CN102363749A - 一种桑黄菌丝体的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的在于提供一种桑黄菌丝体的制备方法。步骤包括桑黄菌种活化；马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板培养；刮取桑黄菌丝体接种于马铃薯葡萄糖液体培养基中进行振荡培养；收集桑黄菌丝体；提取桑黄菌丝体总RNA；琼脂糖凝胶电泳观察结果。本发明使用的菌种是保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)桑黄菌种(鲍姆层孔菌，保藏号为桑黄DL101 CCTCC M 2011137)。本发明操作简单，原理易懂，为今后获得大规模的、高纯度的桑黄菌丝体和高质量的桑黄总RNA提供了简便快捷的方法，也为桑黄的基础研究和应用开发奠定了基础。
Description
(一)技术领域
本发明涉及生物技术，具体说就是一种桑黄菌丝体的制备方法。
(二)背景技术
桑黄属担子菌亚门(Basidiomycotas)、层菌纲(Hymenomycetes)、非褶菌目(Aphyllophorales)、锈革孔菌科(Hymenochae taceae)、针层孔菌属(Phellinus Quel.)。学名Phellinus baummi，中文名鲍姆层孔菌，因其子实体颜色鲜黄而俗称为桑黄，又称桑耳，是多年生的珍稀药用真菌。桑黄是目前国际公认的抗肿瘤最好的大型真菌之一，无任何毒性作用，是一种极具开发价值的珍贵药用真菌，成为药用真菌的研究热点。
对于桑黄总RNA的高质量提取，是深入研究桑黄抗癌功效分子机制的基础，但目前国内外学者对此内容研究较少。在现有生产技术和文献报道中，常用提取某种丝状真菌总RNA的方法是将丝状真菌进行液体培养并收集菌丝体，然后液氮研磨，提取总RNA。所以要想获得高质量总RNA关键是如何获得高质量的菌丝体。关于丝状真菌菌丝体的液体培养，目前培养方法主要是从原种斜面上切取豆粒大小的一块菌饼接种入新配制并灭菌的液体培养基中，置于摇床中在合适的温度下振荡培养。通过此种方法培养后收集得到的菌丝体，由于附带固体培养基，所以导致提取的总RNA浓度不高，直接影响后续的深入研究。因此，需要寻求一种更合适的获得桑黄菌丝体的方法以获取高质量总RNA。
(三)发明内容
本发明的目的在于提供一种桑黄菌丝体的制备方法。
本发明的目的是这样实现的：步骤如下：
步骤一：桑黄菌种活化：
将保存在冰箱里的桑黄菌种用马铃薯葡萄糖琼脂培养基试管斜面活化，首先将从4℃冰箱里拿出来的桑黄菌种在室温下放置一段时间，达到与室温一致即可，然后在超净工作台内进行马铃薯葡萄糖琼脂培养基试管斜面接种，每个试管斜面只接一个点，盖上胶塞，放置在 25℃温箱里恒温避光培养5-7天；
步骤二：马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板培养：
将已活化的桑黄菌种转接到马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上，在超净工作台内，用接种钩挑取马铃薯葡萄糖琼脂培养基试管斜面上边缘生长旺盛的桑黄菌丝体，接于平板中间，每个平板只接一个点，用封口膜封上置于25℃温箱里恒温避光培养7-9天；
步骤三：刮取桑黄菌丝体接种于马铃薯葡萄糖液体培养基中进行振荡培养：
将要长满平板的年轻桑黄菌丝体进行刮取并接种于马铃薯葡萄糖液体培养基中，首先，要选择几乎长满平板但还没有老化变黄的桑黄菌丝体作为接种材料，因为这样的菌丝体更易于刮取；用灭过菌的小钥匙进行刮取，刮的时候不要太用力，只刮取桑黄菌丝体，不要连带培养基，刮取下来的桑黄菌丝体在马铃薯葡萄糖液体培养基里以涮的方式进行接种，接入250ml三角瓶中，每瓶接入1-2个平板的桑黄菌丝体；封瓶膜封口后，置于恒温振荡器120r/min，25℃恒温避光振荡培养5-7天；
步骤四：收集桑黄菌丝体：
在马铃薯葡萄糖液体培养基尚未变色之前进行桑黄菌丝体收集，将三角瓶里的桑黄菌丝体，进行10层纱布过滤，用无菌蒸馏水冲洗桑黄菌丝体2-3遍，冲掉残留的马铃薯葡萄糖液体培养基，带上一次性手套将纱布拧干，拧到桑黄菌丝体在纱布上略微粘起的程度即可，用灭过菌的镊子将桑黄菌丝体从纱布上小块地撕取下来，放入2mL的离心管中，不要放得太实，装入量为离心管的1/3即可，置于-70℃保存，备用；
