意义。

Description

一种植物中总核酸的同步提取方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种植物中总核酸的同步提取方法，具体涉及一种从烟草叶片中同步提取基因组DNA和总RNA的方法。

背景技术

基因组DNA以及总RNA提取的质量，在植物分子生物学研究中具有重要的作用，关系到后续分子生物学研究的成功与否，如基因的克隆、基因上游启动子序列的分离、southern印迹分析、表达特性的研究等。烟草叶片中的蛋白质、糖类、色素、烟碱、酚类等物质含量较高，在基因组DNA和总RNA的提取过程中，这类物质常与核酸形成复合物，使核酸在这种粘稠的胶状物中难以溶解且产生程度不同的褐变，并且这些物质容易与核酸共沉淀，使提取的核酸中含有蛋白和多糖类物质，对后续研究造成干扰。目前，关于植物基因组DNA的提取方法主要有试剂盒法和CTAB法，总RNA提取的方法有商业试剂盒、Trizol法、CTAB法、SDS法和热硼酸盐法等。虽然植物基因组DNA和总RNA提取的技术已经非常的成熟，但是大多都只是在植物中分别进行提取这两种核酸，对于从植物中同步提取DNA和RNA较少，并且采用的都是两步沉淀法，先沉淀RNA后，再沉淀DNA，耗时较长。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种植物中总核酸的同步提取方法。

本发明的另一目的是提供一种植物中基因组DNA的提取方法。

本发明的又一目的是提供一种植物中总RNA的提取方法。

一种植物中总核酸的同步提取方法，将生物材料粉碎后与2％CTAB裂解液混合，65℃水浴45-60min，加入与所述的2％CTAB裂解液等体积的由氯仿和异戊醇组成的混合试剂，上下颠倒混匀；离心，取上清，加入与上清液等体积的由水饱和酚、氯仿及异戊醇组成的混合试剂，上下颠倒混匀；离心，取上清，加入1/30上清液体积的NaAc和1/10上清液体积的无水乙醇，上下颠倒混匀，在冰上静置5min后，再加入与上清液等体积的由氯仿和异戊醇组成的混合试剂；离心，取上清，加入1/10上清液体积的NaAc和两倍上清液体积的无水乙醇，-20℃静置1h；离心，弃上清，用70％的乙醇洗涤沉淀1～5次，室温干燥，得到包含基因组DNA和总RNA的总核酸。

其中，所述的由氯仿和异戊醇组成的混合试剂中氯仿和异戊醇的体积比为20～30∶1，优选24∶1。

所述的由水饱和酚、氯仿及异戊醇组成的混合试剂中水饱和酚、氯仿及异戊醇的体积比为20～28∶20～28∶1，优选25∶24∶1。

所述的生物材料粉碎是通过在液氮中将生物材料研磨成粉末，所述的离心条件为8000～12000rpm，8～15分钟。

所述的植物优选果树或烟草，进一步优选烟草。

一种植物中基因组DNA的提取方法，包括如下步骤：

(1)按照上述植物中总核酸的同步提取方法提取植物中的总核酸；

(2)取步骤(1)提取的总核酸，按照常规方法进行RNA的消化，得到所述的基因组DNA。

其中，所述的由氯仿和异戊醇组成的混合试剂中氯仿和异戊醇的体积比为20～30∶1，优选24∶1；所述的由水饱和酚、氯仿及异戊醇组成的混合试剂中水饱和酚、氯仿及异戊醇的体积比为20～28∶20～28∶1，优选25∶24∶1。

