CN116987691A - 一种槟榔叶表微生物基因组dna提取方法及应用 - Google Patents

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徐芮
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Abstract

本发明涉及的一种槟榔叶表微生物基因组DNA提取方法及应用，包括以下步骤：槟榔叶片的采集，用灭菌剪采集树冠的叶片，戴无菌手套挑选表面干净无病虫害的小裂叶放入无菌袋，迅速冷冻于干冰中带回实验室，转移到‑80℃冰箱保存；洗脱液包括表面活性剂和溶剂，表面活性剂和溶剂的比例为1：5000，溶剂为PBS缓冲液或无菌水；叶表微生物的收集；基因组DNA的提取及质量检测；PCR扩增检测。本发明的有益效果在于：通过改良前处理方法洗脱并收集到更多的叶表微生物，提高效率，为研究槟榔叶表微生物群落结构及多样性奠定基础。

Description

一种槟榔叶表微生物基因组DNA提取方法及应用
技术领域
本发明涉及了微生物提取技术领域，尤其涉及一种槟榔叶表微生物基因组DNA提取方法及应用。
背景技术
植物叶表生境广阔，可供微生物生存的总面积超过6.4×108km2，约是陆地表面积的两倍，是陆生微生物的一个巨大且极其多样化的栖息地，也是地球上最大的微生物栖息地之一。叶表面的环境是复杂而动态的，生活在叶表的微生物经常要面临水分和营养物质的不足，以及剧烈变化的强光、高温和高紫外线等的影响。尽管如此，仍有大量微生物能够适应叶表环境并生存下来，在与植物长期的互作交流过程中形成了正面、负面或共生的关系。研究发现，叶表微生物中只有少数致病，大多数都是有益的，在促进植物生长、增强植物抗病性、降解环境污染物、生物传感检测等方面发挥了重要作用。
传统方法研究叶表微生物主要依赖于培养技术和显微技术，不能完全反映微生物群落信息的真实情况。目前以高通量测序为代表的新一代分子生物学技术为揭示叶表微生物群落结构及功能的关系提供了强有力的工具，测序结果的准确性取决于叶表微生物基因组DNA的质量，要想获得纯度高、结构完整的基因组DNA，首先要收集到足够的微生物。由于各种叶片形态差异，叶片的结构和表面化学构成了一个特殊的微环境，微生物在叶片表面分布不均，且叶片最外侧蜡质层具有疏水性，微生物附着在上面被整合成生物膜，难以分离洗脱，影响后续实验，所以针对叶表微生物的收集选择适合的前处理方法至关重要。
槟榔(ArecacatechuL.)属棕榈科常绿乔木，是我国四大南药之首，也是海南省重要的热带经济作物，发展前景十分广阔。研究槟榔叶表微生物多样性对发掘热带优良微生物资源、解析棕榈科植物与微生物的互作关系有重要意义。槟榔叶片为大型羽状全裂单叶，长达1.5～2m，叶表微生物收集和基因组DNA提取难度较大，制约了高通量测序技术的应用。为解决槟榔叶表微生物多样性丰富但可获取的数量少这一难题，本申请比较了不同样本量和洗脱液成分对提取槟榔叶表微生物基因组DNA质量的影响，通过改良前处理方法洗脱并收集到更多的叶表微生物，提高效率，为研究槟榔叶表微生物群落结构及多样性奠定基础。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种槟榔叶表微生物基因组DNA提取方法及应用，通过改良前处理方法洗脱并收集到更多的叶表微生物，提高效率，为研究槟榔叶表微生物群落结构及多样性奠定基础。
本发明涉及的一种槟榔叶表微生物基因组DNA提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
槟榔叶片的采集，用灭菌剪采集树冠的叶片，戴无菌手套挑选表面干净无病虫害的小裂叶放入无菌袋，迅速冷冻于干冰中带回实验室，转移到-80℃冰箱保存；
洗脱液的配置，所述洗脱液包括表面活性剂和溶剂，所述表面活性剂和所述溶剂的比例为1：5000，所述溶剂为PBS缓冲液或无菌水；
叶表微生物的收集，在超净工作台上，用无菌剪刀将叶片剪成3cm×4cm的小块，称取叶片25g-125g，放入前处理容器中，加入洗脱液，洗脱液的容量应没过叶片，进行前处理，然后去除叶片，在无菌环境中使用真空抽滤装置将瓶内的微生物收集到0.22μm孔径滤膜上；
基因组DNA的提取及质量检测；
PCR扩增检测；
所述前处理包括将前处理容器放入摇床中，25℃，以200r/min的速度振荡20min，洗脱叶表微生物。
进一步地，在叶表微生物的收集过程中，所述槟榔叶片的重量为75g。
进一步地，所述基因组DNA的提取及质量检测包括，将滤膜置于预冷的研钵中，加入液氮进行研磨，然后按照改良CTAB法对基因组DNA进行提取，-20℃冰箱保存，使用超微量分光光度计对提取的DNA浓度和纯度进行检测；用1％琼脂糖凝胶对提取的DNA质量进行检测，电压120V，电泳时间30min。
进一步地，所述PCR扩增检测包括，
PCR反应体系：包括模板DNA0.5μL，KODFXNeoBuffer5μL，dNTP2μL，上下游引物各0.3μL，KODFXNeo0.2μL，最后用双蒸水补足至10μL；
所述上游引物包括338F和ITS1F，所述下游引物包括806R和ITS2；
所述338F的序列为：5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'；
