CN105154491B

CN105154491B - 一种用于冬虫夏草液态发酵生产胞外多糖的培养基

Info

Publication number: CN105154491B
Application number: CN201510556998.8A
Authority: CN
Inventors: 殷海松; 汤卫华; 陈珊; 张乐; 牛红军; 王立晖; 刘鑫龙; 张轶斌; 龙尾; 苑鹏; 刘鹏; 潘志恒; 黄艳玲
Original assignee: Tianjin Modern Vocational Technology College
Current assignee: Tianjin Modern Vocational Technology College
Priority date: 2015-09-02
Filing date: 2015-09-02
Publication date: 2018-08-24
Anticipated expiration: 2035-09-02
Also published as: CN105154491A

Abstract

本发明提供一种用于冬虫夏草液态发酵生产胞外多糖培养基，本发明涉及的培养基由质量百分比：葡萄糖1～5％、蛋白胨1～4％、酵母粉0.5～3％、KH₂PO₄ 0.1～0.5％、MgSO₄·7H₂O 0.1～0.5％、土豆块5～40％和混合营养包，溶剂为水，液态培养基PH值为6.0。本发明的冬虫夏草液态发酵培养基能够促进冬虫夏草细胞生长和胞外多糖的分泌，通过1‑L四联发酵罐培养72h获得的胞外多糖产量高达8.18g/L，较现有技术培养冬虫夏草得胞外多糖的含量提高76％。

Description

一种用于冬虫夏草液态发酵生产胞外多糖的培养基

技术领域

本发明设计生物工程领域，尤其涉及一种用于冬虫夏草液态发酵生产胞外多糖的培养基。

背景技术

冬虫夏草是麦角菌科真菌冬虫夏草寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座及幼虫尸体的复合体，具有补虚损、益精气、保肺、益肾、止血化痰、滋补强壮等功效。但由于过度采集，自然界中野生虫草资源匮乏，而虫草多糖、虫草酸和虫草素是冬虫夏草的主要活性物质，据药理学及临床研究表明，虫草多糖可以增强免疫力，抗肿瘤及降血糖等功能，对于虫草多糖的研究和生产，大多集中在子实体和菌丝体的提取、分离和纯化，液态培养冬虫夏草产生胞外虫草多糖的研究较少，现有技术中获得冬虫夏草胞外多糖的方法有两种：(1)采用常用的液态培养基培养冬虫夏草而获得胞外多糖，但是胞外多糖产量较低。(2)通过改变冬虫夏草液态发酵的工艺提高胞外多糖的产量，但是效果并不明显。

发明内容：

本发明的目的在于提出一种用于冬虫夏草液态发酵生产胞外多糖的培养基，具体包括葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、KH₂PO₄、MgSO₄·7H₂O、土豆和由组氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、维生素B2和硒组成的混合营养包，由组氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、维生素B2和硒组成的混合营养包的配比科学全面，有效的促进冬虫夏草细胞的生长，尤其是能够大幅提高胞外多糖的产量，为冬虫夏草菌丝体和胞外多糖的大规模开发与应用提供了原料保证。

为达到上述目的，本发明可通过如下技术方案来实现：

一种用于冬虫夏草液态发酵生产胞外多糖的培养基，包括：葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、KH₂PO₄、MgSO₄·7H₂O、土豆和混合营养包。

优选，一种用于冬虫夏草液态发酵生产胞外多糖的培养基，包括：混合营养包0.02％～0.15％，葡萄糖1～5％、蛋白胨1～4％、酵母粉0.5～3％、KH₂PO₄ 0.1～0.5％、MgSO₄·7H₂O 0.1～0.5％和土豆5～40％，溶剂为水，以上组分均为质量百分含量。

优选，一种用于冬虫夏草液态发酵生产胞外多糖的培养基，包括：混合营养包0.04～0.15％，葡萄糖3％、蛋白胨1.5％、酵母粉0.5％、KH₂PO₄ 0.3％、MgSO₄·7H₂O 0.15％和土豆20％，溶剂为水，以上组分均为质量百分含量。