所述的常规消化RNA的方法优选佟兆国，王富荣，章镇，等.一种从果树成熟叶片提取DNA的方法[J].果树学报，2008，25(1)：122～125。

一种植物中总RNA的提取方法，其特征在于包括如下步骤：

(2)取步骤(1)提取的总核酸，按照常规方法进行DNA的消化，得到所述的总RNA。

本发明核酸同步提取方法的原理如下：

在提取植物DNA时，用的较多的是Tris平衡酚(pH＞7.8)，提取RNA时，用的较多的是水饱和酚(pH＝4.5)，水饱和酚可以溶解DNA，可以使提取的RNA中没有DNA的污染，但是实验中发现，水饱和酚只能去除少量或者很少量的DNA。同时，实验还发现水饱和酚去除多糖、蛋白、酚类物质的效果较好于Tris平衡酚。现有技术中常使用LiCl选择性的沉淀核酸中的RNA，本发明选用1/3体积的NaAc和2倍体积的无水乙醇既可以沉淀DNA，又可以沉淀RNA。烟草叶片中的蛋白质、糖类等物质含量较高，加入1/30体积的NaAc和1/10体积的无水乙醇可以有效地去除烟草中含有较多的多糖、蛋白类物质。另外，在DNA的提取过程中，不能剧烈震荡，防止DNA的断裂，本研究没有进行剧烈的涡旋混匀，而是采取上下颠倒混匀的方法。

有益效果：

本发明利用改进的CTAB法同步提取烟草叶片总核酸(即基因组DNA和总RNA)，与传统的分别提取基因组DNA或总RNA法相比，该方法可以同时提取基因组DNA和总RNA，不仅节约了时间，而且节约了成本。

该发明同步提取烟草总核酸(即基因组DNA和总RNA)，对于今后开展基因克隆、表达分析等一系列分子生物学研究具有非常重要的意义。

本发明首次利用CTAB法同步提取了烟草总核酸(即基因组DNA和总RNA)，提取的DNA浓度在109.20-245.46μg/ml之间，OD260/280的比值在1.83-1.94之间。RNA具有28S rRNA、18SrRNA和5.8S rRNA 3条清晰的条带，且无降解。RNA浓度在355.57-570.13μg/ml之间，OD260/280在1.84-2.04之间，OD260/230在2.06-2.33之间。基因组DNA和RNA的质量符合后续分子生物学实验的要求。

附图说明

图1.烟草叶片总核酸提取电泳图，

WT：非转基因株系；T1-T7：转基因株系。

图2.烟草叶片消化RAN后的DNA电泳图，

WT：非转基因株系；T1-T7：转基因株系。

图3.烟草叶片消化DNA后的总RNA电泳图，

WT：非转基因株系；T1-T7：转基因株系。

图4.转基因株系的PCR检测，

M：DNA Marker；P：阳性质粒；WT：非转基因株系；T1-T7：转基因株系。

图5.Actin基因的RT-PCR扩增，

M：DNA Marker；WT：非转基因株系；T1-T7：转基因株系。

图6.几丁质酶基因的RT-PCR扩增，

具体实施方式

实施例1

1)基因组DNA和总RNA的提取

本实施例以转几丁质酶基因烟草和非转基因烟草为材料，同步、快速、高效的提取基因组DNA和总RNA。具体方法如下：称取烟草组培苗叶片约0.3g，于液氮中迅速研磨成粉末，加入含有1000μl 2％CTAB裂解液的2ml离心管中，65℃水浴45-60min，加入与2％CTAB裂解液等体积的由氯仿和异戊醇组成的混合试剂，其中氯仿∶异戊醇的体积比为24∶1，轻轻上下颠倒混匀；12000r/min离心10min，取上清，加入与上清液等体积的由水饱和酚、氯仿及异戊醇组成的混合试剂，其中水饱和酚∶氯仿∶异戊醇的体积比为25∶24∶1，轻轻上下颠倒混匀；12000r/min离心10min，取上清，加入1/30上清液体积的NaAc和1/10上清液体积的无水乙醇，上下颠倒混匀，在冰上静置5min后，再加入与上清液等体积的由氯仿和异戊醇组成的混合试剂，其中氯仿∶异戊醇的体积比为24∶1；12000r/min离心10min，取上清，加入1/10上清液体积的NaAc和两倍上清液体积的无水乙醇，-20℃静置1h；12000r/min离心10min，弃上清，用70％的乙醇洗涤沉淀2次，室温干燥，溶于50μlDEPC处理的ddH₂O中。取2μl的总核酸，用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，电压为150V左右，当溴酚兰到达胶面1/3时取出，于紫外成像系统上拍照分析，见图1。取上述提取的总核酸20μl进行基因组中RNA的消化，具体方法参考佟兆国等的方法(佟兆国，王富荣，章镇，等.一种从果树成熟叶片提取DNA的方法[J].果树学报，2008，25(1)：122～125)，将消化后的基因组DNA溶解于20μl的ddH₂O中。取上述剩余的核酸进行总RNA中DNA的消化，具体方法参考说明书(TaKaRa D2215)进行。将消化DNA后的总RNA溶解于20μl的DEPC处理后ddH₂O中。

