CN105505916A - 从海人树干燥叶片中提取高质量基因组dna的方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种海人树干燥叶片基因组DNA的提取方法，属于生物技术领域。具体而言，本发明提供的提取方法包括对干燥叶片细胞研磨破碎，两步法抽提DNA、杂质的去除以及DNA的纯化。采用本发明提供的提取方法能够有效的去除干燥组织样本中富含的多酚、多糖等次生代谢产物，最终获得高质量的基因组DNA。本发明在DNA提取方法中加入了聚乙烯吡咯烷酮，可更加有效的去除多酚类物质，使基因组DNA质量显著提高。本发明适用于海人树等乔木科植物干燥叶片基因组DNA的提取。

Description

从海人树干燥叶片中提取高质量基因组DNA的方法及试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及植物基因组DNA分离提取技术，尤其涉及一种海人树干燥叶片基因组DNA的提取方法。

背景技术

细胞中DNA主要存在于细胞核内，称为基因组DNA。植物gDNA的提取主要用于基因文库构建、PCR分析及Southern杂交等，gDNA提取是植物分子生物学研究的基础技术。目前，已经发展了多种方法，可成功地从植物叶片、愈伤组织、组培苗、果实、韧皮部等组织器官中提取出gDNA。

但是有些情况下，不同植物甚至是同一种植物组织材料的来源、部位、形态等外在性质的不同以及化学成分、组织结构等内在特点的差异,在提取gDNA时需要选择不同的方法或作一些特殊的处理^[1]，综合以往的提取经验，从干燥的木本植物中提取的方法难度就相对大于大多数的禾谷类新鲜组织。从干燥组织中分离出的DNA由于多酚被氧化成棕褐色，多糖、单宁等物质与DNA结合成粘稠的胶状物，获得的DNA常出现产量低、质量差、易降解，影响了DNA质量和纯度，不能被限制性内切酶酶切，严重的甚至不能作为模板进行PCR扩增^[2]。针对这一现象，已有许多学者对植物特别是顽拗型木本植物的gDNA提取纯化进行了改良和发展，如K.Choudhary等^[3]以豇豆作为材料，分别对新鲜叶片和干燥叶片进行了gDNA提取，并对干燥叶片的提取方法进行了改进，但效果都不是很明显。

海人树为苦木科，海人树属的灌木或小乔木，通常分布于太平洋至印度洋热带地区的小孤岛或珊瑚岛上，在我国分布于台湾和广东的西沙群岛等地。目前对海人树的分子生物学研究较少，特别是对海人树干燥叶片的基因组DNA提取还未见报道，而采用常规的CTAB法提取基因组DNA时，最终获得的DNA质量普遍较差，影响后续试验的进行，严重时可能会导致最终分析结果失败。

参考文献

[1]CsaiklUM,BastianH,BrettschneiderRetal.ComparativeanalysisofdifferentDNAextractionprotocols.Afast,universalmaxi-preparationofhighqualityplantDNAforgeneticevaluationandphylogeneticstudies[J].PlantMolecularBiologyReporter,1998,61:69-86.

[2]易庆平等，植物总基因组DNA提取纯化方法综述[J].安徽农业科学，2007，35(25):7789-7791.

[3]ChoudharyK,MathurN,ChoudharyOPandPillaiU.ProtocolforIsolationofgenomicDNAfromDryandFreshLeavesofVignaSpeciesSuitableforRapidandRestrictiondigestion[J].AdvancesinBiologicalResearch,2008,2(5-6):83-89.