优选，一种用于冬虫夏草液态发酵生产胞外多糖的培养基，包括：混合营养包0.08～0.15％，葡萄糖3％、蛋白胨1.5％、酵母粉0.5％、KH₂PO₄ 0.3％、MgSO₄·7H₂O 0.15％和土豆20％，溶剂为水，以上组分均为质量百分含量。

优选，一种用于冬虫夏草液态发酵生产胞外多糖的培养基，包括：混合营养包0.04～0.08％，葡萄糖3％、蛋白胨1.5％、酵母粉0.5％、KH₂PO₄ 0.3％、MgSO₄·7H₂O 0.15％和土豆20％，溶剂为水，以上组分均为质量百分含量。

优选，一种用于冬虫夏草液态发酵生产胞外多糖的培养基，包括：混合营养包0.08％，葡萄糖3％、蛋白胨1.5％、酵母粉0.5％、KH₂PO₄ 0.3％、MgSO₄·7H₂O 0.15％和土豆20％，溶剂为水，以上组分均为质量百分含量。

进一步地，混合营养包包括：组氨酸25-38％、赖氨酸25-38％、谷氨酰胺15-20％、维生素B215-20％和硒1-2％，以上组分均为质量百分含量。

优选，混合营养包包括：组氨酸31.1％、赖氨酸31.1％、谷氨酰胺18.3％、维生素B218.3％和硒1.2％，以上组分均为质量百分含量。

一种用于冬虫夏草液态发酵生产胞外多糖的培养基培养冬虫夏草获得胞外多糖的方法依次包括以下步骤：

(1)配制营养包；

(2)配制液态培养基；

(3)发酵培养：配制的发酵培养基装入容量为1L的发酵罐，灭菌，在无菌条件下将菌种接种到液体培养基，于24℃及150r/min条件下恒温培养；

(4)发酵结束后用显微镜观察发酵液中菌丝体生长情况，并将发酵液接种到营养琼脂平板上来检查其是否染菌；

(5)将在步骤(3)中检测到的未被染菌的发酵液在4000r/min条件下离心20min得到小球形式的发酵菌丝体，然后将菌丝体和上清液进行冷冻干燥并储存在-18℃的冰箱里备用；

(6)将步骤(4)中离心得到的上清液减压浓缩或常压蒸发浓缩，浓缩温度不超过100℃，得到粘稠状液体；

(7)将步骤(5)经浓缩得到的粘稠状液体加入两倍体积的95％的乙醇进行醇析，其醇析时间不低于24小时，得到白色纤维状沉淀；

(8)将经醇析得到的白色纤维状沉淀物用75％的乙醇洗涤并离心，重复数次，最后将经过数次洗涤、离心而得到的沉淀物在60℃烘干，得灰白色粗多糖，并测定胞外多糖的含量。

本发明的有益效果：

(1)本发明特制的液态培养基是专门用于生产冬虫夏草胞外多糖的培养基，其中包含一个混合营养包，可促进冬虫夏草细胞的生长，尤其是大幅提高胞外多糖的产量，冬虫夏草胞外多糖含量达8.08g/l，比不含混合营养包的培养基发酵冬虫夏草得到的胞外多糖的含量提高了76％。

(2)本发明特制的液态培养基成本低，并且大幅提高胞外多糖的产量，具有良好的工业应用化前景。

附图说明：

图1为培养基中混合营养包的质量百分比为0、0.02％、0.04％、0.08％、0.15％时得到的胞外多糖的含量。

具体实施方式：

下面结合具体实施例对本发明的内容进一步说明。

实施例1

(1)液态培养基的配制：按质量百分比计包括葡萄糖3％、蛋白胨1.5％、酵母粉0.5％、KH₂PO₄ 0.3％、MgSO₄·7H₂O 0.15％和土豆20％，溶剂为水，液态培养基PH值为6.0；

