CN105018472B

CN105018472B - 一种高效提取食用菌菌丝体营养生长阶段rna的方法

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Publication number: CN105018472B
Application number: CN201510506182.4A
Authority: CN
Inventors: 姬丹丹; 臧立华; 祝德义; 周茂娟; 张运春
Original assignee: Qilu University of Technology
Current assignee: Qilu University of Technology
Priority date: 2015-08-17
Filing date: 2015-08-17
Publication date: 2018-01-12
Anticipated expiration: 2035-08-17
Also published as: CN105018472A

Abstract

本发明提供一种可用于食用菌菌丝体营养生长阶段RNA提取的方法，可以有效去除培养基质对RNA提取过程的干扰，RNA提取效率高、纯度高、不含PCR酶抑制剂。所述RNA提取的方法，包括前处理阶段和提取阶段，前处理阶段包括下列步骤：1)取一份布满菌丝体的培养基，粗研；2)加入适量的缓冲液I，放置摇床，保持温度35～40℃，摇床转速100～150rpm摇动2～3h；3)取步骤2)的溶液，3000～4000rpm低速离心10～15min；收集上清液；4)步骤3)中剩余的沉淀，加入缓冲液II洗涤2～5次，3000～4000rpm低速离心10～15min，取每次洗涤后的上清液合并；5)将步骤3)和步骤4)离心的上清液集中到一起，在转速10000～12000rpm，4℃离心10～15min，弃上清液，收集沉淀。

Description

一种高效提取食用菌菌丝体营养生长阶段RNA的方法

技术领域

本发明属于分子生物学工程技术领域，具体涉及一种高效提取食用菌菌丝体营养生长阶段RNA的方法。

技术背景

食用菌不仅物美味鲜，而且低能量、低脂肪，并富含蛋白质、膳食纤维和维生素等营养素，正在发展成为继植物性食品、动物性食品之外的第三类食品，即菌物性食品。此外，食用菌还是功能性多糖、萜类化合物等多种天然产物的来源之一，在提高人体免疫功能，防治多种慢性病和抗衰老等方面具有显著的功效。因此，食用菌越来越受到广大消费者的青睐，市场需求量不断增大。常见的食用菌栽培基质主要由富含纤维素、木质素的固形物(木屑、棉籽壳、作物秸秆、中药渣)加入适量的辅料(麸皮或米糠)再与水配制而成。

近年来，尽管食用菌产业在我国发展迅速，国家对食用菌产业支持力度也逐年加大，但基础研究薄弱的现状还没有得到根本性的改变。传统的研究手段已经无法满足当前食用菌相关研究的需求。而分子生物学技术可以突破传统研究方法的限制，将极大地促进食用菌木质纤维素降解的分子机制、食用菌子实体形成发育的调控机理、食用菌环境因子响应的分子机制、食用菌活性物质及其合成代谢的分子基础、食用菌遗传多样性分析及食用菌鉴定与育种等领域的研究，而所有这些研究的基础便是从食用菌菌丝体中获取高质量的RNA。

常规的实验手段是从液体培养基中的菌丝体、PDA培养基表面的菌丝体或者食用菌的子实体中提取RNA，这些提取方法已经比较成熟。然而，食用菌在栽培基质(木屑、棉籽壳、作物秸秆、中药渣)上的生长分为两个阶段：即菌丝体营养生长阶段和子实体生长阶段，而菌丝体营养生长阶段是整个食用菌生长发育过程中最重要的阶段。由于在菌丝体营养生长阶段，菌丝体和栽培基质紧密嵌合，无法将菌丝体从栽培基质上分离，造成了RNA提取困难、质量差，影响扩增。食用菌营养生长阶段RNA提取方法的缺失，导致整个食用菌生长发育过程中分子机制数据链条的不完整，影响了研究的深入开展。因此建立高效、可靠的食用菌菌丝体营养生长阶段RNA提取方法就显得尤为重要。

