CN102392016B - 一种高通量快速提取真菌基因组dna的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种高通量快速提取真菌基因组DNA的方法。所述方法利用真菌菌块或菌丝体，经过简易的物理研磨方法，采用改良的CTAB溶液，经过处理去杂后，可得到纯化的DNA。本发明的有益效果主要体现在：(1)免除了现有方法中必须使用特殊试剂液氮进行研磨的复杂程序，(2)避免了现有方法中使用苯酚等有毒致癌试剂，(3)避免使用有毒难闻的化学试剂β-巯基乙醇，(4)本方法只需要1小时，缩短提取时间2小时，大大加快了实验速度，可实现高通量快速提取。本发明所述方法也可适用于其他各种真菌基因组DNA的快速提取。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种高通量快速提取真菌基因组DNA的方法，通过这种方法可以进行各种真菌，例如酵母、霉菌、木耳、动植物病原真菌等基因组DNA的快速提取。
(二)背景技术
真菌(fungus)在自然界中分布广泛，种属很多。真菌的形态差异很大，有些很小必须在显微镜下才可以看见单细胞形态，例如酵母型菌落；有些很大肉眼可见，例如灵芝等蕈菌的子实体。真菌的营养方式为异养吸收型，即通过细胞表面自周围环境中吸收可溶性营养物质，它可以产生大量无性和有性孢子进行繁殖。绝大多数真菌的营养体都是许多菌丝在一起的菌丝体。
真菌通常分为三类，即酵母菌、霉菌和蕈菌。它们归属于不同的亚门。大多数真菌属于担子菌亚门，少数属于子囊菌亚门。有些真菌既是重要的菌类蔬菜，又是食品和制药工业的重要资源。例如香菇、草菇、金针菇、平菇、木耳、银耳、竹荪、羊肚菌等。真菌也是重要的药材，例如用作名贵药材的灵芝、茯苓等。香菇、草菇等除了为人类提供蛋白质和维生素以外，同时还为人类提供真菌多糖、低聚糖等提高免疫力、抗肿瘤的生物活性物质。真菌的某些代谢产物在工业上具有广泛用途并大规模生产，如乙醇，柠檬酸，甘油，酶制剂，甾醇，脂肪，促生素，维生素等。真菌在自然界的物质转化中也起着不容忽视的作用。它可以将环境中的各种有机物降解为简单的复合物和无机小分子，使许多重要化学元素得以再循环。另外，真菌还是进行基础生物学研究的重要研究工具。但是真菌也有对人类有害的一面，寄生于动植物体表而导致动植物病害的病原真菌，动物性病原真菌常可引起人类、家畜和昆虫类患病。许多真菌可引起人畜的疾病、植物病害、导致工业原料及农产品的霉变、食品和粮食发霉，甚至在食品和粮食中产生毒素，例如急性黄曲霉毒素中毒，会引起肝脏坏死；慢性黄曲霉毒素中毒，则会引起肝癌。这些给人类带来了极大的危害和损失。
近几年来，国内外对真菌的基因资源愈加重视，各国都加大了研究投资力度。在食品领域，从食用真菌基因组中挖掘和克隆一些有益基因，增加有益代谢产物的表达；在农业领域，从水稻、小麦、玉米等重要粮食作物中挖掘和克隆与寄主互作的真菌致病基因，进行抗真菌病害研究，最终获取抗病新品种；在医学领域，从病原真菌中找到致病基因，更好的为人类的健康提供服务。许多国家已经开始了真菌基因组DNA的功能研究，但是这些研究的前提需要提取高质量的真菌基因组DNA。由于真菌有特殊的细胞结构，有些真菌是多核细胞，富含多糖和蛋白质等次生代谢物。常规传统方法使用了液氮研磨进行破坏细胞壁、也有用液氮结合蛋白酶K和蜗牛酶酶解破坏细胞壁等方法。真菌的核酸物质往往是和蛋白质紧密结合在一起的，而提取高质量的真菌DNA的关键是有效的分离核酸和蛋白质。破坏细胞膜使核酸和蛋白质解聚的方法大多使用化学试剂CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)，它不但能够解聚核酸和蛋白质，而且可以去除细胞内多糖等复杂的代谢产物。对于去除细胞破裂释放的蛋白质，大多数使用了苯酚和β-巯基乙醇等，而这些药品毒性很大，对人体健康有较大危害作用。目前国内外报道的这些方法消耗大量化学试剂，实验步骤烦琐，提取时间长，最重要的是接触有毒试剂较多。这些都无法满足目前高通量真菌基因组研究的需要。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种简单安全的高通量快速提取真菌基因组DNA的方法。
本发明采用的技术方案是：
