CN110628763A - 一种针对顽拗植物的无毒、快速、高效的dna提取方法及应用 - Google Patents

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CN110628763A CN201911058381.8A CN201911058381A CN110628763A CN 110628763 A CN110628763 A CN 110628763A CN 201911058381 A CN201911058381 A CN 201911058381A CN 110628763 A CN110628763 A CN 110628763A
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Abstract

本发明公开一种针对顽拗植物的无毒、快速、高效的DNA提取方法，步骤如下：利用含有交联聚乙烯吡咯烷酮和活性炭的抽提裂解缓冲液在65℃下裂解植物细胞，使染色体离析，蛋白质变性，释放出核酸，同时去除杂质；再加入乙酸和乙酸钾去除部分蛋白质和多糖后，采用PEG/高盐溶液和乙醇连续两次沉淀DNA，以进一步去除剩余杂质，最终得到高纯度的DNA。采用本方法可从顽拗植物的幼叶或成熟叶片中提取出大量高纯度的基因组DNA，对操作者无毒，环境污染小，成本低，时间短，可广泛应用于顽拗植物的基因组DNA的提取。

Description

一种针对顽拗植物的无毒、快速、高效的DNA提取方法及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及植物DNA的提取，尤其是一种针对顽拗植物的无毒、快速、高效的DNA提取方法及应用。
背景技术
DNA的提取是开展植物分子生物学研究的基础。通常DNA的提取方法应满足以下几个主要条件：(1)所得到的DNA应具备理想的纯度；(2)DNA要足够完整，破损程度小，这样才能保证电泳容易获得精确、重复性好的迁移模式；(3)从一批样品中提取到的DNA要尽可能地多，这样可以保证在一个完整的实验中DNA样品间没有差异；(4)提取方法应尽可能具备操作简便、省时、费用低等特点，如有可能，避免使用危险化学药品。
相比传统的SDS法，传统的CTAB法成本高、毒性较大、操作烦琐且产率较低,而SDS法提取的DNA产率将近是CTAB法产率的2倍。对于常见的禾本科和豆科植物，基因组DNA的提取一般较为容易，但是对于顽拗植物(recalcitrant plant)，由于其体内含有大量的多糖、多酚、单宁、色素等严重影响高质量DNA分离的次生代谢物，因而常规的DNA提取方法很难同时满足上述要求。研究证明，如果对这些次生代谢物处理不当，它们就会与蛋白质和核酸发生不可逆地结合，不仅降低了DNA的纯度，而且严重抑制了内切酶和DNA聚合酶的作用，导致DNA溶液粘稠且不能被内切酶所酶切，也不能作为PCR模板供进一步分析使用，若用分光光度计检测则提取出的基因组DNA的D260nm/D280nm值降至1.2～1.4之间。
其次，如果采用各种纯化方法(如多次用酚—氯仿抽提)，虽然最终DNA的纯度可能会达到所要求的标准，但DNA却会因在抽提中不断受到机械剪切的作用而被降解为小片段，且得到的量也大为减少。第三，由于在提取过程中反复抽提，一方面是势必会占用大量时间，另一方面是提取所用到的试剂中氯仿、异戊醇、苯酚、β-巯基乙醇、饱和酚等有机试剂均存在较大毒性，不仅对实验人员的健康不利，而且容易造成水体和大气污染，同时试验废弃物的处理也需要格外关注。因此，有必要开发出一种针对顽拗植物的无毒、快速、高效的DNA提取方法。
通过检索，发现如下一篇与本发明专利申请相关的专利公开文献：
一种“顽拗”植物基因组DNA的提取技术(CN102807977A)，利用洗脱液能成功分离出多糖、多酚等次生代谢物质，解决离心上层液粘稠问题；利用酚；氯仿；异戊醇抽提，再用氯仿；异戊醇抽提，可将蛋白质和酚等抽提干净；防止多酚物质氧化成醌类，避免褐变的发生，成功提取“顽拗”植物高质量基因组DNA。主要应用于细胞内含有大量的多糖、多酚、蹂质以及桂皮醛、桂皮酸等次生代谢物的植物材料基因组DNA提取中。