目前，从液体培养基中的菌丝体、PDA培养基表面的菌丝体或者食用菌的子实体中提取RNA的方法已有很多报道(Castanera R,Pérez G,Omarini A,et al.Transcriptionaland enzymatic profiling of Pleurotus ostreatus laccase genes in submerged andsolid～state fermentation cultures[J].Applied and environmental microbiology,2012,78(11):4037～4045.，Abdelazim A M,Afifi1&2M.Oyster mushroom(Pleurotusostreatus)strain 238ameliorates the oxidative stress in STZ～induced diabeticmice[J].Life Science Journal,2013,10(3).，税丕容,郑晓冰,林俊芳,等.简便高质量的食用茵总RNA提取方法[J].食用菌学报,2008,15(1):32～41.)。但是有关菌丝体营养生长阶段，菌丝体和栽培基质紧密混合状态下提取RNA的方法还未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种可用于食用菌菌丝体营养生长阶段RNA提取的方法。该方法可以有效去除培养基质对RNA提取过程的干扰，具有RNA提取效率高、纯度高、不含PCR酶抑制剂等优点。

术语说明：

rpm：每分钟的转数，(revolutions per minute转数/分)

技术方案如下：

一种用于食用菌菌丝体营养生长阶段RNA提取的方法，包括前处理阶段和提取阶段，其特征在于，前处理阶段包括下列步骤：

1)取一份布满菌丝体的培养基，粗研，置一洁净容器中；

2)加入适量的缓冲液I，至淹没过布满菌丝体的培养基，放置于恒温摇床，保持温度35～40℃，摇床转速100～150rpm摇动2～3h；

3)取步骤2)的溶液，3000～4000rpm低速离心10～15min；溶液分成沉淀和上清液，收集上清液；

4)步骤3)中剩余的沉淀，加入缓冲液II洗涤，3000～4000rpm低速离心10～15min，洗涤过程重复2～5次，取每次洗涤后的上清液合并；

5)将步骤3)和步骤4)离心的上清液集中到一起，在转速10000～12000rpm，4℃离心10～15min，弃上清液，收集沉淀。

步骤2)中缓冲液I的加入量优选为缓冲液I与培养基的体积范围为比(1.5∶1)～(4.0∶1)，更优选的为3.0∶1。加入缓冲液I的量过多会造成缓冲液I的浪费，并不会影响提取效果；加入缓冲液I的量过少会造成菌丝体溶解不完全，进而菌丝体中DNA释放不完全，影响DNA提取的浓度和效率。步骤2)的目的是要将附着于培养基的菌丝体细胞结构溶解，使其中的DNA可以充分释放出来；在此目的下，本领域技术人员根据本发明的提示，对缓冲液I的加入量的任何调整，均在本发明的范围之内。缓冲液I与培养基的体积比为1.5：1、1.8：1、2：1、2.2：1、2.4：1、2.6：1、2.8：1、3：1、3.5：1、4：1或者上述比例的任意组合。

步骤4)中缓冲液II的加入量与培养基的体积比为(1：3)～(1.5：1)，只是要尽量把附着于培养基的菌丝体中的DNA涮洗出来。步骤4)的目的是要尽量将已经溶解出的DNA涮洗出来，增加提取效率，保证提取的DNA浓度。缓冲液II的加入量优选为1：3、1：2、1：1、1.5：1或者上述加入量的任意组合的范围区间。本领域技术人员根据本发明的提示，对缓冲液II的加入量的任何调整，均在本发明的范围之内。

