CN103243088B

CN103243088B - 适于转基因检测的大豆干叶子中高质量dna的提取方法

Info

Publication number: CN103243088B
Application number: CN201310177893.2A
Authority: CN
Inventors: 王存芳; 许晓丹; 刘畅; 史永翠
Original assignee: Shandong Institute of Light Industry
Current assignee: Shandong Institute of Light Industry
Priority date: 2013-05-14
Filing date: 2013-05-14
Publication date: 2014-11-05
Anticipated expiration: 2033-05-14
Also published as: CN103243088A

Abstract

本发明公开了一种适于转基因检测的大豆干叶子中高质量DNA的提取方法，所提取基因组DNA条带清晰，纯度高，杂质含量少，满足转基因检测所需的PCR、酶切、分子克隆、测序等分子生物学实验的需要。步骤如下：1）将大豆干叶子用Buffer I浸泡，并于40～60℃温度加热后剪碎成沫状；2）加入Buffer II，摇匀，离心，弃上清，重复至上清液澄清，取沉淀；3）加入CTAB提取液、质量浓度3%的β-巯基乙醇和蛋白酶K，55℃～65℃加热40～60分钟；4）加入等体积的酚、氯仿和异戊醇混合液，混匀，离心，取上清；5）加入等体积的氯仿和异戊醇混合液，混匀，离心，取上清；6）加入0.8倍体积预冷的异丙醇，于-20℃静置10～30分钟，离心，弃上清，洗涤，晾干，TE缓冲液溶解即得。

Description

适于转基因检测的大豆干叶子中高质量DNA的提取方法

技术领域

本发明涉及一种DNA提取方法，具体涉及一种适于转基因检测的大豆干叶子中高质量DNA的提取方法。属于生命科学领域。

背景技术

DNA提取是进行生物技术研究的基础，对于后续分子生物学实验至关重要，提高基因组DNA的完整性和纯度，是高质量DNA提取的关键所在，也关系到分子杂交、分子克隆、转基因检测、遗传多样性分析等后续研究的成败。基因组DNA的提取质量与其材料种类、部位也有很大的关系，对于不同的材料提取方法也不尽相同。从大豆干叶片中获取可用于PCR扩增的高质量DNA，对于高通量样品分析具有重要的意义。一般常规的CTAB方法是对于那些DNA含量丰富，且杂质含量少的材料来说的，如新鲜嫩叶、幼芽，对于自然干燥的叶子的研究很少。

由于有些转入大豆中的外源基因可能会在大豆中的特定部位进行表达，为了确定此类基因是否在某些部位表达，需要检测大豆叶子的基因组，但是幼嫩叶子的存放时间很短，置于常温或冰箱均会很快变老，成为干叶子，此类叶子较嫩叶相比含有更多的酚类和其他类杂质，并且DNA的含量也有所降解，因此在提取干叶子基因组的第一步破碎细胞壁时，如果处理不当，酚类物质就很容易氧化，大量酚类物质与DNA相结合，在后续的操作中很难除去。

在大豆干叶子的基因组DNA提取中，最重要的就是去除酚类、多糖等杂质。传统SDS法不能有效去除多糖等物质，提取的DNA含盐离子和杂质较多。与SDS法相比，传统CTAB法去除多糖较为干净，但DNA产率相对低的多并且不能够去除干老叶子中含有大量的色素物质，得到的DNA不纯净。

发明内容

本发明的目的是为克服上述现有技术的不足，提供一种适于转基因检测的大豆干叶子中高质量DNA的提取方法，特别适用于在大豆叶子中表达的外源基因的转基因大豆的定性、定量检测方法中DNA的提取。本发明操作简单、快速，提取的基因组DNA条带清晰，完整性好，纯度最高，杂质含量少，而且重复性好，可以满足转基因检测所需的PCR、酶切、分子克隆、测序等分子生物学实验的需要。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

