CN106337047B - 一种豇豆叶片dna的高盐乙醇提取方法 - Google Patents

一种豇豆叶片dna的高盐乙醇提取方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种豇豆叶片DNA高盐乙醇提取方法，包括如下步骤：(1)采用DNA提取液裂解液氮研磨好的豇豆叶片，于60℃水浴60min；(2)取混合溶液离心，取上清液，加入CTAB沉淀缓冲液进行沉淀；(3)沉淀反应后离心，弃掉上清液，取沉淀物，向其中加入高盐TE缓冲液，于42℃水浴15min；(4)加入无水乙醇进行沉淀，离心，弃上清液，用80％的乙醇溶液清洗沉淀物；(5)沉淀物离心，弃上清液，剩余物干燥后加入TE溶液，42℃水浴20‑30min，离心，取2/3上清液，4℃冰箱保存。本发明的方法使用安全、成本低廉，不使用毒性强的有机试剂，DNA提取效率高，整个提取过程可以3小时内完成，提取到的豇豆叶片DNA含量高，质量好，可用于酶切以及下游的PCR扩增。

Description

一种豇豆叶片DNA的高盐乙醇提取方法
技术领域
本发明属于DNA提取技术领域，具体涉及一种豇豆叶片DNA的高盐乙醇提取方法。
背景技术
DNA作为生命体特有的遗传物质载体，携带生命个体生长与发育等必需的所有遗传信息，以纯化的分子形式或者基因组文库的方式进行保存就意味着对种质资源的保存，是传统资源保存方式的重要补充。近年来，随着分子生物学的发展，DNA提取技术越来越受到广泛重视和深入研究，DNA提取是开展分子生物学研究的基础，要进行PCR反应、DNA测序、Southern杂交及转基因克隆重组等都离不开高质量完整的DNA提取。
植物DNA提取是进行植物分子研究的第一步，目前已成功地从植物叶片、愈伤组织、组培苗、果实、韧皮部等组织器官中提取出DNA，但是由于不同植物甚至是同一种类植物组织材料的来源、部位、形态等外在性质的不同以及化学成分、组织结构等内在特点的差异，在提取基因组DNA时需要选择不同的方法或作一些特殊的处理，高质量的植物DNA是进行植物分子生物学研究的重要保证。
现有的植物DNA提取方法已经有很多种，1980年，Mμrry和Thompson提出了CTAB法提取植物DNA，1983年Dellaporta等提出了SDS法。此后，许多研究者对这两种方法进行了改良，并且，商业化的试剂盒也越来越多。但是大多数传统的CTAB法和SDS法及其改良方法都离不开苯酚，氯仿/异戊醇抽提和异丙醇沉淀。苯酚对皮肤、粘膜有强烈的腐蚀作用，可抑制中枢神经或损害肝、肾功能，而且对环境有严重危害，对水体和大气可造成污染。氯仿是一种神经毒，肝毒和肾毒物，国际肿瘤研究机构将其列为可疑致癌物，氯仿也能对水体造成污染，有研究表明氯仿对养殖水体中的鱼类有一定毒性效应。异丙醇跟乙醇类似，对中枢神经系统有麻醉作用，对皮肤，黏膜有轻微的刺激作用，但毒性比乙醇高一倍。试剂盒与传统方法相比，省去了液氮研磨等烦琐步骤，热处理时间短，反应快速，得到的基因组DNA可以进行PCR扩增及限制酶处理等，有利于一次性处理大量样品，但是试剂盒大多价格昂贵，往往只有在大比量处理样品和有条件的科研场所才会使用，限制了它的广泛使用。
为了解决上述问题，研发者们认为研发出一种减少或不使用含有上述有毒有机试剂的DNA提取方法是非常有必要的，2010年穆春华等研发出了一种玉米叶片基因组快速提取方法，采用TPS缓冲液进行DNA提取，缓冲液中使用CTAB、EDTA和KCl试剂，整个过程不使用苯酚、氯仿和异戊醇等腐蚀性强、毒性大的有机溶剂，但是该提取方法DNA纯度不高，杂质无法有效去除，且提取出的DNA含量较少；专利CN 103275968 A提供了一种快速提取棉花单粒种子DNA的方法，其在裂解液中加入1％的β-巯基乙醇，裂解离心后直接用异丙醇沉淀DNA，省略了苯酚、氯仿、异戊醇去除蛋白质的步骤，但是该方法并不适用于植物叶片DNA的提取，且提取过程中使用的β-巯基乙醇和异丙醇毒性较大，提取产物纯度不高。