所述ITS1F的序列为：5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'；
所述806R的序列为：5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'；
所述ITS2的序列为：5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'。
进一步地，所述PCR扩增检测还包括，采用引物338F和806R对细菌16SrDNA基因的V3-V4区进行扩增，PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸40s，25个循环；72℃延伸7min。
采用引物ITS1F和ITS2对真菌ITS1区进行扩增，PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸40s，30个循环；72℃延伸7min，获得PCR产物；
PCR产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测。
进一步地，所述对滤膜中的基因组DNA进行提取采用改良CTAB法、土壤基因组DNA提取试剂盒法或植物基因组DNA提取试剂盒法。
所述改良CTAB法包括：
S1、将滤膜置于研钵中，加入液氮充分研磨成粉末，并迅速收集到2mL离心管中，加入1mL缓冲液，涡旋混匀，冰浴10min，4℃、10000r/min离心10min，弃上清，所述缓冲液包括100mmol/LTris-HCl，20mmol/LEDTA，5％甘油，2％PVP，2％β-巯基乙醇，Tris-HCl和EDTA的pH值为8.0；
S2、加入800μL65℃预热的CTAB裂解液，混匀后在65℃保温30min，其间不断晃动，使材料与缓冲液混合充分，所述CTAB裂解液包括2％CTAB，1.4mol/LNaCl，20mmol/LEDTA，100mmol/LTris-HCl，0.2％β-巯基乙醇，Tris-HCl的pH值为8.0；
待材料冷却至室温后加入800μL的第一混合液，所述混合液中苯酚：氯仿：异戊醇的比例为25：24：1，颠倒混匀，12000r/min离心10min，获得第一上清液，将第一上清液转移至新的离心管中，加入等体积的第二混合液，所述第二混合液包括氯仿和异戊醇，所述氯仿和异戊醇的比例为24：1，颠倒混匀，12000r/min离心10min，获得第二上清液；
吸取500μL第二上清液至新的1.5mL离心管中，加入50μL3mol/LNaAc和500μL异丙醇，颠倒混匀，室温静置15min，12000r/min离心10min，弃上清液；
用75％乙醇和无水乙醇各洗涤沉淀1次，12000r/min离心5min，弃上清，置阴凉通风处晾干；
最后，用60μL灭菌ddH2O溶解DNA，加入10μLRnaseA，颠倒混匀，并将其置于-20℃下保存。
本发明还涉及一种槟榔叶表微生物基因组DNA提取方法在研究槟榔叶表微生物群落结构及多样性中的应用。
本发明的有益之处在于：通过超微量分光光度计测定、琼脂糖凝胶电泳、PCR扩增的验证，得出槟榔叶片样本量在75g时，以无菌水+SilwetL-77作为洗脱液可以富集到足够多的叶表微生物，所提取的基因组DNA浓度和纯度满足实验要求，且成本最低，为最佳前处理方法。通过改良前处理方法洗脱并收集到更多的叶表微生物，提高效率，为研究槟榔叶表微生物群落结构及多样性奠定基础。
为让本发明的上述和其他目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合所附图式，作详细说明如下。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是不同样本量和洗脱液对基因组DNA质量的影响图。
图2是槟榔叶表微生物基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果图。
图3是细菌16SrDNA基因V3-V4区片段的扩增结果图。
图4是真菌ITS1区片段的扩增结果图。
图5是不同洗脱和富集方式提取基因组DNA的质量评估结果图。
图6是不同洗脱和富集方式提取基因组DNA的电泳结果图。
图7为不同方法提取基因组DNA的质量参数图。
图8为不同方法提取基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳图。
图9为细菌通用引物PCR产物琼脂糖凝胶电泳图。
图10为真菌通用引物PCR产物琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
槟榔叶片采自海南省定安县龙河镇鸭塘村槟榔园，槟榔植株长势良好，树龄约10年。
1×PBS缓冲液(Biosharplifesciences)；SilwetL-77(源叶生物)；植物基因组DNA提取试剂盒(柱膜法)(MP公司)；琼脂糖、50×TAE、GoldView、6×LoadingBuffer、MarkerDL15000、MarkerDL2000、KODFXNeo、dNTP由上海生工生物工程股份有限公司提供；细菌16SrRNA基因V3-V4通用引物338F和806R、真菌ITS1通用引物ITS1F和ITS2由北京华大基因科技有限公司合成。