步骤五：提取桑黄菌丝体总RNA
将步骤四中在-70℃里2mL离心管中保藏的桑黄菌丝体取出，置于用液氮冷却过的研钵里充分研磨至粉状，迅速分装到盛有1.0mLTrizol试剂的1.5mL无菌离心管中；用振荡器振荡3-5min，放回冰盒；加200μL氯仿，振荡5min再放回冰盒静置3-5min；离心，12000rpm，15min；取新的1.5mL无菌离心管加600μL氯仿，将离心后的上清液加进来，振荡3-5min，保证液体能悬浮起来，静置1min； 离心，12000rpm，10min；取新的1.5mL无菌离心管加500μL异丙醇，将离心后的上清液加进来，振荡1min，混匀；放冰上，静置10min，沉淀，离心12000rpm，10min；去除上清液，留沉淀，加200μL的DEPC水溶解沉淀，用等体积的氯仿抽提2次，离心，12000rpm，5min，每次离心后取上清液，第二次离心后得到的上清液即为我们所需的桑黄总RNA样品；电泳检测，用凝胶成像系统观察结果；剩下的桑黄总RNA样品加入4倍体积的无水乙醇，再滴加几滴3mol/L的乙酸钠溶液，混匀，冰上静置10min，12000rpm，离心10min，放于-70℃保存。
步骤六：琼脂糖凝胶电泳观察结果
称取1.6g琼脂糖于小三角瓶中，加入20mL的1×TAE，微波炉中加热煮沸3次至琼脂糖全部融化，摇匀；当温度降到50度左右时向小三角瓶中加入1μL的溴化乙锭，振荡混匀；趁热倒入洗净的制胶槽中，形成模子，将制胶槽置于水平位置并固定放好梳子，室温下静置直至凝胶完全凝固，即得到琼脂糖凝胶，垂直轻拔梳子，将琼脂糖凝胶及内槽放于电泳槽中，备用。
在点样板上，将3μL步骤五中的桑黄总RNA样品与2μL的上样缓冲液混合均匀，用10μL微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，每加完一个桑黄总RNA样品，应更换一个新枪头，以防污染，加样时，勿碰坏样品孔周围的凝胶面。加样后的凝胶板立即通电进行电泳，电压80-100V，样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动，当上样缓冲液中的溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm时，停止电泳。电泳完毕后，取出琼脂糖凝胶，放于凝胶成像系统中，紫外线下观察并拍照保存。
本发明使用的菌种是保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)桑黄菌种(鲍姆层孔菌，保藏号为桑黄DL101 CCTCC M 2011137)。
保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：中国武汉武汉大学邮编430072。保藏日期：2011.05.03，保藏编号：CCTCC NO：M2011137，分类命名：桑黄DL101 phellinus Baumii DL101。
本发明一种桑黄菌丝体的制备方法，操作简单，原理易懂，为今后获得大规模的、高纯度的桑黄菌丝体和高质量的桑黄总RNA提供了 简便快捷的方法，也为桑黄的基础研究和应用开发奠定了基础。
(四)附图说明
图1为本发明的桑黄总RNA琼脂糖凝胶电泳结果图。
(五)具体实施方式
下面举例对本发明作进一步说明。
实施例1：本发明一种桑黄菌丝体的制备方法，步骤如下：
步骤一：桑黄菌种活化：
将保存在冰箱里的桑黄菌种用马铃薯葡萄糖琼脂培养基试管斜面活化，首先将从4℃冰箱里拿出来的桑黄菌种在室温下放置一段时间，达到与室温一致即可，然后在超净工作台内进行马铃薯葡萄糖琼脂培养基试管斜面接种，每个试管斜面只接一个点，盖上胶塞，放置在25℃温箱里恒温避光培养5-7天；
步骤二：马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板培养：
将已活化的桑黄菌种转接到马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上，在超净工作台内，用接种钩挑取马铃薯葡萄糖琼脂培养基试管斜面上边缘生长旺盛的桑黄菌丝体，接于平板中间，每个平板只接一个点，用封口膜封上置于25℃温箱里恒温避光培养7-9天；