本发明所述的用于食用菌菌丝体营养生长阶段RNA提取的方法，提取阶段可以采用现有技术，也可以采用下述的优选条件。

优选的，用于食用菌菌丝体营养生长阶段RNA提取的方法，其特征在于，提取阶段包括下列步骤：

1)加入TRIzol试剂，混匀；

2)10000～15000r/min,2～8℃，离心5～20min；

3)取上清，加入酚和氯仿混合液，摇匀4～10min，静置4～10min；

4)10000～15000r/min,2～8℃，离心5～20min；

5)取上清液，加入异丙醇，摇匀2～5min，放置～20℃冰箱中，静置20～60min；

6)10000～15000r/min,2～8℃，离心5～20min；

7)舍去上清液，留沉淀，加入乙醇冲洗；

8)10000～15000r/min,2～8℃，离心5～20min；

9)弃上清液，将其放入超净工作台，风干5～30min；

10)加入贮存液I，30～40℃作用10～20min，进一步采用RNA纯化试剂盒纯化RNA；

11)-40～-20℃冰箱中保存。

优选的，步骤1)中，加入0.1～2ml TRIzol试剂；更优选的，加入1ml TRIzol试剂。

优选的，步骤2)中，11000～13000r/min,3～5℃，离心6～15min；更优选的，12000r/min,4℃，离心10min。

优选的，步骤3)中，取600μl上清，加入500～800μl酚和氯仿混合液，摇匀4～8min，静置4～8min；酚∶氯仿体积比20～30∶20～28；优选的，加入600μl酚和氯仿混合液，酚∶氯仿体积比25∶24；

优选的，步骤4)中，11000～13000r/min,3～5℃，离心6～15min；更优选的，12000r/min,4℃，离心10min；

优选的，步骤5)中，取600μl上清液，加入500～800μl异丙醇，摇匀2～4min，放置-20℃冰箱中，静置20～40min；更优选的，取600μl上清液，加入600μl异丙醇，摇匀3min，放置-20℃冰箱中，静置30min；

优选的，步骤6)中，11000～13000r/min,2～5℃，离心6～15min；更优选的，12000r/min,4℃，离心10min；

优选的，步骤7)中，舍去上清液，留沉淀，加入75％的乙醇冲洗；更优选的，75％的乙醇加入量为0.1～2ml；更优选的，75％的乙醇加入量为1ml。

优选的，步骤8)中，11000～13000r/min,2～5℃，离心6～15min；更优选的，12000r/min,4℃，离心10min；

优选的，步骤9)中，弃上清液，将其放入超净工作台，风干10～20min；更优选的，风干15min；

优选的，步骤10)中，加入30～50μl贮存液I，35～40℃作用12～18min，更优选的，加入40μl贮存液I，37℃作用15min。

优选的，步骤11)中，-30～-20℃冰箱中保存；更优选的，-20℃冰箱中保存。

前处理阶段缓冲液I：20mg/mL溶菌酶500μL+20mg/mL蛋白酶K 200μL+0.02～0.1mmol/L pH 5.5～6.5PBS缓冲液配制成1000ml溶液；溶菌酶为N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，蛋白酶K为是一种枯草蛋白酶类的高活性蛋白酶。

前处理阶段缓冲液II：1mmol EDTA+10％SDS 10ml+0.02～0.1mmol pH5.5～6.5PBS缓冲液配制成100ml溶液；EDTA为乙二胺四乙酸；SDS为十二烷基磺酸钠；

提取RNA贮存液I：1.2mL DEPC处理水+1mmol BSA+DNase I(RNase free)30U+RNase抑制剂40U配制成100ml溶液；DEPC处理水：无菌蒸馏水中加入0.1％(v/v)焦碳酸二乙酯(DEPC)，室温搅拌4小时以上，121度高压灭菌20分钟，冷却备用；DNase I(RNase free)：去除了核糖核酸酶的脱氧核糖核酸酶I，是一种可以消化单链或双链DNA产生单脱氧核苷酸或单链或双链的寡脱氧核苷酸的核酸内切酶，作用是除去RNA中的基因组DNA；RNase抑制剂：核糖核酸酶抑制剂，作用是保存RNA的稳定，不被降解。

TRIZOL是一种新型总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总RNA。其含有苯酚、异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶。TRIZOL试剂可以购买也可以根据现有技术的文献自己制备。