多层控温摇床LSI-5004ML(Labtech公司)、三联过滤器MFS-3A-250-K(广东环凯生物科技有限公司)、高速冷冻离心机ST16R(ThermoFisher公司)、FastPrep快速核酸提取仪(美国MP公司)、NanoDropOne超微量分光光度计(ThermoScientific公司)、PowerPacBasic电泳仪(Bio-Rad公司)、PCR仪T100(Bio-Rad公司)等。
实施例1
在本发明一较佳实施例中涉及的一种槟榔叶表微生物基因组DNA提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
槟榔叶片的采集，用灭菌剪采集树冠的叶片，戴无菌手套挑选表面干净无病虫害的小裂叶放入无菌袋，迅速冷冻于干冰中带回实验室，转移到-80℃冰箱保存；
洗脱液的配置，所述洗脱液包括表面活性剂和溶剂，所述表面活性剂和所述溶剂的比例为1：5000，所述溶剂为PBS缓冲液或无菌水；
叶表微生物的收集，在超净工作台上，用无菌剪刀将叶片剪成3cm×4cm的小块，称取叶片25g-125g，放入前处理容器中，加入洗脱液，洗脱液的容量应没过叶片，进行前处理，所述前处理包括将前处理容器放入摇床中，25℃，以200r/min的速度振荡20min，洗脱叶表微生物，然后去除叶片，在无菌环境中使用真空抽滤装置将瓶内的微生物收集到0.22μm孔径滤膜上；
基因组DNA的提取及质量检测；
PCR扩增检测。
在上述实施例中，在叶表微生物的收集过程中，所述槟榔叶片的重量为75g。
在上述实施例中，所述基因组DNA的提取及质量检测包括，将滤膜置于预冷的研钵中，加入液氮进行研磨，然后采用MPBiomedicals植物基因组DNA提取试剂盒(柱膜法)进行提取，-20℃冰箱保存，使用超微量分光光度计对提取的DNA浓度和纯度进行检测；用1％琼脂糖凝胶对提取的DNA质量进行检测，电压120V，电泳时间30min。
进一步地，所述PCR扩增检测包括，
PCR反应体系：包括基因组模板DNA0.5μL，KODFXNeoBuffer5μL，dNTP2μL，上下游引物各0.3μL，KODFXNeo0.2μL，最后用双蒸水补足至10μL；
所述上游引物包括338F和ITS1F，所述下游引物包括806R和ITS2；
所述338F的序列为：5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'；
所述ITS1F的序列为：5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'；
所述806R的序列为：5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'；
所述ITS2的序列为：5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'。
进一步地，所述PCR扩增检测还包括，采用引物338F和806R对细菌16SrDNA基因的V3-V4区进行扩增，PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸40s，25个循环；72℃延伸7min。
采用引物ITS1F和ITS2对真菌ITS1区进行扩增，PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸40s，30个循环；72℃延伸7min，获得PCR产物；
PCR产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测。
本发明还涉及一种槟榔叶表微生物基因组DNA提取方法在研究槟榔叶表微生物群落结构及多样性中的应用。
实施例2
其主要技术特征与实施例1相同，其主要区别在于，所述样本量为25g。
实施例3
其主要技术特征与实施例1相同，其主要区别在于，所述样本量为50g。
实施例4
其主要技术特征与实施例1相同，其主要区别在于，所述样本量为100g。
实施例5
其主要技术特征与实施例1相同，其主要区别在于，所述样本量为125g。
实施例6
其主要技术特征与实施例1相同，其主要区别在于，所述溶剂为无菌水，所述样本量为25g。
实施例7
其主要技术特征与实施例1相同，其主要区别在于，所述溶剂为无菌水，所述样本量为50g。
实施例8
其主要技术特征与实施例1相同，其主要区别在于，所述溶剂为无菌水，所述样本量为75g。
实施例9
其主要技术特征与实施例1相同，其主要区别在于，所述溶剂为无菌水，所述样本量为100g。
实施例10
其主要技术特征与实施例1相同，其主要区别在于，所述溶剂为无菌水，所述样本量为125g。
对比例1
其主要技术特征与实施例1相同，其主要区别在于，所述洗脱液仅包括无菌水，所述样本量为25g。
对比例2
其主要技术特征与实施例1相同，其主要区别在于，所述洗脱液仅包括无菌水，所述样本量为50g。
对比例3
其主要技术特征与实施例1相同，其主要区别在于，所述洗脱液仅包括无菌水，所述样本量为75g。
对比例4
其主要技术特征与实施例1相同，其主要区别在于，所述洗脱液仅包括无菌水，所述样本量为100g。
