CN103432174A

CN103432174A - 一种混合菌株的液体发酵生产冬虫夏草菌粉的方法

Info

Publication number: CN103432174A
Application number: CN2013103961769A
Authority: CN
Inventors: 王玉花; 王辉; 杨成香; 李福奎; 费文全
Original assignee: 王辉
Current assignee: Qinghai Mount Everest caterpillar fungus raw material Co., Ltd.
Priority date: 2013-08-27
Filing date: 2013-08-27
Publication date: 2013-12-11
Anticipated expiration: 2033-08-27
Also published as: CN103432174B

Abstract

本发明涉及一种混合菌株的液体发酵生产冬虫夏草菌粉的方法，依次包括菌株培养、发酵、固液分离和干燥粉碎，其特征在于，所述发酵的菌株为中国被毛孢、蝙蝠蛾拟青霉和中华头孢菌。本发明利用中国被毛孢、蝙蝠蛾拟青霉和中华头孢菌三种不同的菌株，并结合各自的发酵、生长特点，共同通过液体发酵制得了组成更接近于天然冬虫夏草、功效更加齐全的冬虫夏草菌粉，给冬虫夏草的人工产业化带来了良好的经济效益。

Description

一种混合菌株的液体发酵生产冬虫夏草菌粉的方法

技术领域

本发明涉及一种液体发酵生产冬虫夏草菌粉的方法，具体涉及一种混合菌株的液体发酵生产冬虫夏草菌粉的方法。

背景技术

冬虫夏草又称虫草，是我国传统名贵中药，具有止咳、化痰、降低血清胆固醇、调节和增强免疫力、抗肿瘤等多种药理作用。近年来，国内外对冬虫夏草需求剧增。但由于冬虫夏草有其严格的寄生性和特殊的生长地理环境，产量相当有限，药源比较紧缺。为缓解市场的供需矛盾，冬虫夏草的人工发酵产品越来越重要。

目前国内外冬虫夏草的液体深层发酵研究及生产，大部分采用的菌株是蝙蝠蛾拟青霉、中华头孢菌、蝙蝠蛾被孢霉、中华束丝孢菌或中国被毛孢等。这些菌株中蝙蝠蛾拟青霉和中华头孢菌(即虫草头孢菌)属于常温菌，对生长环境和培养基的要求不高；而中国被毛孢则属于低温菌，生长缓慢，对人工发酵的技术条件要求较高。多篇现有技术公开了利用上述菌株进行的发酵工艺。

专利申请CN93104709公开了一种虫草菌丝发酵生产工艺，其生产工艺为深层三级发酵，使用的菌种为蝙蝠蛾拟青霉菌。

专利申请CN03102576公开了一种营养保健口服液，其中包含蝙蝠蛾拟青霉菌的液体发酵过程，制得了富铬冬虫夏草深层发酵提取液。

沈南英等在2005年申请了一系列含有发酵冬虫夏草菌的制剂专利，包括片剂、粉剂、胶囊等，其利用中华束丝孢菌株，经液体发酵培养得到菌丝体，经离心过滤、远红外干燥等步骤制得一系列制剂。

专利申请CN03131904公开了一种中国被毛孢液体菌种发酵工艺方法，其包括菌种的取得、一级固体三角瓶菌种培养、液体种子培养、液体发酵罐生产工序。

专利申请CN201210556728公开了一种虫生真菌的液体发酵菌丝体，其中包含中华被毛孢的液体发酵过程。

专利申请CN201310045628公开了一种冬虫夏草发酵菌丝体活性组分的发酵及提取方法，其中涉及中国被毛孢的液体培养过程。

由此可见，现有技术都是利用单一菌株发酵制备天然冬虫夏草的人工替代品的。但由于天然冬虫夏草含有多种无性系菌株，所以采用单一菌株发酵制备的人工替代品的组成难以接近天然冬虫夏草，并且由单一菌株发酵生产的冬虫夏草菌粉产品的功能单一，效果不够全面，例如百令片／胶囊、金水宝片／胶囊、至灵胶囊、宁心宝胶囊和心肝宝胶囊等。