(2)发酵培养：配制的发酵培养基装入容量为1L的发酵罐，灭菌，在无菌条件下将菌种接种到液体培养基，于24℃及150r/min条件下恒温培养；

(3)发酵结束后用显微镜观察发酵液中菌丝体生长情况，并将发酵液接种到营养琼脂平板上来检查其是否染菌；

(4)将在步骤(3)中检测到的未被染菌的发酵液在4000r/min条件下离心20min得到小球形式的发酵菌丝体，然后将菌丝体和上清液进行冷冻干燥并储存在-18℃的冰箱里备用；

(5)将步骤(4)中离心得到的上清液减压浓缩或常压蒸发浓缩，浓缩温度不超过100℃，得到粘稠状液体；

(6)将经浓缩得到的粘稠状液体加入两倍体积的95％的乙醇进行醇析，其醇析时间不低于24小时，得到白色纤维状沉淀；

(7)将经醇析得到的白色纤维状沉淀物用75％的乙醇洗涤并离心，重复数次，最后将经过数次洗涤、离心而得到的沉淀物在60℃烘干，得灰白色粗多糖，并测定胞外多糖的含量。

实施例2

(1)配制营养包，混合营养包按质量百分比计包括：组氨酸31.1％、赖氨酸31.1％、谷氨酰胺18.3％、维生素B218.3％和硒1.2％；

(2)配制液态培养基：一种用于冬虫夏草液态发酵生产胞外多糖的培养基按质量百分比计包括：混合营养包0.02％、葡萄糖3％、蛋白胨1.5％、酵母粉0.5％、KH₂PO₄ 0.3％、MgSO₄·7H₂O 0.15％和土豆20％，溶剂为水，液态培养基PH值为6.0；

(7)将经浓缩得到的粘稠状液体加入两倍体积的95％的乙醇进行醇析，其醇析时间不低于24小时，得到白色纤维状沉淀；

(8)将经醇析得到的白色纤维状沉淀物用75％的乙醇洗涤并离心，重复数次，最后将经过数次洗涤、离心而得到的沉淀物在60℃烘干，得灰白色粗多糖，并测定胞外多糖的含量，得到的胞外多糖含量较实施例1提高11％。

实施例3

(2)配制液态培养基：一种用于冬虫夏草液态发酵生产胞外多糖的培养基按质量百分比计包括：混合营养包0.04％、葡萄糖3％、蛋白胨1.5％、酵母粉0.5％、KH₂PO₄ 0.3％、MgSO₄·7H₂O 0.15％和土豆20％，溶剂为水，液态培养基PH值为6.0；

(8)将经醇析得到的白色纤维状沉淀物用75％的乙醇洗涤并离心，重复数次，最后将经过数次洗涤、离心而得到的沉淀物在60℃烘干，得灰白色粗多糖，并测定胞外多糖的含量，所得胞外多糖含量较实施例1提高38％。

实施例4

(2)配制液态培养基：一种用于冬虫夏草液态发酵生产胞外多糖的培养基按质量百分比计包括：混合营养包0.08％、葡萄糖3％、蛋白胨1.5％、酵母粉0.5％、KH₂PO₄ 0.3％、MgSO₄·7H₂O 0.15％和土豆20％，溶剂为水，液态培养基PH值为6.0；

(8)将经醇析得到的白色纤维状沉淀物用75％的乙醇洗涤并离心，重复数次，最后将经过数次洗涤、离心而得到的沉淀物在60℃烘干，得灰白色粗多糖，并测定胞外多糖的含量，所得胞外多糖含量较实施例1提高76％。

实施例5

(2)配制液态培养基：一种用于冬虫夏草液态发酵生产胞外多糖的培养基按质量百分比计包括：混合营养包0.15％、葡萄糖3％、蛋白胨1.5％、酵母粉0.5％、KH₂PO₄ 0.3％、MgSO₄·7H₂O 0.15％和土豆20％，溶剂为水，液态培养基PH值为6.0；