对比例5
其主要技术特征与实施例1相同，其主要区别在于，所述洗脱液仅包括无菌水，所述样本量为125g。
对比例6
其主要技术特征与实施例1相同，其主要区别在于，所述洗脱液仅包括PBS，所述样本量为25g。
对比例7
其主要技术特征与实施例1相同，其主要区别在于，所述洗脱液仅包括PBS，所述样本量为50g。
对比例8
其主要技术特征与实施例1相同，其主要区别在于，所述洗脱液仅包括PBS，所述样本量为75g。
对比例9
其主要技术特征与实施例1相同，其主要区别在于，所述洗脱液仅包括PBS，所述样本量为100g。
对比例10
其主要技术特征与实施例1相同，其主要区别在于，所述洗脱液仅包括PBS，所述样本量为125g。
统计分析
对实施例1-实施例10、对比例1-对比例10中获得的DNA浓度和纯度进行检测，PCR产物的电泳检测结果进行统计，DNA浓度和纯度的检测结果如图1所示，电泳检测结果如图所示。
不同样本量对DNA浓度和纯度的影响
参照图1，不同样本量对基因组DNA的质量影响较大，在同种洗脱液处理下，基因组DNA浓度随样本量的增加呈先上升后下降的趋势，当样本量为75g时达到最大，与其他样本量有显著差异；从提取的DNA纯度来看，相同样本量经不同洗脱液处理后提取的基因组DNA样品A260/A280和A260/A230值波动较大，其中25、50、100和125g样本量处理有个别存在杂质污染，只有75g样本量提取的基因组DNA样品A260/A280值和A260/A230值均在正常范围内，说明样本量设置为75g时提取的DNA质量较高且效果稳定。
不同洗脱液对DNA浓度和纯度的影响
参照图1，不同洗脱液对基因组DNA的浓度影响较大，以75g样本量为例，PBS+SilwetL-77或无菌水+SilwetL-77作洗脱液时提取的基因组DNA浓度均较高，平均浓度分别为82.56μg/mL和80.80μg/mL，两者无显著差异，而单独使用PBS或无菌水作洗脱液时提取的基因组DNA浓度较低，平均浓度分别为36.11μg/mL和34.85μg/mL，其他样本量下也有同样的规律；从基因组DNA的纯度来看，以无菌水作洗脱液时，只有75g样本量的纯度合格，以PBS作洗脱液时，50g和75g样本量的纯度合格，当无菌水或PBS洗脱液中加入Silwet L-77后，除125g样本量的纯度不在正常范围内，其他样本量均合格，说明加入SilwetL-77有助于洗脱更多的微生物，显著提高了基因组DNA的浓度和纯度。
电泳检测结果
参照图2(图中M：DL15000Marker；1～3：无菌水；4～6：PBS缓冲液；7～9：无菌水+SilwetL-77；10～12：PBS+SilwetL-77)，以PBS+SilwetL-77或无菌水+SilwetL-77作洗脱液提取的DNA电泳条带明亮清晰，无拖尾弥散，点样孔干净，DNA纯度高完整性好；而以无菌水或PBS作洗脱液提取出来的DNA条带不清晰，质量相对较差，这与超微量分光光度计检测结果一致，说明单一成分的洗脱液不适用于槟榔叶表微生物基因组DNA的提取，在洗脱液中加入SilwetL-77能够富集到更多的微生物，提高基因组DNA的质量。
参照图3(图中，M：DL2000Marker；1：无菌水；2：PBS缓冲液；3：无菌水+SilwetL-77；4：PBS+SilwetL-77)和图4(图中，M：DL2000Marker；1：无菌水；2：PBS缓冲液；3：无菌水+SilwetL-77；4：PBS+SilwetL-77)，以4种洗脱液中75g样本量提取的基因组DNA为模板，用引物338F/806R和ITS1F/ITS2分别对细菌16SrDNA基因的V3-V4区与真菌ITS1区进行扩增，结果显示，不同洗脱液提取的槟榔叶表微生物基因组DNA均能扩增出条带，其中在洗脱液中加入SilwetL-77后扩增效果较为理想，获得的条带单一，亮度更高，完全满足后续实验要求。细菌和真菌引物扩增结果一致，进一步说明在洗脱液中加入SilwetL-77更加适用于槟榔叶表微生物基因组DNA的提取。
本申请在预实验中参照现有技术设置了5～20g的样本量，发现提取的槟榔叶表微生物基因组DNA浓度非常低，且纯度不稳定，无法满足高通量测序的要求。由于槟榔叶片大，表面棱纹多，富含多糖、多酚等物质，增加了分离和收集叶表微生物的难度，需要更多的样本量才能富集到足够的微生物进行DNA提取。从实验结果来看，当样本量在25～75g之间时，DNA的浓度随着样本量的增加而增加，当样本量超过75g时，提取的DNA浓度和纯度都大幅下降，可能是随着样本量的增加，样本中的杂质也在增加，超出了裂解液的裂解能力，致使样本的提取效率降低。
目前针对叶表微生物常用的洗脱液有无菌水和PBS缓冲液，已有研究表明无菌水和PBS缓冲液对叶表微生物的收集效果没有明显差别。本次研究结果和前人的研究结果是一致的，但提取的基因组DNA浓度较低，电泳条带不清晰，表明使用无菌水和PBS对槟榔叶表微生物提取的效果不理想，这是因为槟榔叶片最外侧的蜡质层具有疏水性，普通洗脱液很难使叶面湿润，富集不到足够的叶表微生物。SilwetL-77是一种高效有机硅表面活性剂，能够极大的降低水的表面张力(水的表面张力为72.4mN/m，0.1％的SilwetL-77表面张力约为21mN/m，而常规的表面活性剂溶液的表面张力最低约为30mN/m)，在难以湿化的叶片表面迅速扩散，产生水膜促进微生物在叶平面上活动，从而在震荡的过程中更容易被洗脱下来，因此本实验选择在洗脱液中加入表面活性剂Silwet L-77进行改良，结果表明，无论无菌水还是PBS缓冲液和SilwetL-77结合后，都能够富集到更多的微生物，提取到高质量的基因组DNA，满足分子生物学实验对DNA浓度和纯度的双要求，相较于PBS缓冲液，使用无菌水更能降低实验成本。
