CN108841820A - 高效提取植物基因组dna的无毒提取液组合gpr.1及提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高效提取植物基因组DNA的无毒提取液组合GPR.1及基于该提取液的提取方法。具体包括：利用含PEG8000、PVPP和蛋白酶K的SDS抽提缓冲液裂解植物细胞，使染色体离析、蛋白质变性，释放出核酸；然后，在加入乙酸钾去除大部分蛋白质和多糖后，采用PEG8000/高盐溶液和乙醇/高盐溶液连续两次沉淀DNA，以去除多糖类、多酚类、RNA、NTP等杂质，最终得到大量高纯度的DNA。采用本方法可从多种植物的叶片(幼叶或成熟叶片)中提取出大量高纯度的基因组DNA，对操作者无毒，环境污染小，成本低，时间短。

Description

高效提取植物基因组DNA的无毒提取液组合GPR.1及提取方法

技术领域

本发明涉及植物基因组DNA的提取方法和无毒高效提取液，属于生物技术领域。

背景技术

分离出符合研究目标和要求的DNA是开展现代分子生物学研究的第一步。与动物相比，植物细胞除有细胞壁外，不仅含有多糖、多酚等多种不易与DNA分离的次生代谢物，而且用于DNA提取的组织(如叶片)的成熟度也常常难以控制，因此，植物DNA提取的成功率低，难度较大(陈章良等译，Angeles et al.Extraction of genomic DNA from the lipid-,polysaccharide-,and polyphenol-rich coconut(Cocos nucifera L.)[J].Plant MolBiol Rep,2005,23:297a-297i；Ogunkanmi et al.An improved method of extractinggenomic DNA from preserved tissues of Capsicum annuum for PCR amplification[J].EurAsia J BioSci,2008,2:115-119；Heidari et al.Rapid and efficientisolation of high quality nucleic acids from plant tissues rich inpolyphenols and polysaccharides[J].Mol Biotechnol,2011,49:129-137)。

依据提取缓冲液中选用的表面活性剂和最后纯化、回收DNA方法的不同，从植物组织中分离DNA的方法通常有4种(见表1)，即：常规CTAB法、常规SDS法、SDS吸附法和CTAB吸附法。通常，采用前两种方法可从几乎所有植物较为幼嫩的叶片中提取到满足实验要求的足量DNA且费用低廉。其中，常规CTAB法在细胞膜裂解和去除多糖方面的表现要优于常规SDS法，因而其适用性更加广泛，使用频率也最高。但这两种方法也存在不足，一是提取时间长，二是在绝大多数情况下要使用剧毒的氯仿/苯酚进行抽提。各种试剂盒多采用后两种方法，但费用远高于前两种方法。相比较而言，SDS——吸附法的提取时间较短，且无有机抽提，但费用高昂、DNA产量低，适用范围较小(Clark MS.Plant Molecular biology-A laboratorymanual[M].Copyright Springer-Verlag,Berlin Heidelberg,1997,3-11.；Tanaka J,Ideka S.Rapid and efficient DNA extraction method from various plant speciesusing diatomaceous earth and spin filter[J].Breed Sci,2002,52:151-155.；MurrayMG,Thompson WE.Rapid isolation of high molecular weight DNA[J].Nucleic AcidsRes,1980,8:4221-4235，Doyle JJ,Doyle JL.Isolation of plant DNA from freshtissue[J].Focus,1990,12:12-15.；Dellaporta et al.A plant DNA minipreparationVer.II[J].Plant Mol Bio Rep,1983(1):19-21.；Edwards et al.A simple and rapidmethod for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis[J].NucleicAcids Res,1991,19:1349.；孙璐宏等.植物基因组DNA提取与纯化研究进展[J].西北林学院学报，2010，25(6)：102-106.)。