通过对比，本发明专利申请与上述专利公开文献存在本质的不同。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种针对顽拗植物的无毒、快速、高效的DNA提取方法及应用，采用本方法可从顽拗植物的幼叶或成熟叶片中提取出大量高纯度的基因组DNA，对操作者无毒，环境污染小，成本低，时间短，可广泛应用于顽拗植物的基因组DNA的提取。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种针对顽拗植物的无毒、快速、高效的DNA提取方法，步骤如下：
利用含有交联聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)和活性炭的抽提裂解缓冲液在65℃下裂解植物细胞，使染色体离析，蛋白质变性，释放出核酸，同时去除杂质；再加入乙酸和乙酸钾去除部分蛋白质和多糖后，采用PEG/高盐溶液和乙醇连续两次沉淀DNA，以进一步去除剩余杂质，最终得到高纯度的DNA。
而且，所述抽提裂解缓冲液(GPQ.1A)为：质量终浓度为1.5～4.5％的PEG6000，500～600mM NaCl，100～150mM、pH 8.0的Tris-HCl，40～65mM、pH 8.0的EDTA；临用前加入10～60mg/mL交联聚乙烯吡咯烷酮与10～60mg/mL粉状活性炭。
而且，具体步骤如下：
⑴取植物叶片于液氮中研磨成细粉，立即加入新鲜配制的抽提裂解缓冲液(GPQ.1A)，剧烈摇匀；静置至室温，室温不低于20℃，再次剧烈摇匀；加入溶液AA2，轻缓颠倒摇匀；65℃保温25min，不时轻缓颠倒摇匀，得混合液；
其中，所述植物叶片：抽提裂解缓冲液：溶液AA2的比例(mg：μL：μL)为150±50：1000：60；
⑵加入0.33倍混合液体积的溶液GPQ.1B，轻缓颠倒摇匀；4℃或冰上静置20min；4℃、20000g离心20min，完成后置冰上；
⑶取上清，4℃、20000g离心10min，完成后置冰上；
⑷取上清，转入装有0.5倍混合液体积的溶液GPQ.1D的容器中，轻缓颠倒摇晃30次以上，4℃或冰上静置20min，4℃、5000g离心10min，弃上清；
⑸加入70％乙醇，轻缓颠倒摇晃使沉淀漂浮，4℃、13000g离心5min，弃上清；采用同样的方法再洗涤沉淀1次；短暂离心，使漂浮的沉淀再次沉在离心管的底部，轻缓吸尽残留液体；
⑹加入0.1×TE+溶液，轻缓颠倒摇晃至DNA沉淀完全溶解，65℃开口保温3min，65℃闭口保温15min，即得DNA，-20℃贮存备用。
而且，所述溶液具体为：
溶液AA2：质量终浓度为20％SDS，10～30mg/mL蛋白酶K；
GPQ.1B：5M乙酸钾，质量终浓度为4～20％乙酸；
GPQ.1D：质量终浓度为15～22％PEG6000，3.5～4.2M NaCl；
0.1×TE+：1mM Tris-HCl，0.1mM EDTA，25ng/μL RNaseA，pH8.0。
如上所述的针对顽拗植物的无毒、快速、高效的DNA提取方法在DNA提取方面中的应用。
如上所述的针对顽拗植物的无毒、快速、高效的DNA提取方法在顽拗植物的基因组DNA的提取方面中的应用。
本发明取得的优点和积极效果为：
1、采用本方法可从顽拗植物的幼叶或成熟叶片中提取出大量高纯度的基因组DNA，对操作者无毒，环境污染小，成本低，时间短，可广泛应用于顽拗植物的基因组DNA的提取。
2、由Dellaporta等(1983)的SDS法(D-SDS法)改进而来的本方法适用于从大多数植物，尤其适用于从顽拗植物的幼嫩至成熟叶片中提取基因组DNA，具有无毒、快速、DNA产量高等优点。本方法不含氯仿(剧毒)、β-巯基乙醇(高毒)和异丙醇(低毒)等挥发性有毒试剂，也不含苯酚(剧毒)等非挥发性有毒试剂，实验过程无需通风橱，实验的废弃物均无毒，故而也无需特别处理。使用本方法从加裂解液开始至提取结束(不包括研磨和电泳检测时间)，完成24-30个样品耗时4.5小时左右，多数情况下，150mg叶片可提取出3～7μg DNA，提取的DNA适用于PCR及限制性内切酶切割等分子生物学操作。