本申请通过超微量分光光度计测定、琼脂糖凝胶电泳、PCR扩增的验证，得出槟榔叶片样本量在75g时，以无菌水+SilwetL-77作为洗脱液可以富集到足够多的叶表微生物，所提取的基因组DNA浓度和纯度满足实验要求，且成本最低，为最佳前处理方法。
不同前处理方法对基因组DNA浓度和纯度的影响
分别采用超声处理(摇床震荡)和离心法(真空抽滤法)进行前处理，其它处理方式与实施例相同，前处理(洗脱+富集)的具体方法如图5所示。
结果显示，前处理使用超声波2、4、6min条件下，2种富集方法所提样本DNA均存在浓度较低、纯度不在合格范围内的问题，在超声4min时，样本DNA浓度达最大值。前处理使用摇床振荡10min时，2种富集方法所提样本DNA浓度较低，随着振荡时间增加，DNA浓度逐步增加，在20min时DNA浓度达到最大值(离心法为25.67±0.96μg/mL，真空抽滤法为38.67±0.85μg/mL)，随后又呈下降趋势。
微生物富集使用离心法时，DNA浓度最大值为25.67±0.96μg/mL，真空抽滤富集微生物，DNA浓度最大值为38.67±0.85μg/mL。使用真空抽滤富集叶表微生物提取的基因组DNA浓度和纯度明显高于离心法。
悬摇振荡清洗的过程使叶表微生物得到充分洗脱，提取的DNA浓度更高；真空抽滤法使其微生物大量浓缩在微孔滤膜上，减少微生物的流失，便于后续DNA的提取；由悬摇振荡洗脱和抽滤富集相结合分离收集得到的植物叶表微生物基因组DNA的浓度都大于15μg/mL。
然后对不同前处理方式获得的样本DNA进行电泳处理，电泳处理的结果如图6(图中:M:DL15000Maker；1:超声震荡2min+离心法；2:超声震荡2min+真空抽滤法；3:超声震荡4min+离心法；4:超声震荡4min+真空抽滤法；5:超声震荡6min+离心法；6:超声震荡6min+真空抽滤法；7:悬摇振荡10min+离心法；8:悬摇振荡10min+真空抽滤法；9:悬摇振荡20min+离心法；10:悬摇振荡20min+真空抽滤法；11:悬摇振荡30min+离心法；12:悬摇振荡30min+真空抽滤法)所示。
结果显示，所有基因组条带单一，1、2、3、4、5和6样品条带模糊不清，其原因可能为DNA浓度过低。7、8、9、10、11和12样品均能检验出较明亮的目的条带，11和12样品有轻微拖尾但无弥散现象，基因组DNA完整性良好。
按照实施例1的方式对样本DNA进行进行细菌16SrDNA基因V3-V4区片段的PCR扩增，扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图谱结果如图7(图中：注:M:DL 2000Maker；1:超声震荡2min+离心法；2:超声震荡2min+真空抽滤法；3:超声震荡4min+离心法；4:超声震荡4min+真空抽滤法；5:超声震荡6min+离心法；6:超声震荡6min+真空抽滤法；7:悬摇振荡10min+离心法；8:悬摇振荡10min+真空抽滤法；9:悬摇振荡20min+离心法；10:悬摇振荡20min+真空抽滤法；11:悬摇振荡30min+离心法；12:悬摇振荡30min+真空抽滤法)所示。
超声法与悬摇震荡法洗脱后富集的槟榔叶表微生物基因组DNA均能作为模板扩增出细菌16SrDNAV3-V4区片段，但很明显，超声2min和6min洗脱后富集提取的槟榔叶表微生物基因组DNA(泳道1，2，5和6)为模板扩增的目的条带的亮度比其他条带弱，这进一步说明了超声法洗脱后富集提取的DNA质量不如悬摇法。
不同提取方法对基因组DNA浓度和纯度的影响
试验材料(供试叶片)采自海南省定安县龙河镇鸭塘村槟榔园，品种为海南本地种，树龄约10年，果形为椭圆型，节间8～15cm，有效叶片6～7片。
主要试剂包括SilwetL-77、Tris-HCl、EDTA、甘油、PVP、β-巯基乙醇、CTAB、NaCl、苯酚、氯仿、异戊醇、NaAc、异丙醇；
RnaseA、琼脂糖、50×TAE、GoldView、6×LoadingBuffer、MarkerDL15000、MarkerDL2000、KODFXNeo、dNTP由上海生工生物工程股份有限公司提供。
细菌16SrRNA基因V3-V4通用引物338F和806R、真菌ITS1通用引物ITS1F和ITS2由北京华大基因科技有限公司合成。
试剂盒：柱膜法土壤基因组DNA提取试剂盒(MPBiomedicals)、强力土壤基因组DNA提取试剂盒(QIAGEN)、多糖多酚植物基因组DNA提取试剂盒(天根)、柱膜法植物基因组DNA提取试剂盒(MPBiomedicals)。