目前，对于豇豆叶片DNA的提取方法尚未见完善，因此，急需开发出一种不使用苯酚、氯仿、异戊醇和β-巯基乙醇等毒性有机溶剂，具备使用安全，提取过程简单快速，且成本低廉的豇豆叶片DNA的提取方法。
发明内容
本发明的目的就是为了解决上述技术问题，而提供一种豇豆叶片DNA的高盐乙醇提取方法，完全不使用β-巯基乙醇、苯酚、氯仿、异戊醇和异丙醇等毒性较强的有机试剂，只用到乙醇一种低毒性有机试剂，且本发明的方法使用成本低廉，不需要RNA酶、蛋白酶等较贵的药品，也不需要纯化柱等额外耗材。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为，一种豇豆叶片DNA的高盐乙醇提取方法，包括如下步骤：
(1)取豇豆新鲜叶片经磨碎后置于无菌容器中，加入DNA提取液进行裂解，于60℃水浴60min；
(2)取水浴后的混合溶液离心，取上清液，加入CTAB沉淀缓冲液进行沉淀；所述CTAB沉淀缓冲液为：1％CTAB，50mM tris，10mM EDTA，20％无水乙醇，pH为8.0；
(3)沉淀反应完全后离心，弃掉上清液，取沉淀物，向其中加入高盐TE缓冲液，于42℃水浴15min；所述高盐TE缓冲液为：10mM tris，1mM EDTA，1M NaCl，pH为8.0；
(4)向步骤(3)所得物中加入无水乙醇进行沉淀，然后离心，弃上清液，用80％的乙醇溶液清洗沉淀物；
(5)将步骤(4)所得物进行离心，弃上清液，将离心管倒扣在干净滤纸上干燥10min，加入TE溶液，42℃水浴20-30min，离心，取上清液，4℃冰箱保存。
本发明充分利用了CTAB的较强洗涤性能，它能够从豇豆叶片的细胞膜和蛋白质中释放DNA，在高离子强度的溶液里，CTAB与蛋白质和大多数多聚糖形成复合物，同时高浓度的中性盐破坏了蛋白质在水中存在的两个因素(水化层和电荷)，从而使蛋白质沉淀，通过高速离心即可去除。此时核酸还无法沉淀出来，但当盐离子浓度降低到0.5M以下时，CTAB与核酸形成不溶性复合物，从而除去核酸。而由于DNA中的酶抑制性多糖不会跟随核酸沉淀，在离心后去掉上清液时可被一并去除。
另外由于DNA/CTAB复合体只在高盐溶液中可溶，因此本发明在高盐TE缓冲液中重新溶解DNA/CTAB复合体，再用乙醇进行沉淀，由于CTAB在80％乙醇中可溶，因此很容易去除。然后再将沉淀物进行干燥和重新溶于TE溶液后，DNA就很好地除去了核酸酶，抑制性多糖和CTAB了。
本发明的步骤(2)中CTAB沉淀缓冲液加入20％的无水乙醇(指无水乙醇的体积占缓冲液总体积的20％)是非常必要的，加入的无水乙醇可以使部分杂质溶解于其中，离心后通过去上清液去掉，这些杂质会干扰后续DNA的提取。在本发明的探索实验中，没有加入无水乙醇(总体积的20％)的情况下，最终无法得到较好的DNA，所提取的DNA无法进行酶切反应和下游的PCR扩增。
本发明的方法中采用80％乙醇清洗沉淀物后，此时得到的仍然是DNA与某些不溶于TE溶液的杂质沉淀的混合物。因此，在步骤(5)中加入TE溶液，使DNA溶于TE溶液，而其它杂质依然不溶。在42℃水浴20-30min，使DNA溶解，通过离心取上清液的方法，就可以完全除去其它不溶于低盐溶液的杂质。
采用本发明的方法提取得到的豇豆叶片DNA含量较多，质量较高，能够成功用于酶切以及下游的PCR扩增。本方法已被实验证明可成功应用于十多种植物叶片的DNA提取，应用范围广泛。
进一步的，所述DNA提取液为：100mM tris，20mM EDTA，1.4MNaCl，2％CTAB，1％PVP；pH为8.0。
进一步的，所述豇豆叶片与DNA提取液的m/v比为1:4mg/μL。
进一步的，所述步骤(2)中CTAB沉淀缓冲液的用量为所取上清液体积的两倍，沉淀反应5min，沉淀过程可通过颠倒混匀，然后室温静置5min。
进一步的，所述高盐TE缓冲液的用量为400μL。
进一步的，所述步骤(4)中无水乙醇的用量为800μL，即高盐TE缓冲液体积的2倍，无水乙醇进行沉淀5min。