适于转基因检测的大豆干叶子中高质量DNA的提取方法，步骤如下：

1）将大豆干叶子用Buffer I浸泡，并于40～60℃温度加热后剪碎成沫状物；

2）每0.04g沫状物加入1.2mL Buffer II，摇匀，离心，弃上清，重复至上清液澄清，取沉淀；

3）往步骤2）所得沉淀中，加入CTAB提取液、质量浓度3%的β-巯基乙醇和蛋白酶K，55℃～65℃加热40～60分钟，得混合液；

4）往步骤3）所得混合液中，加入与其等体积的酚、氯仿和异戊醇混合液，混匀，离心，取上清；

5）往步骤4）所得上清中，加入与其等体积的氯仿和异戊醇混合液，混匀，离心，取上清；

6）往步骤5）所得上清中，加入上清0.8倍体积预冷的异丙醇，于-20℃静置10～30分钟，离心，弃上清，洗涤，晾干，TE缓冲液溶解即得；

其中，所述Buffer I的成分为：0.2mol/L tris-HCl，0.05mol/L EDTA，1mol/L NaCl，pH值为8.0；所述Buffer II的成分为：无菌水与β-巯基乙醇，两者质量比为40:1；所述CTAB提取液的成分为：质量浓度2%的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、1.4mol/L NaCl；所述酚、氯仿和异戊醇混合液中三者的体积比为25：24：1；所述氯仿和异戊醇混合液中两者的体积比为24：1；所述TE缓冲液的成分为：10mmol/L Tris-HCl、1mmol/L EDTA，pH值为8.0。

所述步骤1）中，取0.04g大豆干叶子，放入1.5mL的离心管中，加入200μL Buffer I，浸泡5～15分钟，40～60℃水浴加热，把浸软的叶子剪碎。

所述步骤2）的具体步骤为：加入1.2mL Buffer II，上下颠倒混匀5分钟，10000r/min离心5分钟，弃上清，重复此步骤2～3次，至上清液澄清为止。

所述步骤3）的具体步骤为：加入600μL CTAB提取液、2μL蛋白酶K，摇匀，55℃～65℃水浴40～60分钟，每隔10分钟上下颠倒摇匀。

所述步骤4）的具体步骤为：加入酚、氯仿和异戊醇混合液后，上下颠倒混匀10分钟，12000r/min离心10分钟。

所述步骤5）的具体步骤为：加入氯仿和异戊醇混合液后，上下颠倒混匀10分钟，12000r/min离心10分钟。

所述步骤6）的具体步骤为：沿管壁缓慢旋转加入预冷的异丙醇，上下颠倒混匀，放入-20℃冰箱中沉淀10～30分钟，10000r/min离心5分钟，弃上清，用-20℃预冷的体积分数70%的乙醇水溶液500μL洗涤两次，晾干，用30μL的TE缓冲液溶解，-20℃储存。

本发明中，Buffer II、高浓度β-巯基乙醇的使用，可抑制酚氧化酶的活性，防止在叶子剪碎过程中酚类物质的氧化褐变，然后多次离心去除含有大量色素的上清。尚未氧化的酚类物质可与加入CTAB提取液中的PVP形成复合物，通过离心去除。浸泡中使用的Buffer I可在去多糖的同时起保护作用，防止剪碎过程中裸露的DNA发生断裂和降解；少部分多糖在低盐条件下溶解在上清溶液中去除。另外，PVP的加入也有利于多糖的去除。CTAB是一种阳离子去污剂，在高盐的条件下（＞0.7mol/L）与核酸形成可溶复合物，一旦降低盐浓度（0.1～0.5mol/L）CTAB复合物就会降低溶解度而沉淀，因此在高盐浓度下核酸物质在液相中，与其他杂质得以分离，再通过酚、氯仿和异戊醇的抽提去除了蛋白的影响，通过此方法得到的DNA透明无粘稠性。

本发明的有益效果：

本发明针对自然风干的大豆叶子实现了高质量DNA的提取，在第一步破坏细胞壁时就加入了保护剂，接下来去除色素，色素去除完成后再进行CTAB的提取，这样就很好的避免了色素的干扰，使得后续的提取较为简单、快速，并且本发明没有使用液氮的研磨，操作起来比较温和，利于掌握。

本发明将CTAB方法进行改进，解决了大豆干叶子中总DNA提取中色素和多糖去除不彻底、高质量DNA难提取的问题，得到的DNA颜色透明，条带清晰，完整性好，纯度最高，杂质含量少，且操作简便。以其作为模板对Lectin基因进行PCR检测，特异性产物明显，而且重复性好，可以满足分子生物学实验的需要，包括PCR检测、限制性酶切、分子杂交等。