表1植物DNA提取方法的比较

在常规的植物DNA提取方法中，氯仿、苯酚被广泛用于抽提以除去蛋白质和多糖，β-巯基乙醇被用于防止多酚类物质的氧化，异丙醇用于沉淀DNA。其中：氯仿极易挥发，经呼吸系统或皮肤吸收入人体后可引起中毒，且有致癌的可能，虽不可燃但为制毒用化合物，因此其生产、销售及使用受到严格的管控；β-巯基乙醇易挥发，可燃，对人类表现为高毒；异丙醇有一定挥发性，对人体表现为低毒，但在常温下可引火燃烧，其蒸汽与空气的混合易形成爆炸混合物；苯酚虽无挥发性但可燃，对人体则表现为高毒。总之，上述有机试剂不仅对操作者的健康有害，而且容易造成水体和大气污染。

近年来，我国对安全问题和环境问题越来越重视，因此，无有机抽提乃至无毒日渐成为DNA提取方法的重要发展方向之一。Dellaporta等(Dellaporta et al.A plant DNAminipreparation Ver.II[J].Plant Mol Bio Rep,1983(1):19-21.)和Edwards等(Edwards et al.A simple and rapid method for the preparation of plant genomicDNA for PCR analysis[J].Nucleic Acids Res,1991,19:1349.)先后发明了两种无有机抽提的SDS法。但这两种方法及其衍生方法与常规SDS法一样，裂解细胞膜和除多糖的能力均较差，产量低，因而适用范围狭窄，实际应用很少；同时，这些方法均使用了有毒的β-巯基乙醇和异丙醇。此外，为了提高SDS法的DNA产量，一些学者在裂解液中添加了一定量的蛋白酶K(Jobes et al.Plant DNA isolation:method to efficiently removepolyphenolics,polysaccharides and RNA.Taxon,1995,44:379-389.；Mahuku GS.ASimple Extraction Method Suitable for PCR-Based Analysis of Plant,Fungal,andBacterial DNA.Plant Mol Biol Rep,2004,22:71-81.)，但在裂解液中同时添加的β-巯基乙醇等巯基试剂或L-抗坏血酸(Vc)等还原剂都对蛋白酶K的活性具有一定的抑制作用，因此，其效果有限。对这两种方法进行改进，克服其缺点，进而开发出无毒、高效、适用性广、费用低的植物DNA提取方法，是解决植物DNA提取过程中存在问题的途径之一。目前，此类提取基因组DNA的方法及应用还未有报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种无毒、高效、适应性广的植物基因组DNA的提取液组合GPR.1及基于该提取液的提取方法。采用本发明提取液及提取方法可从多种植物的叶片(幼叶或成熟叶片)中提取出大量高纯度的基因组DNA，对操作者无毒，环境污染小，成本低，时间短。

本发明提供一种高效提取植物基因组DNA的无毒提取液组合GPR.1，组成如下：

溶液GPR.1A：2～3.5％PEG8000，0.5M NaCl，0.1M Tris-HCl，0.05M EDTA，2～4％PVPP临用前加入，余量为双蒸水；

溶液GPR.1D：18～20％PEG8000，3.3～3.6M NaCl，余量为双蒸水；

溶液GNR.1E：50mM Tris-HCl，10mM EDTA，2.5M NaCl，余量为双蒸水；

还包括：

20mg/mL蛋白酶K，使用时单独加入；

20％SDS，使用时单独加入；

5M乙酸钾溶液，使用时单独加入。

优选的，所述Tris-HCl是pH 8.0的Tris-HCl溶液。

优选的，所述EDTA是pH 8.0的EDTA溶液。

本发明还提供一种基于上述无毒提取液组合GPR.1的提取方法，技术方案概述如下：利用溶液GPR.1A(含有PEG8000、PVPP)与蛋白酶K结合的SDS抽提缓冲液在65℃下裂解植物细胞，使染色体离析，蛋白质变性，释放出核酸；加入乙酸钾去除大部分蛋白质和多糖的沉淀后，采用溶液GPR.1D(PEG8000/高盐溶液)和乙醇/溶液GNR.1E(乙醇/高盐溶液)连续两次沉淀DNA，去除多糖类、多酚类等杂质，得到大量高纯度的DNA