进一步的，所述步骤(5)中TE溶液为：10mM tris，1mM EDTA；TE溶液的用量为120μL，离心后取上清液的量为80μL。
进一步的，步骤(2)中的离心条件为常温下(25℃)10000g离心10min；步骤(3)-(5)中的离心条件均为常温下(25℃)10000g离心2～5min。
进一步的，所述磨碎是在液氮中研磨成粉。
本发明的DNA提取方法除了适用于豇豆叶片之外，还适用于多种其它植物叶片DNA提取，包括：三叶草、辣椒、油菜、胡豆、豌豆、胡萝卜、生菜、茄子、小麦、南瓜、苦瓜或葫芦。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
(1)本发明提供的豇豆叶片DNA提取方法，具备使用安全、成本低廉，不使用β-巯基乙醇、苯酚、氯仿、异戊醇和异丙醇等毒性较强的有机试剂，对人体和环境友好；
(2)本发明的DNA提取方法具备快速高效的特点，整个提取过程可以3小时内完成，且本发明提取到的豇豆叶片DNA含量可达3μg，OD260/OD280比值在1.8-2.0之间，DNA质量好，提取出的DNA可用于酶切以及下游的PCR扩增；
(3)本发明的DNA提取方法具有通用性，可适用于除豇豆外的十多种植物。
附图说明
图1为实施例1-2中提取的豇豆叶片DNA以及PCR扩增拍照结果；
图2为实施例3-14中提取的其它植物叶片DNA拍照结果；
图3为实施例3-14中提取的其它植物叶片DNA被限制性内切酶HindⅢ酶切图；
图4为RAPD-1(5'-AGGTCACTGA-3')对实施例3-14中植物DNA的PCR扩增结果图；
图5为RAPD-2(5'-TGGTGACTGA-3')对实施例3-14中植物DNA的PCR扩增结果图；
图6为RAPD-3(5'-TGGTCACTGA-3')对实施例3-14中植物DNA的PCR扩增结果图；
其中，图1中M是2000bp DNAmaker，1和2分别是迪拜豇豆和宁豇三号叶片DNA，31和41分别是从这两个品种中扩增出的GAPDH基因片段，51和61分别是从这两个品种中扩增出的CBF基因片段；图2-3中A和B是lambda和HindⅢmolecμlar weight markers(Fermentas)，图4-6中C和D均是100bp ladder DNA marker(Fermentas)，图2-6中的3-14依次代表三叶草、辣椒、油菜、胡豆、豌豆、胡萝卜、生菜、茄子、小麦、南瓜、苦瓜、葫芦的叶片DNA。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行具体描述，有必要指出的是，以下实施例仅仅用于对本发明进行解释和说明，并不用于限定本发明。本领域技术人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
两个豇豆品种(迪拜豇豆和宁豇三号)由四川省绵阳市农业科学院提供，种植于四川农业大学成都校区崇州基地；另外12种植物从四川农业大学雅安校区农场采集，包括三叶草，辣椒，油菜，胡豆，豌豆，胡萝卜，生菜，茄子，小麦，南瓜，苦瓜，葫芦；分别采集14种植物的幼嫩叶片于冰盒中，带回实验室液氮速冻，于-70℃下保存。
本发明中采用的缩略词语为：
十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、乙二胺四乙酸(EDTA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、三羟甲基氨基甲烷(tris)、聚合酶链式反应(PCR)。
实施例1
选取迪拜豇豆，按照如下方法提取豇豆叶片DNA：
(1)取豇豆叶片用研钵和杵在液氮中研磨成粉末，取100mg粉末置于无菌容器中，加入400μL的DNA提取液(100mM tris，20mM EDTA，1.4M NaCl，2％CTAB，1％PVP，pH为8.0)进行裂解，于60℃水浴60min；
(2)取水浴后的混合溶液于常温下10000g离心10min，取300μL上清液，加入600μLCTAB沉淀缓冲液(1％CTAB，50mM tris，10mM EDTA，20％无水乙醇，pH为8.0)，颠倒混匀，室温静置5min；