3、本发明方法在裂解液中加入了PEG6000，并使用PEG6000/高盐溶液沉淀DNA。在裂解液中加入PEG6000可提高裂解效率，大约可使DNA的产量增加约20～300％；使用PEG6000/高盐溶液沉淀DNA不仅可有效去除多糖，还可除去约35％的RNA(包括NTP)。本方法将D-SDS法中的2次沉淀减为1次沉淀，从而减少了约1小时的操作时间，因此，相对于D-SDS法，本法的提取时间减少了约2小时。
4、在本方法的全部过程中均未使用有机试剂进行抽提，既未使用剧毒的氯仿和苯酚，也未使用高毒的β-巯基乙醇，并且用PEG6000替代了异丙醇(低毒)，亦无其他有毒有害的化学与生物试剂(乙醇除外)，因此有益于操作者健康，对环境的污染程度也很小。
5、由于β-巯基乙醇等巯基试剂和Vc等还原剂均对蛋白酶K的活性有不同程度地抑制作用，因此本方法的另一个改进是在裂解液中同时加入蛋白酶K(降解多酚氧化酶)、PVPP(吸附多酚化合物)与活性炭(吸附色素等)，而没有使用β-巯基乙醇和Vc等试剂，这样在保证蛋白酶K有较高活性的同时除去了多酚类物质和色素类物质。总之，蛋白酶K—PVPP—活性炭的组合使用可使DNA的产量提高约20～100％，因此提取成功的几率较高，即1个样品提取1次并得到足量的DNA的概率较高，这就弥补了本法单次提取耗时较长的不足。
6、由于前述改进，本方法将RNaseA的用量减至D-SDS法的25％以下，基本抵消了因使用蛋白酶K所增加的成本；同时，由于本法为常规方法，即没有使用离心柱等昂贵的耗材或试剂，因此耗材和试剂的成本低廉。
7、本方法可从10种代表性植物的幼叶或成熟叶片中提取出高纯度、高数量的DNA，其中落叶松(针叶)为公认的顽拗植物，杨树和丹参为高酚、高糖类植物，银杏为高酚类植物，莲为高糖类植物。因此，本法具有广泛的适用性。
附图说明
图1为本发明中11个植物叶片DNA提取结果的电泳检测图(3次重复)；其中，λ10、λ20、λ30、λ40、λ50、λ60指λ-DNA的加样量依次为10ng、20ng、30ng、40ng、50ng、60ng；+，幼叶；++，中等成熟叶片；+++，成熟叶片；AF，葱(Allium fistulosum)；BM，大叶黄杨(Buxusmegistophylla)；BN，油菜(Brassica napus)；GB，银杏(Ginkgo biloba)；LP，华北落叶松(Larixprincipis-rupprechtii)；MS，苜蓿(Medicago sativa)；NN，莲(Nehlmbonucifera)；SM，丹参(Salvia miltiorrhiza)；TA，小麦(Triticum aestivum)；PC，加拿大杨(Populus X canadensis)；DNA溶液的加样量为0.25μL/样品；
图2为本发明中4种植物叶片DNA的ISSR-PCR分析结果图；其中，LP，华北落叶松(Larixprincipis-rupprechtii)；TA，小麦(Triticum aestivum)；MS，苜蓿(Medicagosativa)；PC，加拿大杨(Populus X canadensis)；M为DL5,000 DNA分子量标准，9个片段从上到下依次为5,000bp、3,000bp、2,000bp、1,500bp、1,000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；1、2、3分别为3次DNA提取重复的ISSR分析结果，其中LP和TA使用ISSR引物UBC807，MS和PC使用ISSR引物UBC826；