目前，为解决上述问题，已有现有技术将两种或三种菌株发酵的冬虫夏草菌粉通过简单的物理混合，来制备多功能的产品，包括CN200710301690、CN200710308028和200710307526等。但这种通过简单物理混合制得的产品在组成上仍然难以接近天然冬虫夏草，其功效仍然是有限的。

发明内容

为克服现有技术的不足，本发明的发明人根据多年来在冬虫夏草菌发酵工艺的研究，利用中国被毛孢、蝙蝠蛾拟青霉和中华头孢菌三种不同的菌株，并结合各自的发酵、生长特点，共同通过液体发酵制得了组成更接近于天然冬虫夏草、功效更加齐全的冬虫夏草菌粉。

本发明提供了一种混合菌株的液体发酵生产冬虫夏草菌粉的方法，还提供了通过该方法制得的冬虫夏草菌粉。具体是按以下技术方案来实现的：

一种混合菌株的液体发酵生产冬虫夏草菌粉的方法，依次包括菌株培养、发酵、固液分离和干燥粉碎，其特征在于，所述发酵的菌株为中国被毛孢、蝙蝠蛾拟青霉和中华头孢菌。

优选地，上述方法中，所述发酵过程包括中国被毛孢菌株的3～4次发酵，以及蝙蝠蛾拟青霉和中华头孢菌的2～3次发酵。

优选地，上述方法中，所述发酵过程包括中国被毛孢单独发酵后，再与蝙蝠蛾拟青霉和中华头孢菌混合继续发酵。

优选地，上述方法中，所述发酵过程中国被毛孢单独发酵7～9天。

优选地，上述方法中，所述发酵过程中国被毛孢、蝙蝠蛾拟青霉和中华头孢菌混合后共进行三级发酵，每级的发酵时间为2～3天。

优选地，上述方法中，所述发酵的温度为15～18℃。

优选地，上述方法中，所述发酵的培养基含有碳源、氮源和无机盐。

优选地，上述方法中，所述发酵的培养基按重量体积比计，含有碳源2.0～15.0％，氮源1.0～15.0％，无机盐0.1～5.0％。

优选地，上述方法中，所述碳源选自葡萄糖、玉米粉、土豆汁和糊精中的一种或几种；所述氮源选自蛋白胨、酵母膏、麸皮和蚕蛹粉中的一种或几种；所述无机盐选自氯化钠、氯化镁、硫酸镁、氯化锰、氯化钾、氯化钙、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸亚铁、硫酸锰中的一种或几种。

优选地，上述方法中，所述发酵的培养基含有葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、硫酸镁、磷酸氢二钾和水。

优选地，上述方法中，所述发酵的培养基为葡萄糖5％、蛋白胨2％、酵母膏0.1％、硫酸镁0.8％、磷酸氢二钾0.05％、水92.05％。

本发明的优点在于：利用中国被毛孢、蝙蝠蛾拟青霉和中华头孢菌三种不同的菌株，并结合各自的发酵、生长特点，共同通过液体发酵制得了组成更接近于天然冬虫夏草、功效更加齐全的冬虫夏草菌粉，给冬虫夏草的人工产业化带来了良好的经济效益。

具体实施方式

实施例1

取购买或分离的中国被毛孢、蝙蝠蛾拟青霉和中华头孢菌三种菌株，分别进行斜面培养，其中中国被毛孢接种后于12℃培养30天，蝙蝠蛾拟青霉和中华头孢菌常温培养8天，斜面培养基的组成按重量体积比计为：蚕豆粉5％、葡萄糖2％、玉米粉3％、蛋白胨0.75％、琼脂2％、麸皮1.5％、硫酸镁1％、磷酸氢二钾0.2％和水84.55％。

将完成培养的中国被毛孢接种于发酵培养基上，接种量5-10％，15℃下进行第一次发酵，时间为7天；发酵培养基的组成按重量体积比计为：葡萄糖2％、酵母膏0.5％、蛋白胨1％、硫酸镁0.1％、磷酸氢二钾0.8％、水95.6％。

