CN105238693B - 一种草菇菌种的常规低温保存方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种草菇菌种的常规低温保存方法，包括：(1)将草菇菌种转接至PDA平板上，在30‑32℃培养箱中静置培养，待菌丝长满平板后，再转接至PDA试管斜面中，于30‑32℃下静置培养3‑7d；(2)配制质量分数为5‑20％的甘露醇溶液，然后过滤灭菌；(3)采用无菌注射器将步骤(2)中的甘露醇溶液转接至步骤(1)中长满菌丝的试管斜面中，然后将试管斜面置于常规低温下保存，即可。本发明能够延长草菇菌丝在3‑6℃低温环境下的保存时间，具有操作简便，成本低廉，菌种保存时间长、恢复生长快、稳定性好等优点，尤其适用于草菇栽培中小型企业、种植农户。

Description

一种草菇菌种的常规低温保存方法

技术领域

本发明属于食用菌菌种保存领域，特别涉及一种草菇菌种的常规低温保存方法。

背景技术

草菇(Volvariella volvacea(Bull ex Fr.)Sing)，又名稻草菇、兰花菇、中国菇，是一种重要的腐生型食用真菌，起源于我国热带、亚热带高温多雨地区。草菇肉质细嫩，味道鲜美，含有丰富的蛋白质、氨基酸、脂肪酸、多糖、维生素等，其中蛋白质含量为27.24％-30.55％，人体必需8种氨基酸含量高达41.54％。草菇中的多糖、不饱和脂肪酸、维生素、矿物质等具有延缓衰老，增强免疫力，预防肿瘤，降低胆固醇的重要功效。

草菇属高温菇种，最适生长温度为30-32℃。当温度低于10℃时，草菇菌丝生长会受到显著地抑制；在4℃低温时，草菇菌丝会发生自溶而死亡，因此草菇不能像香菇、平菇等食用菌菌种一样利用冰箱在3-6℃低温下保存。目前实验室中草菇菌种保藏方法主要包括：简易保藏法、液体石蜡菌种保藏法、冷冻干燥保藏法、液氮超低温保藏法等。简易保藏法，是指将长满试管斜面的草菇菌丝，放置在15-20℃培养箱中，每2-3个月进行转管1次，操作较为繁琐，而且多次转接极易造成菌种的退化和染杂菌；同时所需的15-20℃培养条件较难控制，不如3-6℃低温条件便利，利用家用冰箱即可实现菌种的低温保存。冷冻干燥保藏法和液氮超低温保藏法，虽然菌种的保藏时间较长，但是设备昂贵，干冰、液氮等成本较高，仅适合于大型菌种保藏中心或实验室。对于一般的草菇栽培企业，尤其是种植农户而言，这些方法在实际生产中较难实施。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种草菇菌种的常规低温保存方法，该方法能够延长草菇菌丝在3-6℃低温环境下的保存时间，具有操作简便，成本低廉，菌种保存时间长、恢复生长快、稳定性好等优点，尤其适用于草菇栽培中小型企业、种植农户，采用冰箱或冷柜即可实现对草菇菌种的保存。

本发明的一种草菇菌种的常规低温保存方法，包括：

(1)将草菇菌种转接至PDA平板上，在30-32℃培养箱中静置培养，待菌丝长满平板后，再转接至PDA试管斜面中，于30-32℃下静置培养3-7d；

(2)称取5-20g甘露醇加入80-95mL蒸馏水，溶解拌匀后得到质量分数为5-20％的甘露醇溶液，然后过滤灭菌；

(3)采用无菌注射器将步骤(2)中的甘露醇溶液转接至步骤(1)中长满菌丝的试管斜面中，直至溶液完全覆盖PDA培养基及草菇菌丝为止，然后将试管斜面置于常规低温下保存，即可。

所述步骤(1)中的PDA培养基的配方为：马铃薯200g取汁，葡萄糖20g，琼脂条20g，加蒸馏水定容至1000mL，pH自然。

所述马铃薯取汁的工艺为：挑选长势较好的马铃薯，将表面清洗干净，去皮，称取，切块后加蒸馏水煮烂，用四层纱布过滤。

所述煮烂时间为20-30min。

所述步骤(3)中的常规低温为3-6℃。

本发明加入草菇菌种试管斜面中的甘露醇溶液的量可多可少，但以完全覆盖住试管PDA培养基及草菇菌丝为原则；加入甘露醇溶液的质量分数可以根据不同草菇菌种进行调整，从节约成本角度考虑，在相同菌种保存效果下，优先选择质量分数相对较低的甘露醇溶液。

本发明原理：甘露醇是真菌细胞内最主要的多元醇，大量存在于子囊菌、担子菌的孢子、子实体及菌丝中。大量研究证实，甘露醇具有冷冻保护作用。本发明采用甘露醇来实现对草菇菌种的常规低温保存。