图3为本发明中植物叶片DNA的Hind III与BamH I消化分析结果图；其中，LP，华北落叶松(Larixprincipis-rupprechtii)；TA，小麦(Triticum aestivum)；MS，苜蓿(Medicago sativa)；PC，加拿大杨(Populus X canadensis)；λ为λ-DNA经Hind III酶切的结果，共7个片段，从上到下依次为23130、9416、6557、4361、2322、2027、564；1、2、3分别为3次DNA提取重复的酶切结果。
具体实施方式
下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
一种针对顽拗植物的无毒、快速、高效的DNA提取方法，步骤如下：
利用含有交联聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)和活性炭的抽提裂解缓冲液在65℃下裂解植物细胞，使染色体离析，蛋白质变性，释放出核酸，同时去除杂质；再加入乙酸和乙酸钾去除部分蛋白质和多糖后，采用PEG/高盐溶液和乙醇连续两次沉淀DNA，以进一步去除剩余杂质，最终得到高纯度的DNA。
顽拗植物的细胞中含有大量的多糖、多酚、单宁、色素等严重影响高质量DNA分离的次生代谢物，但裂解细胞时的裂解液、PEG/高盐溶液和乙醇并不是只能去除这些次生代谢物，裂解植物细胞时的裂解液不仅能除去大量的蛋白质、RNA以及SDS-蛋白复合物等物质，而且可以同时去除色素、多酚、丹宁等次生代谢物；到后期，PEG/高盐溶液和乙醇连续两次沉淀DNA时仍然可以进一步地去除多糖类、多酚、蛋白质等杂质。
较优地，所述抽提裂解缓冲液(GPQ.1A)为：质量终浓度为1.5～4.5％的PEG6000，500～600mM NaCl，100～150mM、pH 8.0的Tris-HCl，40～65mM、pH 8.0的EDTA；临用前加入10～60mg/mL交联聚乙烯吡咯烷酮与10～60mg/mL粉状活性炭。
较优地，具体步骤如下：
⑴取植物叶片于液氮中研磨成细粉，立即加入新鲜配制的抽提裂解缓冲液，剧烈摇匀；静置至室温，室温不低于20℃，再次剧烈摇匀；加入溶液AA2，轻缓颠倒摇匀；65℃保温25min，不时轻缓颠倒摇匀，得混合液；
其中，所述植物叶片：抽提裂解缓冲液：溶液AA2的比例(mg：μL：μL)为150±50：1000：60；
⑵加入0.33倍混合液体积的溶液GPQ.1B，轻缓颠倒摇匀；4℃或冰上静置20min；4℃、20000g离心20min，完成后置冰上；
⑶取上清，4℃、20000g离心10min，完成后置冰上；
⑷取上清，转入装有0.5倍混合液体积的溶液GPQ.1D的容器中，轻缓颠倒摇晃30次以上，4℃或冰上静置20min，4℃、5000g离心10min，弃上清；
⑸加入70％乙醇，轻缓颠倒摇晃使沉淀漂浮，4℃、13000g离心5min，弃上清；采用同样的方法再洗涤沉淀1次；短暂离心，使漂浮的沉淀再次沉在离心管的底部，轻缓吸尽残留液体；
⑹加入0.1×TE+溶液，轻缓颠倒摇晃至DNA沉淀完全溶解，65℃开口保温3min，65℃闭口保温15min，即得DNA，-20℃贮存备用。
较优地，所述溶液具体为：
溶液AA2：质量终浓度为20％SDS，10～30mg/mL蛋白酶K；
GPQ.1B：5M乙酸钾，质量终浓度为4～20％乙酸；
GPQ.1D：质量终浓度为15～22％PEG6000，3.5～4.2M NaCl；
0.1×TE+：1mM Tris-HCl，0.1mM EDTA，25ng/μL RNaseA，pH8.0。
如上所述的针对顽拗植物的无毒、快速、高效的DNA提取方法在DNA提取方面中的应用。
如上所述的针对顽拗植物的无毒、快速、高效的DNA提取方法在顽拗植物的基因组DNA的提取方面中的应用。