一种高通量快速提取真菌基因组DNA的方法，所述方法包括：
(1)菌丝体的裂解：从培养基上挑取真菌(包括酵母菌、霉菌和蕈菌)菌块样品(直径约1～2cm)，投入改良的CTAB缓冲液(通常为100～300μL)中，用消毒过的研磨棒充分研磨菌块；所述CTAB缓冲液组成如下：CTAB 1～5％(w/v，每100mL缓冲液中含有1～5g CTAB)，NaCl1～2mol/L，TrisCl 50～100mmol/L，EDTA 10～50mmol/L，SDS 0.5～2％(w/v)，PVP 0.2～1％(w/v)，溶剂为去离子水；
(2)RNA杂质的去除：将研磨好的样品补加CTAB缓冲液(通常为300～600μL，目的是使破碎的菌丝体内容物与CTAB缓冲液充分作用。)和核糖核酸酶A(RNase A)(目的是水解RNA，对DNA不起作用，常规催化量，一般3～5μL即可，酶液浓度10～50μg/ml)，置于60～70℃水浴中，每隔5～10mins轻轻摇动，20～30mins后取出；
(3)蛋白质杂质的去除：加入氯仿∶异戊醇体积比为24∶1的CIA液，振荡混匀1～2mins；
(4)DNA的沉淀：移取上层水相于1.5mL离心管中，加入预冷(-20℃)的异丙醇溶液(体积约为上层水相的0.7倍)，上下颠倒几次使样品混匀，置于-20℃下20～30mins，使核酸充分沉淀；
(5)DNA的溶解：离心，弃上清液，将DNA沉淀吸干水分，即得样品基因组DNA，用TE缓冲液溶解，-20℃保存DNA样品备用。
所述TE缓冲液组成如下：1mol/L TrisCl，0.5mol/L EDTA，pH8.0，溶剂为去离子水。
本发明方法能高效快速的去除真菌细胞内和细胞外的多糖和类似多糖的代谢物。免去了使用液氮这种特殊试剂，也避免使用昂贵的酶试剂和毒性较大的化学试剂β-巯基乙醇和苯酚。提取产物DNA含量高，杂质少，纯度高，能满足后续分子生物学的基因实验分析研究。本发明方法既适用于丝状真菌，也适用于酵母型和类酵母型真菌。通过这种方法，可以成功实现在短时间内上万个真菌菌落的大规模DNA快速提取。本发明真菌优选为水稻稻曲菌、毕赤氏酵母菌、黑霉菌以及平菇、草菇、香菇、银耳和黑木耳等大型真菌。
优选的，所述方法如下：
(1)取1.5mL离心管，加入改良的CTAB缓冲液100μL，从培养基上挑取真菌菌块样品(直径1cm左右)，投入离心管中，用75％(v/v)酒精消毒过的研磨棒充分研磨菌块；所述CTAB缓冲液组成如下：CTAB1.5％，NaCl 1.4mol/L，TrisCl 100mmol/L，EDTA 20mmol/L，SDS 1％，PVP 1％，溶剂为去离子水；
(2)研磨好的样品补加400μL CTAB缓冲液和3～5μl RNase A(10μg/ml，sigma公司)，置于65℃水浴中，每隔10mins轻轻摇动，30mins后取出；
(3)加入氯仿∶异戊醇体积比为24∶1的CIA液700μL，振荡混匀1min；
(4)移取上层水相(约1ml)于离心管中，加入700μL预冷的异丙醇，颠倒几次使样品混匀，置于-20℃下20mins，使核酸充分沉淀；
(5)离心，弃上清，取沉淀吸干水分，即得样品基因组DNA，用TE缓冲液溶解DNA，-20℃保存DNA样品备用。
本发明的有益效果主要体现在：(1)免除了现有方法中必须使用特殊试剂液氮进行研磨的复杂程序，(2)避免了现有方法中使用苯酚等有毒致癌试剂，(3)避免使用有毒难闻的化学试剂β-巯基乙醇，(4)本方法只需要1小时，缩短提取时间2小时，大大加快了实验速度，可实现高通量快速提取。
(四)附图说明
图1为利用本发明方法分别提取的不同基因组DNA的电泳图；M代表15K Marker(从上到下DNA大小依次为：15000bp，10000bp，7500bp，5000bp，2500bp，2000bp，1000bp)，1为水稻稻曲菌基因组DNA，2为毕赤氏酵母基因组DNA，3为黑霉菌基因组DNA，4为平菇基因组DNA，5为黑木耳基因组DNA。