(8)将经醇析得到的白色纤维状沉淀物用75％的乙醇洗涤并离心，重复数次，最后将经过数次洗涤、离心而得到的沉淀物在60℃烘干，得灰白色粗多糖，并测定胞外多糖的含量，所得胞外多糖含量较实施例1提高20％。

此外，将实施例1、2、3、4、5中得到的胞外多糖的含量进行了对比，结果如图1所示，实施例1为常规培养基，实施例2、3、4、5在实施例1中培养基的基础上分别加入了质量比为0.02％、0.04％、0.08％、0.15％的混合营养包，经过无菌恒温发酵培养后得到的胞外多糖含量较实施例1分别提高了11％、38％、76％、20％。

以上所述仅为本发明创造的较佳实施例而已，并不用以限制本发明创造，凡在本发明创造的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。

Claims

1.一种用于冬虫夏草液态发酵生产胞外多糖的培养基，包括葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、KH₂PO₄、MgSO₄·7H₂O、土豆，其特征在于：混合营养包0.02％～0.15％，葡萄糖1～5％、蛋白胨1～4％、酵母粉0.5～3％、KH₂PO₄ 0.1～0.5％、MgSO₄·7H₂O 0.1～0.5％和土豆5～40％，溶剂为水，以上组分均为质量百分含量；

混合营养包包括：组氨酸25-38％、赖氨酸25-38％、谷氨酰胺15-20％、维生素B215-20％和硒1-2％，以上组分均为质量百分含量。

2.根据权利要求1所述的一种用于冬虫夏草液态发酵生产胞外多糖的培养基，其特征在于包括混合营养包0.04～0.15％，葡萄糖3％、蛋白胨1.5％、酵母粉0.5％、KH₂PO₄ 0.3％、MgSO₄·7H₂O 0.15％和土豆20％，溶剂为水，以上组分均为质量百分含量。

3.根据权利要求1所述的一种用于冬虫夏草液态发酵生产胞外多糖的培养基，其特征在于包括混合营养包0.08～0.15％，葡萄糖3％、蛋白胨1.5％、酵母粉0.5％、KH₂PO₄ 0.3％、MgSO₄·7H₂O 0.15％和土豆20％，溶剂为水，以上组分均为质量百分含量。

4.根据权利要求1所述的一种用于冬虫夏草液态发酵生产胞外多糖的培养基，其特征在于包括混合营养包0.04～0.08％，葡萄糖3％、蛋白胨1.5％、酵母粉0.5％、KH₂PO₄ 0.3％、MgSO₄·7H₂O 0.15％和土豆20％，溶剂为水，以上组分均为质量百分含量。

5.根据权利要求1所述的一种用于冬虫夏草液态发酵生产胞外多糖的培养基，其特征在于包括混合营养包0.08％，葡萄糖3％、蛋白胨1.5％、酵母粉0.5％、KH₂PO₄ 0.3％、MgSO₄·7H₂O 0.15％和土豆20％，溶剂为水，以上组分均为质量百分含量。

6.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于混合营养包包括组氨酸31.1％、赖氨酸31.1％、谷氨酰胺18.3％、维生素B2 18.3％和硒1.2％，以上组分均为质量百分含量。

7.根据权利要求1至6任一项权利要求所述的一种用于冬虫夏草液态发酵生产胞外多糖的培养基，其特征在于所述培养基的pH值为6.0。

8.一种培养冬虫夏草获得胞外多糖的方法依次包括以下步骤：

(1)配制营养包和液态培养基；

(2)发酵培养：将步骤(1)配制的发酵培养基装入容量为1L的发酵罐，灭菌，在无菌条件下将菌种接种到液体培养基，于24℃及150r/min条件下恒温培养；

(6)将步骤(5)经浓缩得到的粘稠状液体加入两倍体积的95％的乙醇进行醇析，其醇析时间不低于24小时，得到白色纤维状沉淀；

(7)将经醇析得到的白色纤维状沉淀物用75％的乙醇洗涤并离心，重复数次，最后将经过数次洗涤、离心而得到的沉淀物在60℃烘干，得灰白色粗多糖。