附图说明

图1为实施例1中本发明方法提取大豆干叶子基因组总DNA的1.0%琼脂糖凝胶电泳和绿如蓝染色示意图；

图2为实施例1中常规CTAB方法提取大豆干叶子基因组总DNA的1.0%琼脂糖凝胶电泳和绿如蓝染色示意图；

图3为实施例2中试验例2大豆内源基因Lectin的PCR产物2.0%琼脂糖凝胶电泳和绿如蓝染色示意图；

图4为实施例2中试验例3大豆外源基因CaMV35s启动子的PCR产物2.0%琼脂糖凝胶电泳和绿如蓝染色示意图；

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

1.0%琼脂糖凝胶电泳检测大豆基因组总DNA

实施例1：提取大豆干叶子基因组总DNA

（1）本发明方法步骤如下：

①取约0.04g大豆干叶子，放入1.5mL的离心管中，加入200μL的Buffer I（0.2mol/Ltris-HCl，0.05mol/L EDTA，1mol/L NaCl，pH8.0），浸泡10分钟，60℃水浴加热，用小剪刀把浸软的叶子剪碎，得到约0.04g沫状物；

②加入1.2mL Buffer II（无菌水与β-巯基乙醇的质量比为40：1），上下颠倒混匀5分钟，10000r/min离心5分钟，弃上清，重复此步骤2～3次，至上清液澄清为止；

③取沉淀，加入600μL2×CTAB提取液（含质量浓度2%的PVP、1.4mol/L NaCl）、质量浓度3%的β-巯基乙醇、2μL蛋白酶K，摇匀，65℃水浴60分钟，每隔10分钟上下颠倒摇匀，得混合液；

④加入与混合液等体积的酚：氯仿：异戊醇（体积比为25：24：1）混合液，上下颠倒混匀10分钟，12000r/min离心10分钟；

⑤取上清，加入与上清等体积的氯仿：异戊醇（体积比为24：1）混合液，上下颠倒混匀10分钟，12000r/min离心10分钟；

⑥取上清，沿管壁缓慢旋转加入上清0.8倍体积的-20℃预冷的异丙醇，上下颠倒混匀，于-20℃静置20分钟，10000r/min离心5分钟；

⑦弃离心所得上清，用-20℃预冷的70%乙醇500μL洗涤两次，自然晾干；

⑧用30μL的1×TE缓冲液溶液溶解，取3μL用于质量浓度1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，绿如蓝染色，结果如图1所示。图1中，1～5为本发明方法提取的DNA，M为1kb DNA Ladder Marker。由图1可知，用本发明方法得到的DNA亮度最高，条带清晰，无拖尾现象，样品间的重复性也很好，可以佐证本方法提取的总DNA质量很好。

（2）传统的CTAB方法步骤如下：

①取约0.04g大豆干叶子，放入1.5mL的离心管中，加入600μL的CTAB提取缓冲液，浸泡10分钟，60℃水浴加热，用小剪刀把浸软的叶子剪碎，每隔10分钟上下颠倒摇匀；

②加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（体积比为25:24:1）混合液，上下颠倒混匀10分钟，12000r/min离心10分钟；

③取上清，加入等体积的氯仿：异戊醇（体积比为24:1）混合液，上下颠倒混匀10分钟，12000r/min离心10分钟；

④取上清，沿管壁缓慢旋转加入0.8倍体积的-20℃预冷的异丙醇，上下颠倒混匀，于-20℃静置20分钟，10000r/min离心5分钟；

⑤弃上清，用-20℃预冷的70%乙醇500μL洗涤两次，自然晾干；

⑥用30μL的1×TE缓冲液溶液溶解，取3μL用于质量浓度1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，绿如蓝染色，结果如图2所示。图2中，1～5为传统CTAB方法提取的DNA，M为1kb DNA Ladder Marker。由图2可知，传统CTAB方法提取DNA条带不清楚，提取量较少，降解严重，质量不稳定，且所得DNA溶液颜色发黄，表明含有大量色素、杂质。