仪器与设备，包括多层控温摇床LSI-5004ML(Labtech公司)；三联过滤器MFS-3A-250-K(广东环凯生物科技有限公司)；高速冷冻离心机ST16R(ThermoFisher公司)；FastPrep快速核酸提取仪(美国MP公司)；金属浴MB-102(MixingBlock公司)；NanoDropOne超微量分光光度计(Thermo Scientific公司)；PowerPacBasic电泳仪(Bio-Rad公司)、PCR仪T100(Bio-Rad公司)等。
样品采集，随机选择长势相近的健康槟榔植株，使用酒精消毒的高枝剪采集树冠中层叶片，观察挑选干净无虫卵的小裂叶放入无菌袋中密封保存，用干冰运输至实验室，冻存于-80℃冰箱中备用。每处理设3个重复，每个重复的叶片均来源于同一株树。
叶表微生物收集与前处理，称取75g槟榔叶片，在超净工作台中使用无菌剪刀剪成3×4cm小块，置于含有750mL无菌水的三角瓶中，并添加一定量的表面活性剂SilwetL-77，用灭菌膜封口后在25℃，200r/min的摇床中振荡20min，将微生物细胞从叶片表面分离，然后在无菌环境中使用真空抽滤装置将振荡液中的微生物收集到0.22μm孔径滤膜上。
基因组DNA提取方法包括以下步骤：
S1、将滤膜置于研钵中，加入液氮充分研磨成粉末，并迅速收集到2mL离心管中，加入1mL缓冲液，涡旋混匀，冰浴10min，4℃、10000r/min离心10min，弃上清，所述缓冲液包括100mmol/LTris-HCl，20mmol/LEDTA，5％甘油，2％PVP，2％β-巯基乙醇，Tris-HCl和EDTA的pH值为8.0；
S2、加入800μL65℃预热的CTAB裂解液，混匀后在65℃保温30min，其间不断晃动，使材料与缓冲液混合充分，所述CTAB裂解液包括2％CTAB，1.4mol/LNaCl，20mmol/LEDTA，100mmol/LTris-HCl，0.2％β-巯基乙醇，Tris-HCl的pH值为8.0；
S3、待材料冷却至室温后加入800μL的第一混合液，所述混合液中苯酚：氯仿：异戊醇的比例为25：24：1，颠倒混匀，12000r/min离心10min，获得第一上清液，将第一上清液转移至新的离心管中，加入等体积的第二混合液，所述第二混合液包括氯仿和异戊醇，所述氯仿和异戊醇的比例为24：1，颠倒混匀，12000r/min离心10min，获得第二上清液；；
S4、吸取500μL第二上清液至新的1.5mL离心管中，加入50μL的3mol/LNaAc和500μL异丙醇，颠倒混匀，室温静置15min，12000r/min离心10min，弃上清液；
S5、用75％乙醇和无水乙醇各洗涤沉淀1次，12000r/min离心5min，弃上清，置阴凉通风处晾干；
S6、最后，用60μL灭菌ddH2O溶解DNA，加入10μLRnaseA，颠倒混匀，并将其置于-20℃下保存。
土壤基因组DNA提取试剂盒法：选用柱膜法土壤基因组DNA提取试剂盒(MPBiomedicals)和强力土壤基因组DNA提取试剂盒(QIAGEN)两种试剂盒，按照说明书操作步骤进行。
植物基因组DNA提取试剂盒法：选用多糖多酚植物基因组DNA提取试剂盒(天根)和柱膜法植物基因组DNA提取试剂盒(MPBiomedicals)两种试剂盒，按照说明书操作步骤进行。
基因组DNA质量检测包括，取2μLDNA样品，使用超微量分光光度计测定基因组DNA的浓度，根据A260/280和A260/230比值判断DNA的纯度。另取5μLDNA样品与6×LoadingBuffer混合后，点样于质量分数为1％的琼脂糖凝胶中，染色剂为GoldView，在电泳缓冲液为1×TAE，电压为120V的条件下电泳30min，之后在凝胶成像仪上观察DNA片段的大小、完整性及电泳条带的清晰度，进行拍照。
PCR扩增检验包括，以提取的槟榔叶表微生物基因组DNA为模板，用通用引物，338F、806R、ITS1F和ITS2分别对细菌16SrDNA基因的V3-V4区与真菌ITS1区进行扩增。PCR反应体系(10μL)：KODFXNeoBuffer5μL、dNTP2μL、上下游引物各0.3μL、KODFXNeo0.2μL、DNA模板0.5μL，最后用无菌的双蒸水补至10μL。PCR扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸40s，25/30个循环(细菌/真菌)；72℃延伸7min。PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。
所述338F的序列为：5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'；
所述ITS1F的序列为：5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'；
所述806R的序列为：5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'；
所述ITS2的序列为：5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'。