本发明中，如果没有特殊说明，溶剂均为水。本发明未详述的部分，均可采用现有技术。

琼脂糖凝胶电泳测定完整性：

将2.5μl所提RNA与上样缓冲液混匀后进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，120V 20min后上凝胶成像系统观察并拍照。若条带清晰、明亮，说明RNA完整性较好、无降解，所提总RNA可以用于逆转录。

本发明的有益效果在于：

1、本发明可以有效去除培养基质对RNA提取过程的干扰，利于菌丝体RNA提取的纯度。

2、本发明具有RNA提取效率高、纯度高，可以用于进行精密的分子生物学实验。

3、本发明涉及的提取液配方组成，是实验室普遍采用的常规试剂，经济性好。

4、本发明涉及的提取液无毒、无刺激性气味，操作安全。

5、栽培基质和食用菌菌种对提取没有影响，本发明适用于各种栽培基质和食用菌菌种。

表1本发明方法与常规方法提取RNA的对比

附图说明

图1为实施例1的RNA电泳图；

图2为实施例2的RNA电泳图；

图3为实施例3的RNA电泳图；

具体实施方式

实施例1

食用菌菌丝体样品取自山东省农业科学院农业资源与环境研究所国家级食用菌工程技术推广中心，栽培基质的主要成分为棉籽壳，食用菌菌种为榆黄菇。

取布满菌丝体的培养基20g，粗研，至100mL三角瓶中；加入适量的DNA缓冲液I，至淹没过布满菌丝体的培养基；缓冲液I与培养基的体积范围为比3∶1；放置摇床，35℃，100rpm摇动2h；取溶液，3000rpm，离心10min；取上清液；剩余沉淀，加入培养基1.2倍体积缓冲液II洗涤，3000rpm，离心10min，取上清液；此洗涤过程重复3次，将多次离心的上清液合并，10000rpm，4℃离心10min；弃上清，收集沉淀于一EP管中。加入1ml TRIzol试剂，12000r/min,4℃，离心10min。取600μl上清液加入等体积酚∶氯仿，酚∶氯仿体积比25∶24；摇匀5min，静置5min。12000r/min，10min，4℃，离心。取上清液，加入等体积异丙醇。摇匀3min，放置-20℃冰箱中20～30min。12000r/min，10min，4℃，离心。舍去上清液，留沉淀。75％的乙醇冲洗，即25μl去RNA水和75μl无水乙醇配制。12000r/min，10min，4℃，离心。倒去乙醇，烘干。加入RNase抑制剂1μl，并于37℃作用15min。取1μL RNA，稀释50倍，用紫外分光光度计进行质量检测。取5μL RNA，用琼脂糖凝胶电泳检测RNA条带。

总RNA OD₂₆₀/OD₂₈₀为2.10，这表明RNA无蛋白质或酚污染，电泳结果表明RNA样品条带清晰，28S比18S rRNA条带亮度接近2∶1，说明RNA质量较高，见图1、表2。

表2 RNA质量检测

实施例2

食用菌菌丝体样品来自本实验室中药渣食用菌栽培试验，栽培基质的主要成分为中药渣(黄芩和甜叶菊)，食用菌菌种为平菇。

取布满菌丝体的培养基50g，粗研，至250mL三角瓶中；加入适量的缓冲液I，至淹没过菌块布满菌丝体的培养基；缓冲液I与培养基的体积范围为比2∶1；放置于摇床，40℃，150rpm摇动3h；取溶液，4000rpm，离心15min；取上清液；剩余沉淀，加入0.8倍培养基体积的缓冲液II洗涤，4000rpm，离心15min，取出上清液；此洗涤过程重复2次，将多次离心的上清液合并；12000rpm，4℃离心15min；弃上清，收集沉淀于一EP管中。加入1ml TRIzol，12000r/min,10min，4℃，离心。用移液枪取大约600μl上清。加入等体积酚∶氯仿，酚∶氯仿体积比28∶24；摇匀5min，静置5min。12000r/min，10min，4℃，离心。取上清液，加入等体积异丙醇。摇匀3min，放置-20℃冰箱中20～30min。12000r/min，10min，4℃，离心。舍去上清液，留沉淀。75％的乙醇冲洗，即25μl去RNA水和75μl无水乙醇配制。12000r/min，10min，4℃，离心。倒去乙醇，将其放入机器烘干。加入RNase抑制剂1μl，并于37℃作用15min。取1μLRNA，稀释50倍，用紫外分光光度计进行质量检测。取5μL RNA，用琼脂糖凝胶电泳检测RNA条带。