结论：与传统的CTAB方法相比较，本发明方法提取的DNA透明无杂质，条带清晰，无拖尾现象，获得量大、纯度高、质量稳定，而且样品间重复性好，操作简便，用时较短。

实施例2：提取大豆干叶子基因组总DNA

①取约0.04g大豆干叶子，放入1.5mL的离心管中，加入200μL的Buffer I（0.2mol/Ltris-HCl，0.05mol/L EDTA，1mol/L NaCl，pH8.0），浸泡15分钟，40℃水浴加热，用小剪刀把浸软的叶子剪碎；

③取沉淀，加入600μL2×CTAB提取液（含质量浓度2%的PVP、1.4mol/L NaCl）、质量浓度3%的β-巯基乙醇、2μL蛋白酶K，摇匀，65℃水浴40分钟，每隔10分钟上下颠倒摇匀；

④加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（体积比为25：24：1）混合液，上下颠倒混匀10分钟，12000r/min离心10分钟；

⑤取上清，加入等体积的氯仿：异戊醇（体积比为24：1）混合液，上下颠倒混匀10分钟，12000r/min离心10分钟；

⑥取上清，沿管壁缓慢旋转加入0.8倍体积的-20℃预冷的异丙醇，上下颠倒混匀，于-20℃静置20分钟，10000r/min离心5分钟；

⑦弃上清，用-20℃预冷的70%乙醇500μL洗涤两次，自然晾干；

⑧用30μL的1×TE缓冲液溶液溶解即得。

试验例1：测定样品基因组总DNA的浓度

利用紫外分光光度计检测实施例1中本发明方法所得DNA的浓度和纯度，取待测样品10μL，用双蒸水稀释至160μL，取50微升润洗比色皿，把里面的液体尽量甩干，取100微升待测样品转移至已润洗好的微量比色皿中，放进紫外分光光度计样品室的S架上，分别测定所提取DNA溶液在260nm、280nm时的紫外吸收值。本发明方法和传统方法提取DNA的OD值分别列于表1和表2。对于双链DNA，OD₂₆₀=1.0时溶液浓度为50μg/mL。待测DNA溶液的浓度计算公式为：待测DNA的浓度（μg/mL）=OD₂₆₀×16（样品稀释倍数）×50。纯的DNA溶液的OD₂₆₀/OD₂₈₀=1.8～1.9； OD₂₆₀/OD₂₈₀>2.0时，表明有RNA污染；OD₂₆₀/OD₂₈₀<1.7时，表明有蛋白质或酚污染。

表1本发明方法提取DNA的浓度和纯度

结论：表1中，OD₂₆₀/OD₂₈₀值均低于2.0，说明本发明方法提取的DNA纯度较高，各个样本之间OD比值差异不大，DNA质量比较稳定。

表2传统方法提取DNA的浓度和纯度

结论：表2中，OD₂₆₀/OD₂₈₀值低于1.7或高于2.0，说明传统方法提取的DNA浓度不纯，有蛋白质、酚或色素等杂质污染，各个样本之间OD比值差异较大，DNA质量不稳定。

试验例2：大豆内源基因Lectin的PCR检测

以大豆内源基因凝集素Lectin为模板设计引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物序列为：Lectin-1：5′-GCCCTCTACTCCACCCCAATCC-3′；Lectin-2：5′-GCCCATCTGCAAGCCTTTTTGTG-3′。

PCR反应体系总体积25μL，于200μL离心管中加入基因组DNA、引物各1μL，9.5μL灭菌双蒸水，和12.5μL Mix（Mix成分包括10×PCR Buffer、dNTP、Mg²⁺、TaqDNA聚合酶，Mix购自上海生物工程有限公司）。混匀后置于PCR反应仪上进行扩增。PCR反应程序：94℃预变性3min；然后94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共40个循环；最后72℃延伸7min；4℃保存。取8μL扩增产物于2.0%琼脂糖凝胶中电泳检测，绿如蓝染色，用凝胶成像系统成像记录，结果如图3所示。

结论：图3中，1～5为本发明方法提取的DNA，M为100bp DNA Ladder Marker，由图3可知，5个样品均实现有效扩增，扩增产物片段条带清晰，长度约为118bp，与引物设计的特异性片段长度相符，说明核酸抽提液为大豆基因组DNA，能满足后续PCR实验的需要。