基因组DNA的质量检测结果参照图7，通常将A260/A280和A260/A230的值作为衡量核酸纯度的重要指标，较纯净的DNA样品A260/A280值在1.8～2.0之间，低于1.8说明存在蛋白质或酚类物质污染，大于2.0说明有RNA残留；A260/A230值在1.8～2.2之间，比值降低说明存在碳水化合物、胍盐等污染。如表1所示，改良CTAB法提取的DNA样品A260/A280和A260/A230值均较正常范围相差很远，虽浓度最高，但杂质也最多；相比之下用试剂盒提取的DNA样品A260/A280值明显高于改良CTAB法，虽有不在正常范围内的但也相差不大。从A260/A230的值来看，除MPBiomedicals柱膜法植物基因组DNA提取试剂盒外，其余4种方法提取的DNA样品比值均在1.5以下，说明存在碳水化合物、胍盐等污染。综合评价各项指标，MPBiomedicals柱膜法植物基因组DNA提取试剂盒提取的样品浓度较高，且A260/A280和A260/A230的值均在合理范围内，是最适合提取槟榔叶表微生物基因组DNA的方法。
如图8所示，MPBiomedicals柱膜法植物基因组DNA提取试剂盒提取的样品电泳条带清晰明亮，无拖尾弥散，点样孔干净，DNA纯度高完整性好；改良CTAB法提取的基因组DNA条带弱、无明显主带，质量相对较差；其他方法提取的基因组DNA条带整体均出现了拖尾弥散情况，且主带分子量大小不一，说明DNA存在不同程度的降解，含有较多蛋白质、多糖、酚类等杂质或RNA污染，这与超微量分光光度计检测结果相一致。
图8为基因组DNA不同提取方法获得的DNA的琼脂糖凝胶电泳图，图中，M:DL15000Marker；1～3:改良CTAB法；4～6:柱膜法土壤基因组DNA提取试剂盒(MPBiomedicals)；7～9:强力土壤基因组DNA提取试剂盒(QIAGEN)；10～12:多糖多酚植物基因组DNA提取试剂盒(天根)；13～15:柱膜法植物基因组DNA提取试剂盒(MPBiomedicals)。
2.3PCR扩增效果分析
分别以改良CTAB法、MPBiomedicals柱膜法土壤基因组DNA提取试剂盒、QIAGEN强力土壤基因组DNA提取试剂盒、天根多糖多酚植物基因组DNA提取试剂盒和MPBiomedicals柱膜法植物基因组DNA提取试剂盒提取的样品为模板，来扩增细菌V3-V4区和真菌ITS1区，结果如图9和图10所示，图中：M:DL15000Marker；1～3:改良CTAB法；4～6:柱膜法土壤基因组DNA提取试剂盒(MPBiomedicals)；7～9:强力土壤基因组DNA提取试剂盒(QIAGEN)；10～12:多糖多酚植物基因组DNA提取试剂盒(天根)；13～15:柱膜法植物基因组DNA提取试剂盒(MPBiomedicals)
不同方法提取的基因组DNA均能扩增出目的条带，其中MPBiomedicals柱膜法植物基因组DNA提取试剂盒的扩增条带最亮，大小分别为500bp和260bp左右，说明该方法提取的基因组DNA能更好地应用于PCR扩增，满足后续实验要求。相比而言，其他几种方法的扩增条带相对较弱，且有不同程度的拖尾。
基因组DNA是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，保证基因组DNA的完整性和纯度是分子生物研究的基础。槟榔叶片中含有大量多糖、多酚等成分，无疑给叶表微生物基因组DNA的提取增加了难度。多糖的许多理化性质与DNA很相似，它与DNA结合后形成黏稠的胶状物，不仅难以溶解，还会抑制后续实验中多种生物酶(聚合酶、连接酶以及限制性内切酶)的活性。而多酚易被氧化成醌类物质，与核酸不可逆结合引起褐变，使DNA失活。
相比之下，商业化的DNA提取试剂盒通过对裂解液、洗脱液、沉淀液以及不同材质吸附材料的优化，可以得到纯度更高的DNA产物，提取过程中避免了有毒试剂的配置和对实验人员的伤害，实验步骤简单明了，提取时间较短，刚好满足寻找一种快速、稳定的DNA提取方法的需求。本研究采用的四种试剂盒，都是常用并且容易购买的，其中土壤基因组DNA提取试剂盒提取的样品浓度均高于植物基因组DNA提取试剂盒，但A260/230值远低于正常范围，电泳条带拖尾弥散严重，杂质较多，尽管目前土壤基因组DNA提取试剂盒已被广泛应用于植物叶表微生物基因组DNA的提取，但对于槟榔并不适用。不同品牌的植物基因组DNA提取试剂盒也存在差异，国产天根多糖多酚植物基因组DNA提取试剂盒提取的样品A260/A280值略小于正常范围，A260/A230值较土壤基因组DNA提取试剂盒有所提高但距正常范围还相差很多，电泳条带轻度拖尾；只有MPBiomedicals柱膜法植物基因组DNA提取试剂盒提取的样品质量参数合格，浓度和纯度均较高，PCR扩增条带最亮。通过对比上述5种方法提取的槟榔叶表微生物基因组DNA的完整性、得率、纯度以及细菌V3-V4区、真菌ITS1区特异性扩增质量，MPBiomedicals柱膜法植物基因组DNA提取试剂盒的综合效果最好，适用于后续分子生物学研究，为全面了解槟榔叶表微生物多样性奠定了基础。
本发明中应用了具体实施例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (8)

1.一种槟榔叶表微生物基因组DNA提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
槟榔叶片的采集，用灭菌剪采集树冠的叶片，戴无菌手套挑选表面干净无病虫害的小裂叶放入无菌袋，迅速冷冻于干冰中带回实验室，转移到-80℃冰箱保存；