2)总核酸的质量分析

利用本发明改进的CTAB法，从烟草非转基因株系和转基因株系中，同时分离了基因组DNA和总RNA，结果如图1。从电泳结果可以看出，本发明改良后的CTAB法提取的总核酸中，没有蛋白、多糖等物质的污染，并且DNA和RNA条带清晰、整齐无污染现象。

3)基因组DNA的质量分析

取2μl的消化后的基因组DNA，用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。结果如图2，消化后的DNA条带整齐、无降解现象。DNA在Bio-photometer上检测浓度，体系为1μl DNA样加入49μl ddH₂O，DNA浓度、OD280/OD260直接从仪器上读取，通过SPSS软件进行了标准误分析(表1)，结果表明：所提取的DNA浓度在109.20-245.46μg/ml之间，ODA260/280的比值在1.83-1.94之间，说明提取的DNA质量较高。将消化RNA的DNA稀释10倍后，取1μl进行PCR扩增。扩增引物为：chitF1：GCGGACTAGTAGAAATGAAGTTGC(SEQ ID NO.1)；chitR1：GGTACCTTAGGCAAAAGGCCTTTGATT(SEQ ID NO.2)。PCR反应体系为：模板1μL，10×PCR缓冲溶液2.5μL；MgCl₂1.5μL；上下游引物各1μL，rTaq酶0.2μL，最后用灭菌的ddH₂O补足至25μL。反应条件均为：94℃预变性4min；94℃30s，59℃30s，72℃1min，35个循环；72℃延伸10min。在1.2％(W/V)的琼脂糖凝胶上电泳检测PCR产物(图4)。结果表明：在7株抗性株系和阳性对照质粒中，成功的检测到了约1000bp的目的条带，而非转基因株系未能检测出目的条带。转基因株系的成功检测，表明该实验方法提取的DNA质量很好，符合PCR等分子生物学实验的要求。

表1.改良的CTAB法同时提取的烟草DNA和总RNA的质量分析

注：实验重复3次，利用SPSS软件进行标准误分析，表格中的数据＝平均值±标准误。

4)总RNA的质量分析

取2μl的总RNA，用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，如图3，由图3可见，经消化后的RNA，没有蛋白、多糖、DNA的污染，并且28S、18S和5.8S的条带清晰、整齐，28S是18S的两倍亮。总RNA在Bio-photometer上检测浓度，体系为1μl RNA样加入49μl DEPC处理后ddH₂O，RNA浓度、OD280/OD260和OD260/OD230直接从仪器上读取(表1)，RNA浓度在355.57-570.13μg/ml之间，OD260/280在131.84-2.042之间，OD260/230在2.06-2.33之间。说明该方法提取的RNA质量很高。将消化DNA后的总RNA1μg进行反转录，用M-MLV反转录酶(TaKaRa No D6130)进行反转录，反转录反应体系和反应程序参考说明书的方法进行。以烟草Actin为内参基因，检测总RNA提取以及cDNA合成的质量。根据NCBI数据库中登录的序列(AB158612)，设计扩增Actin基因的特异引物，AF1：AAGGCTGGATTTGCTGGTGATG(SEQ ID NO.3)；AR1：TGCTCAATGGGATACTTCAAGGTG(SEQ ID NO.4)。取1μL的cDNA模板进行PCR扩增，PCR扩增体系同上。PCR反应程序为：94℃预变性4min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，35个循环。在1.5％(W/V)的琼脂糖凝胶上电泳检测PCR产物。目的基因的扩增同上。我们成功的从转基因株系和野生型株系中成功的克隆到了大约167bp的目的片段(图5)，经测序得知，克隆到的片段与目的片段的同源性达到了100％。同时我们对所转导的目的基因(几丁质酶基因)进行了扩增，扩增引物为：chitF1：GCGGACTAGTAGAAATGAAGTTGC(SEQ ID NO.1)；chitR1：GGTACCTTAGGCAAAAGGCCTTTGATT(SEQ ID NO.2)。PCR反应体系为：模板1μL，10×PCR缓冲溶液2.5μL；MgCl₂1.5μL；上下游引物各1μL，rTaq酶0.2μL，最后用灭菌的ddH₂O补足至25μL。反应条件均为：94℃预变性4min；94℃30s，59℃30s，72℃1min，35个循环；72℃延伸10min。在1.2％(W/V)的琼脂糖凝胶上电泳检测PCR产物，结果表明：在阳性对照质粒和转基因株系中成功的扩增到约1000bp的目的片段(图6)。说明反转录合成的cDNA质量好，也进一步说明了该方法提取烟草RNA具有较高的质量，能满足分子生物学试验的要求。

