CN113136384A - 濒危半红树植物莲叶桐核酸提取的方法 - Google Patents

濒危半红树植物莲叶桐核酸提取的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于分子生物学方面，具体涉及一种针对濒危半红树植物莲叶桐核酸的提取方法。采用改进的裂解液对细胞进行裂解，并通过一定比例的Tris平衡酚‑氯仿‑异戊醇混合液进行抽提，同时为了更彻底的清除糖蛋白，又用等体积的Tris平衡酚进行抽提。再用改进体积的醋酸钠‑异丙醇进行沉淀DNA、纯化DNA，从而获得高质量的基因组DNA。采用本发明提供的濒危半红树植物莲叶桐核酸提取方法提取的DNA浓度高、纯度高，还不易降解，同时可以防止超氧阴离子自由基或者活性氧对DNA的损害，为后续的PCR扩增、分子标记技术开发、基因组文库构建等分子生物学实验奠定基础。

Description

濒危半红树植物莲叶桐核酸提取的方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种濒危半红树植物莲叶桐核酸提取的方法。
背景技术
莲叶桐(Hernandia nymphaeifolia(J.Presl)Kubitzki)是莲叶桐科、莲叶桐属常绿乔木，莲叶桐材料因富含多糖、多酚，成分特殊，提取液极其粘稠，且容易褐化，所以核酸提取较困难。
传统的SDS法
(1)称取0.2g样品用液氮研磨成粉,置于1.5ml离心管中，加入800μL经65℃预热的SDS裂解液(100mmol/L Tris-HCl,pH8.0,50mmol/L EDTA,500mmol/L NaCl,2％β疏基乙醇(v/v),5％SDS(m/v)),放入65℃水浴锅中保温20min。
(2)于4℃,12 000rpm离心10min.上清移入新的1.5ml离心管中，加入等体积的KAc,轻轻旋转混匀，静置片刻，而后4℃,12 000rpm/min离心10min。
(3)上清移入新的1.5ml离心管中,加入2倍体积的预冷的无水乙醇,轻轻混匀,在－20℃条件下静置30min,于4℃,12 000rpm/min离心10min,去上清,留沉淀。
(4)用500μL 70％的乙醇洗涤沉淀,重复2～3次。
(5)彻底吸弃上清,加入200μL TE缓冲液溶解干燥的DNA,加入2μL(10mg·ml－1)RNase A,在37℃条件下保温30min,最后将DNA溶解在100μLTE缓冲液中,于－20℃保存备用。
采用传统SDS法提取莲叶桐植物基因组DNA过程中出现的上清液粘稠,裂解时多糖处理不干净，点样跑胶时出现枪头拉丝等问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种适用于莲叶桐核酸提取的方法，解决采用传统SDS法提取时出现的上清液粘稠，裂解时多糖处理不干净，点样跑胶时出现枪头拉丝等问题。
本发明的技术方案为：莲叶桐核酸提取的方法，包括如下步骤：
(1)取适量新鲜莲叶桐叶片，置于预冷的研钵中，加入液氮充分研磨，将粉末转至离心管中，加入预热温度为65℃的裂解液，上下颠倒混匀，加入RNA酶，涡旋振荡1min，裂解液组成为：100mmol/L Tris-HClpH8.0，50mmol/L EDTA，500mmol/L NaCl，2％(V/V)β疏基乙醇，5％(m/v)SDS，2％(m/v)PVP。
(2)混匀后65℃水浴10min，加入等体积的抽提液振荡混匀，抽提液组成为Tris平衡酚︰氯仿︰异戊醇＝25︰24︰1，在转速为11000～135000rpm室温下离心10～15min。
(3)取上清液转入一新离心管加入等体积的Tris平衡酚(pH>7.8)振荡混匀，在转速为11000～135000rpm4℃离心15～20min。
(4)取上清液，加入1/10倍体积的3mol/L NaAc(pH5.6)和两倍体积的异丙醇，混匀后，至于－20℃中过夜，在转速为11000～135000rpm4℃离心15～20min。
(5)弃上清，沉淀用体积浓度70％乙醇(v/v)洗涤2～4次,加入50～250μL TE,充分混匀后,加入1/10倍体积的3mol/L NaAc(pH5.6)和两倍体积的异丙醇，混匀后，至于－20℃中2h。在转速为11000～135000rpm/min室温下离心10～15min。
(6)弃上清，沉淀用体积浓度70％(v/v)乙醇洗涤2～4次，室温静置20～30min晾干，加入50～250μL的TE，充分混匀后，置于-20℃保存。
进一步地，所述步骤(1)中的RNA酶浓度为20mg/ml，一般加入2～4μL。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、裂解液组分：增加了PVP、β疏基乙醇、RNaseA。PVP化学名称为聚乙烯吡咯烷酮，它是一种具有较强的溶解性的抗氧化剂。它能够与多酚、多糖结合形成络合物，使得多酚多糖与DNA分离，从而去除杂质。β疏基乙醇主要是抗氧化，它能防止DNA呈褐色，避免植物体内的多酚物质氧化成醌，减少对核酸的损失。加入RNaseA可有效去除DNA中的RNA以及其他的蛋白质杂质。