洗脱液的配置，所述洗脱液包括表面活性剂和溶剂，所述表面活性剂和所述溶剂的比例为1：5000，所述溶剂为PBS缓冲液或无菌水；
叶表微生物的收集，在超净工作台上，用无菌剪刀将叶片剪成3 cm×4 cm的小块，称取叶片25g-125g，放入前处理容器中，加入洗脱液，洗脱液的容量应没过叶片，进行前处理，所述前处理包括将前处理容器放入摇床中，25℃，以200 r/min的速度振荡20 min，洗脱叶表微生物，然后去除叶片，在无菌环境中使用真空抽滤装置将瓶内的微生物收集到0.22μm孔径滤膜上；
基因组DNA的提取及质量检测；
PCR扩增检测。
2.根据权利要求1所述的槟榔叶表微生物基因组DNA提取方法，其特征在于，在叶表微生物的收集过程中，所述槟榔叶片的重量为75g。
3.根据权利要求1所述的槟榔叶表微生物基因组DNA提取方法，其特征在于，所述基因组DNA的提取及质量检测包括，对滤膜中的基因组DNA进行提取，-20℃冰箱保存，使用超微量分光光度计对提取的DNA浓度和纯度进行检测；用1%琼脂糖凝胶对提取的DNA质量进行检测，电压120V，电泳时间30min。
4.根据权利要求1所述的槟榔叶表微生物基因组DNA提取方法，其特征在于，所述PCR扩增检测包括，
PCR反应体系：包括模板DNA 0.5μL，KOD FX Neo Buffer 5μL，dNTP 2μL，上游引物和下游引物各0.3μL，KOD FX Neo 0.2μL，最后用双蒸水补足至10μL；
所述上游引物包括338F和ITS1F，所述下游引物包括806R和ITS2；
所述338F的序列为：5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'；
所述ITS1F的序列为：5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'；
所述806R的序列为：5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'；
所述ITS2的序列为：5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'。
5.根据权利要求4所述的槟榔叶表微生物基因组DNA提取方法，其特征在于，所述PCR扩增检测还包括，采用引物338F和806R对细菌16S rDNA基因的V3-V4区进行扩增，PCR反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸40 s，25个循环；72℃延伸7min；
采用引物ITS1F和ITS2对真菌ITS1区进行扩增，PCR反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸40 s，30个循环；72℃延伸7 min，获得PCR产物；
PCR 产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。
6.根据权利要求1所述的槟榔叶表微生物基因组DNA提取方法，其特征在于，对滤膜中的基因组DNA进行提取采用改良CTAB法、土壤基因组DNA提取试剂盒法或植物基因组DNA提取试剂盒法。
7.根据权利要求1所述的槟榔叶表微生物基因组DNA提取方法，其特征在所述改良CTAB法包括：
S1、将滤膜置于研钵中，加入液氮充分研磨成粉末，并迅速收集到2 mL离心管中，加入1mL缓冲液，涡旋混匀，冰浴10 min，4 ℃、10000 r/min离心10 min，弃上清，所述缓冲液包括100 mmol/L Tris-HCl，20 mmol/L EDTA，5% 甘油，2% PVP，2%β-巯基乙醇，Tris-HCl和EDTA的pH值为8.0；
S2、加入800μL 65 ℃预热的CTAB裂解液，混匀后在65 ℃保温30 min，其间不断晃动，使材料与缓冲液混合充分，所述CTAB裂解液包括2% CTAB，1.4 mol/L NaCl，20 mmol/LEDTA，100 mmol/L Tris-HCl，0.2%β-巯基乙醇，Tris-HCl的pH值为8.0；
S3、待材料冷却至室温后加入800μL的第一混合液，所述混合液中苯酚：氯仿：异戊醇的比例为25：24：1，颠倒混匀，12000 r/min离心10 min，获得第一上清液，将第一上清液转移至新的离心管中，加入等体积的第二混合液，所述第二混合液包括氯仿和异戊醇，所述氯仿和异戊醇的比例为24：1，颠倒混匀，12000 r/min离心10 min，获得第二上清液；
S4、吸取500μL第二上清液至新的1.5 mL离心管中，加入50μL 3 mol /L NaAc和500μL异丙醇，颠倒混匀，室温静置15 min，12000 r/min离心10 min，弃上清液；
S5、用75%乙醇和无水乙醇各洗涤沉淀1次，12000 r/min离心5 min，弃上清，置阴凉通风处晾干；
S6、最后，用60μL灭菌ddH2O溶解DNA，加入10μL RnaseA，颠倒混匀，并将其置于-20 ℃下保存。
8.权利要求1-7任一项所述的一种槟榔叶表微生物基因组DNA提取方法在研究槟榔叶表微生物群落结构及多样性中的应用。
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