总RNA OD₂₆₀/OD₂₈₀为1.98，这表明RNA无蛋白质或酚污染，电泳结果表明RNA样品条带清晰，28S比18S rRNA条带亮度接近2∶1，说明RNA质量较高，见图2、表3。

表3 RNA质量检测

实施例3

食用菌菌丝体样品来自本实验室中药渣食用菌栽培试验，栽培基质的主要成分为中药渣(赤芍和红花)，食用菌菌种为杏鲍菇。

取布满菌丝体的培养基20g，粗研，至100mL三角瓶中；加入适量的DNA缓冲液I，至淹没过菌块；缓冲液I与培养基的体积范围为比4∶1；放置摇床中，37℃，120rpm摇动2.5h；取溶液，3500rpm，离心12min；取出上清液；剩余沉淀，加入培养基等体积的缓冲液II洗涤，3500rpm，离心12min，取出上清液；此洗涤过程重复5次，将多次离心的上清液合并；11000rpm，4℃离心12min；弃上清，收集沉淀于一EP管中。加入1ml TRIzol，12000r/min,10min，4℃，离心。用移液枪取大约600μl上清。加入等体积酚∶氯仿，酚∶氯仿体积比22∶26；摇匀5min，静置5min。12000r/min，10min，4℃，离心。取上清液，加入等体积异丙醇。摇匀3min，放置-20℃冰箱中20～30min。12000r/min，10min，4℃，离心。舍去上清液，留沉淀。75％的乙醇冲洗，即25μl去RNA水和75μl无水乙醇配制。12000r/min，10min，4℃，离心。倒去乙醇，将其放入机器烘干。加入RNase抑制剂1μl，并于37℃作用15min。取1μL RNA，稀释50倍，用紫外分光光度计进行质量检测。取5μL RNA，用琼脂糖凝胶电泳检测RNA条带。

总RNA OD₂₆₀/OD₂₈₀为1.88，这表明RNA无蛋白质或酚污染，电泳结果表明RNA样品条带清晰，28S比18S rRNA条带亮度接近2∶1，说明RNA质量较高，见图3、表4。

表4 RNA质量检测

采用实施例1的方法，使用不同的栽培基质和食用菌菌种进行实验，结果见表5。我们发现，栽培基质和食用菌菌种对提取没有影响，本发明适用于各种栽培基质和食用菌菌。

表5不同栽培基质栽培食用菌菌种的RNA提取效果对比

Claims

1.一种用于食用菌菌丝体营养生长阶段RNA提取的方法，包括前处理阶段和提取阶段，其特征在于，前处理阶段包括下列步骤：

1)取一份布满菌丝体的培养基，粗研，置一洁净容器中；

2)加入适量的缓冲液I，至淹没过布满菌丝体的培养基，放置摇床，保持温度35～40℃，摇床转速100～150rpm摇动2～3h；缓冲液I：20mg/mL溶菌酶500μL+20mg/mL蛋白酶K 200μL+0.02～0.1mmol/LpH 5.5～6.5PBS缓冲液配制成1000ml溶液；