步骤三：刮取桑黄菌丝体接种于马铃薯葡萄糖液体培养基中进行振荡培养：
将要长满平板的年轻桑黄菌丝体进行刮取并接种于马铃薯葡萄糖液体培养基中，首先，要选择几乎长满平板但还没有老化变黄的桑黄菌丝体作为接种材料，因为这样的菌丝体更易于刮取；用灭过菌的小钥匙进行刮取，刮的时候不要太用力，只刮取桑黄菌丝体，不要连带培养基，刮取下来的桑黄菌丝体在马铃薯葡萄糖液体培养基里以涮的方式进行接种，接入250ml三角瓶中，每瓶接入1-2个平板的桑黄菌丝体；封瓶膜封口后，置于恒温振荡器120r/min，25℃恒温避光振荡培养5-7天；
步骤四：收集桑黄菌丝体：
在马铃薯葡萄糖液体培养基尚未变色之前进行桑黄菌丝体收集，将三角瓶里的桑黄菌丝体，进行10层纱布过滤，用无菌蒸馏水冲洗桑黄菌丝体2-3遍，冲掉残留的马铃薯葡萄糖液体培养基，带上一次性手套将纱布拧干，拧到桑黄菌丝体在纱布上略微粘起的程度即可，用灭过菌的镊子将桑黄菌丝体从纱布上小块地撕取下来，放入2mL的离心管中，不要放得太实，装入量为离心管的1/3即可，置于-70℃ 保存，备用；
步骤五：提取桑黄菌丝体总RNA
将步骤四中在-70℃里2mL离心管中保藏的桑黄菌丝体取出，置于用液氮冷却过的研钵里充分研磨至粉状，迅速分装到盛有1.0mLTrizol试剂的1.5mL无菌离心管中；用振荡器振荡3-5min，放回冰盒；加200μL氯仿，振荡5min再放回冰盒静置3-5min；离心，12000rpm，15min；取新的1.5mL无菌离心管加600μL氯仿，将离心后的上清液加进来，振荡3-5min，保证液体能悬浮起来，静置1min；离心，12000rpm，10min；取新的1.5mL无菌离心管加500μL异丙醇，将离心后的上清液加进来，振荡1min，混匀；放冰上，静置10min，沉淀，离心12000rpm，10min；去除上清液，留沉淀，加200μL的DEPC水溶解沉淀，用等体积的氯仿抽提2次，离心，12000rpm，5min，每次离心后取上清液，第二次离心后得到的上清液即为我们所需的桑黄总RNA样品；电泳检测，用凝胶成像系统观察结果；剩下的桑黄总RNA样品加入4倍体积的无水乙醇，再滴加几滴3mol/L的乙酸钠溶液，混匀，冰上静置10min，12000rpm，离心10min，放于-70℃保存。
步骤六：琼脂糖凝胶电泳观察结果
称取1.6g琼脂糖于小三角瓶中，加入20mL的1×TAE，微波炉中加热煮沸3次至琼脂糖全部融化，摇匀；当温度降到50度左右时向小三角瓶中加入1μL的溴化乙锭，振荡混匀；趁热倒入洗净的制胶槽中，形成模子，将制胶槽置于水平位置并固定放好梳子，室温下静置直至凝胶完全凝固，即得到琼脂糖凝胶，垂直轻拔梳子，将琼脂糖凝胶及内槽放于电泳槽中，备用。
在点样板上，将3μL步骤五中的桑黄总RNA样品与2μL的上样缓冲液混合均匀，用10μL微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，每加完一个桑黄总RNA样品，应更换一个新枪头，以防污染，加样时，勿碰坏样品孔周围的凝胶面。加样后的凝胶板立即通电进行电泳，电压80-100V，样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动，当上样缓冲液中的溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm时，停止电泳。电泳完毕后，取出琼脂糖凝胶，放于凝胶成像系统中，紫外线下观察 并拍照保存。
实施例2：本发明一种桑黄菌丝体的制备方法，步骤如下：
步骤一：制备桑黄菌丝体斜面培养基：
配置本发明中所述的桑黄菌丝体培养基PDA培养基IL，每升中各组份重量为：马铃薯200g(去皮)，葡萄糖20g，琼脂15g。将培养基趁热分装到试管中，每管大约5ml，盖上胶塞，高压蒸汽灭菌，121℃，15min，取出后趁热摆斜面，冷却，备用。
步骤二：菌种活化：
将保存在冰箱里的桑黄菌种用已制备的PDA培养基斜面活化，首先将从4℃冰箱里拿出来的桑黄菌种在室温下放置一段时间，达到与室温一致即可，然后在超净工作台内进行PDA斜面接种，每个斜面只接一个点，放置在25℃温箱里避光培养5-7d；