(3)将步骤(2)所得物于10000g离心5min，弃掉上清液，取沉淀物，向其中加入400μL高盐TE缓冲液(10mM tris，1mM EDTA，1M NaCl，pH为8.0)，于42℃水浴15min；
(4)向步骤(3)所得物中加入800μL无水乙醇，颠倒混匀，室温静置5min，然后于10000g离心2min，弃上清液，用80％的乙醇溶液清洗沉淀物；
(5)将步骤(4)所得物于10000g离心2min，弃上清液，将离心管倒扣在干净滤纸上干燥10min，加入120μL的TE溶液(10mM tris，1mM EDTA)，于42℃水浴30min，10000g离心2min，取80μL上清液，4℃冰箱保存。
实施例2
选取宁豇三号豇豆品种，按照如下方法提取豇豆叶片DNA：
(1)取豇豆叶片用研钵和杵在液氮中研磨成粉末，取100mg粉末置于无菌容器中，加入400μL的DNA提取液(100mM tris，20mM EDTA，1.4M NaCl，2％CTAB，1％PVP，pH为8.0)进行裂解，于60℃水浴60min；
(2)取水浴后的混合溶液于常温下10000g离心10min，取300μL上清液，加入600μLCTAB沉淀缓冲液(1％CTAB，50mM tris，10mM EDTA，20％无水乙醇，pH为8.0)，颠倒混匀，室温静置5min；
(3)沉淀反应结束后于10000g离心5min，弃掉上清液，取沉淀物，向其中加入400μL高盐TE缓冲液(10mM tris，1mM EDTA，1MNaCl，pH为8.0)，于42℃水浴15min；
(4)向步骤(3)所得物中加入800μL无水乙醇，颠倒混匀，室温静置5min，然后于10000g离心3min，弃上清液，用80％的乙醇溶液清洗沉淀物；
(5)将步骤(4)所得物于10000g离心2min，弃上清液，将离心管倒扣在干净滤纸上干燥10min，加入120μL的TE溶液(10mM tris，1mM EDTA)，于42℃水浴20min，10000g离心2min，取80μL上清液，4℃冰箱保存。
实施例3
选取三叶草，按照如下方法提取三叶草叶片DNA：
(1)取三叶草叶片用研钵和杵在液氮中研磨成粉末，取150mg粉末置于无菌容器中，加入600μL的DNA提取液(100mM tris，20mM EDTA，1.4M NaCl，2％CTAB，1％PVP，pH为8.0)进行裂解，于60℃水浴60min；
(2)取水浴后的混合溶液于常温下10000g离心10min，取400μL上清液，加入800μLCTAB沉淀缓冲液(1％CTAB，50mM tris，10mM EDTA，20％无水乙醇，pH为8.0)，颠倒混匀，室温静置5min；
(3)沉淀反应结束后于10000g离心5min，弃掉上清液，取沉淀物，向其中加入400μL高盐TE缓冲液(10mM tris，1mM EDTA，1MNaCl，pH为8.0)，于42℃水浴15min；
(4)向步骤(3)所得物中加入800μL无水乙醇，颠倒混匀，室温静置5min，然后于10000g离心2min，弃上清液，用80％的乙醇溶液清洗沉淀物；
(5)将步骤(4)所得物于10000g离心2min，弃上清液，将离心管倒扣在干净滤纸上干燥10min，加入120μL的TE溶液(10mM tris，1mM EDTA)，于42℃水浴25min，10000g离心2min，取80μL上清液，4℃冰箱保存。
实施例4
选取辣椒，按照如下方法提取辣椒叶片DNA：
(1)取辣椒叶片用研钵和杵在液氮中研磨成粉末，取200mg粉末置于无菌容器中，加入800μL的DNA提取液(100mM tris，20mM EDTA，1.4M NaCl，2％CTAB，1％PVP，pH为8.0)进行裂解，于60℃水浴60min；
(2)取水浴后的混合溶液于常温下10000g离心10min，取400μL上清液，加入800μLCTAB沉淀缓冲液(1％CTAB，50mM tris，10mM EDTA，20％无水乙醇，pH为8.0)颠倒混匀，室温静置5min；