发明内容

为了克服现有技术的不足和缺点，针对海人树干燥叶片富含多酚、多糖的特点，提供了一种海人树干燥叶片基因组DNA的方法，利用该方法能够获得高质量的基因组DNA。

本发明人为解决上述问题进行了深入的研究，结果发现：通过改良传统CTAB裂解液组分配比，并通过氯仿-异戊醇，以及Tris饱和苯酚-氯仿-异戊醇两步法抽提，可以实现高质量的提取海人树干燥叶片基因组DNA，从而完成了本发明。

即，本发明提供的一种提取海人树干燥叶片高质量基因组DNA的方法，包括：

1.一种海人树干燥组织高品质基因组DNA的提取方法，该方法包括下述步骤：

步骤A：将样品在液氮下迅速冷冻并研磨成干粉；

步骤B：将步骤A得到的干粉加入预热的裂解液中混匀，使样品悬浮，水浴裂解30～60分钟，取出混合液冷却至室温；

其中，所述裂解液的组分包含3％(g/v)的CTAB，100mM的Tris-HCl，2M的NaCl，25mM的EDTA，5％(g/v)的PVP，以及4体积％的β-巯基乙醇；

步骤C：将步骤B得到的混合液经氯仿-异戊醇抽提离心获得上清液后，再经Tris饱和苯酚-氯仿-异戊醇抽提离心获得上清液；

步骤D：将步骤C得到的上清液经沉淀剂沉淀并离心，再经洗涤液洗涤并离心后获得纯化的核酸；

步骤E：将步骤D得到的纯化的核酸经干燥后，加入RNase消化RNA，获得消化RNA后的核酸溶液；

步骤F：将步骤E获得的消化RNA后的核酸中加入无水乙醇沉淀基因组DNA，离心后弃上清液干燥后，加入溶解试剂，得到基因组DNA。

2.根据项1所述的提取方法，步骤A使用的样品量为100～200mg。

3.根据项1所述的提取方法，步骤B中裂解液的预热温度为65～75℃，水浴裂解的温度为65～75℃。

4.根据项1所述的提取方法，其特征在于，步骤C中氯仿-异戊醇的体积比为24:1；Tris饱和苯酚-氯仿-异戊醇的体积比为25:24:1。

5.根据项1所述的提取方法，其特征在于，步骤D中洗涤液为70～80％的乙醇，以及2～5M的NaCl。

6.一种用于海人树干燥叶片基因组DNA的提取试剂盒，其包括CTAB裂解液、抽提试剂、以及核酸沉淀剂、洗涤剂和溶解剂；

所述CTAB裂解液的组分包括3％(g/v)CTAB，100mMTris-HCl，2MNaCl，25mMEDTA，5％(g/v)PVP，以及4体积％β-巯基乙醇；

所述抽提试剂包括体积比为24:1的氯仿-异戊醇，以及体积比为25:24:1的Tris饱和苯酚-氯仿-异戊醇。

7.一种用于海人树干燥叶片DNA提取的改良CTAB裂解液，其特征在于，组分包含3％(g/v)CTAB，100mMTris-HCl，2MNaCl，25mMEDTA，5％(g/v)PVP，以及4体积％β-巯基乙醇。

发明效果

根据本发明，在传统CTAB裂解液中加入PVP，以及采用氯仿-异戊醇，以及Tris饱和苯酚-氯仿-异戊醇两步法抽提DNA，能够从海人树干燥叶片中提取高质量的基因组DNA。

附图说明

图1是本发明的实施例2的琼脂糖凝胶电泳图，

其中，M1为分子量标准，3为样品；

图2是本发明的对比例1的琼脂糖凝胶电泳图，

其中，M为分子量标准，3为样品。

发明的具体实施方式

本说明书中提及的科技术语具有与本领域技术人员通常理解的含义相同的含义，如有冲突以本说明书中的定义为准。

在一个方面，本发明提供了一种从海人树干燥叶片中提取高质量基因组DNA的方法，该方法包括：

步骤A：将样品在液氮下迅速冷冻并研磨成干粉；

步骤B：将步骤A得到的干粉加入预热的裂解液中混匀，使样品悬浮，水浴裂解30～60分钟，取出混合液冷却至室温；

其中，所述裂解液的组分包含3％(g/v)的CTAB，100mM的Tris-HCl，2M的NaCl，25mM的EDTA，5％(g/v)的PVP，以及4体积％的β-巯基乙醇；