步骤三：制备PDA平板培养基：
配置本发明中所述的用于刮取桑黄菌丝体的PDA培养基IL，每升中各组份重量为：马铃薯200g(去皮)，葡萄糖20g，琼脂20g(琼脂加的比正常的15g多，易于下面的刮取菌丝体实验)。将培养基分装到500ml三角瓶中，每瓶装250ml左右，用封瓶膜封口，高压蒸汽灭菌，121℃，15min，取出后趁热倒平板，在超净工作台中，向灭过菌的平板里每个倒入10-12ml，静置冷却，备用。
步骤四：PDA平板培养：
将已活化的桑黄PDA斜面转接到PDA培养基平板上，在超净工作台内，用接种钩挑取PDA斜面边缘生长旺盛的菌丝，接于平板中间，每个平板只接一个点，用封口膜封上置于25℃温箱里避光培养7-9d；
步骤五：制备液体培养基(PA培养基)：
配置本发明中所述的用于培养桑黄菌丝体的液体培养基IL，每升中各组份重量为：马铃薯200g(去皮)，葡萄糖20g，将培养基分装到250ml三角瓶中，每瓶装100ml左右，用封瓶膜封口，高压蒸汽灭菌，121℃，15min，取出，冷却备用。
步骤六：刮取菌丝体接种于液体培养基中进行振荡培养：
将要长满平板的年轻菌丝进行刮取并接种于PA培养基中，首先，要选择几乎长满平板但还没有老化变黄的菌丝作为接种材料，因为这 样的菌丝更易于刮取；用灭过菌的小钥匙进行刮取，刮的时候不要太用力，只刮取菌丝，不要连带培养基，刮取下来的菌丝体在PA培养基里以涮的方式进行接种，接入250ml三角瓶中，每瓶接入1-2个平板的菌丝体；封瓶膜封口后，置于恒温振荡器120r/min，25℃避光振荡培养5-7d；
步骤七：收集菌丝体：
在培养液尚未变色之前进行菌丝体收集，将三角瓶里的菌丝体，进行10层纱布过滤，用无菌蒸馏水冲洗菌丝体2-3遍，冲掉残留的培养液，带上一次性手套将纱布拧干，拧到菌丝体在纱布上略微粘起的程度即可，用灭过菌的镊子将菌丝体从纱布上小块地撕取下来，放入2mL的离心管中，不要放得太实，装入量为管的1/3即可，置于-70℃保存，备用；
步骤八：提取桑黄菌丝体总RNA
将-70℃冷冻保藏的桑黄菌丝体取出，置于用液氮冷却过的研钵里研磨，迅速分装到盛有1.0mLTrizol的1.5mL无菌离心管中；用振荡器振荡3-5min，放回冰盒；加200μL氯仿，振5min放冰盒静置3-5min；离心，12000rpm，15min；取新灭菌过的离心管加600μL氯仿，将离心后的上清液加进来，振荡3-5min，保证液体能悬浮起来，静置1min；离心，12000rpm，10min；取新的离心管加500μL异丙醇，将离心后的上清液加进来，振荡1min，混匀；放冰上，静置10min，沉淀，离心12000rpm，10min；加200μL的DEPC水溶解，用等体积的氯仿抽提2次，12000rpm，离心5min；电泳检测，用凝胶成像系统观察结果；剩下的样品加入4倍体积无水乙醇，再滴加几滴乙酸钠，混匀，冰上静置10min，12000rpm，离心10min，放于-70℃保存。
步骤九：琼脂糖凝胶电泳观察结果
制备0.8％琼脂糖凝胶。称取1.6g琼脂糖于小三角瓶中，加入20mL的1×TAE，微波炉中加热煮沸3次至琼脂糖全部融化，摇匀；当温度降到50度左右时向其加入1μL的EB(溴化乙锭)，振荡混匀；趁热倒入洗净的制胶槽中，形成模子，将槽置于水平位置，并在固定位置放好梳子，室温下静置直至凝胶完全凝固，垂直轻拔梳子，将凝胶及内槽放于电泳槽中，备用。
在点样板上，将3μL样品与2μL的上样缓冲液混合均匀，用10μL微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，每加完一个样品，应更换一个新枪头，以防污染，加样时，勿碰坏样品孔周围的凝胶面。
加样后的凝胶板立即通电进行电泳，电压80-100V，样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动，当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm时，停止电泳。
电泳完毕后，取出凝胶，放于凝胶成像系统中，紫外线下观察并拍照保存。
Claims (1)
1.一种桑黄菌丝体的制备方法，其特征在于：步骤如下：
步骤一：桑黄菌种活化：