(3)沉淀反应完全后于10000g离心5min，弃掉上清液，取沉淀物，向其中加入400μL高盐TE缓冲液(10mM tris，1mM EDTA，1MNaCl，pH为8.0)，于42℃水浴15min；
(4)向步骤(3)所得物中加入800μL无水乙醇颠倒混匀，室温静置5min，然后于10000g离心5min，弃上清液，用80％的乙醇溶液清洗沉淀物；
(5)将步骤(4)所得物于10000g离心2min，弃上清液，将离心管倒扣在干净滤纸上干燥10min，加入120μL的TE溶液(10mM tris，1mM EDTA)，于42℃水浴30min，10000g离心2min，取80μL上清液，4℃冰箱保存。
实施例5
按照实施例1的方法提取油菜叶片DNA。
实施例6
按照实施例2的方法提取胡豆叶片DNA。
实施例7
按照实施例3的方法提取豌豆叶片DNA。
实施例8
按照实施例4的方法提取胡萝卜叶片DNA。
实施例9
按照实施例1的方法提取生菜叶片DNA。
实施例10
按照实施例2的方法提取茄子叶片DNA。
实施例11
按照实施例3的方法提取小麦叶片DNA。
实施例12
按照实施例4的方法提取南瓜叶片DNA。
实施例13
按照实施例2的方法提取苦瓜叶片DNA。
实施例14
按照实施例1的方法提取葫芦叶片DNA。
测试例1
取实施例1和2中提取的DNA原液各2μL，稀释到50μL，在EppendorfBio Photometer(Bio PhotometerPlμs，EppendofCo.Ltd.，Germany)上检测其含量，及OD260/OD280值。
对实施例1和2中的豇豆GAPDH基因片段(目标片段大小为1216bp)和本实验室克隆的CBF基因片段(目标片段大小为606bp)(完整序列见序列表)进行PCR扩增，按照如下方法进行：
GAPDH基因上游引物为5'-GGGTGGTGCAAAGAAGGTTA-3'，下游引物为5'-GCTGTATCCCCACTCGTTGT-3'，CBF基因上游引物为5'-ATGTTTTCCACCGACTCACA-3'，下游引物为5'-TTAGAGTGAATAACTCCACA-3'，引物由Invitrogen公司合成；PCR(25μL体系)包含：DNA 1μL，上下游引物各1μL(10μM)，22μL金牌MIX(北京擎科)，PCR扩增在C1000Thermal Cycler(BIO-RAD)进行。循环条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环，最后在72℃延伸10min。取5μL的DNA原液与1μL溴酚蓝混合，再分别取5μL PCR产物，在1.4％琼脂糖凝胶上电泳，电压80V，电泳时间40min，然后用EB染色20min，在ChemiDocXRS+成像系统(BIO-RAD)拍照。所得结果如图1所示。
从图1可以得出，从两个品种中提取到的豇豆DNA完整，OD260/OD280比值在1.8-2.0之间，表明所提取的DNA纯度较高，DNA含量在3μg左右，而且能够从中顺利扩增GAPDH基因和CBF基因。
测试例2
将实施例3-14中提取到的DNA，各取5μL原液，稀释到50μL，在EppendorfBioPhotometer(Bio PhotometerPlμs，EppendofCo.Ltd.，Germany)上检测其含量，及OD260/OD280比值。
另取5μL的DNA原液和1μL溴酚蓝，在0.8％的琼脂糖糖凝胶(Invitrogen)上进行电泳，电泳条件：80V，110min，EB染色30min，在GeneGeniμs Imaging System(Syngene，ADivision ofSynoptics Ltd.，UK)上拍照。所得结果如图2所示。
从图2可以看出，实施例3-14中提取的12种植物的DNA含量在2-8μg之间，OD260/OD280比值在1.8-2.0之间，表明所提取的DNA纯度都较高。