有益效果

(1)本发明与其它草菇菌种保存方法相比，对设备要求较低，能够在常规低温(3-6℃，如冰箱或冷柜)条件下实现对草菇菌种的保存，因此广泛适用于草菇栽培中小型企业，尤其是草菇种植农户；

(2)本发明成本低廉，所需的PDA培养基为真菌培养的常用培养基，而甘露醇早已实现批量化生产，广泛应用于科研、生产及生活中。

附图说明

图1是空白对照、无菌蒸馏水、10％甘露醇溶液，在4℃下保存草菇V23菌种22h后，转接至PDA平板上的生长情况对比图；

图2是空白对照、无菌蒸馏水、10％甘露醇溶液，在4℃下保存草菇VH3菌种22h后，转接至PDA平板上的生长情况对比图；

图3是空白对照、无菌蒸馏水、20％海藻糖溶液，在4℃下保存草菇V23菌种22h后，转接至PDA平板上的生长情况对比图；

图4是空白对照、无菌蒸馏水、20％海藻糖溶液，在4℃下保存草菇VH3菌种22h后，转接至PDA平板上的生长情况对比图；

图5是草菇菌种V23的遗传指纹图谱，1为marker，2为15℃保存的V23菌种，3为4℃保存22h的空白对照V23菌种，4为4℃保存22h的10％甘露醇V23菌种，5为4℃保存22h的20％海藻糖V23菌种；

图6是草菇菌种VH3的遗传指纹图谱，1为marker，2为15℃保存的VH3菌种，3为4℃保存22h的空白对照VH3菌种，4为4℃保存22h的10％甘露醇VH3菌种，5为4℃保存22h的20％海藻糖VH3菌种。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

1试验材料、试剂与培养基的配制

(1)试验材料：草菇菌种V23与VH3由上海市农业科学院食用菌研究所菌种保藏中心提供。

(2)试剂配制：

10％甘露醇溶液：称取10g甘露醇于烧杯中，加入90mL蒸馏水，溶解拌匀后配置成质量分数为10％的甘露醇溶液，然后过滤灭菌；

20％海藻糖溶液：称取20g海藻糖于烧杯中，加入80mL蒸馏水，溶解拌匀后配置成质量分数为20％的海藻糖溶液，过滤灭菌后备用。

(3)培养基配制：

PDA培养基配方(1L)：马铃薯200g(取汁)，葡萄糖20g，琼脂条20g，加蒸馏水定容至1000mL，pH自然。其中马铃薯取汁的具体操作为：挑选长势较好的马铃薯，将其表面清洗干净，去皮，称取200g，切块后加蒸馏水煮烂(一般煮沸20-30min，能被玻璃棒戳破即可)，用四层纱布过滤。

取配置好的尚未凝固的PDA培养基，使用定量分装仪(DOSE IT P910)将其分装到洁净试管中，并用橡胶塞塞紧管口，然后将PDA试管斜面置于121℃下灭菌20min。

2试验方法

(1)草菇菌种的活化与培养：

将草菇菌种转接至PDA平板上，在32℃恒温培养箱中静置培养，待菌丝长满平板后，再将其转接至PDA试管斜面中，于32℃下静置培养4d。

(2)草菇菌种的常规低温保存

将长满试管斜面的草菇菌种按照V23、VH3分为两组，每组设置4个处理，分别为空白对照、无菌蒸馏水、10％甘露醇溶液、20％海藻糖溶液，每个处理组设10个平行重复。

采用5mL无菌注射器吸取无菌蒸馏水、10％甘露醇溶液、20％海藻糖溶液至长满菌丝的试管斜面中，直到所加入液体完全覆盖住试管斜面与草菇菌丝，然后将上述4个处理(空白对照、无菌蒸馏水、10％甘露醇溶液、20％海藻糖溶液)的试管置于4℃冰箱中进行低温保存。

(3)低温保存后草菇菌丝的恢复生长情况

取在4℃冰箱中低温保存的草菇菌种V23与VH3，在无菌环境下分别挑取两菌种空白对照、无菌蒸馏水、10％甘露醇溶液、20％海藻糖溶液处理的草菇菌丝，并转接至新的PDA平板中，置于32℃下观察各自的恢复生长情况。

(4)低温保存后草菇菌种的遗传稳定性分析

采用ERIC-PCR(Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus)分子指纹图谱进行草菇菌种低温保存后的遗传稳定性分析。

草菇DNA的提取：采用CTAB法。具体操作步骤如下：

1)称取80mg草菇菌丝，经液氮充分研磨后转移至2mL离心管中；

2)在上述离心管中，加入65℃提前预热的2×CTAB提取液700μL；

3)65℃水浴60min，并每隔10min轻轻震荡离心管；

4)在12000rmp下离心20min，取上清液，加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1)，轻轻摇荡15min；