试验例3：大豆外源基因的PCR检测

CaMV35s启动子是筛选转基因大豆的首选方法，Primer软件设计引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物序列为：CaMV35s-F：5’-GCT CCT ACA AAT GCC ATC A-3’CaMV35s-R5’-GAT AGT GGG ATT GTG CGT CA-3。

PCR反应体系总体积25μL，于200μL离心管中加入基因组DNA、引物各1μL，9.5μL灭菌双蒸水，和12.5μL Mix（Mix成分包括10×PCR Buffer、dNTP、Mg²⁺、TaqDNA聚合酶，Mix购自上海生物工程有限公司）。混匀后置于PCR反应仪上进行扩增。PCR反应程序如下：94℃预变性3min；然后94℃变性30s，54℃退火40s，72℃延伸60s，共40个循环；最后72℃延伸7min；4℃保存。取8μL扩增产物于2.0%琼脂糖凝胶中电泳检测，绿如蓝染色，用凝胶成像系统成像记录，结果如图4所示。

结论：图4中1为阴性对照，2为阳性对照，3-7为本方法提取的DNA，M为50bp DNA Ladder Marker。从图中可看出，待测样品3和6出现了和阳性对照一致的特异性条带，扩增产物大小与引物设计的特异性片段长度相符，说明样品3和6为转入外源基因的大豆样品。而对待测样品4、5和7的扩增与阴性对照相一致，未出现CaMV35S启动子的扩增产物，说明样品4、5和7不含有CaMV35S启动子的外源成分。本实验室利用本发明方法提取了所有样品的DNA用于检测外源成分，所提取的DNA纯度高、质量稳定，取得了非常满意的结果。证明本发明方法是一种比较理想的适于转基因检测的大豆干叶子中高质量DNA的提取方法。

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims

1.一种适于转基因检测的大豆干叶子中高质量DNA的提取方法，其特征在于，步骤如下：

1)取0.04g大豆干叶子，放入1.5mL的离心管中，加入200μL Buffer I，浸泡5～15分钟，40～60℃水浴加热，把浸软的叶子剪碎；

2)加入1.2mL Buffer II，上下颠倒混匀5分钟，10000r/min离心5分钟，弃上清，重复此步骤2～3次，至上清液澄清为止；

3)往步骤2)所得沉淀中加入600μL CTAB提取液、最终质量浓度3％的β-巯基乙醇和2μL蛋白酶K，摇匀，55℃～65℃水浴加热40～60分钟，每隔10分钟上下颠倒摇匀，得混合液；

4)往步骤3)所得混合液中，加入与其等体积的酚、氯仿和异戊醇混合液，混匀，离心，取上清；

5)往步骤4)所得上清中，加入与其等体积的氯仿和异戊醇混合液，混匀，离心，取上清；

6)往步骤5)所得上清中，加入上清0.8倍体积预冷的异丙醇，于-20℃静置10～30分钟，离心，弃上清，洗涤，晾干，TE缓冲液溶解即得；

其中，所述Buffer I的成分为：0.2mol/L Tris-HCl，0.05mol/L EDTA，1mol/LNaCl，pH值为8.0；所述Buffer II的成分为：无菌水与β-巯基乙醇，两者质量比为40:1；所述CTAB提取液含质量浓度2％的聚乙烯吡咯烷酮、1.4mol/L NaCl；所述酚、氯仿和异戊醇混合液中三者的体积比为25：24：1；所述氯仿和异戊醇混合液中两者的体积比为24：1；所述TE缓冲液的成分为：10mmol/L Tris-HCl、1mmol/L EDTA，pH值为8.0。

2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤4)的具体步骤为：加入酚、氯仿和异戊醇混合液后，上下颠倒混匀10分钟，12000r/min离心10分钟。

3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤5)的具体步骤为：加入氯仿和异戊醇混合液后，上下颠倒混匀10分钟，12000r/min离心10分钟。

4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤6)的具体步骤为：沿管壁缓慢旋转加入预冷的异丙醇，上下颠倒混匀，放入-20℃冰箱中沉淀10～30分钟，10000r/min离心5分钟，弃上清，用-20℃预冷的体积分数70％的乙醇水溶液500μL洗涤两次，晾干，用30μL的TE缓冲液溶解，-20℃储存。