具体地，选用下列10种植物材料来实施本发明，具体的实施例有：百合科的葱(Allium fistulosum)的成熟叶片、卫矛科的大叶黄杨(Buxus megistophylla)的幼叶、十字花科的油菜(Brassica napus)的中等成熟叶片、银杏科的银杏(Ginkgo biloba)的成熟叶片、松科的华北落叶松(Larixprincipis-rupprechtii)的幼叶、蝶形花科的紫花苜蓿(Medicago sativa)的幼叶、莲科的莲(Nehlmbo nucifera)的中等成熟叶片、唇形科的丹参(Salvia miltiorrhiza)的成熟叶片、禾本科的小麦(Triticum aestivum)的中等成熟叶片和杨柳科的加拿大杨(Populus Xcanadensis)的中等成熟叶片及成熟叶片。其中，落叶松(针叶)为公认的顽拗植物，杨树和丹参为高酚、高糖植物，银杏为高酚类植物，莲为高糖类植物。因此可将这些实施例理解为示例性的，本发明方法对于上述科中的其他植物同样适用。
更为具体地，步骤如下：
一、试剂的配制
常规SDS法提取缓冲液的配制不再赘述，下面为GPQ.1A、AA2、GPQ.1B、GPQ.1D和0.1×TE+溶液的组成及各自的工作浓度。
提取裂解缓冲溶液(GPQ.1A)：1.5～4.5％PEG6000，500～600mM NaCl，100～150mMTris-HCl(pH 8.0)，40-65mM EDTA(pH 8.0)，临用前加入10～60mg/mL PVPP(交联聚乙烯吡咯烷酮，又称交联聚维酮)与10～60mg/mL粉状活性炭
溶液AA2：20％SDS，10～30mg/mL蛋白酶K
GPQ.1B：5M乙酸钾，4～20％乙酸
GPQ.1D：15～22％PEG6000，3.5～4.2M NaCl
0.1×TE+：1mM Tris-HCl，0.1mM EDTA，25ng/μL RNaseA，pH8.0
二、提取步骤
1.提取裂解缓冲液(GPQ.1A)的配制：1.5～4.5％PEG6000，500～600mM NaCl，100～150mM Tris-HCl(pH 8.0)，40-65mM EDTA(pH 8.0)；临用前加入10～60mg/mLPVPP(交联聚乙烯吡咯烷酮，又称交联聚维酮)与10～60mg/mL粉状活性炭
2.10种植物的11种叶片样品(见表1)各取150±50mg左右，于液氮中研磨成细粉，转入2mL离心管中，立即加入1000μL新鲜配制的裂解液，剧烈摇匀；静置至室温(不低于20℃)后，再次剧烈摇匀；加入60μL的溶液AA2与6μL蛋白酶K贮液，轻缓颠倒摇匀；65℃保温25min，不时轻缓颠倒摇匀(加裂解液时使用开口较大的吸头吸取，且不时摇匀，以保持溶液均匀；加入AA2与蛋白酶K后切忌剧烈摇匀)。
3.加入0.33体积的溶液GPQ.1B，轻缓颠倒摇匀；4℃或冰上静置20min；离心(4℃，20000g，20min)，完成后置冰上。
4.取上清(约1040μL)，离心(4℃，20000g，10min)，完成后置冰上。
5.取上清(约940μL)，转入装有0.5体积溶液GPQ.1D的1.5mL离心管中，轻缓颠倒摇晃30次以上混匀，4℃或冰上静置20min。离心(4℃，5000g，10min)，弃上清。
6.加入1000μL的70％乙醇，轻缓颠倒摇晃使沉淀漂浮，离心(4℃，13000g，5min)，弃上清；同样方法再清洗沉淀1次；短暂离心使得漂浮的沉淀再次沉在离心管的底部，轻缓吸尽残留液体。
7.加入0.1×TE+溶液，轻缓颠倒摇晃至DNA沉淀完全消失，65℃开口保温3min，65℃闭口保温15min，-20℃贮存备用。
表1.10种代表性植物基因组DNA的(11种叶片样品)提取与检测
三、DNA产量与纯度的检测
为检测所提取基因组DNA的产量和完整性，上述33个样品(11个样品、每个样品的3次DNA提取重复)各取0.2μLDNA溶液，与λ-DNA分子质量标准所设置的6个浓度梯度，一起在加有溴化乙锭的0.7％琼脂糖凝胶上电泳(80V/45min)，最后使用SYNGENEAutomated GelDocumentation System进行照相。对λ-DNA所设置的6个梯度，读取它们各自的灰度值后拟合直线方程，以计算样品DNA的产量。使用DeNovix DS-11分光光度仪测定所提取DNA的OD260/OD230和OD260/OD280两个比值，以检测其纯度。结果如图1所示，结果显示，使用本发明方法从10种植物的11种叶片样品中提取到的DNA完整性好，平均产量为5.07μg/150mg，范围为2.78～7.98μg/150mg，OD260/OD230在1.89～2.44之间，OD260/OD280在1.96～2.09之间(见表1)，表明使用本法提取的植物DNA产量高、纯度大。