5)在12000rmp下离心10min，然后将上清液转移至新的离心管中，加入2倍体积的异丙醇，-20℃静置60min；

6)在12000rmp下离心10min，弃去上清液，用70％乙醇洗涤2-3次，弃去溶液，使乙醇完全挥发；

7)加入50μL灭菌的ddH₂O，轻轻震荡，使DNA沉淀完全溶解；

8)加入RNA酶1uL，37℃温浴1h，去除RNA，DNA在-20℃下贮藏备用。

ERIC-PCR扩增：引物为ERIC1(5’-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3’)和ERIC2(5’-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3’)。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，扩增反应的试剂盒购自TaKaRa公司。

PCR反应体系：

PCR反应条件：95℃7min；94℃60s，52℃60s，65℃8min，共35个循环；65℃16min。

选用1.5％琼脂糖凝胶对PCR扩增产物进行电泳，EB染色后观察电泳结果。

3草菇菌种常规低温保存效果

本实施例主要采用实验手段来评价草菇菌种的常规低温保存效果，具体包括：草菇菌种低温保存后的恢复生长情况，与基于PCR技术的分子指纹图谱(ERIC-PCR)技术以验证草菇菌种低温保存后的遗传稳定性。

(1)低温保存后草菇菌丝的恢复生长情况比较

空白对照、无菌蒸馏水、10％甘露醇溶液、20％海藻糖溶液的试管斜面，经4℃保存22h后，在同一时间转接至新的PDA平板，32℃静置培养，恢复生长相同时间后，各处理草菇菌种的恢复长势如图1-4所示。由图1、2可以看出，经10％甘露醇溶液处理后保存的V23与VH3菌种，其长势显著好于空白对照组与无菌蒸馏水组，其中无菌蒸馏水组转接后始终未恢复生长。由图3、4可以看出，经20％海藻糖溶液处理后保存的V23与VH3菌种，其长势也好于空白对照组与无菌蒸馏水组，但10％甘露醇溶液的低温保存效果要明显优于20％海藻糖溶液。

(2)低温保存后草菇菌种的遗传稳定性分析

ERIC序列是原核生物基因组中一类短的重复序列，该序列在染色体的分布上和拷贝数量上具有种间的特异性，根据序列中心高度保守的44bp长度的ERIC核心序列设计引物，扩增产物能够反映出细菌基因组结构的特征。1997年Gillings从真菌基因组DNA中同样扩增出稳定的多态性分布图谱，将ERIC-PCR用于真菌鉴别中。图5、图6分别是草菇菌种V23和VH3经低温保存后，提取其转接生长的菌丝DNA，进行ERIC-PCR分子指纹图谱分析的结果。由于无菌蒸馏水组的草菇菌种，在4℃保存22h转接后未恢复生长，因此本实施例中没有列出。图中1为marker，2为15℃保存的草菇菌种，3为4℃保存22h的空白对照草菇菌种，4为4℃保存22h的10％甘露醇草菇菌种，5为4℃保存22h的20％海藻糖草菇菌种。从电泳图谱可以看出，草菇菌种低温保存后，其DNA条带的数量、亮度与15℃保藏的菌种没有差异，表明在甘露醇或海藻糖的保护下，草菇菌种的遗传稳定性未发生改变，其性状是稳定遗传的。

研究表明，在逆境条件下甘露醇具有调节渗透压、清除ROS等重要生物功能。草菇菌种在低温保存时，其菌丝体能够利用外源甘露醇，起到维持蛋白和细胞膜生理功能的作用，从而延长了低温下草菇菌种的保存时间。由此本发明也可用于其它不耐低温的和普通的担子菌的菌种保藏，如香菇、灵芝、姬松茸等，能够在现有基础之上，使菌种保存温度更低，或在相同低温条件下延长菌种的保存时间。

Claims (1)

1.一种草菇菌种的常规低温保存方法，包括：

(1)将草菇菌种转接至PDA平板上，在30-32℃培养箱中静置培养，待菌丝长满平板后，再转接至PDA试管斜面中，于30-32℃下静置培养3-7d；所述的草菇菌种为草菇菌种V23和VH3，由上海市农业科学院食用菌研究所菌种保藏中心提供；PDA培养基的配方为：马铃薯200g取汁，葡萄糖20g，琼脂条20g，加蒸馏水定容至1000mL，pH自然；所述马铃薯取汁的工艺为：挑选长势较好的马铃薯，将表面清洗干净，去皮，称取，切块后加蒸馏水煮烂，煮烂时间为20-30min，用四层纱布过滤；

(2)称取10g甘露醇加入90mL蒸馏水，溶解拌匀后得到质量分数为10％的甘露醇溶液，然后过滤灭菌；

(3)采用无菌注射器将步骤(2)中的甘露醇溶液转接至步骤(1)中长满菌丝的试管斜面中，直至溶液完全覆盖PDA培养基及草菇菌丝为止，然后将试管斜面置于常规低温下保存，即可；所述的常规低温为3-6℃。

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