将保存在冰箱里的桑黄菌种用马铃薯葡萄糖琼脂培养基试管斜面活化，首先将从4℃冰箱里拿出来的桑黄菌种在室温下放置一段时间，达到与室温一致即可，然后在超净工作台内进行马铃薯葡萄糖琼脂培养基试管斜面接种，每个试管斜面只接一个点，盖上胶塞，放置在25℃温箱里恒温避光培养5-7天；
步骤二：马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板培养：
将已活化的桑黄菌种转接到马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上，在超净工作台内，用接种钩挑取马铃薯葡萄糖琼脂培养基试管斜面上边缘生长旺盛的桑黄菌丝体，接于平板中间，每个平板只接一个点，用封口膜封上置于25℃温箱里恒温避光培养7-9天；
步骤三：刮取桑黄菌丝体接种于马铃薯葡萄糖液体培养基中进行振荡培养：
将要长满平板的年轻桑黄菌丝体进行刮取并接种于马铃薯葡萄糖液体培养基中，首先，要选择几乎长满平板但还没有老化变黄的桑黄菌丝体作为接种材料，因为这样的菌丝体更易于刮取；用灭过菌的小钥匙进行刮取，刮的时候不要太用力，只刮取桑黄菌丝体，不要连带培养基，刮取下来的桑黄菌丝体在马铃薯葡萄糖液体培养基里以涮的方式进行接种，接入250ml三角瓶中，每瓶接入1-2个平板的桑黄菌丝体；封瓶膜封口后，置于恒温振荡器120r/min，25℃恒温避光振荡培养5-7天；
步骤四：收集桑黄菌丝体：
在马铃薯葡萄糖液体培养基尚未变色之前进行桑黄菌丝体收集，将三角瓶里的桑黄菌丝体，进行10层纱布过滤，用无菌蒸馏水冲洗桑黄菌丝体2-3遍，冲掉残留的马铃薯葡萄糖液体培养基，带上一次性手套将纱布拧干，拧到桑黄菌丝体在纱布上略微粘起的程度即可，用灭过菌的镊子将桑黄菌丝体从纱布上小块地撕取下来，放入2mL的离心管中，不要放得太实，装入量为离心管的1/3即可，置于-70℃保存，备用；
步骤五：提取桑黄菌丝体总RNA
将步骤四中在-70℃里2mL离心管中保藏的桑黄菌丝体取出，置于用液氮冷却过的研钵里充分研磨至粉状，迅速分装到盛有1.0mLTrizol试剂的1.5mL无菌离心管中；用振荡器振荡3-5min，放回冰盒；加200μL氯仿，振荡5min再放回冰盒静置3-5min；离心，12000rpm，15min；取新的1.5mL无菌离心管加600μL氯仿，将离心后的上清液加进来，振荡3-5min，保证液体能悬浮起来，静置1min；离心，12000rpm，10min；取新的1.5mL无菌离心管加500μL异丙醇，将离心后的上清液加进来，振荡1min，混匀；放冰上，静置10min，沉淀，离心12000rpm，10min；去除上清液，留沉淀，加200μL的DEPC水溶解沉淀，用等体积的氯仿抽提2次，离心，12000rpm，5min，每次离心后取上清液，第二次离心后得到的上清液即为我们所需的桑黄总RNA样品；电泳检测，用凝胶成像系统观察结果；剩下的桑黄总RNA样品加入4倍体积的无水乙醇，再滴加几滴3mol/L的乙酸钠溶液，混匀，冰上静置10min，12000rpm，离心10min，放于-70℃保存；
步骤六：琼脂糖凝胶电泳观察结果
称取1.6g琼脂糖于小三角瓶中，加入20mL的1×TAE，微波炉中加热煮沸3次至琼脂糖全部融化，摇匀；当温度降到50度左右时向小三角瓶中加入1μL的溴化乙锭，振荡混匀；趁热倒入洗净的制胶槽中，形成模子，将制胶槽置于水平位置并固定放好梳子，室温下静置直至凝胶完全凝固，即得到琼脂糖凝胶，垂直轻拔梳子，将琼脂糖凝胶及内槽放于电泳槽中，备用；
在点样板上，将3μL步骤五中的桑黄总RNA样品与2μL的上样缓冲液混合均匀，用10μL微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，每加完一个桑黄总RNA样品，应更换一个新枪头，以防污染，加样时，勿碰坏样品孔周围的凝胶面，加样后的凝胶板立即通电进行电泳，电压80-100V，样品由负极向正极方向移动，当上样缓冲液中的溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm时，停止电泳，电泳完毕后，取出琼脂糖凝胶，放于凝胶成像系统中，紫外线下观察并拍照保存。
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