进一步地，在第二次沉淀DNA之前还可以加入少量RNase A，去除RNA影响。

进一步地，所述提取方法具体包括以下步骤：

(1)取植物叶片，于液氮中研磨成细粉，迅速转入2mL离心管中，按每150mg±50mg植物叶片加入1000μL溶液GPR.1A，剧烈摇匀；再加入65μL 20％SDS与5～6μL 20mg/mL蛋白酶K贮液，轻缓颠倒摇匀；65℃保温30min，不时轻缓颠倒摇匀；

(2)加入离心管三分之一体积的5M乙酸钾溶液，65℃保温1min，立即轻缓颠倒摇匀；4℃或冰上静置20min；4℃，20000×g，离心20min，完成后置冰上；

(3)取上清液约1000μL，转入装有二分之一体积的溶液GPR.1D的1.5mL离心管中，轻缓颠倒摇晃30次以上直至混匀，4℃静置25min。4℃，4000～5000×g，离心15min，弃上清；短暂离心，用吸头轻缓吸尽残留液体；

(4)加入0.1×TE(pH 8.0)200μL和10mg/mL RNase A贮液2μL，轻缓摇晃至沉淀完全消失，65℃保温15min；加入300μL的溶液GPR.1E，混匀；4℃，20000×g，离心10min，完成后置冰上；

(5)取上清液450μL，转入装有1000μL-20℃预冷的无水乙醇的1.5mL离心管中，仔细混匀，4℃静置20min；4℃，13000～14000g，离心10min，弃上清；

(6)加入70％乙醇1000μL，轻缓颠倒摇匀几次，4℃，13000～14000g，离心5min，弃上清；短暂离心，吸尽残留液体；加入30μL的0.1×TE(pH 8.0)溶液，轻弹至DNA沉淀完全消失，65℃保温15min，-20℃贮存备用。

说明：叶片的加样量可按照叶片的成熟度和叶脉的多少适当予以增减。

与常规的SDS法相比，本发明的优点和有益效果是：

1)无毒：在试验过程中，没有使用剧毒的氯仿和苯酚进行抽提，用PEG8000代替低毒的异丙醇，用蛋白酶K配合PVPP代替高毒的β-巯基乙醇，亦无其他有毒有害的化学与生物试剂(乙醇除外)，因此采用本方法提取DNA不仅对操作者的健康无损害，对环境的污染程度也很小。

2)产量高：由于未在裂解液中添加β-巯基乙醇等巯基试剂或Vc等还原剂，而是将PEG8000、PVPP与蛋白酶K结合使用，有效提高了蛋白酶K的作用，因此DNA产量提高了大约50～200％。

3)纯度高：一方面，相继使用PEG8000/高盐溶液和乙醇/高盐溶液沉淀DNA，有效减少了多糖与DNA的共沉淀，同时在最终得到的DNA溶液中残留的RNA与NTP大约减少了70％；另一方面，在裂解液中加入PEG8000和PVPP，并在加入乙酸钾的同时加入了乙酸，因而有效去除了多酚类物质极其氧化产物。

4)成本低：本方法将RNase A的用量减至常规SDS法的三分之一以下，并取消了RNase A单独处理RNA的时间，即节约了成本又缩短了提取的时间，完成24～30个样品仅需5.5h左右。加之本法未使用离心柱等昂贵耗材或试剂，因此耗材和试剂方面的成本低。

5)适用性广：可从多糖、多酚含量不同的多种植物的幼叶、中等成熟叶片以及成熟叶片中提取出大量高纯度的DNA。

附图说明

图1：11个样品DNA提取结果的电泳检测(3次重复)；λ10、λ20、λ30、λ40、λ50、λ60指λ-DNA的加样量依次为10ng、20ng、30ng、40ng、50ng、60ng；+：幼叶，++：中等成熟叶片，+++：成熟叶片；BM：大叶黄杨(Buxus megistophylla)，AF：葱(Allium fistulosum)，BN：油菜(Brassica napus)，GB：银杏(Ginkgo biloba)，LP：华北落叶松(Larix principis-rupprechtii)，MS：苜蓿(Medicago sativa)，NN：莲(Nehlmbo nucifera)，SM：丹参(Salviamiltiorrhiza)，TA：小麦(Triticum aestivum)，PC：加拿大杨(Populus X canadensis)；DNA溶液的加样量为0.2μL/样品。