步骤C：将步骤B得到的混合液经氯仿-异戊醇抽提离心获得上清液后，再经Tris饱和苯酚-氯仿-异戊醇抽提离心获得上清液；

步骤D：将步骤C得到的上清液经异丙醇沉淀并离心，再经洗涤液洗涤并离心后获得纯化的核酸；

步骤E：将步骤D得到的纯化的核酸经干燥后，加入RNase消化RNA，获得消化RNA后的核酸溶液；

步骤F：将步骤E获得的消化RNA后的核酸中加入无水乙醇沉淀基因组DNA，离心后弃上清液干燥后，加入溶解试剂，得到基因组DNA。

在本发明中，所述步骤A样品量为100～200mg。

本发明人对传统的CTAB法进行了如下改进：

(1)对于传统CTAB法提取DNA的方法中，CTAB裂解液不能抑制样品中次生代谢产物被氧化。在原有CTAB裂解液中，加入聚乙烯吡咯烷酮(PVP)可以抑制样品中次生代谢产物被氧化的现象。

(2)对于传统CTAB法中，仅使用氯仿-异戊醇进行一步抽提的方法会造成DNA抽提效率低，且抽提过程中存在次生代谢产物易被氧化的现象，采用两步法抽提DNA，即首先用氯仿-异戊醇进行抽提，其次用Tris饱和苯酚-氯仿-异戊醇进行二次抽提，以此保证DNA的抽提效率；同时二次抽提中的Tris饱和苯酚，可减少抽提过程中次生代谢产物的氧化，最终获得高质量的DNA。

在本说明书中，高质量是指基因组DNA的纯度和浓度高。纯度高即OD260/280介于1.6～1.8之间，OD260/230大于2.0。例如核酸的最大吸收波长为260nm，蛋白质的最大吸收波长为280nm，可以通过测定在260和280的OD比值来评价核酸的纯度。浓度高即每单位体积液体中所含的基因组DNA含量高，例如，在100mg的样品起始量下，提取得到的基因组DNA的浓度不低于30ng/μL，基因组DNA的总量不低于1μg。

所述步骤B中使用的CTAB裂解液为3％(g/v)的CTAB，100mM的Tris-HCl，2M的NaCl，25mM的EDTA，5％(g/v)的PVP，以及4体积％的β-巯基乙醇。该裂解液中的PVP浓度对本发明的方法至关重要。

步骤B的裂解液的预热温度为60～75℃，优选为70℃。反应温度为60～75℃，优选为70℃。

所述步骤C的氯仿-异戊醇的体积比为24:1，Tris饱和苯酚-氯仿-异戊醇的体积比为25:24:1。

步骤C中采用10000～13000rpm离心15分钟，优选采用12000rpm离心15分钟。

所述步骤D使用的洗涤液可采用本领域技术人员所知的任何纯化DNA的试剂，如70％乙醇、75％乙醇、70％异丙醇，以及高盐溶液(NaCl)等，优选为75％的乙醇和5M的NaCl。