将第一次发酵后的中国被毛孢与完成培养的蝙蝠蛾拟青霉和中华头孢菌混合，共同接种于发酵培养基上，接种量5-10％，15℃下再进行2次发酵，时间为3天，发酵培养基的组成按重量体积比计为：蚕豆粉2％、葡萄糖2.5％、玉米粉1％、蛋白胨2％、酵母膏5％、硫酸镁0.05％、磷酸氢二钾1％、水86.95％。

待发酵液中总菌丝体浓度达到35％时停止发酵，进行固液分离，将固体烘干粉碎得冬虫夏草菌粉。

实施例2

取购买或分离的中国被毛孢、蝙蝠蛾拟青霉和中华头孢菌三种菌株，分别进行斜面培养，其中中国被毛孢接种后于14℃培养28天，蝙蝠蛾拟青霉和中华头孢菌常温培养10天，斜面培养基的组成按重量体积比计为：蚕豆粉3％、葡萄糖4％、玉米粉1％、蛋白胨0.5％、琼脂1％、麸皮4％、硫酸镁0.1％、磷酸氢二钾0.05％、水86.35％。

将完成培养的中国被毛孢接种于发酵培养基上，接种量5-10％，18℃下进行第一次发酵，时间为7天；发酵培养基的组成按重量体积比计为：葡萄糖3％、酵母膏4％、蛋白胨0.5％、硫酸镁1％、磷酸氢二钾1％、水90.5％。

将第一次发酵后的中国被毛孢与完成培养的蝙蝠蛾拟青霉和中华头孢菌混合，共同接种于发酵培养基上，接种量5-10％，18℃下再进行3次发酵，时间为2天，发酵培养基的组成按重量体积比计为：蚕豆粉3％、葡萄糖4％、玉米粉4％、蛋白胨0.5％、酵母膏1％、硫酸镁0.1％、磷酸氢二钾0.05％、水87.35％。

待发酵液中总菌丝体浓度达到55％时停止发酵，进行固液分离，将固体烘干粉碎得冬虫夏草菌粉。

实施例3

取购买或分离的中国被毛孢、蝙蝠蛾拟青霉和中华头孢菌三种菌株，分别进行斜面培养，其中中国被毛孢接种后于13℃培养29天，蝙蝠蛾拟青霉和中华头孢菌常温培养9天，斜面培养基的组成按重量体积比计为：蚕豆粉4％、葡萄糖2.5％、玉米粉4％、蛋白胨2％、琼脂0.5％、麸皮1％、硫酸镁0.8％、磷酸氢二钾1％、水84.2％。

将完成培养的中国被毛孢接种于发酵培养基上，接种量5-10％，16℃下进行第一次发酵，时间为8天；发酵培养基的组成按重量体积比计为：蚕豆粉4％、葡萄糖5％、玉米粉3％、蛋白胨1％、酵母膏2％、硫酸镁0.9％、磷酸氢二钾0.2％、水83.9％。

将第一次发酵后的中国被毛孢与完成培养的蝙蝠蛾拟青霉和中华头孢菌混合，共同接种于发酵培养基上，接种量5-10％，16℃下再进行3次发酵，时间为3天，发酵培养基的组成按重量体积比计为：葡萄糖4％、酵母膏3％、蛋白胨1.5％、硫酸镁0.05％、磷酸氢二钾0.1％、水91.35％。

待发酵液中总菌丝体浓度达到45％时停止发酵，进行固液分离，将固体烘干粉碎得冬虫夏草菌粉。

实施例4

取购买或分离的中国被毛孢、蝙蝠蛾拟青霉和中华头孢菌三种菌株，分别进行斜面培养，其中中国被毛孢接种后于13℃培养30天，蝙蝠蛾拟青霉和中华头孢菌常温培养8天，斜面培养基的组成按重量体积比计为：蚕豆粉3％、葡萄糖2.5％、玉米粉1.5％、蛋白胨1％、琼脂0.75％、麸皮1.5％、硫酸镁0.1％、磷酸氢二钾0.2％、水89.45％。