图2：4种植物叶片DNA的ISSR-PCR分析结果；LP：华北落叶松(Larix principis-rupprechtii)，MS：苜蓿(Medicago sativa)，TA：小麦(Triticum aestivum)，PC：加拿大杨(Populus X canadensis)；M为DL5 000DNA分子量标准，9个片段从上到下依次为5 000bp、3000bp、2 000bp、1 500bp、1 000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；1、2、3分别为3次DNA提取重复的ISSR分析结果，其中LP和TA使用ISSR引物UBC807，MS和PC使用ISSR引物UBC826。

图3：植物叶片DNA的Hind III与BamH I消化分析结果；TA：小麦(Triticumaestivum)，LP：华北落叶松(Larix principis-rupprechtii)，PC：加拿大杨(Populus Xcanadensis)，MS：苜蓿(Medicago sativa)；λ：λ-DNA Hind III酶切结果，共7个片段，从上到下依次为23130、9416、6557、4361、2322、2027、564；D：未酶切的植物基因组DNA；1、2、3分别为3次DNA提取重复的酶切结果。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

以下实施例中选用卫矛科中的大叶黄杨(Buxus megistophylla)、百合科中的葱(Allium fistulosum)、蝶形花科中的紫花苜蓿(Medicago sativa)、十字花科中的油菜(Brassica napus)、银杏科中的银杏(Ginkgo biloba)、松科中的华北落叶松(Larixprincipis-rupprechtii)、莲科中的莲(Nehlmbo nucifera)、唇形科中的丹参(Salviamiltiorrhiza)、禾本科中的小麦(Triticum aestivum)、杨柳科中的加拿大杨(Populus Xcanadensis)实施本发明。其中，落叶松(针叶)为公认的顽拗植物，杨树和丹参为高酚、高糖植物，银杏为高酚类植物，莲为高糖类植物，上述均为难以用常规方法提取到基因组DNA的植物。以下实施例应理解为示例性的，本发明对于上述科中的其他植物也能达到相同或相近的技术效果，对上述未列举的植物同样适用。

实施例1

提取液的配制：

常规SDS法提取缓冲液的配制不再赘述，下面为GPR.1A、GPR.1D和GPR.1E溶液的组成及各自的工作浓度。

溶液GPR.1A：3.3％PEG8000，0.5M NaCl，0.1M Tris-HCl，0.05M EDTA，3.5％PVPP临用前加入，余量为双蒸水；

溶液GPR.1D：18.5％PEG8000，3.5M NaCl，余量为双蒸水；

溶液GNR.1E：50mM Tris-HCl，10mM EDTA，2.5M NaCl，余量为双蒸水；

20mg/mL蛋白酶K，使用时单独加入；

20％SDS，使用时单独加入；

5M乙酸钾溶液，使用时单独加入。

上述溶液中的百分数指100mL溶液中含有溶质的克数。

上述Tris-HCl是pH 8.0的Tris-HCl溶液。

上述EDTA是pH 8.0的EDTA溶液。

10种代表性植物基因组DNA的提取：

(1)10种植物的11种叶片样品(见表2)各取150±50mg(按叶片成熟度、叶脉多少适当增减)，于液氮中研磨成细粉，迅速转入2mL离心管中，立即加入1000μL溶液GPR.1A，剧烈摇匀；加入65μL 20％SDS与5.5μL 20mg/mL蛋白酶K贮液，轻缓颠倒摇匀；65℃保温30min，不时轻缓颠倒摇匀。要点：叶片、离心管及研磨工具在研磨时均要充分冻透，且快速研磨，以防组织解冻；加溶液GPR.1A时要不时摇匀，以保持溶液均匀；加入SDS与蛋白酶K后切忌剧烈摇匀。

(2)加入三分之一体积的5M乙酸钾，65℃保温1min，立即轻缓颠倒摇匀；4℃或冰上静置20min；离心(4℃，20000×g，20min)，完成后置冰上。

(3)吸取上清液(约1000μL)，转入已装有二分之一体积的GPR.1D溶液的2.0mL离心管中，轻缓颠倒摇晃30次以上直至混匀，4℃静置25min。离心(4℃，5000×g，15min)，弃上清液；短暂离心，用吸头轻缓吸尽残留液体并弃去。