四、ISSR-PCR分析
为进一步验证采用本发明方法所提取的基因组DNA的质量，随机选取华北落叶松、苜蓿、小麦和加拿大杨4种植物的DNA进行ISSR-PCR分析，且每种植物取3个DNA提取重复进行分析。
反应总体积20μL，包括0.8U Taq DNA聚合酶(Takara)，0.2mM dNTPs(Takara)，0.4μM引物(上海生工)，30ng模板DNA，15mM MgCl2。其中，落叶松和小麦使用ISSR引物UBC807(5'-AGAGAGAGAGAGAGAGT-3')，苜蓿和杨树使用ISSR引物UBC826(5'-ACACACACACACACACC-3')。
反应程序为94℃变性3min；94℃变性30s，62℃退火45s，每循环降低1℃，72℃延伸60s，共进行10个循环；94℃变性30s，52℃退火45s，72℃延伸60s，共进行26个循环；72℃延伸7min。
反应结束后将4μL 6×加样缓冲液与PCR产物混匀，取3μL混合液与DNA分子量标准一起在加有溴化乙锭(EB)的1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳检测(90V/40min)，最后使用SYNGENE Automated Gel Documentation System进行照相。
结果如图2所示，结果显示，以采用本发明方法提取的4种植物的DNA为模板均发生了高效率的PCR反应，产生了良好的ISSR图谱，表明使用本法提取的植物DNA可用于PCR分析。
五、限制性内切酶消化分析
选择小麦、华北落叶松、加拿大杨和苜蓿4种植物的DNA进行限制性内切酶消化分析。每种植物取3个DNA提取重复的DNA进行酶切，并使用λ-DNA作为正对照。酶切反应的总体积为55μL，包括24U Hind III(Takara)，24U BamH I(Takara)，1×反应缓冲液K，2.4μg植物DNA，其中λ-DNA仅加入Hind III。将反应液在37℃保温过夜(12小时以上)，70℃保温10min以灭活酶。然后将11μL 6×加样缓冲液与酶切产物混匀，取20μL在加有溴化乙锭(EB)的0.7％琼脂糖凝胶上进行电泳检测(90V/70min)，最后使用SYNGENE Automated GelDocumentation System进行照相。结果如图3所示，结果显示，使用本法提取的4种植物的DNA均酶切完全，无降解，产生了良好的酶切图谱，表明使用本法提取的植物DNA可用于酶切分析。
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例和附图所公开的内容。

Claims (6)

1.一种针对顽拗植物的无毒、快速、高效的DNA提取方法，其特征在于：步骤如下：
利用含有交联聚乙烯吡咯烷酮和活性炭的抽提裂解缓冲液在65℃下裂解植物细胞，使染色体离析，蛋白质变性，释放出核酸，同时去除杂质；再加入乙酸和乙酸钾去除部分蛋白质和多糖后，采用PEG/高盐溶液和乙醇连续两次沉淀DNA，以进一步去除剩余杂质，最终得到高纯度的DNA。
2.根据权利要求1所述的针对顽拗植物的无毒、快速、高效的DNA提取方法，其特征在于：所述抽提裂解缓冲液为：质量终浓度为1.5～4.5％的PEG6000，500～600mM NaCl，100～150mM、pH 8.0的Tris-HCl，40～65mM、pH 8.0的EDTA；临用前加入10～60mg/mL交联聚乙烯吡咯烷酮与10～60mg/mL粉状活性炭。
3.根据权利要求1或2所述的针对顽拗植物的无毒、快速、高效的DNA提取方法，其特征在于：具体步骤如下：
⑴取植物叶片于液氮中研磨成细粉，立即加入新鲜配制的抽提裂解缓冲液，剧烈摇匀；静置至室温，室温不低于20℃，再次剧烈摇匀；加入溶液AA2，轻缓颠倒摇匀；65℃保温25min，不时轻缓颠倒摇匀，得混合液；