步骤D采用5000rpm离心5分钟。应该注意的是，为提高纯化效率，可重复进行步骤D。

所述步骤F中采用的溶解试剂可采用本领域技术人员所熟知的任何试剂，如无菌双蒸水，TE溶液。

优选地，在本发明的方法中，在步骤A之前还包括对样品的预处理步骤，可采用本领域技术人员所熟知的任何方法对样品进行表面杀菌清洁，如70％的乙醇对样品进行冲洗。

优选地，本发明的方法中，在步骤C之后还包括对步骤C离心后的沉淀进行再次抽提，所使用的抽提液可采用本领域技术人员所知的任何抽提试剂，如NaCl-TE缓冲液等。

在另一个方面，本发明提供了一种提取海人树干燥叶片基因组DNA的试剂盒(本发明的试剂盒)，其可例如用于实施本发明的基因组DNA提取方法，具体包括：

上述CTAB裂解液；氯仿-异戊醇；Tris饱和苯酚-氯仿-异戊醇；以及核酸沉淀剂、洗涤剂和溶解剂。其中本发明试剂盒中的核酸沉淀剂、洗涤剂和溶解剂可采用本领域技术人员所熟悉的那些。例如，核酸沉淀剂包括但不限于无水乙醇，异丙醇等；核酸洗涤剂包括但不限于70％乙醇、75％乙醇、70％异丙醇，以及高盐溶液(NaCl)；核酸溶解剂包括但不限于双蒸水，TE缓冲液等。

实施例

以下结合附图和实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1本发明改进的CTAB裂解液

在常规的CTAB裂解液中加入了PVP，并优化了各组分的配比，得到了改进的CTAB裂解液。

所述改良裂解液的组分见表1：

表1本发明CTAB裂解液配方

实施例2海人树干燥叶片基因组DNA提取

采用实施例1的CTAB裂解液裂解海人树干燥叶片基因组DNA

1)取干燥海人树叶片组织约100mg，使用无菌水配置的80％乙醇进行冲洗，并将叶片剪成1mm左右大小；

2)将剪好的叶片放入提前预冷过的研钵中，加入液氮充分研磨；

3)将研磨好的组织迅速转入到预先装有800μL70℃预热实施例1的CTAB裂解液的EP管中，充分混匀，将离心管放在70℃水浴30分钟；

4)水浴结束待恢复至室温，加入200μLNaCl-TE，再加入等体积的氯仿-异戊醇(24:1)，充分混匀后12,000rpm离心10分钟，将上清液加入一个新的EP管中。

5)加入等体积的Tris饱和酚苯-氯仿-异戊醇(25:24:1)，充分震荡混匀15分钟后，12,000rpm离心15分钟；

6)将上清液小心的转移到新的EP管中；

7)将上清小心转移到步骤6)中的EP管中，两次上清混合在一起，12,000rpm离心15分钟；

8)将上清液转移至一个新的离心管中，加入700μL预冷的异丙醇，轻轻混匀后10,000rpm离心5分钟，弃掉上清液；

9)加入预冷的75％乙醇和5MNaCl，5,000rpm离心5分钟，弃掉上清；

10)重复步骤10)两次；

11)放置5分钟以彻底晾干残余的乙醇；

12)加入50μL的TE缓冲液，55℃过夜溶解；

13)加入10μLRNAase，37℃过夜消化RNA；

14)加入等体积的预冷无水乙醇，10,000rpm离心10分钟，弃掉上清；

15)重复步骤15)；

16)放置5分钟以彻底晾干残余的无水乙醇；

17)加入50μL的TE缓冲液溶解。

18)采用凯奥K5500微量分光光度计检测提取DNA的纯度；Qubit荧光光度计测定提取DNA的浓度；琼脂糖凝胶电泳检测提取DNA的完整性。检测结果分别见表2，图1。