2、抽提液组分：在传统的氯仿︰异戊醇抽提液中，加入了Tris平衡酚。酚能够保持DNA中的水分,减少DNA的损失。
3、添加步骤：在第二次抽提时，采用等体积的Tris平衡酚去抽提，Tris平衡酚的作用是防止酚类氧化成醌，醌对核酸有较强的破坏作用。酚又是强的蛋白变性剂，可以使细胞、组织中的蛋白质变性而析出。因此该步骤能够达到减少核酸的损失，高效去除蛋白的作用。
4、沉淀DNA试剂与时间要求：采用醋酸钠和异丙醇沉淀DNA，把95％乙醇改成异丙醇，异丙醇具有用量少、速度快的特点，比较适合浓度低、体积大的DNA沉淀。醇类物质具有沉淀DNA，去除多糖的作用。
附图说明
图1为实施例1与实施例2的对比图，左管为加热前裂解液中未加PVP，右管为加热前裂解液中加PVP。
图2为实施例1与实施例2的对比图，左管为裂解液中加PVP加热后现象，右管为裂解液中未加PVP加热后现象。
图3为实施例1与实施例2的对比图，左管为抽提液中加入Tris平衡酚，右管为抽提液中未加Tris平衡酚。
图4莲叶桐DNA琼脂糖凝胶电泳图，Improved1为实施例1提取物的琼脂糖凝胶电泳图，Improved2为实施例2提取物的琼脂糖凝胶电泳图。
图5为莲叶桐DNA琼脂糖凝胶电泳图，其中SDS是指本实施例2的方法提取物的琼脂糖凝胶电泳图，多糖多酚试剂盒为TIANGEN多糖多酚植物核酸提取试剂盒；普通试剂盒为BIOTAKE新型快速植物核酸提取试剂盒。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。
实施例1
(1)取适量新鲜植物叶片，置于预冷的研钵中，加入液氮充分研磨。将粉末转至2mL的离心管中，加入预热温度为65℃的质量浓度5％SDS(m/v)裂解液，上下颠倒混匀，加入RNA酶，涡旋振荡1min；
(2)混匀后65℃水浴10min；加入等体积的氯仿︰异戊醇＝24︰1振荡混匀，在转速为11000～135000rpm/min室温下离心10～15min。
(3)取上清液转入一新离心管加入等体积的Tris平衡酚(pH>7.8)振荡混匀，在转速为11000～135000rpm/min4℃离心15～20min。
(4)取上清液转入一新的离心管，加入1/10倍体积的3mol/L NaAc(pH5.6)和等体积的异丙醇，混匀后，至于－20℃中过夜，在转速为11000～135000rpm/min4℃离心15～20min。
(5)弃上清沉淀用体积浓度70％乙醇洗涤2～4次，室温静置20～30min晾干，加入50～250μL TE，充分混匀后，置于-20℃保存。
实施例2
(1)取适量新鲜植物叶片，置于预冷的研钵中，加入液氮充分研磨。将粉末转至2mL的离心管中，加入预热温度为65℃的裂解液，上下颠倒混匀，加入RNA酶，涡旋振荡1min，裂解液组成为：100mmol/L Tris-HClpH8.0，50mmol/L EDTA，500mmol/L NaCl，2％(V/V)β疏基乙醇，5％(m/v)SDS，2％(m/v)PVP。改进裂解液的制备方法为：将5g，pH值为8.0的SDS，2g聚乙烯吡咯烷酮，2mlβ疏基乙醇，2.925g氯化钠，1.461g乙二胺四乙酸，10ml的Tris-HCl溶液，混匀，接着加入蒸馏水定容至100ml即得。
(2)混匀后65℃水浴10min，加入等体积的提取液振荡混匀，提取液组成为Tris平衡酚︰氯仿︰异戊醇＝25︰24︰1，在转速为11000～135000rpm室温下离心10～15min。
(3)取上清液转入一新离心管加入等体积的Tris平衡酚(pH>7.8)振荡混匀，在转速为11000～135000rpm4℃离心15～20min。
(4)取上清液，加入1/10倍体积的3mol/L NaAc(pH5.6)和两倍体积的异丙醇，混匀后，至于－20℃中过夜，在转速为11000～135000rpm4℃离心15～20min。
(5)弃上清，沉淀用体积浓度70％乙醇(v/v)洗涤2～4次,加入50～250μL TE,充分混匀后,加入1/10倍体积的3mol/L NaAc(pH5.6)和两倍体积的异丙醇，混匀后，至于－20℃中2h。在转速为11000～135000rpm/min室温下离心10～15min。
(6)弃上清，沉淀用体积浓度70％(v/v)乙醇洗涤2～4次，室温静置20～30min晾干，加入50～250μL的TE，充分混匀后，置于-20℃保存。
图4莲叶桐DNA琼脂糖凝胶电泳图，Improved1为实施例1提取物的琼脂糖凝胶电泳图，Improved2为实施例2提取物的琼脂糖凝胶电泳图，从图4看出，改进后的SDS法(实施例1和实施例2)提取的DNA条带更亮，点样孔也更清晰，说明改进后的SDS法提取出来的DNA浓度高，纯度也高。
图5为莲叶桐DNA琼脂糖凝胶电泳图，其中SDS是指本实施例2的方法提取物的琼脂糖凝胶电泳图，多糖多酚试剂盒为TIANGEN多糖多酚植物核酸提取试剂盒；普通试剂盒为BIOTAKE新型快速植物核酸提取试剂盒。从图5看出，本发明实施例2的方法效果最佳。