其中，所述植物叶片：抽提裂解缓冲液：溶液AA2的比例mg：μL：μL为150±50：1000：60；
⑵加入0.33倍混合液体积的溶液GPQ.1B，轻缓颠倒摇匀；4℃或冰上静置20min；4℃、20000g离心20min，完成后置冰上；
⑶取上清，4℃、20000g离心10min，完成后置冰上；
⑷取上清，转入装有0.5倍混合液体积的溶液GPQ.1D的容器中，轻缓颠倒摇晃30次以上，4℃或冰上静置20min，4℃、5000g离心10min，弃上清；
⑸加入70％乙醇，轻缓颠倒摇晃使沉淀漂浮，4℃、13000g离心5min，弃上清；采用同样的方法再洗涤沉淀1次；短暂离心，使漂浮的沉淀再次沉在离心管的底部，轻缓吸尽残留液体；
⑹加入0.1×TE+溶液，轻缓颠倒摇晃至DNA沉淀完全溶解，65℃开口保温3min，65℃闭口保温15min，即得DNA，-20℃贮存备用。
4.根据权利要求3所述的针对顽拗植物的无毒、快速、高效的DNA提取方法，其特征在于：所述溶液具体为：
溶液AA2：质量终浓度为20％SDS，10～30mg/mL蛋白酶K；
GPQ.1B：5M乙酸钾，质量终浓度为4～20％乙酸；
GPQ.1D：质量终浓度为15～22％PEG6000，3.5～4.2M NaCl；
0.1×TE+：1mM Tris-HCl，0.1mM EDTA，25ng/μLRNaseA，pH8.0。
5.如权利要求1至4任一项所述的针对顽拗植物的无毒、快速、高效的DNA提取方法在DNA提取方面中的应用。
6.如权利要求1至4任一项所述的针对顽拗植物的无毒、快速、高效的DNA提取方法在顽拗植物的基因组DNA的提取方面中的应用。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111100861A (zh) * 2020-01-17 2020-05-05 杨美青 一种植物dna的快速提取方法
CN113151255A (zh) * 2021-05-26 2021-07-23 中国科学院植物研究所 一种植物叶片基因组dna快速提取方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103820432A (zh) * 2014-02-26 2014-05-28 云南省烟草农业科学研究院 一种快速提取干燥烟草叶片dna的方法
CN108707692A (zh) * 2018-06-25 2018-10-26 武汉市农业科学院 一种快速鉴定西瓜品种‘鄂西瓜16号’杂交种子纯度的方法及引物
CN108841820A (zh) * 2018-05-31 2018-11-20 天津农学院 高效提取植物基因组dna的无毒提取液组合gpr.1及提取方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103820432A (zh) * 2014-02-26 2014-05-28 云南省烟草农业科学研究院 一种快速提取干燥烟草叶片dna的方法
CN108841820A (zh) * 2018-05-31 2018-11-20 天津农学院 高效提取植物基因组dna的无毒提取液组合gpr.1及提取方法
CN108707692A (zh) * 2018-06-25 2018-10-26 武汉市农业科学院 一种快速鉴定西瓜品种‘鄂西瓜16号’杂交种子纯度的方法及引物

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111100861A (zh) * 2020-01-17 2020-05-05 杨美青 一种植物dna的快速提取方法
CN113151255A (zh) * 2021-05-26 2021-07-23 中国科学院植物研究所 一种植物叶片基因组dna快速提取方法

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