图2为利用本发明方法分别提取的不同基因组DNA的PCR扩增真菌核糖体5.8SrDNA的电泳图；M代表DL2000Marker(从上到下DNA大小依次为：2000bp，1000bp，750bp，500bp，200bp，100bp)，1为以水稻稻曲菌基因组DNA为模板扩增DNA，2为以毕赤氏酵母基因组DNA为模板扩增DNA，3为以黑霉菌基因组DNA为模板扩增DNA，4为以平菇基因组DNA为模板扩增DNA，5为以黑木耳基因组DNA为模板扩增DNA。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：
(1)取1个1.5ml离心管，提前加入100μl改进优化的CTAB缓冲液(1.5％CTAB，NaCl 1.4mol/L，TrisCl 100mmol/L，EDTA 20mmol/L，1％SDS，1％PVP，溶剂为去离子水)；
(2)从培养基上挑取直径1～2cm的水稻稻曲菌[Ustilaginoidea virens(Cooke)Tak]菌块，放入离心管中，进行如下操作：
(3)用75％酒精消毒过的研磨棒充分研磨菌块；
(4)研磨充分后，补加400μl CTAB缓冲液和4μl RNase A(10μg/ml，sigma公司生产)；
(5)将研磨好的样品置于60～70℃的水浴槽中，每隔8～10mins轻轻摇动，20～30mins后取出；
(6)加入700ul CIA液(氯仿∶异戊醇＝24∶1，v/v)，震荡混匀1min；
(7)12000rpm，离心10mins；
(8)小心移取上层水相于另一离心管中，加入0.7倍体积-20℃预冷的异丙醇，上下轻微颠倒几次使样品混匀，置于-20℃下20mins，使核酸充分沉淀。
(9)12000rpm，离心10mins。
(10)弃上清，沉淀在吸水纸上倒置1～2mins，排干水分。
(11)加入20～50ul TE缓冲液(1mol/L TrisCL，0.5mol/LEDTA，pH8.0，溶剂为去离子水)溶解，-20℃保存DNA样品备用。
实施例2：
取直径约1～2cm的毕赤氏酵母菌(Pichia pastoris)菌块、黑霉菌(Aspergillus niger)菌丝体、平菇(Oyster mushroom)菌丝体和黑木耳(Auricularia auricular)菌丝体，分别按照实施例1方法进行基因组DNA提取。提取所得DNA与实施例1所得DNA按下述方法分别进行琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计方法检测：
琼脂糖凝胶电泳检测：首先配制0.8％的琼脂糖凝胶，用1×TAE电泳缓冲液对提取的真菌基因组总DNA进行电泳检测，所述1×TAE电泳缓冲液组成如下：0.04mol/L Tris-乙酸，0.001mol/L EDTA。吸取真菌基因组DNA 2～4μL，和1ul的6×上样缓冲液(全式金生物公司生产)混合，混合均匀后，按照15v/cm稳压电泳30分钟。同时用15K Marker(全式金生物公司生产)作为DNA的大小参照物。电泳结束后用凝胶成像系统来观察，结果见图1，电泳结果基因组DNA条带清晰完整，RNA去除的也很干净。
紫外分光光度计方法检测：分别取1ul提取的真菌基因组DNA，利用
紫外-可见光分光光度计(Nano-Drop Technologies，Wilmington，DE，USA)测定提取的DNA样品，分别在230nm、260nm和280nm下测定样品的OD值。其中OD260nm/OD280nm比值在1.8～2.0之间表示样品含杂质少，样品纯度比较高；OD260nm/OD230nm比值用于表示DNA样品的去盐程度；OD260nm/OD230nm比值在1.9以上表示样品含盐量少，样品纯度比较高。按下列公式计算DNA的浓度：DNA的浓度(μg/mL)＝OD260×50μg/mL×稀释倍数。结果见表1：
表1：采用本发明方法提取的DNA的纯度和浓度
| 真菌类型 | OD260nm/OD230nm | OD260nm /OD280nm | DNA浓度/(μg/ml) |
| 水稻稻曲菌 | 2.05±0.02 | 1.85±0.31 | 73.14±0.03 |
| 毕赤氏酵母 | 1.98±0.31 | 1.95±0.02 | 60.23±0.21 |
| 黑霉菌 | 1.84±0.21 | 1.80±0.42 | 92.74±0.32 |
| 平菇 | 2.13±0.23 | 1.88±0.13 | 65.73±0.22 |