(4)加入0.1×TE(pH 8.0)200μL和10mg/mL RNase A贮液2μL，轻缓摇晃直至沉淀完全溶解，65℃保温15min；加入300μL的GPR.1E溶液，混匀；离心(4℃，20000×g，10min)，完成后将其置于冰上。

(5)取上清液450μL，转入装有1000μL无水乙醇(已于-20℃预冷)的1.5mL离心管中，仔细混匀，4℃下静置20min；离心(4℃，14000×g，10min)，弃上清液，短暂离心，吸尽残留液体并将之弃去。

(6)加入1000μL 70％乙醇，轻缓颠倒摇匀几次，离心(4℃，14000×g，5min)，弃上清液；短暂离心，吸尽残留液体并将之弃去；加入30μL的0.1×TE(pH 8.0)溶液，轻弹至DNA沉淀完全溶解，65℃保温15min，-20℃贮存备用。

表2 10种植物DNA(11种叶片样品)的提取与检测

DNA产量与纯度的检测：

为检测所提取基因组DNA的产量和完整性，上述33个样品(11个样品、每个样品的3次DNA提取重复)各取0.2μL DNA溶液，与λ-DNA分子质量标准所设置的6个浓度梯度，一起在加有溴化乙锭的0.7％琼脂糖凝胶上进行电泳检测(80V/45min)，最后使用SYNGENEAutomated Gel Documentation System进行照相。对λ-DNA所设置的6个梯度，分别读取它们各自的灰度值后拟合直线方程，以计算样品DNA的产量。使用DeNovix DS-11分光光度仪测定所提取DNA的OD₂₆₀/OD₂₃₀和OD₂₆₀/OD₂₈₀两个比值，以检测其纯度。结果显示，使用本发明方法从10种植物的11种叶片样品中提取到的DNA完整性好(见图1)，DNA产量为2.88～8.26μg/150mg，平均产量为5.38μg/150mg；OD₂₆₀/OD₂₃₀在1.86～2.34之间，OD₂₆₀/OD₂₈₀在1.83～2.04之间(见表2)。这表明使用本法提取的植物DNA产量大、纯度高。

ISSR-PCR分析：

为进一步验证采用该方法所提取的基因组DNA的质量，随机选取华北落叶松、苜蓿、小麦和加拿大杨4种植物的DNA进行ISSR-PCR分析，且每种植物取3个DNA提取重复进行分析。

反应总体积为20μL，包括0.8U Taq DNA聚合酶(Takara)，0.2mM dNTPs(Takara)，0.4μM引物(上海生工)，30ng模板DNA，15mM MgCl₂。其中，落叶松和小麦使用ISSR引物UBC807(5'-AGAGAGAGAGAGAGAGT-3')，苜蓿和杨树使用ISSR引物UBC826(5'-ACACACACACACACACC-3')。

反应程序为：94℃变性3min；94℃变性30s，62℃退火45s，每循环降低1℃，72℃延伸60s，共进行10个循环；94℃变性30s，52℃退火45s，72℃延伸60s，共进行26个循环；72℃延伸7min。

反应结束后将4μL 6×加样缓冲液与PCR产物混匀，从中取3μL混合液与DNA分子量标准一起在加有溴化乙锭(EB)的1.5％的琼脂糖凝胶上进行电泳检测(90V/40min)，最后使用SYNGENE Automated Gel Documentation System进行照相。结果显示，随机选取的上述4种植物的DNA模板均发生了高效率的PCR反应，产生了良好的ISSR图谱(见图2)，表明使用本法提取的植物DNA可用于PCR分析。