将完成培养的中国被毛孢接种于发酵培养基上，接种量5-10％，16℃下进行第一次发酵，时间为8天；发酵培养基的组成按重量体积比计为：葡萄糖5％、蛋白胨2％、酵母膏0.1％、硫酸镁0.8％、磷酸氢二钾0.05％、水92.05％。

将第一次发酵后的中国被毛孢与完成培养的蝙蝠蛾拟青霉和中华头孢菌混合，共同接种于发酵培养基上，接种量5-10％，15℃下再进行3次发酵，时间为3天，发酵培养基的组成按重量体积比计为：葡萄糖5％、蛋白胨2％、酵母膏0.1％、硫酸镁0.8％、磷酸氢二钾0.05％、水92.05％。

对照例1

取购买或分离的中国被毛孢菌株，按照实施例1的培养和发酵条件(培养基、温度、时间等)进行斜面培养、三次发酵。待发酵液中总菌丝体浓度达到45％时停止发酵，进行固液分离，将固体烘干粉碎得冬虫夏草菌粉。

对照例2

取购买或分离的蝙蝠蛾拟青霉菌株，按照实施例2的培养和发酵条件(培养基、温度、时间等)进行斜面培养、三次发酵。待发酵液中总菌丝体浓度达到55％时停止发酵，进行固液分离，将固体烘干粉碎得冬虫夏草菌粉。

对照例3

取购买或分离的中华头孢菌菌株，按照实施例3的培养和发酵条件(培养基、温度、时间等)进行斜面培养、三次发酵。待发酵液中总菌丝体浓度达到45％时停止发酵，进行固液分离，将固体烘干粉碎得冬虫夏草菌粉。

对照例4

按照专利申请CN200710301690中实施例1的条件制得的冬虫夏草菌粉，过程为：取92克中国被毛孢虫草菌粉，4克蝙蝠蛾拟青霉虫草菌粉，4克中华头孢虫草菌粉，再将上述三种原料混匀可制得发酵虫草混合粉产品。

试验例1

按照以下指标对实施例1-4和对照组1-4的冬虫夏草菌粉进行对照，其中各成分含量为冬虫夏草菌粉中的重量百分含量，具体结果见下表(各数值为10批样品的均值)：

由此发现，本发明实施例1-4的冬虫夏草菌粉中各成分的含量都更接近于天然冬虫夏草，多数都高于天然冬虫夏草；相反，对照例1-4的冬虫夏草菌粉中都含有低于天然冬虫夏草的成分。

这一结论通过指纹图谱测试(HPLC法)亦可得出：指纹图谱测试结果本发明实施例1-4的冬虫夏草菌粉与天然冬虫夏草的基因相似度>98.5％，说明本发明的冬虫夏草菌粉完全可以作为天然虫草的替代品。

试验例2

取18～20g的雄性ICR小鼠50只，按体重随机分成10组：空白组、普通组、实验组1-4和对照组1-4，其中空白组给予蒸馏水、普通组给予天然冬虫夏草菌粉混悬液、实验组1-4分别给予实施例1-4的冬虫夏草菌粉混悬液、对照组1-4分别给予对照例1-4的冬虫夏草菌粉混悬液，剂量为0.5g／Kg(菌粉重量／小鼠重)；每天灌胃给药1次，连续7d；每组10只。

小鼠脾淋巴细胞悬浮液的制备：末次给药后30min，小鼠摘眼球放血致死，75％乙醇浸泡5min，无菌取脾，用1ml注射器塞磨碎，尼龙绸布过滤到10ml离心管中，用Hank’S液洗涤，合并洗涤液，1500rpm离心5min，弃上清，加Hank’S液至7ml，细胞混匀，再离心，重复2次。进行细胞计数，以RPMI1640完全培养液稀释至1×10⁷个／ml的脾细胞混悬液备用。