| 黑木耳 | 1.94±0.31 | 1.90±0.10 | 82.53±0.28 |
由表1可见，利用本发明方法提取得到的各种真菌基因组DNA，DNA含量高且杂质少，能满足分子生物学实验对DNA纯度的要求。
另取取直径约1～2em的水稻稻曲菌菌块、毕赤氏酵母菌菌块、黑霉菌菌丝体、平菇菌丝体和黑木耳菌丝体，使用未改良的CTAB缓冲液(1.5％CTAB，NaCl 1.4mol/L，TrisCl 100mmol/L，EDTA 20mmol/L，溶剂为去离子水)，按照实施例1方法提取基因组DNA，并按前述方法进行紫外分光光度计方法检测，结果见表2：
表2：采用未改良的CTAB缓冲液提取的DNA的纯度和浓度
| 真菌类型 | OD260nm/OD230nm | OD260nm/OD280nm | DNA浓度/(μg/ml) |
| 水稻稻曲菌 | 1.91±0.02 | 1.79±0.12 | 71.28±0.02 |
| 毕赤氏酵母 | 1.88±0.12 | 1.85±0.61 | 53.25±0.08 |
| 黑霉菌 | 1.72±0.06 | 1.75±0.23 | 81.54±0.31 |
| 平菇 | 1.92±0.23 | 1.81±0.02 | 62.23±0.42 |
| 黑木耳 | 1.84±0.42 | 1.82±0.31 | 81.45±0.05 |
由表2可见，使用本发明改良的CTAB缓冲液，提取各种真菌基因组DNA的纯度质量要明显优于采用未改良的CTAB缓冲液提取的DNA的质量。
PCR(polymerase chain rection，聚合酶链式反应)扩增真菌核糖体5.8SrDNA检测DNA质量：
为了验证上述方法提取的基因组DNA是否适用于分子生物学后续操作研究，应用真菌通用引物ITS1和ITS4(序列见表3)扩增其ITS1、5.8S rDNA及ITS2序列。引物由上海生工生物技术有限公司合成。PCR扩增实验步骤为：取0.2ml的离心管，分别加入下列试剂，10×PCR Buffer5μL，dNTP Mixtur 4μL，Primer ITS1 1μL，Primer ITS4 1μl，DNA模板(所提取的真菌DNA分别稀释200倍后作为PCR反应的模板)1μL，Taq DNA聚合酶1μL，补加灭菌的双蒸水到50μL。
PCR扩增反应条件为：94℃预热变性5min，然后进入循环阶段，94℃热变性30s，54℃复性30s，72℃延伸1min，进行30个循环，最后72℃延伸10min。反应结束后，结束后取5μL产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图2。
表3：扩增真菌ITS-5.8SrDNA的通用引物序列
所提取的5种真菌基因组DNA，利用真菌的通用引物ITS1、ITS4扩增得到的PCR产物条带清晰，大小均在750bp左右，符合预期的片段大小。
Claims (1)
1.一种高通量快速提取真菌基因组DNA的方法，其特征在于所述方法如下：
（1）取1.5mL离心管，加入CTAB缓冲液100μL，从培养基上挑取真菌菌块样品，投入离心管中，用75%酒精消毒过的研磨棒充分研磨菌块；所述CTAB缓冲液组成如下：CTAB 1.5%，NaCl 1.4mol/L，TrisCl 100mmol/L，EDTA 20mmol/L，SDS 1%，PVP 1%，溶剂为去离子水；所述真菌为下列之一：水稻稻曲菌、毕赤氏酵母菌、黑霉菌、平菇、黑木耳；
（2）研磨好的样品补加400μL CTAB缓冲液和3～5μl RNase A，置于65℃水浴中，每隔10min轻轻摇动，30min后取出；
（3）加入氯仿：异戊醇体积比为24:1的CIA液700μL，振荡混匀1min；
（4）移取上层水相于离心管中，加入700μL预冷的异丙醇，颠倒几次使样品混匀，置于-20℃下20min，使核酸充分沉淀；
（5）离心，弃上清，取沉淀吸干水分，即得样品基因组DNA，用TE缓冲液溶解DNA，-20℃保存DNA样品备用；所述TE缓冲液组成如下：1mol/L TrisCl，0.5mol/L EDTA，pH8.0，溶剂为去离子水。
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