Claims (2)

1.莲叶桐核酸提取的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取适量新鲜莲叶桐叶片，置于预冷的研钵中，加入液氮充分研磨，将粉末转至离心管中，加入预热温度为65℃的裂解液，混匀，加入RNA酶，涡旋振荡1min；裂解液组成为：100mmol/L Tris-HClpH8.0，50mmol/L EDTA，500mmol/L NaCl，2％(v/v)β疏基乙醇，5％(m/v)SDS，2％(m/v)PVP；
(2)混匀后65℃水浴10min，加入等体积的抽提液振荡混匀，抽提液组成为Tris平衡酚︰氯仿︰异戊醇＝25︰24︰1，在转速为11000～135000rpm室温下离心10～15min；
(3)取上清液转入一新离心管加入等体积的Tris平衡酚振荡混匀，在转速为11000～135000rpm4℃离心15～20min；
(4)取上清液，加入1/10倍体积的3mol/L NaAc和两倍体积的异丙醇，混匀后，至于－20℃中过夜，在转速为11000～135000rpm4℃离心15～20min；
(5)弃上清，沉淀用体积浓度70％乙醇洗涤2～4次，加入50～250μL TE，充分混匀后，加入1/10倍体积的3mol/L NaAc和两倍体积的异丙醇，混匀后，至于－20℃中2h，在转速为11000～135000rpm室温下离心10～15min；
(6)弃上清，沉淀用体积浓度70％乙醇洗涤2～4次，室温静置20～30min晾干，加入50～250μL的TE，充分混匀后，置于-20℃保存。
2.根据权利要求1所述的莲叶桐核酸提取的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的RNA酶浓度为20mg/ml，加入量2～4μL。
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