Claims

1.一种植物中总核酸的同步提取方法，其特征在于将生物材料粉碎后与2％CTAB裂解液混合，65℃水浴45-60min，加入与所述的2％CTAB裂解液等体积的由氯仿和异戊醇组成的混合试剂，上下颠倒混匀；离心，取上清，加入与上清液等体积的由水饱和酚、氯仿及异戊醇组成的混合试剂，上下颠倒混匀；离心，取上清，加入1/30上清液体积的NaAc和1/10上清液体积的无水乙醇，上下颠倒混匀，在冰上静置5min后，再加入与上清液等体积的由氯仿和异戊醇组成的混合试剂；离心，取上清，加入1/10上清液体积的NaAc和两倍上清液体积的无水乙醇，-20℃静置1h；离心，弃上清，用70％的乙醇洗涤沉淀1～5次，室温干燥，得到包含基因组DNA和总RNA的总核酸。

2.根据权利要求1所述的植物中总核酸的同步提取方法，其特征在于所述的由氯仿和异戊醇组成的混合试剂中氯仿和异戊醇的体积比为20～30∶1，优选24∶1。

3.根据权利要求1所述的植物中总核酸的同步提取方法，其特征在于所述的由水饱和酚、氯仿及异戊醇组成的混合试剂中水饱和酚、氯仿及异戊醇的体积比为20～28∶20～28∶1，优选25∶24∶1。

4.根据权利要求1所述的植物中总核酸的同步提取方法，其特征在于所述的生物材料粉碎是通过在液氮中将生物材料研磨成粉末，所述的离心条件为8000～12000rpm，8～15分钟。

5.一种植物中基因组DNA的提取方法，其特征在于包括如下步骤：

1)按照权利要求1中任一项所述的方法提取植物中的总核酸；

2)取步骤(1)提取的总核酸，按照常规方法进行RNA的消化，得到所述的基因组DNA。

6.根据权利要求5所述的植物中基因组DNA的提取方法，其特征在于所述的由氯仿和异戊醇组成的混合试剂中氯仿和异戊醇的体积比为20～30∶1，优选24∶1；所述的由水饱和酚、氯仿及异戊醇组成的混合试剂中水饱和酚、氯仿及异戊醇的体积比为20～28∶20～28∶1，优选25∶24∶1。

7.根据权利要求5所述的植物中基因组DNA的提取方法，其特征在于所述的生物材料粉碎是通过在液氮中将生物材料研磨成粉末；所述的离心条件为8000～12000rpm，8～15分钟。

8.一种植物中总RNA的提取方法，其特征在于包括如下步骤：

1)按照权利要求1中任一项所述的方法提取植物中的总核酸；

2)取步骤(1)提取的总核酸，按照常规方法进行DNA的消化，得到所述的总RNA。

9.根据权利要求8所述的植物中总RNA的提取方法，其特征在于所述的由氯仿和异戊醇组成的混合试剂中氯仿和异戊醇的体积比为20～30∶1，优选24∶1；所述的由水饱和酚、氯仿及异戊醇组成的混合试剂中水饱和酚、氯仿及异戊醇的体积比为20～28∶20～28∶1，优选25∶24∶1。

10.根据权利要求8所述的植物中总RNA的提取方法，其特征在于所述的生物材料粉碎是通过在液氮中将生物材料研磨成粉末，所述的离心条件为8000～12000rpm，8～15分钟。