限制性内切酶消化分析：

选择华北落叶松、苜蓿、小麦和加拿大杨4种植物的DNA样品进行限制性内切酶消化分析。每种植物取3个DNA提取重复的DNA样品进行酶切，并使用λ-DNA作为正对照。酶切反应总体积为55μL，包括24U Hind III(Takara)，24U BamH I(Takara)，1×反应缓冲液K，2.4μg植物DNA，其中λ-DNA仅加入Hind III。将反应液在37℃保温12h以上，70℃保温10min以灭活酶。然后将11μL 6×加样缓冲液与酶切产物混匀，取20μL混合物在加有溴化乙锭(EB)的0.7％的琼脂糖凝胶上进行电泳检测(90V/70min)，最后使用SYNGENE Automated GelDocumentation System进行照相。结果显示，使用本法提取的4种植物的DNA均可酶切完全，无降解，产生了良好的酶切图谱(见图3)。这表明使用本法提取的植物DNA可用于酶切分析。

Claims (7)

1.一种高效提取植物基因组DNA的无毒提取液组合GPR.1，其组成如下：

溶液GPR.1A：2～3.5％PEG8000，0.5M NaCl，0.1M Tris-HCl，0.05M EDTA，2～4％PVPP临用前加入，余量为双蒸水；

溶液GPR.1D：18～20％PEG8000，3.3～3.6M NaCl，余量为双蒸水；

溶液GNR.1E：50mM Tris-HCl，10mM EDTA，2.5M NaCl，余量为双蒸水；

还包括：

20mg/mL蛋白酶K，使用时单独加入；

20％SDS，使用时单独加入；

5M乙酸钾溶液，使用时单独加入。

2.如权利要求1所述的一种高效提取植物基因组DNA的无毒提取液组合GPR.1，其特征在于，所述Tris-HCl是pH 8.0的Tris-HCl溶液。

3.如权利要求1所述的一种高效提取植物基因组DNA的无毒提取液组合GPR.1，其特征在于，所述EDTA是pH 8.0的EDTA溶液。

4.权利要求1或2或3所述的无毒提取液组合GPR.1应用于提取植物基因组DNA的用途。

5.一种基于权利要求1或2或3所述的无毒提取液组合GPR.1提取植物基因组DNA的方法，其特征在于：利用GPR.1A与蛋白酶K结合的SDS抽提缓冲液在65℃下裂解植物细胞，使染色体离析，蛋白质变性，释放出核酸；加入乙酸钾去除大部分蛋白质和多糖的沉淀后，采用GPR.1D和乙醇/GNR.1E连续两次沉淀DNA，去除多糖类、多酚类等杂质，得到大量高纯度的DNA。

6.如权利要求5所述的提取植物基因组DNA的方法，其特征在于，在第二次沉淀DNA之前加入少量RNase A，去除RNA影响。

7.如权利要求6所述的提取植物基因组DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)取植物叶片，于液氮中研磨成细粉，迅速转入2mL离心管中，按每150mg±50mg植物叶片加入1000μL溶液GPR.1A，剧烈摇匀；再加入65μL 20％SDS与5～6μL 20mg/mL蛋白酶K贮液，轻缓颠倒摇匀；65℃保温30min，不时轻缓颠倒摇匀；

(2)加入离心管三分之一体积的5M乙酸钾溶液，65℃保温1min，立即轻缓颠倒摇匀；4℃或冰上静置20min；4℃，20000×g，离心20min，完成后置冰上；

(3)取上清液约1000μL，转入装有二分之一体积的溶液GPR.1D的1.5mL离心管中，轻缓颠倒摇晃30次以上直至混匀，4℃静置25min。4℃，4000～5000×g，离心15min，弃上清；短暂离心，用吸头轻缓吸尽残留液体；

(4)加入0.1×TE(pH 8.0)200μL和10mg/mL RNase A贮液2μL，轻缓摇晃至沉淀完全消失，65℃保温15min；加入300μL的溶液GPR.1E，混匀；4℃，20000×g，离心10min，完成后置冰上；

(5)取上清液450μL，转入装有1000μL-20℃预冷的无水乙醇的1.5mL离心管中，仔细混匀，4℃静置20min；4℃，13000～14000g，离心10min，弃上清；

(6)加入70％乙醇1000μL，轻缓颠倒摇匀几次，4℃，13000～14000g，离心5min，弃上清；短暂离心，吸尽残留液体；加入30μL的0.1×TE(pH 8.0)溶液，轻弹至DNA沉淀完全消失，65℃保温15min，-20℃贮存备用。