MTT法淋巴细胞增殖反应实验：新鲜分离的1×10⁷cel1／ml小鼠脾细胞悬液加入96孔细胞培养板中，每孔加100μL脾细胞混悬液，再根据实验设计加入刺激剂(ConA和LPS)50μL／孔，每个样品设3个平行孔并设对照孔(仅加RPMI1640培养基)，将培养板置于37℃的5％CO₂培养箱中培养44h。每孔加入5050μL MTT溶液((2mg／ml)，继续培养4h。培养物1500rpm离心5min，弃去上清，每孔加150μL酸性DMSO溶液，振荡，使紫色结晶完成溶解(置暗处室温放置15～30min)。以酶标仪于578nm处测其OD值。计算刺激指数(SI)=加ConA细胞孔的平均OD值÷对照孔的平均OD值，结果见下表(与空白组比较，**P<0.01)。

组别	T淋巴细胞SI值	B淋巴细胞SI值
			空白组	1.12±0.41	1.29±0.34
普通组	2.33±0.48**	1.86±0.25**
			实验组1	2.47±0.32**	1.93±0.41**

实验组2	2.43±0.50**	1.88±0.28**
			实验组3	2.49±0.34**	1.93±0.39**
实验组4	2.54±0.40**	1.95±0.27**
			对照组1	1.27±0.23	1.35±0.19
对照组2	1.19±0.31	1.32±0.25
			对照组3	1.17±0.26	1.31±0.30
对照组4	1.29±0.33	1.36±0.22

T、B淋巴细胞在体外培养时，受到有丝分裂原(如PHA、ConA)刺激后，可出现细胞体积增大，代谢旺盛，蛋白和核酸合成增加，即向淋巴母细胞转化和增殖。淋巴细胞转化率的高低可以反映机体的细胞免疫水平，因此可作为测定机体免疫功能的指标之一。该试验例2的结果显示，与空白组比较，在剂量为0.5g／Kg(菌粉重量／小鼠重)的条件下，普通组和实验组1-4均能显著地提高小鼠脾T、B淋巴细胞转化刺激指数，而对照组1-4的影响不明显。由此说明本发明的冬虫夏草发酵菌粉与天然冬虫夏草在增强免疫功能方面具有相似的功效，都能显著提高正常小鼠免疫功能。而仅用单一菌株发酵、或物理混合三种菌株发酵产物的冬虫夏草菌粉则不具有上述效果。

最后应说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而己，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种混合菌株的液体发酵生产冬虫夏草菌粉的方法，依次包括菌株培养、发酵、固液分离和干燥粉碎，其特征在于，所述发酵的菌株为中国被毛孢、蝙蝠蛾拟青霉和中华头孢菌。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵过程包括中国被毛孢菌株的3～4次发酵，以及蝙蝠蛾拟青霉和中华头孢菌的2～3次发酵。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵过程包括中国被毛孢单独发酵后，再与蝙蝠蛾拟青霉和中华头孢菌混合继续发酵。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发酵过程中国被毛孢单独发酵7～9天。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述发酵过程中国被毛孢、蝙蝠蛾拟青霉和中华头孢菌混合后共进行三级发酵，每级的发酵时间为2～3天。

6.根据权利要求1-5任意一项所述的方法，其特征在于，所述发酵的温度为15～18℃。

7.根据权利要求1-5任意一项所述的方法，其特征在于，所述发酵的培养基含有碳源、氮源和无机盐。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述发酵的培养基按重量体积比计，含有碳源2.0～15.0％，氮源1.0～15.0％，无机盐0.1～5.0％。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述碳源选自葡萄糖、玉米粉、土豆汁和糊精中的一种或几种；所述氮源选自蛋白胨、酵母膏、麸皮和蚕蛹粉中的一种或几种；所述无机盐选自氯化钠、氯化镁、硫酸镁、氯化锰、氯化钾、氯化钙、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸亚铁、硫酸锰中的一种或几种。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述发酵的培养基含有葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、硫酸镁、磷酸氢二钾和水。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述发酵的培养基为葡萄糖5％、蛋白胨2％、酵母膏0.1％、硫酸镁0.8％、磷酸氢二钾0.05％、水92.05％。

12.通过权利要求1-11任意一项所述的方法制备得到的冬虫夏草菌粉。