4)步骤3)中剩余的沉淀，加入缓冲液II洗涤，3000～4000rpm低速离心10～15min，洗涤过程重复2～5次，取每次洗涤后的上清液合并；缓冲液II：1mmol EDTA+10％SDS 10ml+0.02～0.1mmol pH 5.5～6.5PBS缓冲液配制成100ml 溶液；EDTA为乙二胺四乙酸；SDS为十二烷基磺酸钠；

2.如权利要求1所述的用于食用菌菌丝体营养生长阶段RNA提取的方法，其特征在于，步骤2)中缓冲液I的加入量为：缓冲液I与培养基的体积范围为(1.5∶1)～(4.0∶1)。

3.如权利要求1所述的用于食用菌菌丝体营养生长阶段RNA提取的方法，其特征在于，步骤4)中缓冲液II的加入量与培养基的体积比为(1：3)～(1.5：1)。

4.如权利要求1～3任一项所述的用于食用菌菌丝体营养生长阶段RNA提取的方法，其特征在于，提取阶段包括下列步骤：

1)加入TRIzol试剂，混匀；

2)10000～15000r/min,2～8℃，离心5～20min；

4)10000～15000r/min,2～8℃，离心5～20min；

6)10000～15000r/min,2～8℃，离心5～20min；

7)舍去上清液，留沉淀，加入乙醇冲洗；

8)10000～15000r/min,2～8℃，离心5～20min；

9)弃上清液，将其放入超净工作台，风干5～30min；

10)加入贮存液I，30～40℃作用10～20min，进一步采用RNA纯化试剂盒纯化RNA；贮存液I：1.2mL DEPC处理水+1mmol BSA+DNase I(RNase free)30U+RNase抑制剂40U配制成100ml溶液；DEPC处理水：无菌蒸馏水中加入0.1％(v/v)焦碳酸二乙酯(DEPC)，室温搅拌4小时以上，121度高压灭菌20分钟，冷却备用；

11)-40～-20℃冰箱中保存。

5.如权利要求4所述的用于食用菌菌丝体营养生长阶段RNA提取的方法，其特征在于，步骤1)中，加入0.1～2ml TRIzol试剂。

6.如权利要求4所述的用于食用菌菌丝体营养生长阶段RNA提取的方法，其特征在于，步骤3)中，取600μl上清，加入500～800μl酚和氯仿混合液，摇匀4～8min，静置4～8min；酚∶氯仿体积比20～30∶20～28。

7.如权利要求6所述的用于食用菌菌丝体营养生长阶段RNA提取的方法，其特征在于，步骤3)中，，加入600μl酚和氯仿混合液，酚∶氯仿∶异戊醇体积比25∶24。

8.如权利要求4所述的用于食用菌菌丝体营养生长阶段RNA提取的方法，其特征在于，步骤5)中，取600μl上清液，加入500～800μl异丙醇，摇匀2～4min，放置～20℃冰箱中，静置20～40min。

9.如权利要求8所述的用于食用菌菌丝体营养生长阶段RNA提取的方法，其特征在于，步骤5)中，取600μl上清液，加入600μl异丙醇，摇匀3min，放置-20℃冰箱中，静置30min。

10.如权利要求4所述的用于食用菌菌丝体营养生长阶段RNA提取的方法，其特征在于，步骤7)中，舍去上清液，留沉淀，加入75％的乙醇冲洗。

11.如权利要求10所述的用于食用菌菌丝体营养生长阶段RNA提取的方法，其特征在于，步骤7)中，75％的乙醇加入量为0.1～2ml。

12.如权利要求4所述的用于食用菌菌丝体营养生长阶段RNA提取的方法，其特征在于，步骤9)中，弃上清液，将其放入超净工作台，风干10～20min。

13.如权利要求4所述的用于食用菌菌丝体营养生长阶段RNA提取的方法，其特征在于，步骤10)中，加入30～50μl贮存液I，35～40℃作用12～18min。

14.如权利要求13所述的用于食用菌菌丝体营养生长阶段RNA提取的方法，其特征在于，步骤10)中，加入40μl贮存液I，37℃作用15min。