酶切：取5μL的DNA原液(约2μg)，15μ限制性内切酶HindⅢ，20μL体系，37℃水浴5min，之后在0.8％琼脂糖凝胶(Invitrogen)上电泳，电泳条件：80V，105min，EB染色30min，在GeneGeniμs Imaging System(Syngene，ADivision ofSynoptics Ltd.，UK)上拍照。所得结果如图3所示。
从图3可以看出，实施例3-14中所提取的12种植物的DNA均能被限制性内切酶HindⅢ完全酶切。
PCR扩增：采用了如下三个RAPD引物：
RAPD-1序列为5'-AGGTCACTGA-3'，
RAPD-2序列为5'-TGGTGACTGA-3'，
RAPD-3序列为5'-TGGTCACTGA-3'。
引物由Invitrogen公司合成。
PCR(25μL体系)包含：DNA 1μL，引物1μL(10μM)，12.5μL 2×Taq PCR MasterMix(天根)用ddH2O(重蒸水)补足25μL。PCR扩增在PeltierThermal Cycler(BIO-RAD DNAEngine)进行，循环条件：94℃预变性4min，94℃变性1min，36℃退火1min，72℃延伸2min，40个循环，最后在72℃延伸7min。取6μL PCR产物，在1.5％琼脂糖凝胶上电泳，电泳条件为：电压80V，电泳时间140min，然后用EB染色20min，在GeneGeniμs成像系统(Syngene，ADivisionofSynoptics Ltd.，UK)拍照，所得结果分别如图4-6所示，三个RAPD引物的PCR都分别进行三次重复，重复性结果类似。
从图4-6可以看出，实施例3-14中所提取的12种植物的DNA均能被RAPD引物扩增出条带，而且重复性好。三次扩增的结果基本相同，表明本实验所用的反应体系以及扩增程序适用于RAPD-PCR扩增。另外可以看出不同植物品种的多态性明显，从分子水平上表明这几种植物的差距很大。

Claims (3)

1.一种豇豆叶片DNA的高盐乙醇提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取豇豆新鲜叶片经磨碎后置于无菌容器中，加入DNA提取液进行裂解，于60℃水浴60min；所述DNA提取液为：100mM tris，20mM EDTA，1.4M NaCl，2％CTAB，1％PVP，pH为8.0；所述豇豆叶片与DNA提取液的m/v比为1:4mg/μL；
(2)取水浴后的混合溶液于常温下10000g离心10min，取上清液，加入上清液体积2倍的CTAB沉淀缓冲液进行沉淀反应5min；所述CTAB沉淀缓冲液为：1％CTAB，50mM tris，10mMEDTA，20％无水乙醇，pH为8.0；
(3)沉淀反应完全后于常温下10000g离心2～5min，弃掉上清液，取沉淀物，向其中加入400μL高盐TE缓冲液，于42℃水浴15min；所述高盐TE缓冲液为：10mM tris，1mM EDTA，1MNaCl，pH为8.0；
(4)向步骤(3)所得物中加入800μL无水乙醇进行沉淀5min，然后于常温下10000g离心2～5min，弃上清液，用80％的乙醇溶液清洗沉淀物；
(5)将步骤(4)所得物于常温下10000g离心2～5min，弃上清液，将离心管倒扣在干净滤纸上干燥10min，加入120μLTE溶液，所述TE溶液为：10mM tris，1mM EDTA；42℃水浴20-30min，于常温下10000g离心2～5min，取80μL上清液，4℃冰箱保存。
2.根据权利要求1所述的豇豆叶片DNA的高盐乙醇提取方法，其特征在于，所述磨碎是在液氮中研磨成粉。
3.根据权利要求1所述的豇豆叶片DNA的高盐乙醇提取方法，其特征在于，所述豇豆可以替换为三叶草、辣椒、油菜、胡豆、豌豆、胡萝卜、生菜、茄子、小麦、南瓜、苦瓜或葫芦。
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