表2DNA纯度和浓度检测结果

对比例1采用传统CTAB裂解液提取海人树干燥叶片基因组DNA

裂解液成分见表3：

表3传统CTAB裂解液配方

1)取干燥海人树叶片组织约100mg，使用无菌水配置的80％乙醇进行冲洗，并将叶片剪成1mm左右大小；

2)将剪好的叶片放入提前预冷过的研钵中，加入液氮充分研磨；

3)将研磨好的组织迅速转入到预先装有800μL70℃预热CTAB裂解液的EP管中，充分混匀，将离心管放在70℃水浴30分钟；

4)水浴结束待恢复至室温，加入等体积的氯仿-异戊醇(24:1)，充分混匀后12,000rpm离心10分钟，将上清液加入一个新的EP管中。

5)在吸完上清的离心管中加入200μLNaCl-TE缓冲液，充分震荡混匀15分钟后，12,000rpm离心15分钟；

6)将上清液转移至一个新的离心管中，加入700μL预冷的异丙醇，轻轻混匀后10,000rpm离心5分钟，弃掉上清液；

7)加入预冷的75％乙醇和5MNaCl，5,000rpm离心5分钟，弃掉上清液；

8)重复步骤7)两次；

9)放置5分钟以彻底晾干残余的乙醇；

10)加入50μL的TE缓冲液，55℃过夜溶解；

11)加入10μLRNAase，37℃过夜消化RNA；

12)加入等体积的预冷无水乙醇，10,000rpm离心10分钟，弃掉上清；

13)重复步骤12)；

14)放置5分钟以彻底晾干残余的无水乙醇；

15)加入50μL的TE缓冲液溶解。

16)采用凯奥K5500微量分光光度计检测提取DNA的纯度；Qubit荧光光度计测定提取DNA的浓度；琼脂糖凝胶电泳检测提取DNA的完整性。检测结果分别见表4，图2。

表4DNA纯度和浓度检测结果

从以上数据结果可以看出，对比例采用传统的CTAB法提取海人树干燥叶片DNA，尽管可以获得DNA，但DNA的纯度和浓度均很低，质量很差。相对的，采用实施例2的方法可以在相同样品量的前提下，提取获得纯度和浓度高，完整性好的基因组DNA。

还需要说明的是，上述说明示出并描述了本发明的优选实施例，如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。

工业实用性

根据本发明，提供一种提取海人树干燥叶片基因组DNA的方法，利用该方法中改良CTAB裂解液和两步抽提方法，可获得高质量基因组DNA。

Claims (7)

1.一种海人树干燥叶片高质量基因组DNA的提取方法，该方法包括下述步骤：

步骤A：将样品在液氮下迅速冷冻并研磨成粉末；

步骤B：将步骤A得到的粉末加入预热的裂解液中混匀，水浴裂解30～60分钟，取出混合液冷却至室温；

其中，所述裂解液的组分包含3％的CTAB，100mM的Tris-HCl，2M的NaCl，25mM的EDTA，5％的PVP，以及4体积％的β-巯基乙醇；

步骤C：将步骤B得到的混合液经氯仿-异戊醇抽提离心获得上清液后，再经Tris饱和苯酚-氯仿-异戊醇抽提离心获得上清液；

步骤D：将步骤C得到的上清液经沉淀剂沉淀并离心，再经洗涤液洗涤并离心后获得纯化的核酸；

步骤E：将步骤D获得的纯化的核酸经干燥后，加入RNase消化RNA，获得消化RNA后的核酸溶液；

步骤F：将步骤E获得的消化RNA后的核酸溶液中加入无水乙醇沉淀基因组DNA，离心弃上清液并干燥后，加入溶解试剂，得到基因组DNA。

2.根据权利要求1所述的提取方法，步骤A所述样品的起始量为100～200mg。

3.根据权利要求1所述的提取方法，步骤B所述裂解液的预热温度为65～75℃，水浴裂解的温度为65～75℃。

4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤C所述氯仿-异戊醇的体积比为24:1；Tris饱和苯酚-氯仿-异戊醇的体积比为25:24:1。

5.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤D所述洗涤液为70～80％的乙醇，和2～5M的NaCl。

6.一种用于海人树干燥叶片基因组DNA的提取试剂盒，其包括CTAB裂解液、抽提试剂、核酸沉淀剂、洗涤剂和溶解剂；

所述CTAB裂解液的组分包括3％CTAB，100mMTris-HCl，2MNaCl，25mMEDTA，5％PVP，以及4体积％β-巯基乙醇；

所述抽提试剂包括体积比为24:1的氯仿-异戊醇，以及体积比为25:24:1的Tris饱和苯酚-氯仿-异戊醇。

7.一种用于海人树干燥叶片DNA提取的改良CTAB裂解液，其特征在于，组分包含3％CTAB，100mMTris-HCl，2MNaCl，25mMEDTA，5％PVP，以及4体积％β-巯基乙醇。